DE3872235T2 - Allgemeiner krebsverbundener faktor, durch scm erkannt, seine praeparation und sein verwendungsverfahren. - Google Patents
Allgemeiner krebsverbundener faktor, durch scm erkannt, seine praeparation und sein verwendungsverfahren.Info
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Description
- Zahlreiche Krankheiten von Menschen und Tieren sind am Vorhandensein von der Krankheit oder dem Zustand spezifisch zugeordneter Fremdstoffe, insbesondere im Blut, erkennbar. Tests auf Antigene oder andere derart infolge derartiger Krankheiten erzeugter Stoffe sind mit gutem Erfolg bei der Diagnose zum Früherkennen der speziellen Krankheit verwendbar, die das Antigen oder den anderen Stoff erzeugt hat. Verfahren zum Erkennen derartiger Stoffe müssen zuverlässig reproduzierbar und empfindlich sein, damit sie in der Gesundheitsvorsorge zur Diagnosepraxis verwendbar sind. Ferner soll jedes derartige Verfahren schnell und mit geringem Aufwand von Personen mit durchschnittlichem Geschick und durchschnittlicher Ausbildung in Laborarbeiten durchführbar sein.
- Bei der Behandlung von verschiedenen, allgemein als Krebs bezeichneten, bösartigen Erkrankungen bei Menschen und Tieren hat man beispielsweise erkannt, daß die Früherkennung der Schlüssel zu einer wirksamen Behandlung ist, insbesondere weil die meisten Therapiemaßnahmen wirksamer und gefahrloser angewendet werden können, wenn sich der Krebs noch in einem relativ frühen Stadium befindet als in späteren Stadien. Beispielsweise sind zahlreiche Chemotherapeutika, die für maligne Zellen toxisch sind, auch für normale Zellen toxisch, und die zum Heilen oder Hemmen von Krebs im fortgeschritteneren Zustand erforderlichen, höheren Dosierungen können auch unangenehme und schwerwiegende Nebenwirkungen haben. Ferner ist auch die Operation meistens nur wirksam, wenn die Krankheit sich noch nicht ausgebreitet oder metastasiert hat. Aber viel zu viele Fälle von Krebs werden für eine wirksame Behandlung zu spät entdeckt.
- Daher besteht nach wie vor ein starkes Bedürfnis nach zuverlässigen Tests für die Früherkennung von Krebs, und zu diesem Ziel sind beträchtliche Forschungsarbeiten durchgeführt worden. Daher sind derzeit neue Tests und neue Verfahren für die Früherkennung von Krebs in der Entwicklung.
- Ein wichtiges Kriterium für einen derartigen Test ist seine Eignung zur Anzeige entweder aller Krebsarten im allgemeinen oder zur Anzeige von spezifischen Krebsarten, je nach den verwendeten Stoffen. Die erstgenannte Anwendung eines solchen Tests ist für Reihenuntersuchungen von großen Patientenpopulationen sehr wichtig, beispielsweise bei Routineuntersuchungen. Bei derartigen Reihenuntersuchungen wäre ein auf eine bestimmte Krebsart ansprechender Test nicht zweckmäßig, weil es buchstäblich Hunderte oder sogar Tausende von Krebsarten gibt und weil bei einem Test, mit dem nur eine Art oder wenige Arten der Krankheit aufgezeigt werden können, mit zu hoher Wahrscheinlichkeit zahlreiche Krebsarten nicht erkannt werden würden. Im allgemeinen haben diese Patienten entweder keine Symptome oder nur schwache, allgemeine Symptome, die mit einer bestimmten Art der Krankheit in Verbindung gebracht werden könnten, so daß kein Anlaß besteht, eine bestimmte Art der Krankheit zu vermuten und einen für diese Art der Krankheit spezifischen Test durchzuführen.
- Wenn dagegen das Vorhandensein einer bösartigen Erkrankung erkannt worden ist oder stark vermutet wird, ist ein Test erwünscht, mit dem die bestimmte Art der bösartigen Erkrankung bestimmt werden kann. Ein derartiger Test würde die Wirksamkeit der Behandlung stark erhöhen, weil zahlreiche der wirksamsten Krebstherapien, beispielsweise mit Chemotherapeutika, nur gegen eine Krebsart oder bestenfalls einen schmalen Bereich von Krebsarten wirksam sind und eine falsche Chemotherapie mehr schaden als nützen kann.
- Im Bemühen, dieses Bedürfnis zu befriedigen und die Diagnose und Früherkennung von Krebs im Körper von Menschen und Tieren zu verbessern, ist ein Testverfahren entwickelt worden, in dem Veränderungen der Strukturiertheit der Zytoplasmamatrix (SCM) von lebenden Lymphozyten gemessen werden, die der Einwirkung von Phytohämagglutinin oder von dem Krebs zugeordneten Antigenen ausgesetzt werden. Dieses Verfahren ist von L. Cercek, B. Cercek und C.I.V. Franklin in "Biophysical Differentiation Between Lymphocytes from Healthy Donors, Patients with Malignant Diseases and Other Disorders", Brit. J. Cancer 29, 345-352 (1974), und von L. Cercek und B. Cercek in "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: A Review". Europ. J. Cancer 13, 903-915 (1977) beschrieben worden.
- In diesem Verfahren wird eine Unterpopulation von Lymphozyten mit veränderbarer SCM von einer Blutprobe des zu testenden Patienten abgetrennt und werden die Lymphozyten mit malignem Gewebe oder Extrakten von malignem Gewebe inkubiert. Wenn der Spender der Blutprobe an einer bösartigen Erkrankung leidet, zeigt die SCM eine charakteristische Veränderung, die von der Veränderung der SCM von Lymphozyten von nicht bösartig erkrankten Spendern unterschieden werden kann. Die Veränderung der SCM wird durch Messen der Veränderungen der Polarisation der Fluoreszenz des intrazellulären Fluoreszeins der Lymphozyten mit veränderbarer SCM bestimmt.
- Man nimmt an, daß die in der SCM-Prüfung erkannten Veränderungen auf Veränderungen zurückzuführen sind, die in der Innenstruktur der Lymphozyten auftreten, wenn diese für die Synthese aktiviert wird. Diese Veränderungen bewirken eine Abnahme der Fluoreszenzpolarisation der Zellen, wenn das in den Zellen vorhandene Fluoreszein mit polarisiertem Licht erregt wird. Die Fluoreszenzpolarisation ist ein Maß der intrazellulären Starrheit; je größer die intrazelluläre Mobilität, desto niedriger ist die gemessene Fluoreszenzpolarisation. Man nimmt an, daß eine beobachtete Abnahme der Fluoreszenzpolarisation vor allem auf Veränderungen der Form der Mitochondrien, der energieerzeugenden Organellen der Zelle, zurückzuführen ist. Ferner wird angenommen, daß die Veränderungen der Mitochondrien auf die Kontraktionen der Cristen oder Innenfalten der Mitochondrienmembran zurückzuführen ist. Die SCM spricht auf die Wechselwirkungskräfte zwischen Makromolekülen und kleinen Molekülen, z.B. Wassermolekülen, Ionen, Adenosintriphosphat und zyklischem Adenosinphosphat, an. Störungen dieser Wechselwirkungen führen zu Veränderungen der SCM.
- Im SCM-Test kann eine Ansprache schon auf eine relativ kleine Menge von malignen Zellen erhalten werden. Bei einer Person mit einem Gewicht von 70 kg genügen im SCM-Test schon etwa 10&sup9; Zellen zur Ausbildung eines für eine bösartige Erkrankung charakteristischen Musters. Wenn in Mäuse nur 7,5 x 10&sup5; Tumorzellen von Ehrlich ascutes implantiert werden, führt der SCM-Test zu einer andersartigen Veränderung, und zwar im Sinne einer Ansprache auf krebsspezifische Antigene, während die normale Ansprache auf Phytohämagglutinin praktisch beseitigt wird (L. Cercek in "Changes in SCM Responses of Lymphocytes in Mice After Implantation with Ehrlich Ascites Cells", Europ. J. Cancer 17, 167-172 (1981)).
- Häufig kann durch den SCM-Test Krebs viel früher erkannt werden als es nach üblichen Verfahren möglich ist, und dabei wird der Patient durch das Nehmen einer Blutprobe kaum belästigt.
- Das genannte Verfahren hat jedoch auch Nachteile. Beispielsweise müssen dazu Rohextrakte aus Tumorgewebe und dergl. hergestellt oder muß das Tumorgewebe selbst als Quelle von bei Krebs vorkommenden Antigenen verwendet werden. Bei der Verwendung von malignem Gewebe oder Extrakten von derartigem Gewebe im SCM-Test treten verschiedene schwerwiegende Probleme auf. Manchmal ist es schwierig, die erforderliche Gewebemenge zu erhalten. Ferner können durch die Verwendung von ganzem Gewebe oder von rohen Gewebeextrakten Störstoffe in das Testverfahren eingeführt werden, die die Empfindlichkeit des Tests oder die Testergebnisse selbst beeinträchtigen können. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein dieser Störstoffe kann von einer Probe malignen Gewebes zur anderen unterschiedlich sein, so daß in den SCM-Test eine unerwünschte Variabilität eingeführt wird. Ferner ist es sehr schwierig, die Störstoffe zu identifizieren oder quantifizieren, weil sie in dem ganzen Gewebe oder in den Rohextrakten vorhanden sind.
- Daher ist es sehr erwünscht, den oder die die Lymphozyten mit veränderbarer SCM zu einer Ansprache veranlassenden Faktor bzw. Faktoren zu identifizieren, abzutrennen und zu reinigen. Durch die Verwendung eines derartigen gereinigten Faktors oder derart gereinigter Faktoren kann die Durchführung des SCM-Tests zur Krebserkennung in Reihenuntersuchungen verbessert werden, weil dann keine Störstoffe vorhanden sind, und kann die Erforschung des Krebses, seiner Ursachen und seiner Wirkungen im Körper von Menschen und Tieren erleichtert werden.
- Wir haben in tierischen und menschlichen Körperflüssigkeiten, insbesondere im Blutplasma und im Harn, bei Krebs vorkommende Faktoren (Krebserkennungsfaktoren) entdeckt, die, wenn sie von einem krebskranken Spenderkörper stammen, bei Lymphozyten mit veränderbarer SCM im SCM-Test dieselbe Ansprache hervorrufen wie auf dem Krebs zugeordnete Extrakte und/oder Tumorgewebe. In der vorliegenden Beschreibung werden die Faktoren in der Einzahl angegeben und als "allgemein bei Krebs vorkommender, an der SCM nachweisbarer Faktor" oder als "an der SCM erkennbarer Faktor" oder einfach als "SCM-Faktor" bezeichnet.
- Es wird angenommen, daß der SCM-Faktor ein Peptid oder eine peptidartige Substanz ist und wenigstens teilweise aus mehreren nahverwandten Peptiden besteht. Dabei wird angenommen, daß der SCM-Faktor ein aus dreizehn Aminosäuren bestehendes Fragment mit der Sequenz Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7; enthält, wobei R&sub1; aus Asn und Gln ausgewählt ist, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander jeweils aus Val, Leu und Ile ausgewählt sind, R&sub5; aus Asp und Glu ausgewählt ist und R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander jeweils aus Asn und Gln ausgewählt sind. In dieser Sequenz ist die endständige Aminogruppe des SCM-Faktors nicht enthalten.
- Der allgemein bei Krebs vorkommende, an der SCM erkennbare Faktor besteht im wesentlichen aus einem Peptid von niedrigem Molekulargewicht, das durch Filter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße hindurchtritt und von Filtern mit einer einem Molekulargewicht von 500 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße zurückgehalten wird und das bei von krebskranken Spendern stammenden Lymphozyten mit veränderbarer SCM den Polarisationswert der intrazellulären Fluoreszenz um mindestens zehn Prozent herabsetzt, wenn es im SCM-Test zur Provokation der Lymphozyten verwendet wird. Der nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren gereinigte Faktor hat annähernd folgende Aminosäurenzusammensetzung:
- (Asx&sub2;, Glx, Ser, His, Gly&sub5;, Thr, Arg, Ala&sub3;, Tyr, Met, Val&sub3;, Phe&sub3;, Ile, Leu&sub3;, Lys&sub2;)
- Die Bestimmung der Aminosäurensequenzen von Trypsinaufschlußfragmenten des SCM-Faktors zeigt, daß in einer Zubereitung des Faktors ein aus sechzehn Aminosäuren bestehendes Segment des Faktors die Aminosäurensequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys hat, die die endständige Aminogruppe des Faktors nicht enthält.
- In einer anderen Zubereitung des Faktors hat ein aus fünfzehn Aminosäuren bestehendes Segment die Aminosäurensequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys und enthält dieses Segment ebenfalls nicht die endständige Aminogruppe des Faktors.
- Diese beiden Trypsinaufschlußfragmente sind beide im SCM-Test voll aktiv. Es wird angenommen, daß die ersten dreizehn Aminosäuren, die beiden Fragmenten gemeinsam sind, für die SCM-wirksame Aktivität am wichtigsten sind. Daher ist ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ein SCM-Faktor, der nur Peptide mit einer definierten Sequenz besitzt, deren SCM-wirksame Aktivität entweder nachgewiesen worden ist oder angenommen wird. Ganz allgemein enthält ein derartiger Faktor nur Peptide, die mindestens dreizehn Aminosäurereste besitzen, zu denen die Sequenz Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7; gehört, wobei R&sub1; aus Asn und Gln ausgewählt ist, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander jeweils aus Val, Leu und Ile ausgewählt sind, R&sub5; aus Asp und Glu ausgewählt ist und R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander jeweils aus Asn und Gln ausgewählt sind. Dieser Faktor enthält vorzugsweise im wesentlichen nur ein Peptid.
- Ein genauer definierter Faktor dieser Klasse enthält im wesentlichen nur Peptide mit der Sequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys. Diese Peptide können ferner an beiden Enden der angegebenen Sequenz flankierende Sequenzen enthalten. Dieser Faktor enthält vorzugsweise im wesentlichen nur ein Peptid.
- Der am genauesten definierte Faktor dieser Klasse enthält ein im wesentlichen reines Peptid, das im wesentlichen aus der Aminosäurensequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu- Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys besteht.
- Die zweite Klasse besteht ganz allgemein im wesentlichen nur aus Peptiden mit mindestens sechzehn Aminosäureresten, die die Sequenz Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-Phe-R&sub8;-Lys enthalten, in der R&sub1; bis R&sub7; die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben und R&sub8; aus der aus Ser und Thr bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Dieser Faktor enthält vorzugsweise im wesentlichen nur ein Peptid.
- Ein genauer definierter Faktor dieser Klasse enthält im wesentlichen nur Peptide mit der Sequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Thr-Lys. Diese Peptide können ferner an beiden Enden der angegebenen Sequenz flankierende Sequenzen enthalten. Dieser Faktor enthält vorzugsweise im wesentlichen nur ein Peptid.
- Der am genauesten definierte Faktor dieser Klasse enthält ein im wesentlichen reines Peptid, das im wesentlichen aus der Aminosäurensequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu- Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Thr-Lys besteht. Im SCM-Test hat dieses Peptid vorzugsweise eine solche Aktivität, daß 5 x 10&supmin;² Femtogramm des Peptids den Polarisationswert um mindestens 30% herabsetzen, wenn es zur Provokation von Lymphozyten mit veränderbarer SCM verwendet wird, die von krebskranken Spendern stammen.
- Zum Gewinnen des SCM-Faktors kann man durch Ultrafiltration einer Körperflüssigkeit eines krebskranken Spenders eine erste Fraktion der Körperflüssigkeit mit Molekülen, die ein scheinbares Molekulargewicht über 1000 Dalton haben, von einer zweiten Fraktion mit Molekülen trennen, die ein scheinbares Molekulargewicht unter 1000 Dalton haben. Die Körperflüssigkeit wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus peripherem Blut, Harn und Plasma besteht. Nach der Ultrafiltration wird der Faktor vorzugsweise in mehreren Stufen nachgereinigt, wobei in jeder Stufe ein stärker gereinigter Faktor erhalten wird.
- In der ersten Stufe dieses Reinigungsverfahrens wird von einer Gelfiltriersäule eluiert, die einen Fraktionierbereich von 0 bis 700 Dalton hat und geeignet ist, die Salze von dem Ultrafiltrat abzutrennen, wobei der Faktor ungefähr bei einem Elutionsvolumen vom etwa 0,3-fachen und bis zum etwa 0,5- fachen des Gesamtvolumens des für die Chromatographie verwendeten Bettes eluiert wird.
- In der zweiten Stufe wird von einer Gelfiltriersäule eluiert, die einen Fraktionierbereich von etwa 1500 Dalton bis etwa 30 000 Dalton hat. Dabei wird der Faktor bei einem Elutionsvolumen vom etwa 0,4-fachen bis zum etwa 0,6-fachen des Gesamtvolumens des für die Chromatographie verwendeten Bettes eluiert.
- In der nächsten Stufe dieses Reinigungsverfahrens wird von einer Anionenaustauschsäule aus Diethylaminoethylcellulose von etwa 0,28 M bis etwa 0,31 M Ammoniumbicarbonat eluiert.
- In der letzten Stufe wird der Faktor durch Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr im wesentlichen zur Erzielung eines homogenen Zustandes gereinigt.
- Vorzugsweise werden im SCM-Test die stärker gereinigten Zubereitungen des Faktors verwendet. Man kann in dem Test jedoch den in jeder Stufe des Reinigungsvorganges, einschließlich des zunächst erhaltenen Ultrafiltrats, erhaltenen Faktor verwenden.
- Bei Lymphozyten mit veränderbarem SCM, die von Spendern mit verschiedenen Arten von bösartigen Erkrankungen stammen, bewirkt der SCM-Faktor eine positive Ansprache, und zwar unabhängig von der Art des Krebses des Spenders, von dem der SCM-Faktor gewonnen wurde; daher wird der Ausdruck "allgemein" verwendet. Bei Lymphozyten von nicht bösartig erkrankten Spendern bewirkt der Faktor nur eine geringe oder gar keine Veränderung der SCM. Infolge seiner Fähigkeit, als ein allgemein bei Krebs vorkommendes Antigen zu wirken, kann der Faktor für allgemeine Reihenuntersuchungen von Blutproben auf das Vorhandensein von bösartigen Erkrankungen verwendet werden.
- Der Faktor hat noch andere interessante Eigenschaften. Eine dieser Eigenschaften ist seine Fähigkeit, in Berührung mit Lymphozyten mit veränderbarer SCM, die von nicht bösartig erkrankten Spendern stammen, die SCM-Reaktion zu verändern, wobei die Lymphozyten im SCM-Test nach der Berührung auf bei Krebs vorkommende Antigene, aber nicht auf Mitogene ansprechen. Eine zweite Eigenschaft ist die Fähigkeit, bei Lymphozyten mit veränderbarer SCM deren spontane Toxizität in vitro für die Humanmyeloidzellenlinie K 562 bei Messung durch die Freisetzung von &sup5;¹Cr um mindestens 90% herabzusetzen.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zum Verwenden des allgemein bei Krebs vorkommenden SCM-Faktors im SCM-Test. Allgemein werden in diesem Verfahren von einem Säugetier als Spender stammende Lymphozyten auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von bösartigen Erkrankungen dadurch getestet, daß (1) die Lymphozyten mit einem allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor in Berührung gebracht werden und (2) die auf die Berührung der Suspension der Lymphozyten mit dem Faktor zurückzuführende Herabsetzung der Strukturiertheit der Zytoplasmamatrix der Lymphozyten bestimmt wird.
- Ein zum Quantifizieren der Herabsetzung der Strukturiertheit bevorzugtes Verfahren umfaßt folgende Schritte: (1) für ein mit dem allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor in Berührung gebrachtes Aliquot der Lymphozyten wird die Fluoreszenzpolarisation PS gemessen; (2) für ein nicht mit dem Faktor in Berührung gebrachtes Kontrollaliquot der Lymphozyten wird die Fluoreszenzpolarisation PC gemessen; und (3) das Verhältnis von PS zu PC wird bestimmt. Ein Verhältnis von PS zu PC unter etwa 0,9 zeigt eine positive Ansprache auf den SCM-Faktor und das Vorhandensein einer bösartigen Erkrankung beim Spender der Lymphozyten an.
- In einem bevorzugteren Verfahren wird PS mit der Fluoreszenzpolarisation PM eines anderen, mit einem Mitogen in Berührung gebrachten Aliquots der Lymphozyten verglichen und wird das SCM-Veränderungsverhältnis RRSCM bestimmt. Dabei ist
- RRSCM = PS/PM.
- Ein RRSCM unter etwa 0,9 zeigt das Vorhandensein einer bösartigen Erkrankung beim Spender der Lymphozyten an. Man kann den SCM-Faktor im SCM-Test auch in einem Verfahren verwenden, das folgende Schritte umfaßt (1) von der Blutprobe werden Lymphozyten mit veränderbarer SCM abgetrennt; (2) zum Anregen der abgetrennten Lymphozyten werden diese mit einem allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor in Berührung gebracht; (3) die angeregten Lymphozyten werden mit einer Vorstufe eines Fluorogens in Berührung gebracht, das als eine nichtfluorogene Verbindung definiert ist, die intrazellulär zu einer fluorogenen Verbindung hydrolysierbar ist und die in die Lymphozyten eindringt und infolge einer intrazellulären enzymatischen Hydrolyse die fluorogene Verbindung bildet, so daß angeregte fluorhaltige Lymphozyten erzeugt werden; (4) die angeregten fluorhaltigen Lymphozyten werden mit polarisiertem Licht erregt und dadurch zur Fluoreszenz veranlaßt; (5) zur Bestimmung eines Polarisationswertes der fluoreszierenden Lymphozyten werden die vertikal und die horizontal polarisierte Fluoreszenz gemessen, die von den fluoreszierenden Lymphozyten emittiert werden, und (6) zur Feststellung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von Krebs im Körper der Lymphozyten wird der so bestimmte Polarisationswert für die angeregten fluorhaltigen Lymphozyten mit dem Polarisationswert für ein Kontrollaliquot von von demselben Spender stammenden Lymphozyten verglichen. Dabei können die Schritte (3) und (4) gleichzeitig durchgeführt werden.
- Die Lymphozyten können mit vertikal polarisiertem Licht erregt werden. Bei Verwendung von vertikal polarisiertem Licht werden die Polarisationswerte in einem Fluoreszenz- Spektralphotometer nach der Beziehung bestimmt, in der IV und IH die Intensitäten der polarisierten Fluoreszenz in der vertikalen bzw. horizontalen Ebene sind und G ein Korrekturfaktor zum Ausgleich des ungleichen Durchtritts der horizontalen und vertikalen Komponente des polarisierten Lichts durch die Optik des Spektralphotometers ist.
- Die Erfindung schafft nicht nur eine Diagnosetechnik zum Identifizieren von krebskranken Objekten, sondern umfaßt auch Verfahren zum Behandeln derartiger Objekte. Diese Verfahren beruhen auf der Beobachtung, daß der allgemein bei Krebs vorkommende, an der SCM nachweisbare Faktor die Eigenschaft hat, die spontane Toxizität von Lymphozyten in vitro für maligne Zellen herabzusetzen. Angesichts dieser Feststellung dürfte die Herabsetzung der Aktivität des an der SCM nachweisbaren Faktors in vivo den Wirkungsgrad der immunologischen Überwachung von malignen Zellen durch Lymphozyten erhöhen.
- Diese Behandlung ist allgemein bei einem Patienten anwendbar, der in mindestens einer seiner Körperflüssigkeiten einen allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor enthält. Bei der Behandlung wird (1) in einer den an der SCM nachweisbaren Faktor enthaltenden Körperflüssigkeit durch selektives Inaktivieren desselben die Wirkung des Faktors in vivo vermindert und (2) zum Erhöhen der Resistenz des Patienten gegen den Krebs die Körperflüssigkeit wieder in den Patienten eingeführt.
- In einer Anwendungsform dieses allgemeinen Verfahrens ist die Körperflüssigkeit peripheres Blut und wird zum Behandeln der Körperflüssigkeit das periphere Blut derart dialysiert, daß Peptide mit einem scheinbaren Molekulargewicht unter 1000 Dalton entfernt werden, so daß der an der SCM nachweisbare Faktor von dem Blut abgetrennt und dadurch selektiv inaktiviert wird.
- In anderen Anwendungsformen dieses allgemeinen Verfahrens kann zum Behandeln der Körperflüssigkeit der an der SCM nachweisbare Faktor in der Körperflüssigkeit mit einem für den Faktor spezifischen Antikörper oder mit Fab-Fragmenten eines derartigen Antikörpers neutralisiert werden, wobei die Fab-Fragmente zum Herstellen einer einwertigen Bindung mit dem an der SCM nachweisbaren Faktor befähigt sind.
- Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zum Abbilden von Krebszellen. In diesem Verfahren wird (1) ein Antikörper gegen den allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor mit einer abbildbaren Substanz markiert und (2) der markierte Antikörper zum Abbilden von Krebszellen verwendet.
- Die Erfindung umfaßt ferner zum Hinführen einer Krebsbekämpfungssubstanz zu Krebszellen ein Verfahren in dem (1) ein Antikörper gegen den allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor mit der Krebsbekämpfungssubstanz markiert wird, die infolgedessen zu den Krebszellen hingeführt wird; und (2) der markierte Antikörper einem Krebspatienten appliziert wird, so daß sich der markierte Antikörper an die Krebszellen des Patienten anlagern kann.
- Die Erfindung betrifft ferner zum Bestimmen des Spiegels des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktors in einer Körperflüssigkeit ein Verfahren, in dem in einem Immunoassay ein Antikörper gegen den allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor verwendet wird. Dabei kann das Immunoassay ein Radioimmunoassay, ein Fluoreszenzimmunoassay, ein Immunoassay mit einem mit Enzymen verbundenen Immunosorbens oder ein Ausfäll- Immunoassay, z.B. ein nephelometrisches oder turbidimetrisches Assay, sein.
- Diese und andere Merkmale, Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der beigefügten Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen näher erläutert.
- Nachstehend werden zum Erleichtern des Verständnisses Begriffsbestimmungen für eine Anzahl von Ausdrücken zusammengefaßt, die in der nachstehenden Erörterung, den Ausführungsbeispielen und den beigefügten Patentansprüchen wiederholt verwendet werden.
- Nichtspezifisch für die jeweilige Art des Krebses, von dem der Spender der den gereinigten SCM-Faktor gemäß der Erfindung enthaltenden Körperflüssigkeit, oder der Spender der in dem SCM-Test mit diesem Faktor verwendeten Lymphozyten befallen ist.
- Nichtfluorogene Verbindung, die von Lymphozyten aufnehmbar und darin intrazellulär durch Hydrolyse in eine fluorogene Verbindung umwandelbar ist, die in dem hier beschriebenen Beispiel das Fluoresceindiacetat (FDA) ist.
- Ein SCM-Test, in dem 1,0 ml einer Lymphozytensuspension mit 6 x 10&sup6; Zellen/ml und 0,1 ml des Mitogens oder Antigens verwendet werden, ferner FDA als fluorogenes Mittel und zum Messen der Fluoreszenzpolarisation eine Erregungswellenlänge von 470 nm und eine Emissionswellenlänge von 510 nm.
- Diese beiden Ausdrücke betreffen die Tatsache, daß in dem Molekulargrößenbereich des SCM-Faktors die Größentrennung von Molekülen durch Ultrafiltration nicht vollkommen genau sein kann und nicht nur von der Größe, sondern auch von der Form abhängt. Infolgedessen bewirkt ein Ultrafilter mit einer einem Molekulargewicht von x Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße eine Trennung von Molekülen mit einem scheinbaren Molekulargewicht unter x Dalton von Molekülen mit einem scheinbaren Molekulargewicht über x Dalton.
- Eine Substanz, die zum Ändern der SCM befähigt und so rein ist, daß bei weitem der größte Teil von anderen Molekülen mit einer spezifischen biologischen Wirksamkeit, einschließlich aller Proteine und größerer Peptide, in der Substanz nicht enthalten ist.
- Ein Peptid, das von einem größeren Peptid durch das proteolytische Trypsin abgespalten worden ist, das Peptidketten nach Lysin- oder Argininresten abbricht.
- Die Erfindung betrifft unsere Entdeckung eines Peptids, das ein allgemein bei Krebs vorkommender, an der SCM nachweisbarer Faktor ist, und seine Reinigung zum Erzielen eines im wesentlichen homogenen Zustandes. Der Faktor tritt durch Filter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße hindurch und wird von Filtern mit einer einem Molekulargewicht von 500 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße zurückgehalten. Der Faktor hat ungefähr die Aminosäurenzusammensetzung (Asx&sub2;, Glx&sub3;, Ser, His, Gly&sub5;, Thr, Arg, Ala, Tyr, Met, Val&sub3;, Phe&sub3;, Ile, Leu&sub3;, Lys&sub2;). Von verschiedenen Zubereitungen des Faktors sind zwei aktive Trypsinaufschlußfragmente isoliert worden, die die endständigen Aminogruppen des ursprünglichen Faktors nicht enthalten. Das erste dieser Fragmente besitzt fünfzehn Aminosäuren mit der Folge Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys. Das zweite dieser Fragmente besitzt sechzehn Aminosäuren mit der Folge Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val- Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys.
- Nachstehend werden Eigenschaften des Faktors beschrieben, zu denen die Fähigkeit des Faktors gehört, die Ansprache der SCM von Lymphozyten von nicht bösartig erkrankten Spendern zu modifizieren und die Zytotoxizität derartiger Lymphozyten in vitro für maligne Zellen zu vermindern, ferner das Kreuzreaktionsvermögen des von an zahlreichen verschiedenen Krebsarten erkrankten Spendern isolierten Faktors. Es wird ein Verfahren zum Reinigen dieses Faktors zum Erzielen eines im wesentlichen homogenen Zustandes beschrieben. Ferner werden Verfahren für die Verwendung dieses Faktors im SCM-Test beschrieben. Außerdem werden für die Behandlung von Krebspatienten Verfahren beschrieben, in denen die Aktivität des Faktors in vivo vermindert wird, sowie ein Verfahren zum Abbilden von Krebszellen unter Verwendung eines Antikörpers gegen den Faktor und ein Verfahren zum Hinführen von Krebsbekämpfungssubstanzen zu Krebszellen, wobei ein Antikörper gegen den Faktor mit den Krebsbekämpfungssubstanzen markiert wird.
- Es wurde die Aminosäurenzusammensetzung des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktors bestimmt, der aus dem Plasma von brustkrebskranken Patientinnen gewonnen und gereinigt worden war. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Lyophilisierte Proben des durch RP-HPLC (Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr) gereinigten Faktors wurden in dicht verschlossenen Glasampullen 24 Stunden bei 110ºC mit 2% Thioglykolsäure in 6 N HCL unter Stickstoff gereinigt. Nach der Hydrolyse wurden die Proben lyophilisiert. Die Rückstände wurden mit 2% Natriumdodecylsulfat in einer 0,04 M Natriumborat enthaltenden Pufferlösung gelöst. Die Aminosäuren wurden auf Grund ihrer Fluoreszenz als -Phthaldialdehydderivate bestimmt, nachdem sie durch HPLC (Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie) abgetrennt worden waren, wie es in dem Artikel von B.N. Jones, S. Paabo und S. Stein "Amino Acid Analysis and Enzymatic Sequence Determination of Peptides by an Improved -Phthaldialdehyde Precolumn Labeling Procedure" in J. Liquid Chromat. 4, 565 (1981) und in dem Handbuch "Amino Acid Analysis by HPLC", Altex Division, Beckman Instruments, Inc., Berkeley, California 94710, beschrieben ist. TABELLE 1 AMINOSÄURENZUSAMMENSETZUNG DES SCM-FAKTORS IN MOLANTEILEN Aminosäure Molanteil
- Die Aminosäurenzusammensetzung wurde bestimmt, nachdem getrocknete Peptide in dicht verschlossenen Glasampullen unter Stickstoff mit 2% Thioglykolsäure in 6 N HCl hydrolysiert worden waren. Nach der Hydrolyse wurden die Proben lyophilisiert und wurde der Rückstand mit 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Pufferlösung von 0,04 M Natriumborat gelöst. Auf Grund ihrer Fluoreszenz wurden die Aminosäuren als -Phthaldialdehydderivate bestimmt, und zwar in dem Verfahren, das in dem Handbuch "Amino Acid Analysis by HPLC", Altex Division, Beckman Instruments, Inc., Berkeley, CA 94710, beschrieben ist. Die Aminosäuren Cys und Pro wurden nicht bestimmt.
- Aus den Angaben in der Tabelle 1 über die Aminosäurenzusammensetzung geht hervor, daß der aktive Faktor ein Peptid ist. Die Daten stimmen am bestem mit einem Peptid überein, das ungefähr die Aminosäurenzusammensetzung (Asx, Glx, Ser, His, Gly, Thr, Arg, Ala, Tyr, Met, Val, Phe, Ile, Leu, Lys) hat.
- Zum Bestimmen der Aminosäurensequenzen von von zwei verschiedenen Zubereitungen des SCM-Faktors isolierten Segmenten wurden Edman-Abbauverfahren automatisch und unter Verwendung eines Proteinsequenzbestimmungsgeräts Applied Biosystems 477A durchgeführt, das mit einem On-line-Aminosäurenanalysiergerät 120A PTH gekoppelt war. Wenn der ganze von Patienten mit verschiedenen Krebsarten, wie Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Bronchialkrebs oder Gebärmutterhalskrebs, isolierte SCM-Faktor dem Edman-Abbau unterworfen wurde, fand keine Reaktion statt und wurde festgestellt, daß die endständige Aminosäure des SCM-Faktors blockiert war. Zum Bestimmen der Sequenz eines Segments der Moleküle mußte daher ein Fragment mit einer Aminosäure mit freier endständiger Aminogruppe erhalten werden. Derartige Fragmente wurden aus getrennten gereinigten Zubereitungen des Faktors durch Aufschluß mit Trypsin und darauffolgende Reinigung der Trypsinaufschlußfragmente durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr erhalten, wie nachstehend unter "Ausführungsbeispiele", genauer erläutert wird. Eines dieser Fragmente wurde aus einer Zubereitung des Faktors aus dem Plasma von Patienten mit Lungenkrebs gewonnen, das andere aus dem Plasma von Patientinnen mit Brustkrebs.
- In jedem Fall wurde ein bestimmtes Fragment, von dem später gezeigt wird, daß es SCM-aktiv ist, mit 30,4 Vol.-% Phase A und 69,6 Vol.-% Phase B in einem Gesamtvolumen von etwa 30 ul verdünnt. Zur Sequenzbestimmung wurden die SCM- aktiven Trypsinaufschlußfragmente direkt auf die Scheibe des Sequenzbestimmungsgeräts aufgetüpfelt und unter Rechnersteuerung einer automatischen Sequenzanalyse in auf einanderfolgenden Zyklen des Edman-Abbaus unterworfen. Danach wurden in dem gekoppelten On-line-PTH-Aminosäurenanalysiergerät die auf diese Weise erzeugten PTH-Aminosäuren identifiziert.
- Das die Sequenz bestimmende Rechnerprogramm des Sequenzbestimmungsgeräts identifizierte eine Sequenz von sechzehn Aminosäuren als die Sequenz des Fragments des SCM-Faktors, der aus dem Plasma von Patienten mit Lungenkrebs isoliert worden war. Diese Sequenz war: Phe-Asn-Lys-Pro-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys. Ferner identifizierte der Rechner eine Sequenz von fünfzehn Aminosäuren in dem Fragment des Faktors, der aus dem Plasma von Patientinnen mit Brustkrebs gewonnen worden war. Die Sequenz war:
- Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys.
- In diesen zwei Trypsinaufschlußfragmenten sind die ersten dreizehn Aminosäuren identisch. Sie haben zwar verschiedene endständige Carboxylgruppen, doch besteht nach dem Einfügen der fehlenden Aminosäure Phe in das kürzere Fragment der einzige Unterschied darin, daß Ser durch Thr ersetzt worden ist; dieser Ersatz ist sehr schonend und dürfte die Funktion des Peptids nicht beeinflussen.
- Der gereinigte SCM-Faktor ist im SCM-Test als Mittel zum Provozieren von Lymphozyten von Patienten voll wirksam, die an verschiedenen Arten von bösartigen Erkrankungen leiden. Man kann diese Wirksamkeit durch ein an einer beliebigen Stelle des Reinigungsvorganges des Faktors durchgeführtes Assay nachweisen. Einzelheiten der Ergebnisse derartiger Assays sind nachstehend unter "Ausführungsbeispiele" angegeben. Die höchste Aktivität besitzt eine Substanz, die in einer letzten Reinigungsstufe einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr unterworfen worden ist. Ein Zehntelmilliliter dieser Fraktion mit einem Proteingehalt von etwa 20 Pikomol Peptid bewirkt eine Herabsetzung der Polarisation der intrazellulären Fluoreszenz um bis zu 44,6%, wenn sie zum Provozieren von Lymphozyten mit veränderbarer SCM verwendet wird, die von Krebspatienten gewonnen wurde, bewirkt dagegen keine Herabsetzung der Polarisation der intrazellulären Fluoreszenz, wenn sie zum Provozieren derselben Unterpopulation von von gesunden Spendern isolierten Lymphozyten verwendet wird.
- Sowohl das durch fünfzehn Aminosäuren enthaltende Peptidfragment, das mit Trypsin von dem SCM-Faktor abgespalten wurde, der aus dem Plasma von Patientinnen mit Brustkrebs isoliert worden war, (das Brustfragment) als auch das sechzehn Aminosäuren enthaltende Peptidfragment, das mit Trypsin von dem SCM-Faktor abgespalten wurde, der aus dem Plasma von Patienten mit Lungenkrebs isoliert worden war, (das Lungenfragment) sind im SCM-Test voll wirksam. Etwa 5 x 10&supmin;² Femtogramm (d.h. 5 x 10&supmin;¹&sup7; g oder etwa 16 000 Moleküle) des Lungenfragments waren bei ihrer Verwendung zum Provozieren von Lymphozyten von krebskranken Spendern voll wirksam. Im SCM-Test reagierte das Lungenfragment mit Lymphozyten von Spendern mit Lungenkrebs und Brustkrebs gleich gut, bewirkt aber keine Ansprache, wenn es zum Provozieren von Lymphozyten von normalen Spendern verwendet wurde. Weitere Einzelheiten werden nachstehend unter "Ausführungsbeispiele" angegeben.
- Da sowohl das Lungenfragment als auch das Brustfragment im SCM-Test voll wirksam sind und ihnen nur die ersten dreizehn Aminosäuren ihrer Sequenz gemeinsam sind, wird angenommen, daß diese gemeinsame Sequenz von dreizehn Aminozellen die für die Wirkung auf die SCM wichtigste Sequenz ist. Daher wird angenommen, daß die SCM durch eine nachstehend als "Kernsequenz" bezeichnete Sequenz aus nur diesen dreizehn Aminosäuren Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn verändert wird.
- Diese Sequenz ist jedoch nicht die einzige aus dreizehn Aminosäuren bestehende Sequenz, von der angenommen wird, daß sie die SCM verändert. In der Protein- und Peptidchemie ist es bekannt, daß in einem Peptid bestimmte Aminosäuren durch andere ersetzt werden können, ohne daß dadurch die Form oder Funktion des Peptids verändert wird, so daß derartige Austauschmaßnahmen als "schonend" bezeichnet werden. Zu derartigen Veränderungen der Aminosäuren in der Kernsequenz gehöre der Ersatz von Val durch Ile oder Leu und umgekehrt, der Ersatz von Glu durch Asp und umgekehrt und der Ersatz von Gln durch Asn und umgekehrt. Daher wird angenommen, daß geänderte Peptidmoleküle mit einer Kernstruktur, in der wenigstens eine oder alle der vorgenannten schonenden Maßnahmen zum Austausch von Aminosäuren vorgenommen worden sind, ebenfalls die SCM verändern und daher als Teil der hier angegebenen Erfindung angesehen werden.
- Sowohl das Lungen- als auch das Brustfragment wird als ein Teil von größeren Molekülen isoliert, die allgemein bei Krebs vorkommen und an der SCM nachweisbar sind. Derartige Fragmente besitzen offenbar ihre Fähigkeit zum Verändern der SCM auch dann, wenn sie in größeren Molekülen enthalten sind. Daher wird angenommen, daß auch ein größeres Peptid, das die aus dreizehn Aminosäuren bestehende Kernsequenz mit oder ohne die vorgenannten schonenden Maßnahmen zum Austausch von Aminosäuren enthält, zum Verändern der SCM geeignet ist.
- Das Vorhandensein dieser beiden Arten von Modifikationen der Kernsequenz führt daher zu einem wichtigen weiteren Gegenstand der Erfindung, und zwar zu einem die SCM verändernden Faktor, der nur Peptide in einer definierten Sequenz enthält, wobei für diese Peptide entweder gezeigt worden ist oder angenommen wird, daß sie die SCM verändern. Allgemein enthält ein derartiger Faktor nur Peptide die mindestens dreizehn Aminosäurereste besitzen, zu denen die Sequenz Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7; gehört, wobei R&sub1; aus Asn und Gln ausgewählt ist, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander jeweils aus Val, Leu und Ile ausgewählt sind, R&sub5; aus Asp und Glu ausgewählt ist und R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander jeweils aus der Gruppe Asn und Gln ausgewählt sind. Dieser Faktor enthält vorzugsweise nur ein derartiges Peptid.
- Die vollständige Ausnutzung der das Lungen- und das Brustfragment betreffenden Sequenzinformation führt zu zwei getrennten, parallelen Klassen von SCM-Faktoren, von denen jeder die Kernsequenz oder eine durch schonende Austauschmaßnahmen von der Kernsequenz abgeleitete Sequenz umfaßt. Auch diese längeren Peptide können schonenden Maßnahmen zum Austausch von Aminosäuren unterworfen werden, und zwar durch den Ersatz von Ser durch Thr und umgekehrt. Die Gleichwertigkeit dieser Aminosäuren ist daran erkennbar, daß das Lungenfragment Ser und das Brustfragment Thr enthalten. Man kann die Positionen dieser Aminosäuren in den jeweiligen Fragmenten dadurch miteinander in Übereinstimmung bringen, daß das Phe in der Position 14 des Lungenfragments entfernt wird.
- Die erste Klasse dieser Faktoren wird von der Sequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys abgeleitet. Diese Klasse enthält allgemein nur Peptide mit mindestens fünfzehn Aminosäureresten in einer Sequenz Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-R&sub8;-Lys. In dieser Sequenz haben R&sub1; bis R&sub7; die vorgenannten Bedeutungen und können sie infolge von Maßnahmen zum Austausch von Aminosäuren in der Kernsequenz vorhanden sein. R&sub8; ist aus der Gruppe Ser und Thr ausgewählt. Dieser Faktor enthält vorzugsweise im wesentlichen nur ein Peptid.
- Ein genauer definierter Faktor dieser ersten Klasse enthält im wesentlichen nur Peptide mit der Sequenz Phe-Asn-Lys- Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Asn-Thr-Lys: Dies ist die ursprüngliche Sequenz des Brustfragments. Diese Peptide können ferner an beiden Enden der angegebenen Sequenz flankierende Sequenzen enthalten, die eine unbestimmte Länge haben können. Dieser Faktor enthält ebenfalls im wesentlichen nur ein Peptid.
- Der am genauesten definierte Faktor dieser ersten Klasse enthält ein im wesentlichen reines Peptid, das im wesentlichen aus der Aminosäurensequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys besteht. Dies ist genau die Sequenz des Brustfragments ohne flankierende Sequenzen.
- Die zweite Klasse dieser Faktoren wird von der Sequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys des Lungenfragments abgeleitet und enthält allgemein im wesentlichen nur Peptide mit mindestens sechzehn Aminosäureresten mit der Sequenz Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-Phe-R&sub8;-Lys. In dieser Sequenz haben R&sub1; bis R&sub7; die vorgenannten Bedeutungen und können sie infolge von Maßnahmen zum Austausch von Aminosäuren der Kernsequenz vorhanden sein. R&sub8; ist aus der Gruppe Ser und Thr ausgewählt. Dieser Faktor enthält vorzugsweise im wesentlichen nur ein Peptid.
- Ein genauer definierter Faktor dieser zweiten Klasse enthält im wesentlichen nur Peptide mit der Sequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys. Dies ist die ursprüngliche Sequenz des Lungenfragments. Diese Peptide können ferner an beiden Enden der angegebenen Sequenz flankierende Segmente besitzen, die eine unbestimmte Länge haben können. Dieser Faktor enthält vorzugsweise im wesentlichen nur ein Peptid.
- Der am genauesten definierte Faktor dieser zweiten Klasse enthält ein im wesentlichen reines Peptid, das im wesentlichen aus der Aminosäurensequenz Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys besteht. Das ist genau die Sequenz des Lungenfragments ohne flankierende Sequenzen.
- Von allen diesen Faktoren wird angenommen, daß sie die SCM verändern, und sie fallen in den Rahmen der Erfindung.
- Der Faktor wird als ein allgemein bei Krebs vorkommender SCM-Faktor bezeichnet, weil von Spendern mit allen Arten von Krebs isolierte Lymphozyten im SCM-Test auf den Faktor ansprechen. Die Art des Krebses, von dem der Spender der Lymphozyten befallen ist, braucht nicht mit der Art des Krebses übereinzustimmen, von dem der Spender der Körperflüssigkeit befallen ist, aus der der gereinigte SCM-Faktor gewonnen worden ist. Nachstehend wird erläutert, daß durch Reinigen der aus den Blutplasmen von Patienten mit neunzehn verschiedenen Arten von Krebs gewonnenen Faktoren jeweils ein Faktor gewonnen worden ist, der bei der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr an derselben Stelle eluiert wurde, was stark darauf hinweist, daß von allen diesen Patienten identische Moleküle oder annähernd identische Moleküle gewonnen wurden. Tatsächlich wurde bei der Bestimmung der Aminosäurensequenzen eines Fragments, das durch tryptische Spaltung der SCM-Faktoren gewonnen wurde, die aus dem Blutplasma von Patienten mit Lungenkrebs bzw. Brustkrebs isoliert worden waren, festgestellt, daß die ersten dreizehn Aminosäuren der Fragmente identisch sind. Der einzige Unterschied zwischen den beiden Sequenzen besteht im Wegfall des in dem Lungenfragment in der Position 14 vorhandenen Phenylalaninrestes und in dem schonenden Austausch des in der nächsten Position vorhandenen Serins durch Threonin. Einzelheiten des Nachweises des Kreuzreaktionsvermögens des SCM- Faktors werden nachstehend unter "Ausführungsbeispiele" mitgeteilt.
- Der allgemein bei Krebs vorkommende SCM-Faktor kann die Ansprache von Lymphozyten mit veränderbarer SCM modifizieren, die von nicht bösartig erkrankten Spendern stammen, wenn diese Lymphozyten mit dem Faktor in Berührung gebracht werden. Vor dieser Berührung sprechen die Lymphozyten im SCM- Test nur auf Mitogene, aber nicht auf dem Krebs zugeordnete Antigene an. Nach längerer Berührung mit dem SCM-Faktor dagegen wird die Veränderung der SCM der Zellen derart modifiziert, daß sie nur auf dem Krebs zugeordnete Antigene, aber nicht mehr auf Mitogene ansprechen. Das bedeutet, daß die Berührung derartiger Lymphozyten mit dem SCM-Faktor im SCM- Test die Ansprache dieser Lymphozyten gegenüber der normalen Ansprache von Lymphozyten von nicht bösartig erkrankten Spendern derart verändert, daß die Ansprache von Lymphozyten erhalten wird, die von krebskranken Spendern stammen. Der Nachweis dieser Modifikation der SCM-Ansprache von Lymphozyten von nicht bösartig erkrankten Spendern wird nachstehend unter "Ausführungsbeispiele" näher erläutert.
- Der SCM-Faktor bewirkt eine starke Herabsetzung der spontanen natürlichen Zytotoxizität von Lymphozyten mit veränderbarer SCM in vitro. Wegen dieser Eigenschaft wird angenommen, daß die Moleküle des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktors bei der Abwehr von Killerlymphozyten durch Krebszellen mitwirken und dadurch das Überleben und das ungehinderte Wachsen von Krebszellen unterstützen. Die große Bedeutung der normalen Funktion des Immunsystems bei der Hemmung des Wachsens von Krebszellen ist daran erkennbar, daß bei Patienten mit Immunsuppression häufig ungewöhnliche Formen von Krebs auftreten. Ein wichtiges Beispiel dafür ist das Auftreten von aggressiven Formen des Kaposi-Sarkoms, das normalerweise ein sich ziemlich langsam ausbreitender Krebs ist, bei Patienten mit dem erworbenen Immunodefizienzsyndrom (AIDS).
- Da durch den allgemein bei Krebs vorkommenden SCM-Faktor die Veränderung der SCM von Lymphozyten von gesunden Spendern modifiziert und die natürliche Zytotoxizität von Killerlymphozyten für Myeloidzellen herabgesetzt wird, ist anzunehmen, daß durch eine geeignete Behandlung einer den an der SCM nachweisbaren Faktor enthaltenden Körperflüssigkeit der Faktor selektiv inaktiviert und dadurch seine Wirkung in vivo herabgesetzt werden und dann durch Wiedereinleiten der Körperflüssigkeit in den Patienten die natürliche Resistenz gegen Krebs herabgesetzt und dadurch das Krebsrisiko vermindert werden kann. Wenn die Körperflüssigkeit aus peripherem Blut besteht, können durch ein Behandeln der Körperflüssigkeit durch eine Dialyse des peripheren Blutes Peptide mit einem scheinbaren Molekulargewicht unter 1000 Dalton entfernt werden. Man kann auch durch das Behandeln der Körperflüssigkeit den Faktor mit einem für ihn spezifischen Antikörper oder mit Fragmenten eines solchen Antikörpers, wie Fab-Fragmenten, neutralisieren. Derartige Fab-Fragmente können einwertige Bindungen eingehen, so daß jedes Molekül des Fragments nur ein Molekül des Faktors bindet. Dies kann in manchen Anwendungsfällen der Verwendung des intakten Antikörpers vorzuziehen sein, weil die Bildung von großen Faktor- Antikörper-Komplexen als unerwünscht angesehen wird. Diese Verwendung des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM zum Erkennen von Krebs nachweisbaren Faktors wird nachstehend ausführlicher beschrieben.
- Bei der Reinigung des SCM-Faktors wird im ersten Schritt ein Ultrafiltrat einer Körperflüssigkeit eines krebskranken Spenders hergestellt. Die Körperflüssigkeit kann peripheres Blut, Blutplasma oder Harn sein. Wenn die Körperflüssigkeit aus peripherem Blut besteht, müssen durch Zentrifugieren des Blutes die roten Blutkörperchen von dem Plasma getrennt werden. Der Spender der Körperflüssigkeit, von der der SCM- Faktor isoliert wird, kann gegenüber den für den SCM-Test verwendeten Lymphozyten autolog oder allogen sein.
- Bei der Ultrafiltration wird eine erste Fraktion der Körperflüssigkeit, die Moleküle mit einem scheinbaren Molekulargewicht über 1000 Dalton enthält, von einer zweiten Fraktion getrennt, die Moleküle mit einem scheinbaren Molekulargewicht unter 1000 Dalton enthält. Der allgemein bei Krebs vorkommende SCM-Faktor gemäß der Erfindung ist in der zweiten Fraktion des Ultrafiltrats enthalten. Die Ausdrücke "scheinbares Molekulargewicht" und "einem Molekulargewicht entsprechende Nenn-Trenngröße" werden hier verwendet,weil in diesem Molekulargewichtsbereich das Ultrafiltrieren ein etwas ungenaues Verfahren zum Trennen von Molekülen nach ihrem Molekulargewicht ist und weil der genaue Wert des Molekulargewichts der Moleküle, die von einem Filter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße etwas von der Form des Moleküls abhängt. Es kann vorkommen, daß Moleküle mit einem Istmolekulargewicht von mehr als 1000 Dalton durch ein Filter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße hindurchtreten, wenn die Moleküle z.B. relativ lang und schmal sind.
- Zum Trennen der zweiten Fraktion von der ersten wird die Körperflüssigkeit vorzugsweise durch ein Ultrafilter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße filtriert.
- Die Reinheit einer Zubereitung eines derartigen Faktors als Ultrafiltrat oder später kann durch ihre spezifische Aktivität angegeben werden. Dabei wird der Ausdruck "spezifische Aktivität" als der Kehrwert der Proteinmenge angegeben, die benötigt wird, um den Polarisationswert der intrazellulären Fluoreszenz um ein bestimmtes Maß, z.B. um 20%, herabzusetzen, wenn eine bestimmte Fraktion im SCM-Test zum Provozieren von Lymphozyten mit veränderbarer SCM verwendet wird. Durch das Reinigen des SCM-Faktors soll dessen spezifische Aktivität gegenüber der des rohen Ultrafiltrats erhöht werden. Daher kann der Fortschritt der Reinigung durch Bestimmen der spezifischen Aktivität der gereinigten Fraktionen verfolgt werden. Da in den hier angegebenen Beispielen die Proteinkonzentration nur ungefähr angegeben wird, und zwar durch die Ultraviolettextinktion, vorzugsweise bei 220 nm, und die Dosis-Wirkungs-Kurve für den Faktor noch nicht bestimmt worden ist, werden nachstehend die verschiedenen Schritte der Reinigung des hier beschriebenen SCM- Faktors durch die spezifische Aktivität nur ungefähr angegeben. Es versteht sich jedoch, daß durch die verschiedenen Schritte zur Reinigung des Faktors die Proteinkonzentration deutlich abnimmt, die Aktivität dagegen relativ unbeeinflußt bleibt, so daß die spezifische Aktivität des SCM- Faktors erhöht wird. Man kann aber trotzdem sagen, daß das Ultrafiltrat im wesentlichen aus dem im wesentlichen reinen, allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor besteht, weil durch die Ultrafiltration durch eine Membran mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße von einer biologischen Flüssigkeit der bei weitem größte Teil der Moleküle mit einer spezifischen biologischen Aktivität, einschließlich aller Proteine und größeren Peptide, entfernt wird.
- Die nächste Stufe der Reinigung des allgemein bei Krebs vorkommenden SCM-Faktors ist ein Entsalzungsschritt, in dem die bei der Ultrafiltration erhaltene zweite Fraktion auf eine Chromatographiesäule aufgegeben wird, die zum Abtrennen der Salze befähigt ist. Das auf die Säule aufgegebene Gut wird dann mit destilliertem Wasser von der Säule eluiert, und es wird der den SCM-Faktor enthaltende Teil gesammelt, der bei einem Elutionsvermögen vom etwa 0,3-fachen bis zum etwa 0,5-fachen des Gesamtvolumens des für die Chromatographie verwendeten Bettes eluiert wird. Die in diesem Schritt verwendete Säule ist vorzugsweise eine Gelfiltriersäule mit einem Fraktionierbereich von 0 bis etwa 700 Dalton, wie Sephadex G-10.
- Die nächste Stufe der Reinigung ist erneut ein Gelfiltrierschritt, in dem wieder eine Größenklassierung durchgeführt wird. Das von dem beim Entsalzungsschritt erhaltene, den SCM-Faktor enthaltende Gut wird auf eine andere Gelfiltriersäule aufgegeben, die einen Fraktionierbereich von etwa 1500 Dalton bis etwa 30 000 Dalton hat, z.B. Sephadex G-50. Das auf die Säule aufgegebene Gut wird dann von ihr mit einer schwachen wässerigen Lösung eines Ammoniumsalzes eluiert. Das Ammoniumsalz ist vorzugsweise Ammoniumbicarbonat, insbesondere 50 mM Ammoniumbicarbonat. Es wird der den SCM-Faktor enthaltende Teil gesammelt, der bei einem Elutionsvolumen vom etwa 0,4-fachen bis zum etwa 0,6-fachen des Gesamtvolumens des für die Chromatographie verwendeten Bettes eluiert wird.
- Die nächste Stufe der Reinigung ist eine Anionenaustauschchromatographie, in der eine Trennung nach der Ladung erfolgt. Das in dem vorhergehenden Gelfiltrierschritt erhaltene, den SCM-Faktor enthaltende Gut wird auf eine Anionenaustauschsäule aufgegeben, die vorzugsweise Diethylaminoethylcellulose (DEAE-Cellulose) enthält. Das auf die Säule aufgegebene Gut wird von ihr bei zunehmender Konzentration eines Ammoniumsalzes eluiert, das vorzugsweise Ammoniumbicarbonat ist und dessen Konzentration von 10 mM auf 1,0 M Ammoniumbicarbonat ansteigt. Es wird von der Säule jene den SCM-Faktor enthaltende Fraktion gesammelt, die bei etwa 0,28 M bis etwa 0,31 M Ammoniumbicarbonat eluiert wird.
- Die letzte Stufe der Reinigung ist eine Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr (RP-HPLC), in der eine Trennung nach der Ladung und/oder der Hydrophobie erfolgt. Das von der DEAE-Cellulose-Säule eluierte, den SCM- Faktor enthaltende Gut wird auf eine RP-HPLC-Säule mit Aquapore RP-300 aufgegeben, die 220 mm x 2,1 mm mißt. Dann wird mit einer Kombination von zwei Lösungsmitteln eluiert, und zwar zunächst mit 90 Vol.-% 0,1-vol.%iger wässeriger Trifluoressigsäure (TFA) und 10 Vol.-% 0,09-vol.%iger TFA in 70%igem wässerigem Acetonitril, wonach die Konzentration der acetonitrilhaltigen Lösung allmählich erhöht wird. Von allen Ausgangssubstanzen wird der SCM-Faktor in einer homogenen Zacke bei einem Lösungsmittelgemisch von 26 Vol.-% 0,1-vol.%iger wässeriger Trifluoressigsäure und 74 Vol.-% 0,09-vol.%iger wässeriger Trifluoressigsäure in 70%igem wässerigem Acetonitril eluiert.
- Man kann die RP-HPLC auch mit einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiesäule mit Phasenumkehr Beckmann Ultrasphere ODS durchführen. Bei dieser Säule wird mit einer etwas anderen Lösungsmittelkombination eluiert, und zwar zunächst mit 70 Vol.-% 0,1-vol.%iger wässeriger Trifluoressigsäure und 30 Vol.-% 0,1-vol.%iger wässeriger Trifluoressigsäure in 70%igem wässerigem Acetonitril, worauf die Konzentration des acetonitrilhaltigen Lösungsmittels allmählich erhöht wird. Bei Verwendung dieser Säule und dieses Lösungsmittelsystems wird der SCM-Faktor stets in einer homogenen Zacke bei einem Lösungsmittelgemisch von 43,7 Vol.-% 0,1-vol.%iger wässeriger Trifluoressigsäure und 56,3 Vol.-% 0,1-vol.%iger wässeriger Trifluoressigsäure in 70%igem wässerigem Acetonitril eluiert.
- Die Aktivität des SCM-Faktors wird durch seine Wirkung auf lebende Lymphozyten mit veränderbarer SCM in dem allgemeinen Testverfahren bestätigt, das in der Vorveröffentlichung von L. Cercek und B. Cercek, "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: A Review", Europ. J. Cancer 13, 903-915 (1977), beschrieben ist. Durch den allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor gemäß der Erfindung wird der Polarisationswert der intrazellulären Fluoreszenz von Lymphozyten mit veränderbaren Lymphozyten von krebskranken Spendern beträchtlich herabgesetzt, wenn der Faktor in dem in dem genannten Artikel beschriebenen SCM-Test zum Provozieren derartiger Lymphozyten verwendet wird. Die Herabsetzung des Polarisationswertes der intrazellulären Fluoreszenz wird beträchtlich, um mindestens 20%, herabgesetzt, wenn zum Provozieren derartiger Lymphozyten das Ultrafiltrat verwendet wird, und um mehr als 50%, wenn die am stärksten gereinigte HPLC- Fraktion verwendet wird.
- Für die einwandfreie Durchführung des hier besprochenen SCM-Tests sind zwei bereits eingeführte Technologien wichtig. Diese Technologien bestehen im Isolieren von Lymphozyten mit veränderbarer SCM und in der Technik zum Messen der Fluoreszenzpolarisationswerte selbst und zu deren Umsetzung in für den SCM-Test aussagekräftigen Zahlen. Diese Technologien werden nachstehend erläutert.
- Das Isolieren von Lymphozyten mit veränderbarer SCM ist in dem vorstehend angeführten Artikel im European Journal of Cancer, der einen Überblick gibt, und in einer älteren, am 10. März 1986 von B. Cercek und L. Cercek unter der Serial No. 838 264 eingereichten Patentanmeldung mit der Bezeichnung "Automated Collection of Buoyant Density Specific Cells from Density Gradients", auf deren Inhalt hier ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben. Das Abtrennen dieser Lymphozyten von der allgemeinen Lymphozytenpopulation ist für die einwandfreie Durchführung des SCM-Tests wichtig, weil nur ein relativ kleiner, etwa 20 bis 25 % ausmachender Teil der Lymphozyten im SCM-Test ansprachefähig ist. In einem mit nichtfraktionierten Lymphozyten durchgeführten Test wird eine viel geringere Herabsetzung des intrazellulären Polarisationswertes selbst dann festgestellt, wenn die im SCM-Test tatsächlich ansprachefähigen Lymphozyten voll angesprochen haben.
- Zum Isolieren von Lymphozyten mit veränderbarer SCM wird eine periphere Blutprobe von einem Spender genommen und in einem heparinisierten Röhrchen gesammelt. Nach dem Sammeln wird das periphere Blut mit Eisen- oder Carbonyleisenpulver behandelt und werden die das Gemisch von Blut und Eisenpulver enthaltenden Röhrchen auf einem Magneten angeordnet, damit die Phagozyten zusammen mit dem Eisenpulver von der Blutprobe abgetrennt werden. Dann wird ein Teil der Blutprobe in eine Ficoll -Triosil -Dichtegradientenlösung eingebracht und zentrifugiert, damit die Lymphozyten mit veränderbarer SCM auf Grund von Dichteunterschieden abgetrennt werden. In diesem Trennverfahren wird eine Dichtegradientenlösung verwendet, die eine Dichte von 1,081 g/cm³ bei 25ºC und eine Osmolalität von 0,320 Osmol/kg hat. Das Zentrifugieren wird 20 min bei 550 g bei einer Temperatur von 25ºC durchgeführt. Zum Entfernen der Lymphozyten mit veränderbarer SCM wird mit einer Pasteur-Pipette die Zellenschicht abgenommen, die sich oberhalb der Dichtegradientensubstanz abgeschieden hat. Dabei muß ein Abnehmen auch von Dichtegradientensubstanz so weit wie möglich vermieden werden, weil diese Substanz verschiedene schwerere Plasma- und Zellenkomponenten enthält, die die Testergebnisse beeinflussen würden. Soweit wie möglich soll auch ein Abnehmen der leichteren Plasmasubstanzen vermieden werden, damit keine Verunreinigungen oder Zellen mit nicht veränderbarer SCM in die Testproben gelangen.
- Nach ihrem Abtrennen werden die Lymphozyten mit veränderbarer SCM verschiedenen Waschschritten unterworfen, und zwar zuerst in einer konservierungsstoffreien 0,9-%igen Natriumchloridlösung und dann in einer vollständigen dulbeccoschen phosphat gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (PBS), und werden sie danach bis zur Verwendung im SCM-Testverfahren auf 37ºC gehalten.
- Das Verfahren zum Messen der Fluoreszenzpolarisationswerte von Lymphozyten mit veränderbarer SCM im SCM-Test ist in dem vorstehend angeführten Artikel im European Journal of Cancer, in dem ein Überblick gegeben wird, und in einer von B. Cercek und L. Cercek am 27. Mai 1986 unter der Serial No. 867 079 eingereichten älteren Patentanmeldung mit der Bezeichnung "Method for Measuring Polarized Fluorescence Emissions", auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben. In diesen Vorveröffentlichungen ist angegeben, daß vorher vom peripheren Blut eines Versuchsobjekts abgetrennte Lymphozyten mit veränderbarer SCM in sterilen Glasröhrchen bei 37ºC inkubiert werden, und zwar mit einer bekannten Konzentration entweder eines Mitogens, wie Phytohämagglutinin, oder eines bei Krebs vorkommenden Antigens, z.B. des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktors, der der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Es sind auch schon andere Mitogene als Phytohämagglutinin (PHA) verwendet worden, beispielweise Konkanavalin A und "pokeweed"-Mitogen, doch wird im SCM-Test PHA bevorzugt. Zum Einleiten dieser Inkubation wird zu 1 ml der Zellensuspension von 6 x 10&sup6; Zellen/ml 0,1 ml des entsprechend verdünnten Mitogens oder Antigens zugesetzt. Dann wird 30 bis 60 min inkubiert.
- Der Suspension der inkubierten Lymphozyten wird dann eine geeignete nichtfluorogene Verbindung beigemischt, die intrazellulär zu einer fluorogenen Verbindung hydrolysierbar ist, nachstehend als Vorstufe eines fluorogenen Mittels bezeichnet wird und beispielsweise aus Fluoreszeindiacetat (FDA) bestehen kann. Das Fluoreszeindiacetat wird bei einer Endkonzentration von 2,5 mM in vollständiger PBS bei pH 7,4 und einer Osmolalität von 0,330 Osmol/kg verwendet und durch Verdünnen einer konzentrierten Stammlösung in Aceton oder Eisessig erhalten. Aliquote von 0,2 ml Suspension mit Kontroll- bzw. angeregten Lymphozyten werden mit einer Spritze langsam in ein Becherglas gespritzt, das 3 ml der FDA-Substratlösung enthält.
- Die Zellen werden der FDA so lange (etwa 5 min) ausgesetzt, daß die FDA-Substratlösung in die Lymphozyten eindringen kann. Im Innern der Zellen werden die Moleküle des nicht fluorogenen Fluoreszeindiacetats durch enzymatische Hydrolyse in Fluoreszeinmoleküle umgesetzt.
- Die fluorhaltigen Lymphozyten sprechen auf polarisiertes Licht isotrop an, weil die auf die Polarisation des Erregungslichts bezogene Polarisation der emittierten Fluoreszenz nicht von der Orientierung des zum Erregen der Lymphozyten verwendeten, linear polarisierten Lichtes abhängt.
- In der hier zum Messen der Fluoreszenzpolarisation verwendeten, üblichen Vorrichtung werden die Lymphozyten jedoch mit vertikal polarisiertem Licht erregt. Daher wird das Meßverfahren anhand der Erregung mit vertikal polarisiertem Licht beschrieben.
- Unter der Einwirkung der Erregungsenergie in Form von vertikal polarisiertem Licht emittieren die Fluoreszeinmoleküle Fluoreszenz. Die Beziehung zwischen der vertikal polarisierten und der horizontal polarisierten Emission wird gemessen. Zu diesem Zweck kann man die Intensitäten der polarisierten Fluoreszenz in der vertikalen und der horizontalen Ebene messen und einen Polarisationswert (P-Wert) nach der Gleichung
- bestimmen, in der IV, und IH die Intensitäten der polarisierten Fluoreszenz in der vertikalen bzw. horizontalen Ebene sind und G ein Korrekturfaktor zum Ausgleich des ungleichen Durchtritts der horizontalen und vertikalen Komponente des polarisierten Lichts durch die Optik des jeweils verwendeten Geräts ist. Zum Bestimmen des Wertes von G wird die Intensität des horizontal polarisierten Lichts durch die Intensität des vertikal polarisierten Lichts dividiert, die von einer Lösung von 10&supmin;&sup7; M Fluoreszein in PBS emittiert werden, wenn diese Lösung mit horizontal polarisiertem Licht der auch für die SCM-Messungen verwendeten Wellenlänge erregt wird. Für die hier berichteten Messungen ist G = 0,42.
- Der P-Wert der angeregten Lymphozyten, d.h. jener Lymphozyten, die dem allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor gemäß der Erfindung ausgesetzt sind, wird mit dem P-Wert einer Kontrollsuspension von nicht angeregten Lymphozyten von demselben Spender verglichen. Die prozentuelle Herabsetzung des P-Wertes der angeregten Lymphozyten gegenüber dem P-Wert der Kontrollymphozyten ist eine Angabe der Ansprache der SCM auf das Krebsantigen.
- Man kann zwar die Ansprache der SCM in einem gewissen Bereich der Erregungs- und Emissionswellenlängen feststellen, wenn FDA als Vorstufe des fluorogenen Mittels verwendet wird. Es ist jedoch unbedingt vozuziehen, eine Erregungswellenlänge von 470 nm und eine Emissionswellenlänge von 510 nm zu verwenden, und alle nachstehend angegebenen Ergebnisse wurden bei diesen Wellenlängen erhalten. Es sind aber gute Ergebnisse auch mit einer Erregungswellenlänge von 442 nm und einer Emissionswellenlänge von 527 nm erhalten worden.
- Das für die SCM-Fluoreszenzmessungen verwendete Spektralphotometer muß eine hohe Empfindlichkeit und Stabilität haben und muß imstande sein, Schwankungen der Intensität des Erregungslichtes auszugleichen, weil die Intensitäten der polarisierten Fluoreszenzemissionen als Funktion der Zeit aufgezeichnet werden und die Volumenkonzentration des Fluoreszeins bei den SCM-Messungen nur eine Größenordnung von 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup9; M hat. Ferner sind Instrumente mit einem Breitbandfilter für die Verwendung bei SCM-Messungen nicht geeignet, weil die Ansprache der SCM nur in einem schmalen Wellenlängenbereich erfaßt werden kann. Die maximale spektrale Spaltbreite des Erregungsmonochromators soll 20 nm und die maximale spektrale Spaltbreite des Emissionsmonochromators 10 nm betragen. Wenn der Erregungsmonochromator auf 470 nm und der Emissionsmonochromator auf 510 nm arbeitet, soll das Spektralphotometer mit einem thermostatgesteuerten Küvettenhalter versehen sein, weil die polarisierten Fluoreszenzemissionen stark temperaturabhängig sind. Außerdem muß das Spektralphotometer mit Mitteln zum Messen sowohl der horizontal als auch der vertikal polarisierten Komponente der Fluoreszenzemission versehen sein.
- In den nachstehend erläuterten Ausführungsbeispielen haben wir ein Spektralphotometer Perlin-Elmer MPF-4 verwendet, das mit einem thermostatgesteuerten Küvettenhalter ausgerüstet war. Alle Messungen wurden bei 27ºC durchgeführt. Die Lichtquelle war eine Xenonlampe.
- Zum Messen der Fluoreszenzpolarisation werden die Intensitäten der zu dem Strahlenbündel des vertikalen Erregungslichtes parallelen bzw. rechtwinkligen Emissionen mit einem automatischen Polarisationswechsler abwechselnd aufgezeichnet, und zwar etwa 6 min lang oder bis die Intensität der zu dem Strahlenbündel des vertikal polarisierten Erregungslichtes rechtwinkligen Emissionen 80 bis 90 % des vollen Skalenausschlages des Aufzeichnungsgeräts erreicht.
- Im Hinblick auf ein mögliches Entweichen von Fluoreszein aus den Zellen und eine Hintergrundfluoreszenz in der Substratlösung müssen die so abgelesenen Werte korrigiert werden. Für diese Korrektur werden die Zellen auf einem in einem geeigneten Filterkopf montierten Nitrocellulosefilter mit einer Porenweite von 0,22 um von der Lösung abfiltriert. Mit derselben Vorrichtung zum Messen der Fluoreszenzpolarisation werden die Intensitäten der Polarisation des zu der Polarisation des Erregungslichts parallelen und zu ihr rechtwinkligen Fluoreszenz bestimmt. Die korrekten Fluoreszenzintensitäten der Zellen werden dann erhalten, indem die von dem Filtrat erhaltenen Werte von den auf die Halbzeit der Filtration extrapolierten Intensitäten der Gesamtfluoreszenz subtrahiert werden. Diese Extrapolation ist notwendig, weil infolge des Entweichens von Fluoreszein aus Zellen und einer spontanen Hydrolyse von FDA die Hintergrundfluoreszenz während der Inkubation zunimmt.
- Man kann die Hintergrundfluoreszenz auch nach dem Verfahren kompensieren, das in der von den Cerceks am 27. Mai 1986 unter der Serial No. 867 079 eingereichten älteren Patentanmeldung mit der Bezeichnung "Method for Measuring Polarized Fluorescence Emissions", auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben ist. Wenn nach diesem Verfahren gearbeitet wird, braucht nicht mehr jede Probe filtriert zu werden, sondern werden die Emissionen der horizontal und vertikal polarisierten Fluoreszenz bei mehr als einer Wellenlänge gemessen und aus diesen Meßwerten die Emissionen der intrazellulären Fluoreszenz berechnet.
- Ein nach dem vorstehend beschriebenen Protokoll durchgeführter SCM-Test mit 1,0 ml einer Lymphozytensuspension von 6 x 10&sup6; Zellen/ml und 0,1 ml des Mitogens bzw. Antigens sowie mit FDA als Vorstufe des fluorogenen Mittels und mit einer Erregungswellenlänge von 470 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm wird nachstehend als "Standard-SCM-Test" bezeichnet.
- Der allgemein bei Krebs vorkommende, an der SCM nachweisbare Faktor, dessen Reinigung hier beschrieben ist, kann im SCM-Test als wirksames Provokationsmittel für das Erkennen von Krebs verwendet werden. Wenn Zellen von nicht krebskranken Spendern im SCM-Test mit Krebsantigenen als Provokationsmitteln angeregt werden, wird die SCM-Ansprache nicht nennenswert verändert. Dagegen erfolgt eine merkliche Veränderung der SCM-Ansprache bei Zellen von krebskranken Spendern. Diese Veränderung ist an einer Herabsetzung des P- Wertes von Zellen von krebskranken Spendern erkennbar, wenn diese Zellen mit bei Krebs vorkommenden Antigenen angeregt werden. Es wurde schon gesagt, daß der SCM-Faktor hinsichtlich der Art des zu erkennenden Krebses unspezifisch ist: die im SCM-Test mit dem SCM-Faktor provozierten Lymphozyten brauchen nicht von einem Spender zu kommen, der an einem Krebs derselben Art leidet wie der Spender der Körperflüssigkeit, von der der SCM-Faktor stammt.
- Bei Verwendung als Provokationsmittel im SCM-Test bewirkt der SCM-Faktor eine Herabsetzung des P-Wertes um mindestens zehn Prozent und kann er den P-Wert um bis zu 44,6% herabsetzen. Wenn mit PS der P-Wert eines Aliquots der provozierten Lymphozyten und mit PC der P-Wert eines Aliquots eines nicht mit dem SCM-Faktor provozierten bezeichnet wird, ist ein Verhältnis von PS zu PC unter etwa 0,9 eine Anzeige einer bösartigen Erkrankung im Körper des Spenders der provozierten Lymphozyten.
- In einem bevorzugten Verfahren zur Verwendung des SCM- Faktors als Provokationsmittel im SCM-Test wird PS mit dem Fluoreszenzpolarisationswert PM eines anderen Aliquots von Lymphozyten verglichen, die mit einem Mitogen in Berührung gebracht worden sind. Man erhält dann ein SCM-Veränderungsverhältnis RRSCM. Dabei ist
- RRSCM = PS/PM
- Ein RRSCM unter etwa 0,9 zeigt das Vorhandensein einer bösartigen Erkrankung beim Spender der Lymphozyten an.
- Es wird angenommen, daß der allgemein bei Krebs vorkommende, an der SCM nachweisbare Faktor bei der Abwehr von Krebszellen gegen den Angriff von Killerlymphozyten in vivo mitwirkt. Infolgedessen können Maßnahmen zum selektiven Herabsetzen der Aktivität des SCM-Faktors in der Krebsbekämpfung nützlich sein, indem sie die Anfälligkeit von Krebszellen für den Angriff von Killerlymphozyten erhöhen. Dabei wird als "Aktivität in vivo" die Fähigkeit des an der SCM nachweisbaren Faktors bezeichnet, die Zytotoxizität von Killerlymphozyten für bösartig erkrankte Zellen herabzusetzen.
- In einem ersten Schritt derartiger Verfahren werden Lymphozyten verwendet, die von einem bekannterweise oder vermutlich krebskranken Spender stammen und bei denen festgestellt worden ist, daß sie in dem SCM-Test auf den allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor positiv ansprechen. Von einem derartigen Patienten wird dann eine Körperflüssigkeitsprobe genommen und durch ein Filter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße filtriert. Die durch das Filter hindurchgetretene Fraktion wird gesammelt und im SCM-Test zum Provozieren von von demselben Patienten stammenden Lymphozyten verwendet, damit nachgewiesen wird, daß die Fraktion den bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor enthält. Dieser Test braucht aber nicht immer durchgeführt zu werden, insbesondere dann nicht, wenn andere klinische Indikatoren für das Vorhandensein von Krebs sprechen.
- Wenn das Vorhandensein des SCM-Faktors in einer Körperflüssigkeit eines Krebspatienten nachgewiesen worden ist oder vermutet wird, kann man durch eine Behandlung der Körperflüssigkeit nach einem von mehreren Verfahren durch selektives Inaktivieren des Faktors dessen Wirkung in vivo herabsetzen und dann die Körperflüssigkeit wieder in den Patienten einbringen, dessen Resistenz gegen die bösartige Erkrankung dadurch erhöht wird. Da der allgemein bei Krebs vorkommende, an der SCM nachweisbare Faktor im SCM-Test zu einer Ansprache führt, kann man unabhängig von der Art des Krebses, an dem der Patient leidet, durch Herabsetzen der Wirksamkeit des SCM-Faktors in vivo die Resistenz des Patienten nicht nur gegen die zunächst diagnostizierte Krebsart, sondern auch gegen andere Arten von bösartigen Erkrankungen erhöhen, die sich später gegebenenfalls entwickeln könnten. Dies kann bei der Behandlung von Patienten mit Medikamenten von Bedeutung sein, die eine immunosuppressive Wirkung haben, oder von Patienten, deren Immunsystem beispielsweise durch AIDS bereits geschwächt worden ist.
- Wenn die Körperflüssigkeit aus peripherem Blut besteht, kann man nach einem Verfahren die Aktivität des SCM-Faktors dadurch herabsetzen, daß zum Entfernen des Faktors das periphere Blut einer Dialyse unterworfen wird, durch die Peptide mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 1000 Dalton oder weniger physikalische entfernt werden, weil der Faktor durch Ultrafilter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße hindurchtritt.
- In einem anderen Verfahren zum Herabsetzen der Aktivität des SCM-Faktors in vivo in einer Körperflüssigkeit wird dieser Faktor neutralisiert oder mit einem für den Faktor spezifischen Antikörper inaktiviert. Der SCM-Faktor kann von einem größeren Trägermolekül, wie Polylysin und gegen das Konjugat erzeugten Antikörpern, kovalent gebunden werden, wobei der SCM-Faktor als Hapten wirkt. Nachdem derartige Antikörper erzeugt worden sind, kann man Antikörper bildende Zellen nach üblichen Verfahren isolieren und durch Fusion von Zellen mit Hybridomen monoklonale Antikörper erzeugen. Nachdem ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper erzeugt worden ist, kann er zum Neutralisieren des SCM-Faktors verwendet werden.
- Der erzeugte Antikörper kann auch mit dem proteolytischen Enzym Papain in einwertige Fab-Fragmente gespalten werden. Zum Unterschied von dem intakten Antikörper, der Bindestellen für zwei getrennte Moleküle des Faktors besitzt, kann jedes durch eine derartige Spaltung erzeugte Fragmentmolekül nur ein Molekül des Faktors binden. Die Verwendung der Fragmente kann der Verwendung des intakten Antikörpers in manchen Fällen vorzuziehen sein, wenn die Bildung großer Faktor-Antikörper-Komplexe nicht erwünscht ist. Das Vorhandensein derartiger großer Antigen-Antikörper-Komplexe im peripheren Blut kann möglicherweise zu einer Serumkrankheit und zu anderen allergischen Reaktionen führen.
- In einem anderen Verfahren zum Verwenden von gegen den SCM-Faktor erzeugten Antikörpern bei der Krebsbekämpfung wird der Antikörper mit einer krebsbekämpfend wirkenden Substanz aktiviert, die dadurch zu dem Ort des Krebses hingeführt wird, so daß die wirksame Konzentration der Krebsbekämpfungssubstanz am Ort des Krebses erhöht wird. Dieses Verfahren kann besonders vorteilhaft sein, wenn die Krebsbekämpfungssubstanz bei höherer Dosierung Nebenwirkungen haben kann.
- Mit Hilfe des Antikörpers gegen den SCM-Faktor kann man auch die Spiegel des SCM-Faktors im peripheren Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten nach Techniken wie Radioiummunoassays, Fluoreszenzimmunoassays oder Assays mit einem mit Enzymen verbundenen Immunosorbens bestimmen oder durch Ausfällassays, wie Nephelometrie oder Turbidimetrie, wobei angenommen wird, daß der SCM-Faktor kein einwertiges Antigen ist. Wenn angenommen wird, daß der SCM-Faktor auf irgendeine Weise Tumorzellen zugeordnet ist, kann man mit abbildungsfähigen Substanzen, wie fluoreszenzfähigen Farbstoffen oder radioaktiven Isotopen, markierte Antikörper auch zum Abbilden von Krebszellen verwenden, so daß Krebszellen in Biopsien erkannt werden können. Ferner kann man einen Antikörper mit einer fluoreszenzfähigen Markierung zum automatischen Erkennen von Krebszellen durch Strömungs-Zytometrie verwenden.
- In den nachstehenden Ausführungsbeispielen werden der SCM-Faktor, seine Isolierung und Reinigung und das Verfahren zu seiner Anwendung erläutert. Die nachstehenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung jedoch nur erläutern, nicht einschränken.
- Blutproben von Patienten mit der Diagnose aktiver Krebs, z.B. Brust-, Lungen-, Dickdarm-, Eierstock-, Gebärmutterhals-, Gebärmutter-, Kehlkopf- oder Hautkrebs (Basalzellenkarzinom oder bösartiges Melanom) wurden in heparinisierten Phiolen, z.B. Vacutainer -Gläsern gesammelt. 20 ml jeder Blutprobe wurden etwa 40 min bei etwa 1200 g zentrifugiert. Das oberhalb der abgesetzten Blutzellen vorhandene Plasma wurde gesammelt und unter Druck durch ein poröses Membranfilter filtriert, z.B. durch das Filter Amicon UM2 oder YM2, das eine einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechende Trenngröße hatte. Diese Ultrafiltrate wurden lyophilisiert und bis zu ihrer weiteren Reinigung bei 4º gelagert.
- Aliquote der Ultrafiltrate je einer der Probe nach Beispiel 1 wurden mit Lymphozyten mit potentiell veränderbarer SCM inkubiert, die von denselben Spendern stammten, und die Lymphozyten wurden nach dem vorstehend beschriebenen SCM- Testverfahren auf die Veränderung ihrer SCM getestet. In jedem Fall bewirkte das Ultrafiltrat eine charakteristische Ansprache der Lymphozyten mit veränderbarer SCM durch eine Herabsetzung ihres P-Wertes, wie sie auch auftreten würde, wenn die Zellen mit dem Krebsgewebe selbst oder mit Krebsgewebeextrakten in Berührung gebracht worden wären (Tabelle 2). TABELLE 2 SCM-AKTIVITÄT DER ULTRAFILTRATE NACH BEISPIEL 1 Diagnose des Lymphozytenspenders Diagnose des Spenders des SCM-Faktors SCM-Ansprache P-Wert in % der Kontrollprobe Bösartiges Melanom Kehlkopfkarzinom Brustkarzinom Basalzellen-Hautkarzinom
- Aus den Daten der Tabelle 2 geht hervor, daß schon bei seiner Verwendung im Roh-Ultrafiltrat der SCM-Faktor den P- Wert der Lymphozyten mit veränderbarer SCM von krebskranken Patienten mindestens in dem Maße herabsetzt, in dem die P- Werte herabgesetzt werden, wenn Lymphozyten mit Rohextrakten von Krebsgeweben oder mit Krebsgewebe selbst angeregt werden. Bei einer Anregung durch die Ultrafiltrate wurde der P-Wert um mindestens 10% herabgesetzt, wie es für eine derartige positive SCM-Ansprache charakteristisch ist. Dabei trat der SCM-Faktor jedoch nicht durch das Amicon -Filter UM05 mit einer einem Molekulargewicht von 500 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße hindurch. Durch diese Daten wird bestätigt, daß der Faktor klein ist und eine höhere Aktivität hat als ein kleines Molekül, z.B. eine kleine Aminosäure.
- Das aus den Proben nach Beispiel 1 erhaltene, lyophilisierte Pulver wurde in 2 ml konservierungsstoffreiem, sterilem Wasser für Injektionen gelöst. In diesem Stadium wurde die SCM-Aktivität der Zubereitungen bestimmt. Dabei wurden aktive Proben von Spendern zusammengefaßt, die an derselben Stelle von Krebs derselben Art befallen waren. Die zusammengefaßten Proben wurden mit einer mit Sephadex G-10 gefüllten Säule von 0,9 x 18 cm entsalzt, die einen Fraktionierbereich von 0 bis 700 Dalton hat. Das Probenvolumen für jeden Chromatographielauf war nicht größer als 25% des Säulenvolumens. Die Elution wurde mit zweimal destilliertem Wasser mit einer linearen Elutionsgeschwindigkeit von 8 bis 9 cm/h durchgeführt. Das Entsalzen wurde bei Zimmertemperatur (21 bis 23ºC) durchgeführt. Bei einem Elutionsvolumen vom 0,3-fachen bis zum 0,5-fachen des Gesamtvolumens der Chromatographiesäule eluierte Fraktionen von je 1 ml wurden gesammelt, und deren optische Dichten wurden bestimmt. Die SCM- Aktivität war in der ersten Elutionszacke enthalten. Das Vorhandensein der SCM-Aktivität in dieser Zacke wurde durch einen SCM-Test bestätigt. Ein Aliquot der ersten Elutionszacke, das von einem Ultrafiltrat erhalten worden war, das zunächst von einer Patientin mit Brustkrebs gewonnen worden war, setzte im SCM-Test den P-Wert von Lymphozyten von einer Patientin mit Brustkrebs auf 86,3% des Kontrollwertes herab, was das Vorhandensein von SCM-Aktivität anzeigte. Diese Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert.
- Zur weitergehenden Reinigung des Eluats wurde dieses auf einer Gelfiltriersäule mit Sephadex G-50 fraktioniert, die einen Fraktionierbereich von 1500 bis 30 000 Dalton hatte. Die entsalzten und lyophilisierten Proben wurden in je 50 mM NH&sub4;HCO&sub3; gelöst und dann in einem Volumen von nicht mehr als 5% des Säulenvolumens auf eine mit Sephadex G-50 gefüllte Säule von 0,9 x 18 cm aufgegeben und bei Zimmertemperatur mit einer linearen Geschwindigkeit von 3 cm/h eluiert. Bei einem Elutionsvolumen vom 0,4-fachen bis zum 0,6-fachen des Gesamtvolumens des für die Chromatographie verwendeten Bettes eluierte Fraktionen von je 1 ml wurden gesammelt und auf ihre SCM-Aktivität getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind nachstehend im Beispiel 4 angegeben. Die SCM-aktiven Fraktionen waren in der ersten Elutionszacke enthalten. Dies wurde durch die optischen Dichten der 1 ml-Fraktionen nach dem SCM-Testen der Fraktionen bestimmt.
- Nach dem Testen der Fraktionen auf SCM-Aktivität wurden die von Spendern mit denselben Krebsarten erhaltenen aktiven Fraktionen zusammengefaßt und lyophilisiert.
- Zur weitergehenden Reinigung wurden die lyophilisierten Proben in 10 mM NH&sub4;HCO&sub3; gelöst und in einer Menge von nicht mehr als 4% des Säulenvolumens auf eine 0,8 x 26 cm messende Säule mit mikrokörniger DEAE-Cellulose Whatman DE-52 aufgegeben. Die Säule wurde mit 10 ml 10 mM wässerigem NH&sub4;HCO&sub3; gewaschen, dessen Konzentration mit einer Geschwindigkeit von 0,108%/min von 10 mM auf 1 M NH&sub4;HCO&sub3; erhöht wurde. Es wurden Fraktionen von je 1 ml gesammelt, und für jede dieser Fraktionen wurde die Extinktion bei 220 nm bestimmt. Auf Grund der Extinktion wurden die aktiven Fraktionen, die von der Säule bei einem Elutionsvolumen vom 4,5-fachen bis zum 4,7- fachen des Gesamtvolumens des für die Chromatographie verwendeten Bettes eluiert wurden, zusammengefaßt und lyophilisiert und danach getestet und weitergereinigt. Die Ergebnisse der SCM-Tests der aktiven Fraktionen sind im Beispiel 4 angegeben.
- In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse angegeben, die erhalten wurden, wenn Aliquote der im Beispiel 3 erhaltenen Sephadex G-50-Fraktionen, die ursprünglich von Spendern mit verschiedenen Arten von Krebs stammten, im SCM-Test zum Provozieren von Lymphozyten von Spendern verwendet wurden, die ebenfalls von Spendern mit verschiedenen Arten von Krebs stammten. Man erkennt, daß Lymphozyten mit veränderbarer SCM auf die G-50-Fraktionen in derselben charakteristischen Weise ansprechen wie auf die vorstehend charakterisierten, bei Krebs vorkommenden Antigene. Dieses entsalzte und teilgereinigte proteinhaltige Gut bewirkt eine allgemein stärkere Veränderung der SCM als das Roh-Ultrafiltrat, mit dem die in der Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse erhalten wurden. Diese stärkere SCM-Ansprache ist an niedrigeren P-Werten erkennbar. TABELLE 3 SCM-AKTIVITÄT DER SEPHADEX G-50-FRAKTIONEN NACH BEISPIEL 3 Diagnose des Lymphozytenspenders Diagnose des Spenders des SCM-Faktors SCM-Ansprache P-Wert in % der Kontrollprobe Lungenkrebs Kehlkopfkrebs Brustkrebs Dickdarmkrebs Bösartiges Melanom Gesunder Spender Kolitis Gebärmutterhaiskrebs Bronchialkrebs Dickdarmkrebs
- In der Tabelle 4 sind die Ergebnisse angegeben, die erhalten wurden, wenn der von Spendern mit verschiedenen Arten von bösartigen Erkrankungen stammende SCM-Faktor nach der Reinigung in der DEAE-Cellulose-Stufe im SCM-Test zum Provozieren von Lymphozyten verwendet wurde, die entweder von Spendern mit verschiedenen Arten von bösartigen Erkrankungen oder von Spendern ohne bösartige Erkrankungen verwendet wurde. Wie zu erwarten war, sprachen die Lymphozyten von krebskranken Patienten auf die mit den DEAE-Cellulose-Säulen gereinigten SCM-Faktoren durch eine beträchtliche Herabsetzung des P-Wertes an, während bei Lymphozyten von nicht bösartig erkrankten Spendern keine derartige Abnahme des P- Wertes auftrat. TABELLE 4 SCM-AKTIVITÄT DER DEAE-CELLULOSE-FRAKTIONEN NACH BEISPIEL 3 Diagnose des Lymphozytenspenders Diagnose des Spenders des SCM-Faktors SCM-Ansprache P-Wert in % der Kontrollprobe Brustkrebs Basalzellen-Hautkarzinom Gesunder Spender Cholezystitis Urethritis Appendizitis Gutartige Brustgeschwulst Gutartiges Hypophysenadenom Bronchialkrebs Gebärmutterhalskrebs Dickdarmkrebs Bösartiges Melanom Dickdarmkrebs Gehirnkrebs
- Die im Beispiel 4 erhaltenen DE-52-Fraktionen mit dem allgemein bei Krebs vorkommenden SCM-Faktor wurden erneut hergestellt und durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr (RP-HPLC) zum Erzielen eines homogenen Zustandes gereinigt. Dabei wurde eine HPLC-Säule von 2,1 mm x 22 cm verwendet, die mit Aquapore RP 300 (7 Mikrometer) gefüllt war. Bei der Reinigung durch RP-HPLC wurden folgende Laufmittel verwendet.
- Laufmittel A: Wässerige 0,1-vol.%ige Trifluoressigsäure (TFAA)
- Laufmittel B: Wässerige 0,09-vol.%ige TFA in 70%igem wässerigem Acetonitril
- Mit sterilem Wasser für Injektionen (ohne Konservierungsstoffe) wurden erneut lyophilisierte SCM-aktive DE- 52-Fraktionen hergestellt. Aliquote von je 250 Mikrolitern wurden in die RP-HPLC-Säule injiziert. 50 Mikroliter/min Laufmittel wurden mit folgendem Zusammensetzungsprofil eingeleitet: 10 min 90 Vol.-% Phase A und 10 Vol.-% Laufmittel B; während der darauffolgenden 30 min lineare Zunahme der Konzentration des Laufmittels B mit einer Geschwindigkeit von 3 Vol.-%/min. Die an der Extinktion bei 220 nm erkannten optischen Dichtezacken wurden von Hand durch einen "Nanobore"- Teflonschlauch in konischen Eppendorf-Zentrifugiergläsern von 1,5 ml aus Kunststoff gesammelt. Dann wurde das Lösungsmittel in einer Vakuumzentrifuge verdampft. In allen Fällen wurde der allgemein bei Krebs vorkommende, an der SCM nachweisbare Faktor von der Säule eluiert, wenn der Gehalt an dem Laufmittel B 74 Vol.-% betrug.
- Zum Reinigen des SCM-Faktors durch HPLC kann man die im Beispiel 4 erhaltenen SCM-aktiven DEAE-52-Fraktionen auch auf eine HPLC-Säule von 4,6 mm x 25 cm aufgeben, die mit Ultrasphere ODS gefüllt ist und von Beckman Instruments, Inc. vertrieben wird. In dieser Säule wurden folgende Laufmittel verwendet:
- Laufmittel A: Wässerige 0,1-vol.%ige Trifluoressigsäure (TFA)
- Laufmittel B: 0,1-vol.%ige TFA in 70%igem wässerigem Acetonitril
- Mit dieser Säule wurde nach demselben allgemeinen Verfahren gearbeitet wie mit der Aquapore-Säule, wobei jedoch 1,00 ml/min Laufmittel mit folgendem Zusammensetzungsprofil aufgegeben wurde: 5 min 70 Vol.-% Laufmittel A, 30 Vol.-% Laufmittel B; während der darauffolgeden 20 Minuten lineare Zunahme der Konzentration des Laufmittels B mit einer Geschwindigkeit von 3,5 Vol.-%/min. Die optischen Dichtespitzen wurden bei 220 nm erfaßt und von Hand in siliconisierten Reagensgläsern gesammelt. Das Lösungsmittel wurde in einer Vakuumzentrifuge verdampft. Bei Verwendung dieses HPLC- Systems zur Reinigung des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktors von neunzehn verschiedenen Krebsarten, einschließlich des Gebärmutterhals-Plattenepithelkarzinoms, des Brust-Adenokarzinoms, des Bronchial- Adenokarzinoms und bösartiger Melanome wurde stets ein einziges, an der optischen Dichte erkennbares Aktivitätsmaximum festgestellt, und zwar bei einer Elution bei einem Gehalt von 56,3 Vol.-% des Laufmittels B.
- Zum Testen der im Beispiel 6 mit der Ultraspheresäule durch RP-HPLC isolierten Peptide auf ihre SCM-Aktivität wurden die Peptide erneut mit sterilem Wasser für Injektionen ohne Konservierungsstoffe angesetzt. In der Tabelle 5 ist die SCM-Aktivität von Lymphozyten mit veränderbarer SCM nach einer Inkubation mit diesen Proben angegeben. Mit dieser Fraktion wird bei ihrer Verwendung zur Provokation von Lymphozyten von krebskranken Spendern der Polarisationswert am meisten herabgesetzt. Bei zwei der drei Zubereitungen des SCM-Faktors wurde der Polarisationswert um mehr als 40% herabgesetzt, d.h. um mehr als durch jede andere getestete Fraktion. Wie erwartet war der gereinigte Faktor hinsichtlich der Art des Krebses des Spenders der verwendeten Lymphozyten unspezifisch. Ferner bewirkte, wie ebenfalls zu erwarten war, der gereinigte Faktor keine Ansprache, wenn er zur Provokation von Lymphozyten von gesunden Spendern verwendet wurde. TABELLE 5 SCM-AKTIVITÄT DER RP-HPLC-FRAKTIONEN NACH ANSPRUCH 6 Diagnose des Lymphozytenspenders Diagnose des Spenders des SCM-Faktors SCM-Ansprache P-Wert in % der Kontrollprobe Brustkrebs Dickdarmkrebs Gesunder Spender Lungenkrebs Bronchialkrebs
- Ein durch Trypsinaufschluß erhaltenes Fragment aus sechzehn Aminosäuren wurde von dem gereinigten SCM-Faktor nach Beispiel 5 isoliert. Es wurde nachgewiesen, daß dieses Fragment die volle Aktivität des größeren Peptids hat, und seine Sequenz wurde durch den automatischen Edman-Abbau bestimmt: Zur Spaltung des gereinigten SCM-Faktors mit Trypsin und zum Reinigen des aktiven Fragments wurde folgendes Verfahren durchgeführt:
- Um beim Lyophilisieren einen Adsorptionsverlust des Peptids zu verhindern, wurde der SCM-Faktor in Gegenwart von HPLC-Elutionsmitteln mit Trypsin aufgeschlossen. Der Trypsinaufschluß wurde in einer Pufferlösung mit 0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,3, bei 27ºC 24 Stunden lang mit 10 Gew.-% Trypsin durchgeführt. Das Aufschlußprodukt wurde mit wässeriger 0,1- vol.%iger Trifluoressigsäure auf das vierfache Volumen verdünnt und wurde dann in ein mikroporöses HPLC-Trennsystem Applied Biosystems 130A injiziert. Die durch Trypsinaufschluß gebildeten Fragmente wurden mit einer Säule mit Aquapore RP-300 (200 mm x 2,1 mm) abgetrennt. Zum Eluieren der Fragmente wurden als Laufmittel folgende Lösungsmittel verwendet:
- Laufmittel A: Wässerige 0,1-vol.%ige Trifluoressigsäure (TFA)
- Laufmittel B: 0,09%ige TFA in 70%igem wässerigem Acetonitril
- 50 Mikroliter/min Laufmittel wurden mit folgendem Zusammensetzungsprofil aufgegeben: 10 min 96 Vol.-% Laufmittel A und 4 Vol.-% Laufmittel B, während der darauffolgenden 30 min wurde die Konzentration des Laufmittels B mit einer Geschwindigkeit von 3 Vol.-%/min linear erhöht. Das durch Trypsinaufschluß gewonnene SCM-aktive Peptidfragment wurde bei 69,6 Vol.-% Laufmittel B und 30,4 Vol.-% Laufmittel A in einem Gesamtvolumen von etwa 30 Mikrolitern eluiert.
- In der Tabelle 6 sind die Ergebnisse zusammengefaßt, die bei der Verwendung des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktors nach verschiedenen Reinigungsstufen gemäß den Beispielen 1, 3 und 6 als Provokationsmittel im SCM-Test erhalten wurden. In SCM-Tests mit Lymphozyten von Spendern mit einer Anzahl von verschiedenen bösartigen Erkrankungen und dem erfindungsgemäßen Faktor wurde in allen Fällen eine aussagekräftige Ansprache erzielt. Diese Ansprache ist in der Tabelle 6 in Prozent eines Kontrollpolarisationswertes angegeben, der bei der SCM-Messung mit denselben Lymphozyten erzielt wurde, die nicht mit dem Faktor inkubiert worden waren. Je kleiner der Wert, dest größer ist die Ansprache auf den Faktor im SCM-Test. Selbst durch das Ultrafiltrat, d.h. die roheste getestete Zubereitung des Faktors, wurde der Polarisationswert um 18,0% bis 37,1% herabgesetzt. Durch die durch RP-HPLC gereinigte Fraktion, d.h. die am stärksten gereinigte Fraktion wurde der Polarisationswert um bis zu 44,6% herabgesetzt. Der Faktor gemäß der Erfindung ist spezifisch und setzt den Polarisationswert nur herab, wenn er zur Provokation von Lymphozyten von krebskranken Spendern verwendet wird. Selbst die durch RP-HPLC gereinigte Fraktion bewirkte keine Herabsetzung des Polarisationswertes, wenn sie zur Provokation von Lymphozyten von gesunden Spendern verwendet wurde. TABELLE 6 BEISPIELE DER SCM-AKTIVITÄT NACH VERSCHIEDENEN REINIGUNGSSTUFEN (BEISPIEL 9) Reinigungsstufe Bereich der prozentuellen Abnahme des P-Wertes bei Verwendung von Lymphozyten von Krebspatienten Plasmaultrafiltrat (Trenngröße 1000 Dalton) Sephadex G-50-Fraktion DE-52-Cellulose-Fraktion RP-HPLC-Fraktion
- Beim Testen mit Lymphozyten von gesunden Spendern oder von Spendern mit nicht bösartigen Krankheiten wurde bei keiner Fraktion eine Aktivität festgestellt.
- Das vorstehend im Beispiel 8 beschriebene Trypsinaufschlußpeptid ist im Standard-SCM-Test voll aktiv. Mit etwa 5 x 10&supmin;² Femtogramm (d.h. 5 x 10&supmin;¹&sup7; g oder etwa 16 000 Molekülen) des Fragments wurde in dem Test die volle Aktivität festgestellt. Wie aus der Tabelle 7 hervorgeht, war das von Patienten mit Lungenkrebs isolierte Fragment im Test mit Lymphozyten von einem Patienten mit einem kleinzelligen Lungenkarzinom voll aktiv und zeigte es eine volle Kreuzreaktion mit Lymphozyten von einer Patientin mit einem Brust- Adenokarzinom. Dagegen wurde bei der Verwendung von Lymphozyten von gesunden Spendern keine Ansprache festgestellt. TABELLE 7 SCM-AKTIVITÄT DES TRYPSINAUFSCHLUSS-FRAGMENTS VON EINEM LUNGENKREBSPATIENTEN Diagnose des Lymphozytenspenders SCM-Ansprache P-Wert in % der Kontrollprobe Kleinzelliges Lungenkarzinom Brust-Adenokarzinom Gesunde Spender
- Im nachstehenden Beispiel wird die Fähigkeit des SCM-Faktors gezeigt, eine Ansprache zu bewirken, wenn er im SCM-Test zur Provokation von Spendern verwendet wird, die an anderen Arten von Krebs leiden. Zum Nachweis dieses Kreuzreaktionsvermögens wurden aus Blutproben von mehreren Krebspatienten jeweils 2 ml zellenfreies Blutplasma gewonnen. Diese Blutproben waren zunächst in heparinisierten Vacutainer -Gläsern gesammelt worden. Die Proben wurden mindestens 12 Stunden durch ein Filter Amicon UM2 oder YM2 mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße filtriert und unter sterilen Bedingungen bei 4ºC gelagert. Von heparinisierten Blutproben von krebskranken Patienten, gesunden Spendern und Spendern mit nicht bösartigen Erkrankungen wurden Lymphozyten mit veränderbarer SCM isoliert. Zum Testen der Aktivität und der Krebsspezifität der den allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor enthaltenden Ultrafiltrate wurden Aliquote von 0,75 ml Lymphozyten mit veränderbarer SCM (5 x 10&sup6; Zellen/ml in PBS) bei 37ºC 40 min mit den Ultrafiltraten inkubiert. Für jedes Assay wurde 0,075 ml Ultrafiltrat verwendet. Die SCM-Messungen wurden nach dem Verfahren durchgeführt, das in dem Artikel von L. Cercek und B. Cercek "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders, a Review", Europ. J. Cancer 13, 903-915 (1977), und in der älteren Patentanmeldung Ser. No. 867 079 beschrieben ist, die von B. Cercek und L. Cercek am 27. Mai 1986 mit der Bezeichnung "Method for Measuring Polarized Fluorescence Emissions" eingereicht worden ist. In dem SCM-Assay wurde eine Herabsetzung des Polarisationswertes der intrazellulären Fluoreszenz (P- Wertes) um mindestens 10% als positive Ansprache auf das zur Provokation verwendete Ultrafiltrat angesehen. TABELLE 8 KREUZREAKTIONSVERMÖGEN BESTIMMT DURCH DIE SCM-AKTIVITÄT VON ULTRAFILTRATEN NACH BEISPIEL Diagnose des Lymphozytenspenders Fälle mit Ansprache/getestete Fälle bei Lymphozytenspendern mit der Diagnose Mundkrebs Kehlkopfkrebs Gebärmutterhalskrebs Eierstockkrebs Lungenkrebs Gehirnkrebs Brustkrebs Dickdarmkrebs Andere Krankheiten als Krebs Gesunde Spender Lungenkrebs Bronchialkrebs Brustkrebs Eierstockkrebs Gebärmutterhalskrebs Dickdarmkrebs Mundkrebs Kehlkopfkrebs Bösartiges Melanom Glioblastom Appendizitis Urethritis Infektiöser Abszeß Kolitis Gutartiges Hypophysenadenom Gesunde Spender
- Aus den Angaben in der Tabelle 8 geht hervor, daß Lymphozyten mit veränderbarer SCM von Spendern mit acht verschiedenen Krebsarten auf Ultrafiltrate mit allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktoren von Spendern mit neun verschiedenen Krebsarten angesprochen haben. Dagegen haben Ultrafiltrate von Plasmen von gesunden Spendern und von Spendern mit anderen Krankheiten als Krebs keine positive SCM-Ansprache ausgelöst. Ferner haben auch die Lymphozyten mit veränderbarer SCM von gesunden Spendern oder von nicht bösartig erkrankten Spendern im SCM-Test auf keines der Ultrafiltrate angesprochen.
- Zum Nachweis der Veränderung der SCM-Ansprache von Lymphozyten von nicht bösartig erkrankten Spendern bei der Inkubation mit dem SCM-Faktor wurden Lymphozyten mit veränderbarer SCM von den Blutproben von gesunden Spendern isoliert und in vollständiger dulbeccoscher phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) in einer Menge von 5 x 10&sup5; Zellen/ml suspendiert, wie es in dem vorgenannten Artikel im European Journal of Cancer und in der von B. Cercek am 10. März 1986 eingereichten Patentanmeldung Serial No. 838 264 mit der Bezeichnung "Automated Collection of Buoyant Density Specific Cells from Density Gradients" beschrieben ist. Aliquote dieser Zellen wurden in je 3 ml der folgenden Medien inkubiert: (a) zellenfreies Blutplasma von Krebspatienten; (b) Plasma von Krebspatienten, das 12 Stunden durch ein Filter Amicon UM2 mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße ultrafiltriert worden war; (c) Plasma von Krebspatienten, das 12 Stunden durch ein Filter Amicon UM5 mit einer einem Molekulargewicht von 500 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße ultrafiltriert worden war; (d) der allgemein bei Krebs vorkommende SCM- Faktor nach seiner Reinigung einschließlich der Entsalzungsstufe oder der mit der Sephadex G-10-Säule durchgeführten Stufe; (e) der Faktor nach seiner Reinigung in der mit der Sephadex G-50-Säule durchgeführten Stufe; (f) der Faktor nach seiner Reinigung in der DEAE-Cellulose-Säule; (g) der Faktor nach seiner Endreinigung durch RP-HPLC; und (h) Plasma von gesunden Spendern nach der Ultrafiltration durch ein Filter Amicon UM2 mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße. Diese Inkubationen wurden 2,5 Stunden durchgeführt.
- Zum Nachweis der Fähigkeit des SCM-Faktors zur Modifikation der SCM-Ansprache der Lymphozyten von gesunden Spendern wurden das SCM-Veränderungsverhältnis (RRSCM) der Lymphozyten vor und nach der Inkubation mit jeder der vorstehend beschriebenen Fraktionen bestimmt. Bevor die inkubierten Zellen zur Bestimmung des RRSCM mit einem Mitogen bzw. mit dem SCM- Faktor in Berührung gebracht wurden, wurden die inkubierten Zellen gründlich gewaschen. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Modifikation war an dem Verhältnis des Polarisationswertes der Lymphozytensuspension nach einer kurzen Berührungszeit derselben mit den SCM-Faktor enthaltenden Substraten zu dem Polarisationswert der Lymphozytensuspension nach einer kurzen Zeit der Berührung mit Phytohämagglutinin (PHA) erkennbar. Im SCM-Test zeigt ein RRSCM unter 1,0 das Vorhandensein einer bösartigen Erkrankung des Spenders und ein RRSCM von 1,1 oder mehr das Nichtvorhandensein einer bösartigen Erkrankung an. TABELLE 9 MODULATION DER SCM-ANSPRACHE VON LYMPHOZYTEN VON GESUNDEN SPENDERN DURCH DEN SCM-FAKTOR (BEISPIEL 12) Für die Modulation verwendete SCM-Zubereitung vor der Modulation nach der Modulation Zellenfreies Blutplasma von Krebspatienten Ultrafiltrat (Trenngröße 1000 Dalton) von Blutplasma von Krebspatienten Sephadex G-10 (SCM-aktiv) Sephadex G-50 (SCM-aktiv) DEAE-Cellulose (SCM-aktiv) RP-HPLC (SCM-aktiv) Ultrafiltrat (Trenngröße 500 Dalton) von Blutplasma von Krebspatienten Ultrafiltrat von autologem und allogenem Blutplasma von gesunden Spendern
- Aus der Tabelle 9 geht der am RRSCM erkennbare Effekt der Inkubation mit den SCM-Faktor enthaltenden Fraktionen auf die Ansprache der Lymphozyten auf den SCM-Faktor oder Phytohämagglutinin hervor. Bei Lymphozyten, die nicht vorinkubiert worden waren oder die mit einem durch Filtrieren durch ein Filter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße erhaltenem Ultrafiltrat von gesunden Spendern oder mit einem durch Filtrieren durch ein Filter mit einer einem Molekulargewicht von 500 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße erhaltenen Ultrafiltrat von krebskranken Spendern vorinkubiert worden waren, betrug das RRSCM 1,35 oder mehr, wie dies zu erwarten gewesen war. Dagegen wurde bei mit allen mit den SCM-Faktor enthaltenden Fraktionen vorinkubierten Lymphozyten ein niedrigeres RRSCM von 0,65 bis 0,80 erhalten, wie dies für Lymphozyten charakteristisch ist, die von bösartig erkrankten Patienten stammen.
- Zum Nachweis des Einflusses des SCM-Faktors auf die natürliche Zytotoxizität von Lymphozyten mit veränderbarer SCM für maligne Zellen wurden derartige von gesunden Spendern stammende Lymphozyten 2 1/2 Stunden bie 37ºC mit den SCM-Faktor enthaltendem Plasma inkubiert, das wie vorstehend beschrieben von Blutproben von krebskranken Spendern isoliert worden war. Aliquote dieser Lymphozyten wurden nicht inkubiert und als Kontrollproben verwendet. Ferner wurden von krebskranken Spendern stammende Lymphozyten mit veränderbarer SCM verwendet, wobei einige Aliquote mit den SCM-Faktor enthaltendem Blutplasma inkubiert und andere Aliquote nicht inkubiert und als Kontrollproben verwendet wurden.
- Nach der Inkubation wurde die Zytotoxizität der Lymphozyten nach dem Verfahren getestet, das von M.R. Potter und M. Moore in "Natural Cytotoxic Reactivity of Human Lymphozyte Subpopulations", Immunology 37, 187-194 (1979) beschrieben wurde. Nach diesem veröffentlichten Verfahren wurden mit &sup5;¹Cr markierte Zellen der Humanmyeloidzellenlinie K 562 als Zielzellen und die Lymphozyten mit veränderbarer SCM als Effektorzellen verwendet. Dabei betrug das Verhältnis von Zielzellen zu Effektorzellen 1 zu 20. Das Freisetzen von &sup5;¹Cr zeigt an, daß die Effektorzellen für die Zielzelle toxisch sind. Die Zytotoxizität in Prozent wird wie folgt bestimmt:
- Zytotoxizität in % =
- Dabei ist RS die in der Probe freigesetzte Menge &sup5;¹Cr in %, RC die in der Kontrollprobe freigesetzte Menge &sup5;¹Cr in %, und RT die in Gegenwart von Triton X-100 freigesetzte Menge &sup5;¹Cr in %. Aus den in der Tabelle 10 angegebenen Ergebnissen geht hervor, daß durch eine 2,5-stündige Inkubation von von gesunden Spendern stammenden Lymphozyten mit veränderbarer SCM mit durch Filtrieren durch ein Filter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-Trenngröße erhaltenen Ultrafiltraten die Zytotoxizität der Lymphozyten um mehr als 90% herabgesetzt wurde. Wenn die Inkubation mit von Krebspatienten stammenden Lymphozyten mit veränderbarer SCM durchgeführt wurde, war die Abnahme der Zytotoxizität geringer und lag sie zwischen 40 und 90%. Derartige Lymphozyten von Krebspatienten hatten jedoch vor der Inkubation eine geringere Zytotoxizität, und nach der Inkubation mit dem Ultrafiltrat war die Restzytotoxizität mit der nach der Inkubation mit Lymphozyten von gesunden Spendern vergleichbar. Die niedrige Zytotoxizität von von Krebspatienten stammenden Zellen steht im Einklang mit der Tatsache, daß diese Zytotoxizität in vivo unter dem Einfluß von Faktoren wie dem allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM nachweisbaren Faktor gemäß der Erfindung herabgesetzt wird. TABELLE 10 EINFLUSS DES SCM-FAKTORS AUF DIE NATÜRLICHE TOXIZITÄT LYMPHOZYTEN FÜR DIE HUMANMYELOIDZELLENLINIE K 562 (BEISPIEL 13) Diagnose des Spenders der Lymphozyten mit veränderbarer SCM Diagnose des Spenders des SCM-Faktors als Ultrafiltrat Zytotoxität der Lymphozyten vor der Inkubation nach der Inkubation Abnahme der Zytotoxität in % Gesunder Spender Nr. 1 Gesunder Spender Nr. 2 Gesunder Spender Nr. 3 Gesunder Spender Nr. 4 Gesunder Spender Nr. 5 Zungenkrebs Lippenkrebs Eierstockkrebs Gebärmutterhalskrebs Bronchialkrebs Gebärmutterhalskrebs Bronchialkrebs Kehlkopfkrebs Rachenkrebs
- Vorstehend wurde die Erfindung anhand von verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen näher erläutert, doch sind auch andere Ausführungsformen möglich. Daher dürfen der Erfindungsgedanke und der Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche durch die hier gegebene Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen nicht eingeschränkt werden.
Claims (30)
1. Im wesentlichen reiner, allgemein bei Krebs
vorkommender, an der SCM erkennbarer Faktor, der im wesentlichen
aus einem Peptid von niedrigem Molekulargewicht besteht, das
durch Filter mit einer einem Molekulargewicht von 1000 Dalton
entsprechenden Nenn-Trenngröße hindurchtritt und von Filtern
mit einer einem Molekulargewicht von 500 Dalton
entsprechenden Nenn-Trenngröße zurückgehalten wird und das die
Aminosäurensequenz Lys-Pro-Phe besitzt, wobei der Faktor den
Polarisationswert der intrazellulären Fluoreszenz von
Lymphozyten mit veränderbarer SCM von an Krebs erkrankten Spendern
bei Messung in der genormten SCM-Prüfung um mindestens zehn
Prozent herabsetzt.
2. Faktor nach Anspruch 1, der infolge einer Reinigung
im wesentlichen homogen ist.
3. Allgemein bei Krebs vorkommender, an der SCM
nachweisbarer Faktor, der im wesentlichen nur Peptide enthält,
die mindestens dreizehn Aminosäurereste besitzen, zu denen
die Sequenz Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;
gehört, wobei R&sub1; aus Asn und Gln ausgewählt ist, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;
unabhängig voneinander jeweils aus Val, Leu und Ile
ausgewählt sind, R&sub5; aus Asp und Glu ausgewählt ist und R&sub6; und R&sub7;
unabhängig voneinander jeweils aus Asn und Gln ausgewählt
sind.
4. Faktor nach Anspruch 3, der geeignet ist, die
SCM-Änderung von Lymphozyten mit veränderbarer SCM von von
bösartigen Erkrankugen freien Spendern zu verändern, wenn der
Faktor mit derartigen Lymphozyten mit veränderbarer SCM in
Berührung gebracht wird, wobei die Lymphozyten bei der SCM-
Prüfung auf bei Krebs vorkommende Antigene, aber nicht auf
Mitogene ansprechen.
5. Faktor nach Anspruch 3 oder 4, der geeignet ist, die
spontane Toxizität in vitro von Lymphozyten mit potentiell
veränderbarer SCM bei der Messung durch die Freisetzung von
&sup5;¹Cr zu der Humanmyeloidzellenlinie K 562 hin um mindestens
90% zu vermindern.
6. Faktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der
annähernd die folgende Aminosäurenzusammensetzung hat: (Asx&sub2;,
Glx&sub3;, Ser, His, Gly&sub5;, Thr, Arg, Ala&sub3;, Tyr, Met, Val&sub3;, Phe&sub3;,
Ile, Leu&sub3;, Lys&sub2;).
7. Faktor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß ein aus sechzehn Aminosäuren bestehendes
Segment in dem Faktor die Aminosäurensequenz
Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys besitzt und
dieses Segment nicht die endständige Aminogruppe des Faktors
enthält.
8. Faktor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß ein aus fünfzehn Aminosäuren bestehendes
Segment in dem Faktor die Aminosäurensequenz
Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys besitzt, wobei
das Segment nicht die endständige Aminogruppe des Faktors
enthält.
9. Faktor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das im
wesentlichen nur Peptide enthält, die mindestens fünfzehn
Aminosäurereste besitzen, zu denen die Sequenz
Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-R&sub8;-Lys gehört, wobei R&sub8;
aus Ser und Thr ausgewählt ist.
10. Faktor nach Anspruch 9, der im wesentlichen nur
Peptide enthält, die die Sequenz
Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys
besitzen.
11. Faktor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der im
wesentlichen nur Peptide enthält, die mindestens sechzehn
Aminosäurereste besitzen, zu denen die Sequenz
Phe-R&sub1;-Lys-Pro-Phe-R&sub2;-Phe-R&sub3;-Met-R&sub4;-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-Phe-R&sub6;-Lys gehört wobei
R&sub6; aus Ser und Thr ausgewählt ist.
12. Faktor nach Anspruch 11, der im wesentlichen nur
Peptide enthält, die die Sequenz
Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys besitzen.
13. Faktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der
im wesentlichen nur ein Peptid enthält.
14. Peptid nach Anspruch 12 und 13, dadurch
gekennzeichnet, daß durch 5 x 10² Femtogramm des Peptids bei seiner
Verwendung zum Provozieren von Lymphozyten mit veränderbarer SCM
von krebskranken Spendern in der SCM-Prüfung der
Polarisationswert um mindestens 30% herabgesetzt wird.
15. Verfahren zum Prüfen von von einem Säugetier als
Spender stammenden Lymphozyten auf das Vorhandensein oder
Nichtvorhandensein von bösartigen Erkrankungen beim Spender,
mit folgenden Schritten:
(a) eine Suspension der Lymphozyten wird mit dem
allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM erkennbaren Faktor
nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Berührung
gebracht, und
(b) die infolge der Berührung mit der Suspension der
Lymphozyten bewirkte Herabsetzung der Strukturiertheit der
Zytoplasmamatrix wird bestimmt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
daß die Herabsetzung der Strukturiertheit der
Zytoplasmamatrix durch folgende Schritte bestimmt wird:
(a) für ein mit dem Faktor in Berührung gebrachtes
Aliquot der Lymphozyten wird die Fluoreszenzpolarisation PS
gemessen;
(b) für ein nicht mit dem Faktor in Berührung
gebrachtes, zweites Aliquot der Lymphozyten wird die
Fluoreszenzpolarisation PC gemessen und
(c) das Verhältnis von PS zu PC wird bestimmt, wobei
ein Verhältnis von PS zu PC unter etwa 0,9 eine bösartige
Erkrankung des Spenders der Lymphozyten anzeigt.
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
daß die Herabsetzung der Strukturiertheit der
Zytoplasmamatrix durch folgende Schritte bestimmt wird:
(a) für ein mit dem Faktor in Berührung gebrachtes
Aliquot der Lymphozyten wird die Fluoreszenzpolarisation PS
gemessen;
(b) für ein zweites Aliquot der Lymphozyten, das mit
einem Mitogen der Gruppe Phytohämagglutinin, Concanavalin A
und "pokeweed"-Mitogen in Berührung gebracht worden ist, wird
die Fluoreszenzpolarisation PM gemessen und
(c) als SCM-Veränderungsverhältnis RRSCM wird das
Verhältnis von PS zu PM bestimmt, wobei ein RRSCM unter etwa 0,9
eine bösartige Erkrankung des Spenders der Lymphozyten
anzeigt.
18. Verfahren zum Untersuchen einer Blutprobe auf eine
bösartige Erkrankung des Körpers des Spenders der Blutprobe,
in dem
(a) von der Blutprobe Lymphozyten mit veränderbarer SCM
abgetrennt werden;
(b) die abgetrennten Lymphozyten mit dem Faktor nach
einem der Ansprüche 1 bis 14 in Berührung gebracht und
dadurch angeregt werden;
(c) die angeregten Lymphozyten solange mit einer
Vorstufe eines fluorogenen Mittels in Berührung gebracht werden,
daß die Vorstufe in die Lymphozyten eindringt und durch
intrazelluläre enzymatische Hydrolyse in die fluorogene
Verbindung überführt wird, so daß fluorhaltige angeregte
Lymphozyten gebildet werden;
(d) die fluorhaltigen angeregten Kyphozyten mit
polarisiertem Licht erregt und dadurch zur Fluoreszenz veranlaßt
werden;
(e) zur Bestimmung eines Polarisationswertes für die
fluoreszierenden Lymphozyten die von diesen emittierte,
vertikal polarisierte bzw. horizontal polarisierte Fluoreszenz
gemessen werden und
(f) zum Feststellen des Vorhandenseins oder
Nichtvorhandenseins von Krebs im Körper des Spenders der Lymphozyten
der so bestimmte Polarisationswert der fluorhaltigen
angeregten Lymphozyten mit dem Polarisationswert eines
Kontrollaliquots von Lymphozyten verglichen wird, die den Schritten
(a), (c), (d) und (e), aber nicht dem Schritt (b),
unterworfen worden sind.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lymphozyten mit vertikal polarisiertem Licht erregt
werden und daß die Polarisationswerte in einem Fluoreszenz-
Spektralphotometer nach der Beziehung
P = (IV - GIH)/(IH + GIH)
bestimmt werden, in der IV und IH die Intensitäten der
polarisierten Fluoreszenz in der Vertikal- bzw. Horizontalebene
sind und G ein Korrekturfaktor zum Ausgleich des ungleichen
Durchtritts der horizontalen und vertikalen Komponente des
polarisierten Lichts durch die Optik des Spektralphotometers
ist.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, daß die Schritte (b) und (c) gleichzeitig
durchgeführt werden.
21. Verfahren zum Abbilden von Krebszellen mit folgenden
Schritten:
(a) ein Antikörper gegen den allgemein bei Krebs
vorkommenden, an der SCM erkennbaren Faktor nach einem der
Ansprüche 1 bis 14 wird mit einer abbildbaren Substanz markiert
und
(b) der markierte Antikörper wird zum Abbilden von
Krebszellen verwendet.
22. Verfahren zum Bestimmen des Spiegels eines allgemein
bei Krebs vorkommenden, an der SCM erkennbaren Faktors in
einer Körperflüssigkeit unter Verwendung eines Antikörpers
gegen den allgemein bei Krebs vorkommenden, an der SCM
erkennbaren Faktor nach einem der Ansprüche 1 bis 14 in einem
Immunoassay.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet,
daß das Immunoassay ein Radioimmunoassay, ein
Fluoreszenzimmunoassay, ein Assay mit einem mit Enzymen verbundenen
Immunosorbens oder ein Ausfäll-Immunoassay, unter Einschluß
von nephelometrischen und turbidimetrischen Assays, ist.
24. Verfahren zum Erzeugen eines allgemein bei Krebs
vorkommenden, an der SCM erkennbaren Faktors mit folgenden
Schritten:
(a) einem krebskranken Spender wird eine
Körperflüssigkeit entnommen;
(b) eine erste Fraktion der Körperflüssigkeit mit
Molekülen mit einem scheinbaren Molekulargewicht über 1000 Dalton
wird von einer zweiten Fraktion mit Molekülen mit einem
scheinbaren Molekulargewicht unter 1000 Dalton getrennt, und
(c) durch Reinigen der zweiten Fraktion wird ein im
wesentlichen reiner, allgemein bei Krebs vorkommender, an der
SCM erkennbarer Faktor gewonnen.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,
daß die Körperflüssigkeit aus peripherem Blut, Harn und
Plasma ausgewählt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch
gekennzeichnet, daß zum Abtrennen der zweiten von der ersten
Fraktion die Körperflüssigkeit durch ein Ultrafilter mit einer
einem Molekulargewicht von 1000 Dalton entsprechenden Nenn-
Trenngröße filtriert wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, in dem
in einem weiteren Schritt zum Entsalzen der zweiten Fraktion
diese auf eine Gelfiltriersäule mit einem Fraktionierbereich
von 0 bis 700 Dalton aufgegeben wird, die zum Abtrennen der
Salze von der zweiten Fraktion geeignet ist, worauf das Gut
von der Säule eluiert und jener Teil gesammelt wird, dessen
Elutionsvolumen zwischen dem etwa 0,3- und dem 0,5-fachen des
Gesamtvolumens des für die Chromatographie verwendeten Bettes
liegt, so daß in dem gesammelten entsalzten Teil die
spezifische Aktivität des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der
SCM erkennbaren Faktors gegenüber dessen spezifischer
Aktivität in der zweiten Fraktion nach Anspruch 24 erhöht wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, mit folgenden weiteren
Schritten:
(a) der gesammelte entsalzte Teil wird auf eine
Gelfiltriersäule mit einem Fraktionierbereich von etwa 1500
Dalton bis etwa 30 000 Dalton aufgegeben;
(b) das im Schritt (a) aufgegebene Gut wird mit einer
schwachen wäßrigen Lösung eines Ammoniumsalzes von der
Kolonne eluiert; und
(c) es wird jener Teil gesammelt, dessen
Elutionsvolumen etwa das 0,4-fache bis etwa das 0,6-fache des
Gesamtvolumens des für die Chromatographie verwendeten Bettes
beträgt, wodurch die spezifische Aktivität des allgemein bei
Krebs vorkommenden, an der SCM erkennbaren Faktors in dem
gesammelten Eluat gegenüber der spezifischen Aktivität dieses
Faktors in dem gesammelten entsalzten Teil nach Anspruch 27
erhöht wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28 mit folgenden weiteren
Schritten:
(a) das gesammelte Eluat wird auf eine
Diethylaminoethyl-Cellulose-Anionenaustauschsäule aufgegeben;
(b) das im Schritt (a) auf die Säule aufgegebene Gut
wird mit zunehmender Konzentration eines Ammoniumsalzes von
der Säule eluiert; und
(c) der etwa 0,28 M bis etwa 0,31 M des Ammoniumsalzes
enthaltende Teil des Eluats wird gesammelt, so daß die
spezifische Aktivität des allgemein bei Krebs vorkommenden, an der
SCM erkennbaren Faktors in dem gesammelten Eluat gegenüber
der spezifischen Aktivität dieses Faktors in dem nach
Anspruch 28 gesammelten Eluat erhöht wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, in dem der aus dem nach
Anspruch 29 gesammelten Eluat gewonnene, allgemein bei Krebs
vorkommende, an der SCM erkennbare Faktor durch
Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr so gereinigt wird, daß er im
wesentlichen homogen ist.
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