DE2714751C2

DE2714751C2 -

Info

Publication number: DE2714751C2
Application number: DE2714751A
Authority: DE
Inventors: Jun-Ichi Tokio/Tokyo Jp Tohmatsu; Tomiaki Fuchu Tokio/Tokyo Jp Morimoto; Emiko Ohmiya Saitama Jp Kishi
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1976-04-05
Filing date: 1977-04-01
Publication date: 1987-07-16
Also published as: SE7703918L; DE2714751A1; SE8205891L; FR2347688B1; SE446128B; US4132767A; SE8205891D0; FR2347688A1; SE448032B; CH636449A5; GB1564063A

Description

Die Erfindung betrifft das α-L-Antigen des Anspruchs 1 und dessen Verwendung zur Herstellung eines Reagens für die Erkennung von Lebererkrankungen (vgl. Anspruch 2).

Es ist bekannt, daß es HB-Antigene (HBs, HBc, e) und HA-Antigene gibt, die man bei an Hepatitis leidenden Patienten findet, und daß α-Fetoprotein bei Patienten gefunden wird, die an primärem Leberkrebs und dergleichen leiden, daß also diese Antigene bei Lebererkrankungen vorkommen. Die Bestimmung dieser Antigene und der entsprechenden Antikörper werden für die Diagnose der Lebererkrankung und für die Untersuchung des Blutes bei Bluttransfusionen verwendet. Da jedoch bei der Untersuchung von Leberkrankheiten in vielen Fällen negative Ergebnisse hinsichtlich der genannten Antigene und Antikörper erzielt werden, reicht es bisher nicht aus, die Untersuchung nur auf die Entdeckung dieser Antigene und Antikörper zu erstrecken. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein neues α-L-Antigen (genannt Arai-Antigen) und dessen Antikörper gefunden, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen. Das α-L-Antigen hat die folgenden Eigenschaften:

(1) Molekulargewicht etwa 1 000 000:
es wird mit der fast gleichen Fraktion wie IgM (Molekulargewicht etwa 900 000 bis 1 000 000) durch Säulenchromatografie mit Biogel A-1,5 m gefunden).
(2) Elektrophoretische Beweglichkeit:
β - a ₂-Globulinregion (dies ist ein Zwischenwert zwischen HBs Antigen und α - Fetoprotein).
(3) Isoelektrischer Punkt:
PI = 5,04 (die Aktivität des α-L-Antigens wurde im Bereich von 4,22 bis 5,88 durch Messen mit einer Ampholeinsäule gefunden).
(4) Auftriebsdichte:
d = 1,08 g/ml in Lösung von Cäsiumchlorid und
d = 1,03 g/ml in Lösung von Rohrzucker.
(5) Bildung eines Komplexes:
Ein ausfallender Komplex bildet sich mit Dextransulfat in Gegenwart von Magnesiumchlorid, wobei dieser Komplex lipoproteinähnliche Eigenschaften zeigt.
(6) Färbung:
Der α-L-Antigen/Antikörper, der ausgefallen ist in Agargel kann mit Sudanschwarz B angefärbt werden.
(7) Thermostabilität:
Antigene Eigenschaften in dem Serum werden bei 56°C 30 Minuten aufrechterhalten.
(8) Form (als Antigen/Antikörper-Komplex):
Sphärische Partikel mit etwa 300 · ^-10 m Durchmesser.

Es wurde die Häufigkeit untersucht hinsichtlich des Nachweises von α-L-Antigen und -Antikörpern im Serum von unter verschiedenen Lebererkrankungen leidenden Patienten, von HBs Antigen-positivem Trägerserum und dem Serum von gesunden Menschen, und es wurde untersucht das Verhältnis zwischen dem α-L-Antigen (und -Antikörper) gemäß der vorliegenden Erfindung und den bekannten Antigenen und Antikörpern, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, d. h. HBs-Antigensystemen, e-Antigensystemen und α-Fetoprotein (nachfolgend α-FP). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. In dieser Tabelle wurde HBs-Antigen durch die IAHA-Methode untersucht; HBs-Antikörper wurden durch die PHA-Methode untersucht und die anderen wurden durch die MO-Methode untersucht.

Tabelle

Wie in dieser Tabelle gezeigt wird, ist das α-L-Antigen stark positiv bei Leberkrebs und Leberzirrhose und die Existens des α-L-Antigens wird bei chronischer Hepatitis und akuter Hepatitis festgestellt. Dagegen kann das α-L-Antigen nicht in den HBs-Antigen-positiven Blutspendern und beim gesunden Menschen festgestellt werden. Der α-L-Antikörper zeigt eine hohe Positivität gegen Leberzirrhose und wird auch bei HBs-Antikörper-positiven Blutspendern festgestellt. Etwa 60% des gegenüber α-L-Antigen- und α-L-Antikörper-positiven Serums wird von dem HBs-Antigen- Antikörper-System begleitet. Im Falle des Serums bei Leberkrebs kommen etwa 45% des gegenüber α-L-Antigen-positiven Serums mit α -FP vor. Andererseits sind etwa 25% des gegenüber α-L-Antigen-positiven Serums völlig unempfindlich gegenüber dem bekannten Antigen-Antikörper-System.

Infolgedessen kommt α-L-Antigen und α-L-Antikörper sehr häufig bei Lebererkrankungen vor. Die Bestimmung von diesem α-L-Antigen und α-L-Antikörper ist geeignet für die Diagnose von Lebererkrankungen und für die Untersuchung von Blut bei Bluttransfusionen.

Ein Ziel der Erfindung ist es, ein neues α-L-Antigen, das bei Lebererkrankungen vorkommt, und eine technische Anwendbarkeit desselben aufzuzeigen.

Der a-L-Antikörper wird hergestellt durch Immunisierung eines Tieres mit dem α-L-Antigen oder dem α-L-Antigen- Antikörper-Komplex, wobei man das Antiserum dann sammelt.

Das α-L-Antigen kann zur Bildung eines α-L-Antigen- positiven Serums oder von Ascites durch eine Protein- oder Lipoproteintrennmethode verwendet werden. Bei einer solchen Trennmethode wird eine übliche Verfahrensweise angewendet, wie sie auf dem Gebiet der Immunologie bekannt ist. Solche Verfahren schließen beispielsweise ein, Verfahren zur Bestimmung des Dichtegradienten durch Zentrifugieren, Aussalzen, Elektrophorese, Gelfiltration, Affinitätschromatografie, Feststellung des isoelektrischen Punktes, Ultrafiltration, Cohn's-Fraktion, die Dextransulfat- Ausfällmethode und ein Verfahren, bei dem man Antiserum zu Verunreinigungen gibt, die nicht das α-L-Antigen enthalten, um die Verunreinigungen zu entfernen, sowie weitere Methoden.

Der α-L-Antigen-Antikörper-Komplex kann erhalten werden als Niederschlag, z. B. indem man eine Lösung des α-L-Antigens mit einer Lösung des α-L-Antikörpers vermischt. Als Tiere für die Immunisierung können beispielsweise Kaninchen, Meerschweinchen, Ziegen, Pferde, Kühe und dergleichen verwendet werden.

Beim Durchführen der Immunisierung arbeitet man vorzugsweise, um das Antiserum mit einer hohen Antikörperaktivität zu gewinnen, mit dem α-L-Antigen oder dem α-L-Antigen-Antikörper- Komplex, der emulgiert wurde unter Verwendung des Freund-Adjuvants, wobei man dieses Verfahren nicht nur einmal, sondern mehrere Male durchführt.

Das erhaltene Antiserum kann durch die Immunoadsorptionsmethode gereinigt werden unter Verwendung des Serums von gesunden Menschen, Affinitätschromatografie und dergleichen.

Das Bestimmungsreagenz, welches das α-L-Antigen gemäß der Erfindung umfaßt, kann verwendet werden für die übliche immunobiologische Verfahrensweise zur Bestimmung, bei welcher man Antigen-Antikörper-Reaktion feststellt. Solche Bestimmungsmethoden schließen ein eine Methode, bei welcher man das Antigen per se verwendet, und eine Methode, bei welcher man das behandelte Antigen verwendet. Ein Reagenz für die Bestimmung, welche das α-L-Antigen gemäß der Erfindung enthält, schließt sowohl α-L-Antigen per se und das behandelte α-L-Antigen ein.

Das α-L-Antigen wird per se angewendet, wenn die Bestimmung nach einer Methode wie der Ouchterlony-Methode (MO) durch Immunoelektrophorese (IES, IEP), Ergänzungsfixierungsmethode (CF), Immunohämatologie (IAHA) und dergleichen durchgeführt wird.

Das behandelte α-L-Antigen wird verwendet, wenn die Bestimmung nach einer Methode, wie der einfachen radialen Immunodiffusionsmethode (SRID), durch die Radioimmunobestimmungsmethode (RIA), durch die enzymverbunde Immuno- Lösungsmittelanordnung (ELISA) oder die passive Hämagglutinationsmethode (PHA) und dergleichen durchgeführt wird.

Im Falle der einfachen radialen Immunodiffusionsmethode (SRID) kann man das behandelte α-L-Antigen verwenden, das hergestellt wurde, indem man das α-L-Antigen zusammen mit einem Trägermedium auflöste und die Lösung in Form einer Platte verfestigte. Ein solches Trägermedium schließt Agar, Agarose, Stärke, Polyacrylamidgel und dergleichen ein. Die Gelplatte kann von dem genannten Trägermedium und dem α-L-Antigen nach üblichen Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise wird ein Trägermedium unter Wärme in einer Pufferlösung gelöst, α-L-Antigen wird dazugegeben und das Ganze wird zusammen vermischt. Die erhaltene Lösung wird dann auf eine Glasplatte oder in ein Plastikgefäß gegossen und zur Verfestigung gekühlt. Um das zu untersuchende Serum aufzubringen, wird ein Loch in die erhaltene Gelplatte gebohrt.

Im Falle der passiven Hämagglutinationsmethode (PHA) verwendet man ein α-L-Antigen, das hergestellt wurde durch Binden des α-L-Antigens an feine Teilchen. Als feine Teilchen können übliche Stoffe verwendet werden. Besonders bevorzugt werden als feine Teilchen Erythrocyten von Säuretieren und Vögeln. Man kann als Teilchen einer Größe von etwa 1 bis 10 µm im Durchmesser auch Polystyrollatex, Polyesterlatex, Polyvinylchlorid, Bentonit, Glaskugeln und dergleichen verwenden. Die üblichen Bindemittel können zum Binden des α-L-Antigens an die feinen Teilchen verwendet werden. Zu solchen Mitteln gehören beispielsweise Glutaraldehyd, Formaldehyd, Tanninsäure, Bis-azotiertes Benzidin, Chromchlorid, Carbodiimid und dergleichen.

Bei der Radioimmunobestimmungsmethode (RIA) verwendet man das α-L-Antigen, das durch ein Isotop gekennzeichnet ist. Die Kennzeichnung kann durchgeführt werden in üblicher Weise, z. B. nach der Chloramin-T-Methode unter Verwendung von ¹²⁵J oder ¹³¹J.

Im Falle der enzymverbundenen Immunolösungsmittelmethode (ELISA) wird das α-L-Antigen, gebunden an ein Enzym, verwendet. Als Enzym können verwendet werden Glukoseoxydase, Alkaliphosphatase, Peroxydase und dergleichen. Glutaraldehyd wird gewöhnlich als Bindemittel verwendet.

Das α-L-Antigen und der α-L-Antikörper können bestimmt werden nach üblichen Verfahren unter Verwendung der vorgenannten Reagenzien für die Bestimmung mittels des α-L-Antigens. In allen Fällen wird das Reagenz für die Bestimmung, welches α-L-Antigen enthält, für die Bestimmung des α-L-Antikörpers verwendet. Dieses Reagenz kann auch verwendet werden zur Bestimmung des α-L-Antikörpers, indem man die inhibierte Reaktion anwendet, bei welcher bei jeder Methode der a-L-Antikörper verwendet wird. Bei allen Methoden können im geeigneten Falle zusätzlich andere Reagenzien als Ergänzungsstoffe verwendet werden, wie Erythrocyten, Pufferlösungen, α-L-Antikörper und dergleichen, falls dies notwendig ist.

Die vorhergehende Beschreibung des Reagenzes für die Bestimmung mittels des α-L-Antigens kann in gleicher Weise auch dienen für das Reagenz zur Bestimmung, bei dem man den α-L-Antikörper verwendet, wobei der Ausdruck " α-L-Antikörper" einfach durch den Ausdruck " α-L-Antigen" ausgetauscht wird. Das Verfahren zur Reinigung des α-L- Antigens wird durchgeführt an einem Material, welches das α-L-Antigen enthält, und zwar mittels der Bestimmung des Dichtegradienten durch Zentrifugieren, wobei man eine Fraktion sammelt mit einer Auftriebsdichte von weniger als 1,1 g/ml, vorzugsweise 1,03 bis 1,08 g/ml.

Mittels dieses Verfahrens kann das a-L-Antigen von einem großen Teil der unreinen Proteinkomponente und anderen Antigenen, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, abgetrennt werden, weil das α-L-Antigen eine sehr geringe Auftriebsdichte aufweist.

Als Material, welches α-L-Antigen enthält, das verwendet werden kann, kann jede Substanz dienen, welche das α-L-Antigen enthält, beispielsweise α-L-Antigen- positives Serum und Ascites und dergleichen.

Als Mittel für die Zentrifugierung zur Bestimmung des Dichtegradienten können übliche Stoffe verwendet werden, wie Cäsiumchlorid, Cäsiumbromid, Kaliumbromid, Lithiumbromid, Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Glyzerin, Rohrzucker und dergleichen.

Um das Reinigungsverfahren durchzuführen, können, in Form von Kombinationen, andere Verfahren zum Trennen des Proteins oder der Lipoproteinfraktionen angewendet werden, beispielsweise die Aussalzmethode, die Elektrophorese, Gelfiltration, Affinitätschromatografie, Bestimmung des isoelektrischen Punktes, Ultrafiltration, Cohns- Fraktion, Dextransulfatreinigung oder ein Verfahren, bei dem man die Antikörper den Verunreinigungen zusetzt (ausgenommen solchen, die α-L-Antigen enthalten), um die Verunreinigungen zu entfernen und dergleichen und wobei man ein reines α-L-Antigen erhält.

Das Zentrifugieren mit einem Dichtegradienten ist ausgezeichnet geeignet für die Reinigung von zunächst dem α-L-Antigen aus dem Rohmaterial, wie einem Serum, Ascites und dergleichen. Das Verfahren kann auch für die weitere Reinigung des α-L- Antigens, welches vorher nach anderen Reinigungsverfahren gereinigt worden war, verwendet werden.

Die Beispiele und Versuche, die anschließend beschrieben werden, dienen der Beschreibung der Erfindung.

Beispiel 1

100 ml eines α-L-Antigen-positiven Serums wurden 20 Minuten mit 10 000 Upm zentrifugiert und das Überstehende wurde gewonnen. Pulverförmiges Cäsiumchlorid wurde zu dem Überstehenden in einem Verhältnis von 0,3 g/ml gegeben, wobei sich das Ganze löste. Die erhaltene Lösung wurde einer Zentrifugierung unter Ausbildung eines Dichtegradienten 40 Stunden mit 40 000 Upm unterworfen. Die äußerste Fraktion mit einer Auftriebsdichte von weniger als 1,1 g/ml wurde gesammelt und über Nacht mit destilliertem Wasser bzw. einer Kochsalzlösung dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde etwa 5mal unter Verwendung eines Amicon Diaflow-XM-50 konzentriert, wobei man eine α-L-Antigenlösung erhielt. Die erhaltene α-L-Antigenlösung bildet einen Komplex mit dem α-L-Antigenkörper und man stellt keine anderen Antigene, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, wie HBs-Antigen, e-Antigen, das α-FP und dergleichen, bei der MO-Methode fest. Die spezifische Aktivität des α-L-Antigens wurde auf etwa das 30fache erhöht. Dieses a-L-Antigen ist als Reagenz für den Nachweis geeignet.

Beispiel 2

Unter Verwendung von 100 ml des α-L-Antigen-positiven Ascites wurde die a-L-Antigenlösung nach der gleichen Verfahrensweise, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Der Dichtegradient im Bereich von 1,05 bis 1,2 g/ml war vorher in einem Zelluloserohr gebildet worden, unter Verwendung einer Lösung, in welcher Cäsiumchlorid in 0,01 m Trishydrochlorsäure-Pufferlösung aufgelöst war. Die α-L-Antigen-Lösung wurde auf die obere Schicht der Röhre unter Ausbildung von verschiedenen Schichten gegeben. Das Ganze wurde dann einer Dichtegradienten-Zentrifugierung 24 Stunden mit 40 000 Upm unterworfen. Die α-L-Antigen- positive Fraktion wurde gesammelt und mit destilliertem Wasser und dann mit Trischlorwasserstoffpufferlösung über Nacht dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde auf etwa ¹/₅ ihrer Konzentration konzentriert, unter Verwendung von Amicon Diaflow-XM-50. Das erhaltene α-L-Antigen bildete einen Komplex mit dem α-L-Antikörper und man stellte keine anderen Antigene, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, fest, wie HBs-Antigen, e-Antigen, α-FP und dergleichen, unter Zuhilfenahme der MO-Methode. Die spezifische Aktivität des α-L-Antigens wurde um etwa das 100fache erhöht. Dieses α-L-Antigen ist ein brauchbares Reagenz für den Nachweis.

Beispiel 3

Die gemäß Beispiel 1 hergestellte α-L-Antigen-Lösung wurde nach Zugabe von Freund-Adjuvants im Verhältnis von 1 : 1 emulgiert. 1 ml der Emulsion wurde an getrennten Stellen in den Rücken eines Kaninchens injiziert, und zwar subkutan als auch intrakutan und auch in die Fußsohle, so daß das Kaninchen eine Immunität entwickelte. Eine Woche nach der ersten Immunisierung wurde eine zweite Immunisierung durchgeführt, die in gleicher Weise vorgenommen wurde, und zwar auch mit der gleichen Menge der Emulsion wie bei der ersten Immunisierung. Einen Monat nach der ersten Immunisierung wurde eine dritte Immunisierung durchgeführt, und zwar zusätzlich mit doppelten Mengen der Emulsion im Vergleich zu der ersten Immunisierung. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurde mehrere Male Blut abgenommen und das Serum wurde vom Blut getrennt. Zu diesem Serum wurden äquivalente Mengen eines Serums eines gesunden Menschen gegeben. Man ließ die Mischung 1 Stunde bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C stehen. Das Gemisch der Seren wurde mit 10 000 Upm pro Minute während 10 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen. Das erhaltene Antiserum, enthaltend den α-L-Antikörper, reagiert lediglich mit α-L-Antigen, aber nicht mit anderen Antigenen, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, wie HBs-Antigen, e-Antigen, α-FP und dergleichen, sowie dem Serum vom gesunden Menschen.

Das Antiserum, enthaltend diesen a-L-Antikörper kann als Bestimmungsreagenz verwendet werden.

Beispiel 4

Freund-Adjuvants wurde zu einer Lösung des nach Beispiel 2 erhaltenen α-L-Antigens im Verhältnis von 1 : 1 gegeben und das Ganze wurde emulgiert. Eine Menge von 0,5 ml der Emulsion wurde an verschiedenen Stellen in den Rücken eines Meerschweinchens injiziert, und zwar subkutan und intrakutan und auch in die Fußsohle, so daß das Meerschweinchen eine Immunität entwickelte. In gleicher Weise wie in Beispiel 3 beschrieben wurde ein Antiserum, welches den α-L-Antikörper enthielt, gewonnen. Das erhaltene Antiserum reagiert sehr stark lediglich mit α-L-Antigen, aber zeigt praktisch keine Reaktion mit den anderen Antigenen wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, wie beispielsweise HBs-Antigen, e-Antigen, a-FP und dergleichen, sowie dem Serum eines gesunden Menschen.

Das Antiserum, welches den α-L-Antikörper enthält, kann als Reagenz für die Bestimmung verwendet werden.

Beispiel 5

Zu 25 ml der gemäß Beispiel 1 erhaltenen α-L-Antigen- Lösung werden allmählich 50 ml des gemäß Beispiel 3 gewonnenen Antiserums, welches einen a-L-Antikörper enthielt, gegeben. Das Ganze wird unter Rühren vermischt. Man läßt die Mischung 1 Stunde bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C stehen. Die Mischung wird dann 20 Minuten mit 10 000 Upm zentrifugiert. Der α-L-Antigen-Antikörper- Komplex wurde als Niederschlag gewonnen. Zu diesem Niederschlag wurden 0,01 n Trisaminomethan/Chlorwasserstoffsäure- Pufferlösung gegeben und die Mischung wurde zentrifugiert um die Verunreinigungen durch Waschen zu entfernen.

Der α-L-Antigen-Antikörper-Komplex wurde in 5 ml Salzlösung suspendiert und die Suspension wurde durch Zugabe von Freund-Adjuvants emulgiert. Anschließend wurde die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel 3 durchgeführt und man erhielt ein Antiserum, welches den α-L-Antikörper enthielt. Das erhaltene Antiserum reagiert im wesentlichen nur mit α-L-Antigenen, aber nicht mit Antigenen, wie sie bei Lebererkrankungen vorkommen, nämlich mit HBs-Antigen, e-Antigen, α-FP und dergleichen oder dem Serum von gesunden Menschen.

Beispiel 6

Zu diesem Antiserum, enthaltend α-L-Antikörper, das gemäß Beispiel 3 gewonnen wurde, wurde eine äquivalente Menge von 0,05 m einer Phosphat-Kochsalz-Pufferlösung (pH 7,5) gegeben. Zu dieser Lösung wurde eine äquivalente Menge einer wäßrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung (pH 6,8) gegeben. Das Ganze wurde unter Rühren gemischt. Nach einer Stunde wurde die Lösung zentrifugiert mit 5000 Upm während 30 Minuten. Die erhaltenen Niederschläge wurden in der Phosphat- Kochsalz-Pufferlösung gelöst, wobei man eine Lösung erhielt mit dem gleichen Volumen des ursprünglichen Antiserums. Ein Viertel Volumenteil der wäßrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung (pH 6,8) wurde zu der Lösung gegeben. Nach einer Stunde wurde die Lösung mit 5000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert. Ein weiteres Viertel (Volumenteil) der wäßrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurde zu der entstandenen überstehenden Lösung gegeben, wodurch man eine 33%ige Ammoniumsulfatlösung erhielt. Nach 1 Stunde wurde diese Lösung mit 5000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert und die Niederschläge wurden gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,01 m Trisaminomethan/Chlorwasserstoffsäure- Pufferlösung (pH 8,0) gelöst, wobei man eine Lösung erhielt mit einer Proteinkonzentration von 80 mg/ml. Diese Lösung wurde einer Gelfiltration mit Sephadex G 50 unterworfen unter Verwendung der genannten Pufferlösung, um die Entsalzung und das Puffern durchzuführen. Die erhaltene Lösung wurde konzentriert und auf eine Proteinkonzentration von 70 mg/ml gebracht unter Verwendung von Amicon Diaflow-XM-50. Aktivierte DEAE-Zellulose wurde in eine Säule von 40 cm Länge und 2,6 cm Durchmesser gepackt unter Verwendung von Trisaminomethan/Chlorwasserstoffsäure- Pufferlösung. Die konzentrierte Lösung wurde auf die Säule gegeben, um den a-L-Antikörper auf der aktivierten DEAE-Zellulose zu absorbieren. Das absorbierte α-L-Antigen wurde mit 0,1 m Natriumchlorid/Trisaminomethan/ Hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 8,0), die hergestellt worden war durch Zugabe von Natriumchlorid zu der Trisaminomethan/ Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung, eluiert. Die α-L-Antikörper- positive Fraktion wurde isoliert und gesammelt. Diese Fraktion wurde dann konzentriert, auf eine Proteinkonzentration von 70 mg/ml unter Verwendung von Amicon Diaflow-XM-50. Der erhaltene α-L-Antikörper kann als Bestimmungsreagenz verwendet werden.

Beispiel 7

Der gemäß Beispiel 6 erhaltene α-L-Antikörper wurde in 0,1 m Barbital-Pufferlösung (pH 9,0) gelöst, um die Konzentration des Proteins auf 10 mg/ml einzustellen. Zu dieser Lösung wurde die äquivalente Menge von Bromcyanid- aktiviertem Sepharose-4B-Gel gegeben und die Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C reagieren gelassen. Das nicht umgesetzte Protein wurde durch Waschen mit 0,05 m Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung (pH 7,5) entfernt. Die erhaltene Lösung wurde in eine Säule von 20 cm Länge und 1,5 cm Durchmesser gefüllt. Die α-L-Antigen-Lösung gemäß Beispiel 2 wurde auf diese Säule gegeben.

Nach der Entfernung von nicht umgesetzter Substanz durch Waschen mit der Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung wurde 3,5 m einer Natriumjodid-Lösung auf die Säule gegeben, um das α-L-Antigen aufzulösen und zu eluieren. Die gesammelte α-L-Antigen-Lösung wurde mit destilliertem Wasser zur Entfernung des Natriumjodids dialysiert und die Lösung wurde dann unter Verwendung von Amicon Diaflow-XM-50 konzentriert. Das erhaltene α-L-Antigen kann als Nachweisreagenz verwendet werden.

Beispiel 8

Die in Beispiel 1 hergestellte α-L-Antigen-Lösung wurde in 0,1 m Barbital-Pufferlösung (pH 9,0) gelöst, um die Konzentration des Proteins auf 10 mg/ml zu bringen. Diese Lösung wurde zu einer äquivalenten Menge eines Bromcyanid- aktivierten Sepharose-4B-Gel gegeben und die Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C reagieren gelassen. Nicht umgesetztes Protein wurde durch Waschen mit 0,05 m Phosphat/ Kochsalz-Pufferlösung (pH 7,5) entfernt. Anschließend wurde das erhaltene Produkt auf eine Säule von 1,5 cm Durchmesser und 20 cm Länge gegeben. Auf die Säule wurde dann das Antiserum, enthaltend den α-L-Antikörper, hergestellt gemäß Beispiel 3, gegeben. Nach Entfernen der nicht umgesetzten Substanzen durch Waschen mit einer Phosphat/ Kochsalz-Pufferlösung wurde eine 3,5 m Natriumjodidlösung auf die Säule gegeben, um das α-L-Antigen aufzulösen und zu eluieren. Die erhaltene α-L-Antigen-Lösung wurde gesammelt und mit destilliertem Wasser dialysiert zur Entfernung des Natriumjodids und anschließend wurde die Lösung mittels eines AMicon Diaflow-XM-50 konzentriert. Das erhaltene α-L-Antigen kann als Nachweisreagenz verwendet werden.

Beispiel 9

Das Blut eines Schafes wurde in einem Zentrifugierröhrchen gesammelt und dann 5mal mit 2000 Upm während 10 Minuten unter Verwendung einer Kochsalzlösung, um die Erythrocyten zu waschen, zentrifugiert. Zu diesen Erythrocyten wurde eine Lösung eines 0,15 m Phosphat/Kochsalz- Puffers (pH 7,5) gegeben, um die Konzentration der Erythrocyten- Lösung auf 5% zu bringen. Zu der Lösung, in welcher die Erythrocyten schwammen, wurde ¹/₅ Volumen einer Glutaraldehyd-Lösung gegeben, die auf eine Konzentration von 2,5% eingestellt wurde mittels der Phosphat/Kochsalz- Pufferlösung und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur etwa 5 Stunden unter Rühren zur Fixierung der Erythrocyten durchgeführt. Durch Zentrifugieren dieser Suspension erhielt man die fixierten Erythrocyten, die dann mehrere Male mittels einer Kochsalz-Lösung durch Zentrifugieren gewaschen wurden. Nach Einstellen dieser fixierten Erythrocyten auf eine 5%ige Suspension mittels der Phosphat-Pufferlösung wurde zu der Suspension die äquivalente Menge an Tanninsäure- Lösung zugegeben, die auf 3 mg/dl eingestellt war mittels der Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung und man rührte weitere 15 Minuten. Durch Zentrifugieren dieser Suspension erhielt man die Erythrocyten, die dann mit Tanninsäure behandelt wurden. Die erhaltenen Erythrocyten wurden mehrere Male unter Verwendung einer Kochsalzlösung zentrifugiert. Zu den erhaltenen, mit Tanninsäure behandelten Erythrocyten wurde eine Phosphat-Pufferlösung gegeben, wobei man eine Suspension erhielt, die die Erythrocyten in Mengen von 5% enthielt. Zu dieser, die Erythrocyten enthaltenden Suspension, wurde die Lösung gegeben, welche den α-L-Antikörper gemäß Beispiel 6 enthielt, und welche auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml mittels der Phosphat/Kochsalz- Pufferlösung eingestellt worden war, und das Ganze wurde vermischt. Die erhaltene Suspension wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur sensibilisiert. Nach dem Zentrifugieren wurden die erhaltenen sensibilisierten Erythrocyten mehrere Male unter Verwendung von Kochsalz-Lösung durch Zentrifugieren gewaschen. Zu den erhaltenen sensibilisierten Erythrocyten wurde die Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung gegeben, wobei man eine 7,5%ige Suspension erhielt. Nachdem man eine genaue Menge Tymelosal als Antiseptikum zugefügt hatte, wurde die Lösung bei 4°C aufbewahrt. Die α-L-Antikörper- sensibilisierten Erythrocyten des Schafes können als Reagenz für den Nachweis bei der RPHA-Methode verwendet werden.

Beispiel 10

Die gleiche Verfahrensweise, die in Beispiel 9 beschrieben wurde, wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Suspension, die die Erythrocyten enthielt, mit einer äquivalenten Menge einer Lösung vermischt wurde, die erhalten worden war, indem man das in Beispiel 2 erhaltene α-L-Antigen auf eine Proteinkonzentration von 100 µg/ml unter Verwendung einer Phosphat/Kochsalz-Pufferlösung einstellte, worauf dann die Erythrocyten sensibilisiert wurden. Die α- L-Antigen-sensibilisierten Erythrocyten des Schafes können als Reagenz für den Nachweis bei der PHA-Methode verwendet werden.

Beispiel 11

Das gemäß Beispiel 7 gewonnene α-L-Antigen wurde in einer 0,04 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) gelöst und die erhaltene Lösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml eingestellt. 10 µl der Lösung wurden 50 µl 1 mc Na¹²⁵J zugegeben. 10 µl einer Lösung, in welcher Chloramin T in einer Phosphat-Pufferlösung im Verhältnis von 1,5 mg/ml gelöst worden waren, wurden zu der vorgenannten Lösung gegeben und die erhaltene Lösung wurde 30 Sekunden gerührt. Nach Zugabe von 100 µl der Phosphat- Pufferlösung, in welcher Metanatriumbisulfit gelöst worden war, im Verhältnis von 2 mg/ml, wurde die Umsetzung abgebrochen. Zu der Reaktionslösung wurden 100 µl einer Phosphat-Pufferlösung gegeben, in welcher Kaliumjodid im Verhältnis von 10 mg/ml gelöst worden war. Unmittelbar darauf wurde die erhaltene Lösung einer Gelfiltration unterworfen unter Verwendung von Sephadex G-50, um das ¹²⁵J-markierte a-L-Antigen und das ¹²⁵J zu trennen. Die spezifische Radioaktivität des erhaltenen ¹²⁵J-markierten α-L-Antigens betrug 80 µc/µg.

Das ¹²⁵J-markierte α-L-Antigen kann als Reagenz für die Bestimmung bei der RIA-Methode verwendet werden. Der Nachweisbereich des α-L-Antigens liegt im Bereich von 10 ng bis 600 ng/ml und der Nachweisbereich des α-L-Antikörpers im Bereich von 30 ng bis 1000 ng/ml.

Beispiel 12

Der nach Beispiel 8 erhaltene a-L-Antikörper wurde in 0,04 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) gelöst und die erhaltene Lösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml eingestellt. Zu 10 µl dieser Lösung wurden 50 µl 1 mc Na¹²⁵J gegeben. Zu dieser Lösung wurden 10 µl einer Lösung gegeben, in welcher Chloramin T in der Phosphatpufferlösung im Verhältnis von 1,5 mg/ml gelöst worden war und die erhaltene Lösung wurde 30 Sekunden gerührt. Zu der erhaltenen Lösung wurden 10 µl der Phosphat-Pufferlösung, in welcher Metanatriumbisulfit im Verhältnis von 2 mg/ml gelöst worden war, gegeben, so daß die Reaktion abbrach. Zu der Reaktionslösung wurde eine Phosphat-Pufferlösung gegeben, in welcher Kaliumjodid im Verhältnis von 10 mg/ml gelöst worden war. Die erhaltene Lösung wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, um den ¹²⁵J-markierten α-L-Antikörper und das ¹²⁵J zu trennen. Die spezifische Radioaktivität des erhaltenen ¹²⁵J-markierten α-L-Antikörpers betrug 70 µc/µg.

Dieser ¹²⁵J-markierte α-L-Antikörper kann als Reagenz für den Nachweis bei der RIA-Methode verwendet werden. Das Reagenz zeigte einen Nachweisbereich des α-L-Antigens im Bereich von 10 ng bis 600 ng/ml und einen Nachweisbereich für den α-L-Antikörper im Bereich von 30 ng bis 1000 ng/ml.

Beispiel 13

Agarose wurde in der Wärme in 0,01 m Tris-aminomethan/ Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit einem pH von 7,5 (welche 0,15 m Natriumchlorid und 0,1% Natriumchlorid enthielt) gelöst bis zu einem Gehalt von 1,2% Agarose. 80 ml der Agarose- Lösung wurden auf etwa 56°C gekühlt und zu der Lösung wurden unter Rühren 20 ml der α-L-Antikörper-Lösung gemäß Beispiel 3 gegeben. Die Lösung wurde in Plastikgefäße gegossen und dort abkühlen gelassen, wobei man Agarosegelplatten von 1 mm Dicke erhielt, welche den α-L-Antikörper enthielten. In diese Platten wurden Löcher für die Proben von 3 mm Durchmesser in regelmäßigen Abständen gemacht. Das erhaltene Produkt kann als Nachweisreagenz bei der RID-Methode verwendet werden.

Beispiel 14

Die in Beispiel 13 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das α-L-Antigen gemäß Beispiel 2 anstelle der a-L-Antikörper-Lösung verwendet wurde. Man erhielt so Agarosegelplatten, welche das α-L-Antigen in einer Dicke von 1 mm enthielten.

Das erhaltene Produkt kann als Reagenz bei dem Nachweis in der SRID-Methode verwendet werden.

Versuch 1

Versuche wurden durchgeführt für den Nachweis des α-L- Antigens aus dem Serum bei verschiedenen Lebererkrankungen, HBs-Antigen-positiven Blutspendern und bei gesunden Menschen. Dieser Nachweis wurde durchgeführt nach der MO-Methode unter Verwendung des α-L-Antikörpers, der gemäß Beispiel 3 erhalten worden war, und mittels der SRID-Methode unter Verwendung des Bestimmungsreagenzes, das gemäß Beispiel 13 gewonnen worden war.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle festgehalten.

Versuch 2

Es wurden Versuche durchgeführt für die Bestimmung von α-L-Antikörpern aus dem Serum von verschiedenen lebererkrankten oder von gesunden Menschen mittels der SRID- Methode unter Verwendung des gemäß Beispiel 14 erhaltenen Nachweisreagenzes und mittels der MO-Methode unter Verwendung des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Nachweisreagenzes. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Versuch 3

Es wurden Versuche durchgeführt für die Bestimmung des α-L-Antigens aus dem Serum von verschiedenen Lebererkrankungen oder gesunden Menschen unter Verwendung der SRID-Methode mit dem Nachweisreagenz gemäß Beispiel 13 und mittels der IES-Methode unter Verwendung des Nachweisreagenzes, das gemäß Beispiel 3 erhalten worden war.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zu sehen.

Claims

1. α-L-Antigen mit folgenden Eigenschaften:

(1) Molekulargewicht etwa 1 000 000:
(es wird mit der fast gleichen Fraktion wie IgM (Molekulargewicht etwa 900 000 bis 1 000 000) durch Säulenchromatografie mit Biogel A-1,5 m gefunden).
(2) Elektrophoretische Beweglichkeit:
β - a ₂-Globulinregion (dies ist ein Zwischenwert zwischen HBs Antigen und α -Fetoprotein).
(3) Isoelektrischer Punkt:
PI = 5,04 (die Aktivität des a-L-Antigens wurde im Bereich von 4,22 bis 5,88 durch Messen mit einer Ampholeinsäule gefunden).
(4) Auftriebsdichte:
d = 1,08 g/ml in Lösung von Cäsiumchlorid und
d = 1,03 g/ml in Lösung von Rohrzucker.
(5) Bildung eines Komplexes:
Ein ausfallender Komplex bildet sich mit Dextransulfat in Gegenwart von Magnesiumchlorid, wobei dieser Komplex lipoproteinähnliche Eigenschaften zeigt.
(6) Färbung:
Der α-L-Antigen/Antikörper, der ausgefallen ist in Agargel, kann mit Sudanschwarz B angefärbt werden.
(7) Thermostabilität:
Antigene Eigenschaften in dem Serum werden bei 56°C 30 Minuten aufrechterhalten.
(8) Form (als Antigen/Antikörper-Komplex):
Sphärische Partikel mit etwa 300 · 10^-10 m Durchmesser.

2. Verwendung des α-L-Antigens gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Reagens für die Erkennung von Lebererkrankungen.