DE1925952C3

DE1925952C3 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumorwirksamkeit

Info

Publication number: DE1925952C3
Application number: DE1925952A
Authority: DE
Inventors: Fumio Kato; Yoshinobu Miyamura; Masao Machida Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-06-05
Filing date: 1969-05-21
Publication date: 1974-06-20
Also published as: FR2010156A1; DE1925952A1; GB1215786A; DE1925952B2; US3627639A; CA940852A

Description

' Konzentration an einer Kohfenstoffquelle im Nähr-

^5 medium vorliegt, die anderen Nährstoffe, beispielsweise die Stickstoffquelle, anorganische Salze u. dgl., ebenfalls in einer großen Menge eingesetzt, um das

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Wachsturn der Mikroorganismen bei optimalen Bevon !.-Asparaginase mit Antitumonvirksamkeit durch dingungen zu halten. In diesen Falle variiert die aerobes Zuchten eines !-Asparaginase bildenden Mi- 30 Ammonstickstoffkonzentration in dem Nährmedium kroorgani^mus der Art Serratia marcescens in einem
wäßrigen Nährmedium und durch Gewinnung der
L-Asparaginase aus den Zellen mit üblichen Methoden.

Die Herstellung von !-Asparaginase mit Anti- _ _ _W£ „.. „.„..

tumonvirksamkeit durch Kultivierungeines i.-Aspara- 35 ist, ist dVs^VachstunTdeTM^ ginase erzeugenden Mikroorganismus der Art Serratia 'meinen gut. marcescens ist an sich bekannt. So ist beispielsweise
in »Biochemi 1 und Biophysical Research Communi-

in Abhängigkeit von der Stickstoffquelle {organisch oder nnorganisen), die zusammen mit der Kohlenstoff quelle verwendet wird. Wenn die Menge an der in dem Nährmedium vorliegenden Sticksloffquelle groß

cations«. Bd. Ü8, Nr. 2, ϊ%7, S. 160 bis 165, ein Ver

Wenn nun aber die Züchtung eines !.-Asparaginase bildenden Mikroorganismus der Art Serratia mar- __ cescens so durchgeführt wird, daß in dem Nährfahren beschrieben, in dem zur Herstellung der 40 medium 1 bis 15 Gewichtsprozent einer Kohlenstoffi-Asparaginase ein festes Kulturmedium verwendet quelle vorhanden sind und die Ammonsticksioffmengc wird.

Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß die damit eivielbare Ausbeute an !--Asparaginase gering ist und den Anforderungen nicht genügt, die an ein technisches Verfahren zur Herstellung von 1 -Asparaginase gestellt werden müssen

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, ein

verbessertes Verfahren zur Herstellung von i-Aspara- _. . . _. _c ..,,....._U£....<*»^ ,„...^.^

ginase anzugeben, mil dessen Hilfe es möglich ist, 50 diese bildenden Mikroorganismen von Serratia mar-I.-Asparaginase auf wirtschaftliche Weise großtech- cescens aneeeehen. unhfi Hip k «n /ent rat inn rUr nisch herzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem Ver-

auf einem konstanten Wert bei 5 mg ml oder weniger gehalten wird, so ist die Bildung der gewünschten i.-Asparaginase mit Amitumoraktivität optimal.

In der nachfolgenden Tabelle I wird das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Verfanren der französischen Offenlegungsschrift 2C01 930 verglichen. In dieser französischen Offenlegungsschrift ist ein Verfahren zur Herstellung von !-Asparaginase mittels

cescens angegeben, wobei die Konzentration der Kohlenstoffquclle im Nährmedium höchstens 1 °_u betragen darf.

Die in der folgenden Tabelle I angegebenen Werte

tumorwirksamkeit durch aerobes Züchten eines 1-As- 55 wurden jeweils nach beendeter Züchtung in iden-

paraginase bildenden Mikroorganismus der Art Ser- tischer Weise ermittelt.

fahren zur Herstellung von !--Asparaginase mit Anti

Tabelle

Ammonstickstoff (NH₃ — N) .

Feuchte Zellen

L-Asparaginase-Aktivitäl

Spezifische Aktivität der rohen
enzymatischen Flüssigkeit ..

Verfahren A

Spuren

16 mg/ml

65 Einheiten/ml

18,6 Einheilen/mg

Verfahren B

9 mg/ml
65 mg/ml
13 Einheiten/ml

1,05 Einheiten/mg

Verfahren C

Spuren 44 mg/ml 196 Einheiten/ml

27,9 Einheiten/mg

Verfahren A

Kultivierung unter Belüften und Rühren während 36 Stunden bei 30' C in einem Nährmedium vom pH-Wert 7,0, das 0,3"_u Glucose. 1,0",, Fleischextrakt, 1,0",, Pepton, 0,5 "^Natriumchlorid und 0,5";, Hefecxtrakt enthält (gemäß französischer Offenlefuinesschrift 2 001 930).

Verfahren B

Das gleiche Verfahren wie Verfahren A mit der Änderung, daß die Menge an Glucose 4,0";, beträgt und der pH-Wert mil Ammoniakwasser auf 7,0 bis 8,5 eingestellt wird.

Verfahren C

Kultivierung unter Belüften und Rühren während 36 Stunden bei 30⁰C in einem 4,0% Glucose, 2,0% Fleischextrakt, 2,0 "„ Pepton, 0,5",, Hefeextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthaltenden Nährmedium. Der pH-Wert des Mediums wird mit Natriumhydroxyd auf 7,0 bis 8,5 eingestellt (gemäß vorliegender Erfindung). ι

Wie sich aus Tabelle I ergibt, wird die Aktivität pro ml der Kühlflüssigkeit im erfindungsgemäßen Verfahren um mindestens das 3fache gegenüber dem in der französischen Offenlegungsschrift 2 001 930 be-

la schriebenen Verfahren gesteigert. Darüber hinaus ist auch die spezifische Aktivität der rohen enzymatischen Flüssigkeit beträchtlich gesteigert.

Die Beziehungen zwischen der als Ammonstickstoff in dem Nährmedium vorliegenden Stickstoffmenge und der Anlitumorwirksamkeit der !.-Asparaginase und deren spezifischer Aktivität sind in der folgenden Tabelle!! aufgeführt.

Tabelle Il

Stickstoff in Form von Ammoniak 0,1 mg/ml I 0,5 mg/ml I 5,0 mg/ml

t.-Asparaginase-Aktivität.

Spezifische Aktivität der rohen enzymatischen
Flüssigkeit

Einheiten/ml

Einheiten/mi

193 Einheiten/ml

26,5 Einheiten mg

132 Einheiten »ml

19,5 Einheiten/mg

54 Einheiten ml

9,8 Einheiten mg

11 Einheiten ml

0,8 Einheiten mg

Die erfindungsgemäß hergestellten r-Asparaginase-Präparate weisen eine Antitumorwirksamkeit auf, auf Grund deren es möglich ist, eine künstlich erzeugte Leukämie einer Maus vollständig zu heilen.

Sowohl ein synthetisches Nährmedium als auch ein natürliches Nährmedium ist geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe zum Wachstum der verwendeten Mikroorganismenstämme enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören Stoffe, wie beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen, die von den verwendeten Mikroorganismen benötigt werden.

Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise Kohlehydrale, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate und Melasse oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie organische Säuren, beispielsweise Essigsäure und Milchsäure, genannt. Diese Stoffe können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, wie Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüsdgkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, lösliche Fischsubstanz und Reiskleieextrakt, verwendet werden. Diese Stoffe können ebenfalls entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Zu anorganischen Salzen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Nalriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zinksulfat.

Wachstumsfördernde Mittel, wie Biotin, oder Vitamine, z. B. Thiamin oder Cobalamin, können ebenfalls, falls erwünscht oder erforderlich, dem Medium zugesetzt werden.

Die Kultivierung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, z. B. unter aerobem Schütteln der Kultur oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 C und einem pH-Wert \on etwa 6,0 bis 10.0 durchgeführt. Nach etwa 1- bis 3tägiger Kultivierung unter diesen Bedingungen haben sich grofe Mengen !.-Asparaginase in der erhaltenen Kullurflüssigkeit angesammelt.

Nach beendeter Kultivierung kann die l-Asparaginase nach üblichen Methoden, wie beispielsweise Ionenaustauscherharz-Behandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption oder Chromatographie, abgetrennt und gereinigt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die aufgeführten Prozentangaben beziehen sich, falls nicht anders angegeben, auf das Gewicht pro 1 Wasser.

Beispiel 1

Serratia marcescens ATCC 60 wurde in einem flüssigen, 2% trockene Bouillon enthaltenden Nährmedium unter Belüften und Rühren 7 Stunden lang bei 30 C kultiviert. Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde als Impfkultur eingesetzt. Diese Impfkullur wurde in einen FermentationsbehäUer von 5 I Inhalt in einer Inokulationsmenge von 10 Volumprozent in 3 1 eines Fermenlationsmediums der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

4,0% Glucose,
2,0% Pepton,

2,0%'Fleischextrakt,
0,5%'Hefeextrakt,
0,5% Natriumchlorid.

Die Kultivierung wurde dann 36 Stunden lang bei 30 C und 400 UpM unter Belüften mit einer Luftmenge von 3 1 pro Minute kultiviert. Der pH-Wert des Mediums wurde mit Calciumhydroxyd! auf 7,0 bis 8,5 eingestellt. Die erhaltenen Zellen wurden durch einen Zentrifugalabscheider abgetrennt, wobei 210 g nasse Zellen erhalten wurden.

Die Zellen wurden in einu 0,01-m-Tris-Pufferlösung (pH 8,5) suspendiert und mit einem Schalloszillator (10 Kc) 10 Minuten lang behandelt, um die Zellen zu zerstören. Man erhielt eine rohe Exlraktflössigkeit mii einer L-Asparaginase-Aklivität von 150 Einheiten/ ml und einer spezifischen Aktivität von 25,0 Einheilen pro mg Protein. Diese Extraktflüssigkeit wurde einer Behandlung zur Entfernung von Nucleinsäuren mit Mn", der Entfernung von Proteinverunreinigungen durch Erhitzen, danach einer fraktionierten Fällung mit Ammonsulfat und einer Chromatographie mit Diäthylaminoäthylcellulose und Biogelen unterworfen, wobei das enzymatische Protein gereinigt wurde. Man erhielt ein L-Asparaginase-Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 1500 Einheiten pro mg Protein in einer Gesamtausbeute von etwa 20%. Dieses Präparat zeigte eine Antitumorwirksamkeit, womit es möglich war, eine experimentelle Leukämie mit einer Dosierung von einigen 10 μ-g vollständig zu heilen.

Beispiel 2

Seirratia marcescens ATCC19 180 wunie in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, zur Herstellung einer Impfkultur kultiviert. Diese linpfkultur wurde in einen Fermcntatiorisbehälter von 51 Inhalt in einer Inokulationsmenge von 10 Volumprozent in 3 ! eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

8 "„Glycerin,

3 "„ Pepton,

0,25",, Kaliumsulfat,

0,05",, Kaliumphosphat,
0,05 "„ Dikaliumphosphat,

0,05",, Magnesiumsulfat,
10 mg/1 Eisensulfat,
10 mg'l Mangansulfat,
10 mg'l Cadmiumsulfat,
10 mg/I Kupfersulfat,
10 mg/I Zinksulfat.

Die Kultivierung wurde dann 60 Stunden lang bei 30"C unter aeroben Bedingungen bei 400 UpM und unter Belüften mit einer Luftmenge von 3 1 pro Minute durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wurde mit einer 40%igen Natriumhydroxydlösung auf 7,0 bis 8,5 eingestellt. Die erhaltenen Zellen wurden durch einen Zentrifugalabscheider abgetrennt, und man erhielt 360 g feuchte Zellen. Diese Zellen wurden den gleichen Behandlungen wie im Beispiel 1 zur Reinigung der Enzyme unterzogen, wobei ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 2000 Einheiten pro mg Protein in einer Gesamtausbeute von etwa 20 "'„ erhalten wurde. Dieses Enzympräparat war in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 gegenüber einer Leukämie einer Maus wirksam.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von !.-Asparaginase mit Antitumonvirksamkeit durch aerobes Züchten eines L-Asparaginase I/ildenden Mikroorganismus der Art Serratia marcescens in einem wäßrigen Nährmedium und durch Gewinnung der !.-Asparaginase aus den Zellen mit üblichen Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Nährmedium, das 1 bis 15 Gewichtsprozent einer Kohlenstoffquelle enthält und in dem die als Ammonstickstoff vorliegende Stickstoffmenge bei 5 mg/ml oder weniger

ratia marcescens in einem wäßrigen Nährmedium und durch Gewinnung der !.-Asparaginase aus den Zellen mit üblichen Methoden dadurch gelöst, daß man die Züchtung in einem Nährmedium, das 1 bis 15Ge-

wichtsprozent einer Kohlenstoffquelle enthält und in dem die als Ammonsiicksloff vorliegende Stickstoffmenge bei 5 mg/ml oder weniger gehalten wird, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 C und bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 10,0 durchführt.

ο Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber dem bekannten Verfahren den Vorteil, daß es damit erstmals möglich ist, !.-Asparaginase auf wirtschaftliche Weise in hoher Ausbeute herzustellen. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung wird das

gehalten wird, bei einer Temperatur von etwa 20 15 Verfahren der Erfindung in der Weise durchgeführt, bis 40" C und bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis daß der pH-Wert des Nährmediums mit einem AJkali-10 0 durchführt. hydroxyd auf einen Wen von 7,0 bis 8,5 eingestellt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- wird.

zeichnet, daß der pH-Wert des Nährmediums mit Als Mikroorganismen für die Durchführung des

einem A/kaJihydroxyd auf 7,0 L.s 8,5 eingestellt ao erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich insbeson^u dere die Mikroorganismen Serratia marcescens

ATCC 60 und ATCC 19 180.

Ganz allgemein werden, wenn eine relativ hohe