DE2707881C2 - Verfahren zum Nachweis von rheumatoiden Faktoren - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von rheumatoiden Faktoren mindestens einer der Immunoglobulinklassen
IgM, IgG undlgA in einer wäßrigen Probe.
Anti-immunoglobuline werden auch als rheumatoide
Faktoren bezeichnet und können den Immunoglobulinklassen IgM, IgG, IgA oder gegebenenfalls auch anderen
Immunoglobulinklassen zugehören. Der rheumatoide Faktor kann seinerseits gegen Immunoglobuline der
Klassen IgG oder IgM oder gegebenenfalls anderer Immonoglobulinklassen gerichtet sein, welche Immonoglobuline
durch Immonokomplexbildung oder Aggregation in der Struktur geändert worden sind.
Bereits vorgeschlagene Testmethoden zum Nachweis von rheumatoiden Faktoren basieren auf einer Agglutination
von z. B. Blutkörperchen oder Latexpartikeln, die mit nativem oder aggregiertem IgG überzogen sind, vgl.
z. B. US-PS 36 89 632. Diese Methoden weisen vor allem rheumatoide Faktoren vom IgM-Typ gerichtet gegen
geändertes IgG nach. Patienten mit rheumatoider Arthritis sind in einem solchen Test in der Regel positiv,
aber 20 bis 30% sind negativ.
Erfindungsgemäß wurde nun ein Verfahren zum Nachweis rheumatoider Faktoren in einer wäßrigen
Probe bereitgestellt, das vollständiger als bereits bekannte Verfahren den Nachweis sämtlicher rheumatoider
Faktoren in der Probe ermöglicht, d. h. auch solcher, welche der Immunoglobulinklasse IgM nicht angehören
und früher nicht in erwünschtem Maße weder in Anwesenheit noch in Abwesenheit solcher IgM zugehöriger
Faktoren nachgewiesen werden konnten.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein in der Probe etwa vorkommender
Kon ,)lementfaktor CIq in an sich bekannter Weise inaktiviert
wird, worauf die Probe mit löslichem, aggregiertem Immunoglobulin, das mit einem oder mehreren
analytisch nachweisbaren Atomen oder Gruppe markiert ist, zur Bildung von Aggregaten zwischen rheumatoiden
Faktoren und aggregiertem, markiertem Immunogl'.ibulin
umgesetzt wird, welche Aggregate gefällt werden, worauf der entstehende Niederschlag abgeschieden
wird und das analytisch nachweisbare Atom oder die analytisch nachweisbare Gruppe bzw. die ana-Iytisch
nachweisbaren Atome oder die analytisch nachweisbaren Gruppen in der Fällungsphase und/oder in
der Lösung nachgewiesen werden.
Die Inaktivierung des Komplementfaktors CIq in der Probe kann beispielsweise durch Erwärmung oder
ίο durch Zusatz von Diaminobutan oder Desoxyribonucleinsäure
in an sich bekannter Weise durchgeführt werden.
Lösliches, aggregiertes Immunoglobulin kann beispielsweise durch Erhitzung einer Lösung eines Immunoglobulins
und anschließende Trennung von löslichem, aggregiertem Immunoglobulin aus monomerem Immunoglobulin
und aus etwa entstehender geringerer Menge an unlöslichen Aggregaten durch Gelfiltrierung hergestellt
werden. Vorzugsweise wird als Immunoglobulin in diesem Zusammenhang ein solches der IgG-Klasse
verwendet. Die Aggregation wird nicht weiter getrieben, als daß der Hauptteil des aggregierten Immunoglobulins
in der wäßrigen Phase löslich ist.
Zur Markierung des aggregierten Immunoglobulins kann jedes im Zusammenhang mit der Markierung von Immunoglobulin bekannte analytisch nachweisbare Atom oder jede Gruppe verwendet werden. Die Markierung von aggregiertem Immunoglobulin mit einem radioaktiven Isotop kann somit in konventioneller Weise durchgeführt werden, wobei ein zweckmäßiges Isotop gewählt wird, z. B. 125I (siehe z. B. die Methode gemäß Hunter und Greenwood, Nature, Band 194, 1962, Seite 495). Ebenfalls kann die Markierung mit einer fluoreszierenden Gruppe in konventioneller Weise gemacht werden, z. B. mit einem Fluoresceinderivat wie Fluoresceinisothiocyanat. Auch die Markierung mit beispielsweise enzymatisch aktiven Gruppen oder mit freie Radikale enthaltenden Gruppen zum Nachweis kann grundsätzlich angewandt werden.
Zur Markierung des aggregierten Immunoglobulins kann jedes im Zusammenhang mit der Markierung von Immunoglobulin bekannte analytisch nachweisbare Atom oder jede Gruppe verwendet werden. Die Markierung von aggregiertem Immunoglobulin mit einem radioaktiven Isotop kann somit in konventioneller Weise durchgeführt werden, wobei ein zweckmäßiges Isotop gewählt wird, z. B. 125I (siehe z. B. die Methode gemäß Hunter und Greenwood, Nature, Band 194, 1962, Seite 495). Ebenfalls kann die Markierung mit einer fluoreszierenden Gruppe in konventioneller Weise gemacht werden, z. B. mit einem Fluoresceinderivat wie Fluoresceinisothiocyanat. Auch die Markierung mit beispielsweise enzymatisch aktiven Gruppen oder mit freie Radikale enthaltenden Gruppen zum Nachweis kann grundsätzlich angewandt werden.
Um eine vollständigere Fällung des erhaltenen Aggregats zwischen rheumatoiden Faktoren und aggregiertem,
markiertem Immunoglobulin herbeizuführen, kann man beispielsweise ein wasserlösliches, ungeladenes
Polymeres zusetzen, wie es zur Erleichterung des Ausfällens von Makromolekülen verwendet wird (z. B.
bei immunologischen Reaktionen, um die Fällung von Antikörper-Antigenkomplex Zu erleichtern), indem man
das den Makromolekülen zugängliche Flüssigkeitsvolumen in der Lösung durch sog. sterische Aussschließung
reduziert, wodurch eine reduzierte Löslichkeit der Makromoleküle erreicht wird (siehe z. B. Hellsing, Acta
Chem. Scand. 20 (1966) Seite 1251). Beispiele solcher Polymeren sind wasserlösliche Polyäthylenglykole, Polysaccharide
und (ungeladene) Polysaccharidderivate,
z. B. Dextran und wasserlösliche Cellulosederivate. Das
Polymere kann während oder nach der Reaktion, aber vorzugsweise vor derselben zugesetzt werden. Die Zusatzmenge
v/ird in sämtlichen diesen Fällen so gewählt, daß die Konzentration des Polymeren unmittelbar unterhalb
derjenigen liegt, bei welcher man eine Fällung einer der an der Reaktion teilnehmenden einzelnen
Komponenten (d. h. in erster Linie aggregiertem, markiertem Immunoglobulin) erhält. Die geeignete Konzentration
läßt sich leicht durch einfache Vorversuche feststellen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand einer Anzahl von spezifischen Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
3
Beispiel 1 und mit gemäß konventioneller Testtechnik negativer
Reaktion erhielt man in 16 Fällen deutlich erhöhte Meß-
A. Herstellung von werte, welche das Vorhandensein rheumatoider Fakto-
aggregiertem Human-IgG (agg IgG) ren anzeigen.
Human-IgG (Fraktion Il der Cohn-Fraktionierung) aus zusammengezogenen Humansera wurde von der
Kabi AB, Schweden, erhalten und inForm einer 2%igen IgG-Lösung 20 Minuten bei 60° C erhitzt Somit erhaltenes
aggregiertes IgG (agg IgG) wurde durch Gelfiltrierung
auf einer 90x 1,5 cm Kolonne von mit Epichlorohydrin vernetzten! Dextran (Sephadex® G-200 von Pharmacia
Fine Chemicals AB, Schweden) äquilibriert mit 0,1 M Tris(hydroxymethyI)aminomethan-HCl-Puffer
enthaltend 0,5 M NaCl mit pH 7,4 aus monomeren! IgG abgetrennt. Konzentrationen von agg IgG wurden bei
280 nm spektrophotometrisch bestimmt.
3. Herstellung von markiertem agg IgG
20
20 μΐ einer Lösung enthaltend 40 μg agg IgG, erhalten
gemäß A, wurden 500 \iC\ Na125I und 10 μΙ 0,5 M Natriumphosphatpuffer
mit pH 7,4 und 10 μg Chloramin T in 10 μ! Wasser zugesetzt Nach 50 Sekunden wurden
24 μg Natriummethabisulfit zugesetzt. Das Reaktionsgemisch
wurde auf Sephadex® G-200 getrennt (d. h. Gelpartikel bestehend aus mit Epichlorohydrin vernetztem
Dextran), wobei die erste Fraktion mit dem Voidvolumen aufbewahrt wurde. Das eluierte, markierte agg Ig
wurde bei 3500 g 5 Minuten geschleudert, um spontan präzipitierbares IgG zu entfernen. Das markierte Protein
wurde mit einer Pufferlösung, hergestellt aus 500 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5, 500 ml 0,15 M
NaCl, 10 ml 5% (m/v) NaM3 und 5 ml Tween® 20, auf etwa 40 μg/l (40 000 cpm in 0,1 ml) verdünnt.
C. Bestimmung der rheumatoiden Faktor-Aktivität
Blutproben wurden den Patienten aseptisch entnommen und man ließ das Blut bei Raumtemperatur gerinnen,
worauf bei 3000 g geschleudert wurde und Sera aufbewahrt wurden.
Serum wurde 30 Minuten bei einer Temperatur von 56°C wärmebehandelt. Serum wurde dann 1 :40 in einer
Lösung verdünnt, welche die folgende Zusammensetzung hatte: 500 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH
7,5, 500 ml 0,15 M NaCl, 10 ml 5% NaN3, 5 ml Tween® 20 und 2 g Polyäthylenglykol (Molekulargewicht
6000). 400 μΐ dieser Serumverdünnung sowie 100 μΐ von I125 markiertem agg IgG (40 000 cpm) (erhalten
gemäß B) wurden Kunststoffröhren zugeführt. Die Röhren wurden zugepfropft und 16 Stunden bei +40C
unter konstanter Drehung inkubiert. Darauf wurden die Röhren 3 Minuten bei 3500 g geschleudert. Die Kunststoffpfropfen
wurden entfernt und 2 ml der 0,9 M NaCl-Lösung enthaltend 0,5% Tween® wurden jeder Röhre
zugesetzt. Die Röhren wurden erneut 3 Minuten bei 3500 g geschleudert. Die Oberflüssigkeit wurde dann
abgesaugt. Dieser Waschvorgang wurde dreimal wiederholt. Die Röhren wurden dann zugepfropft und in
einem automatischen Gammarechner untergebracht.
Hohe Meßwerte wurden mit Proben von Patienten mit rheumatoider Arthritis erreicht. Im Vergleich zu
konventioneller Meßtechnik erhielt man bessere Übereinstimmung zwischen den Meßergebnissen und klinischer
Diagnose mit vorliegender Methode.
Für 28 Patienten mit Gelenkbeschwerden, von denen man vermutete, vom Typ rheumatoider Arthritis zu sein,
Claims (2)
1. Verfahren zum Nachweis von rheumatoiden Faktoren mindestens einer der Immunoglobulinklassen
IgM, IgG und lgA in einer wäßrigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß ein in der Probe
etwa vorkommender Komplementfaktor CIq in an sich bekannter Weise inaktiviert wird, worauf die
Probe mit löslichem, aggregiertem Immunoglobulin, das mit einem oder mehreren analytisch nachweisbaren
Atomen oder Gruppen markiert ist zur Bildung von Aggregaten zwischen rheumatoiden Faktoren
und aggregiertem, markiertem Immunoglobulin umgesetzt wird, welche Aggregate gefällt weiden,
worauf der entstehende Niederschlag abgeschieden wird und das analytisch nachweisbare
Atom oder die analytisch nachweisbare Gruppe bzw. die analytisch nachweisbaren Atome oder die
analytisch nachweisbaren Gruppen in der Fällungsphase und/oder in der Lösung nachgewiesen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das markierte aggregierte Immunoglobulin der IgG-Klasse zugehört.
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