DE69218700T2 - Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch FermentationInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation. Riboflavin ist eine als Medikament, Nahrungsmittelzusatz, Farbstoff für Nahrungsmittel oder dergleichen bedeutende Substanz.
- Unter den bislang bekannten Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation finden sich solche, in denen Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii, Candida flalerii oder Bacillus subtilis in einem kohlenhydrathaltigen Medium kultiviert werden und Riboflavin im Medium angereichert wird (Progress Industrial Microbiology, Vol. 1, Seite 139 (1959); Belgische Patentschrift NO. 890.917; Japanische Patentveröffentlichung NO. 10.155/78 und Französiche Patentanmeldung FR-A-2 204 687). Die in diesen Verfahren verwendeten Mikroorganismen reichem Riboflavin jedoch nur in geringer Konzentration an oder produzieren diese Verbindung nur langsam. Sie sind deshalb als ein Verfahren zur kommerziellen Herstellung von Riboflavin nicht zufriedenstellend.
- Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Mikroorganismus mit verbesserter Fähigkeit zur Herstellung von Riboflavin zu erhalten und ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin mittels effizienter, billiger Fermentation bereitzustellen.
- Um ein Verfahren zur effizienten Herstellung von Riboflavin durch Fermentation zu entwickeln haben die Erfinder intensive Untersuchungen durchgeführt und als Ergebnis gefunden, daß die vorerwähnten Aufgaben durch Mutanten der Spezies Bacillus subtilis mit verringerter Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-Guanylsäure (im folgenden als "5'-GMP" bezeichnet) von nicht mehr als 0.081 µMol/min/mg Protein und der Fähigkeit zur Produktion von Riboflavin gelöst werden können. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesem Befund.
- Dementsprechend wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation bereitgestellt, welches umfaßt: das Züchten einer Mutante der Spezies Bacillus subtilis mit verringerter Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP von nicht mehr als 0.081 µMol/min/mg Protein und der Fähigkeit zur Herstellung von Riboflavin in einem flüssigen Fermentationsmedium, das Anreichern von Riboflavin in dem Medium und das Gewinnen von Riboflavin aus dem Medium.
- Erfindungsgemäß wird ein Mikroorganismus der Spezies Bacillus subtilis mit verringerter Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP von nicht mehr als 0.081 µMol/min/mg Protein und der Fähigkeit zur Produktion von Riboflavin verwendet. Mutanten mit weiter verbesserter Fähigkeit zur Produktion von Riboflavin können durch Ausstatten eines solchen Mikroorganismus mit anderen Eigenschaften (z.B. Resistenz gegen Nukeinsäurebasen-Analoga) erhalten werden, die in der Verstärkung der Fähigkeit zur Produktion von Riboflavin als wirksam bekannt sind (siehe Japanische Patenveröffentlichung No. 10.155/78).
- Als Beispiel für eine erfindungsgemäß verwendbare Mutante sei folgende angeführt:
- Bacillus subtilis AJ12644 (FERN BP-3855)
- (Dieser Stamm benötigt Adenin, ist GMP-Reduktase-defizient, gegen (Purin und Azaxanthin) resistent und hat eine verringerte Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP)
- Für den Erhalt einer solchen Mutante können als Elternstamm Stämme der Spezies Bacillus subtilis verwendet werden. Als spezifisches Beispiel kann das Riboflavin produzierende Bakterium Bacillus subtilis AJ12643 (FERM BP-3856) angeführt werden (dieser Stamm benötigt Adenin, ist GNP-Reduktase-defizient und gegen (Purin und Azaxanthin) resistent).
- Erfindungsgemäße Mutanten können erhalten werden, indem ein solcher Elternstamm einem üblichen Mutations-induzierenden Verfahren wie z.B. Bestrahlen mit Röntgenstrahlung oder Ultraviolettstrahlunq und Behandeln mit einem mutaqenen Mittel, wie N-Methyl-N'-nitrosoguanidin oder dergeleichen, ausgesetzt wird.
- Als Beispiel sei das folgende Experiment zur Herstellung einer solchen Mutante angeführt:
- In ein flüssiges Nährmedium (pH 7,0) mit 2,5 % löslicher Stärke, 0,3 % Hefeextrakt, 0,3 % Polypepton und 0,1 % Natriumchlorid wurde ein Riboflavin produzierender Bacillus subtilis AJ12643 (FERN BP-3856) inokuliert, der ein Adenin benötigender, von Bacillus subtilis ATCC 13952 stammender, GMP-Reduktase-defizienter und gegen (Purin und 8-Azaxanthin) resistenter Mikroorganismus ist. Der Mikroorganismus wurde in einer Schüttelkultur bei 34 ºC 16 h kultiviert, und 1 ml der erhaltenen Kultur wurde in 4 ml Nährmedium der gleichen Zusammensetzung, wie vorstehend, inokuliert und bei 34 ºC in einer Schüttelkultur kultiviert. Sobald die Trübung der Kultur bei 562 nm einen Wert von 0,8 erreichte, wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in dem gleichen Puffer (5 ml) suspendiert, und dann wurden 5 ml 50 NIM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 500 µg N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde unter Eiskühlung 4.0 min stehengelassen. Die so behandelten Zellen wurden mit dem gleichen Puffer gewaschen, darauf in 5 ml des gleichen Puffers redispergiert und sodann auf eine Agarplatte aufgetragen, die in ihrem Medium die gleichen, vorerwähnten Nährstoffe enthielt. Nach dem Züchten bei 34 ºC während 2 Tagen wurde Wachstum vön Kolonien festgestellt. Danach wurde ein mit Dinatrium-4-nitrophenylphosphat-Lösung / 50 mM Trispuffer (pH 8,8) getränktes Filterpapier auf die Platte gelegt und die Platte mit dem Filterpapier 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Da sich Kolonien von Stämmen mit hoher Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP gelb färben, wurden Stämme mit verringerter Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP als Kolonien mit nur schwacher Geibfärbung selektiert.
- Der Elternstamm (Bacillus subtilis AJ12643) und die wie vorerwähnt erhaltenen Varianten wurden getrennt in Flüssignährmedien mit der vorerwähnten Zusammensetzung inokuliert und bei 34 ºC 16 h einer Schüttelkultur unterzogen. Die gewachsenen Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und mit physiologischer salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden sodann suspendiert und mit Hilfe eines Ultraschallhomogenisators mit einer Leistung von 200 W 7 min behandelt. Die erhaltene, die homogenisierten Zellen enthaltende Lösung wurde einer Lösung von 40 mM 5'-GMP (Endkonzentration) in 200 mM MOPS-Puffer (pH 7,0) zugegeben, und die Umsetzung wurde bei 34ºC während 2 h durchgeführt. Die Aktivität der Stämme zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP wurde durch quantitative Analyse von Guanosin mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (Säule: CPK-08, hergestellt von Mitsubishi Kasei Corp.; Elutionsmittel: 3 % Lithiumformiat (pH 4,75); Detektion: UV mit einer Wellenlänge von 260 nm) bestimmt. In einem gesonderten Test wurden die Stämme in das vorstehend beschriebene, flüssige Nährmedium (4 ml) inokuliert und bei 34 C 16 h kultiviert. Die erhaltenen Kulturen wurden in ein Medium zur Produktion von Riboflavin mit der in Tabelle 1 angeführten Zusammensetzung inokuliert (Inokulationsmenge = 5 %), bei 34 C 3 Tage kultiviert, und es wurde die Fähigkeit der Stämme zur Produktion von Riboflavin bestimmt. Tabelle 1
- (Hinweis) * : Produkt der Ajinomoto Corp.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Wie aus dieser Tabelle ersichtlich, wiesen alle erhaltenen Mutanten eine verringerte Fähigkeit zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP auf, konnten jedoch im Vergleich mit dem Elternstamm, Bacillus subtilis AJ12643, Riboflavin in größeren Mengen anreichern. Tabelle 2
- Eine der vorerwähnt erhaltenen Mutanten (Bacillus subtilis NO. 189) wurde einer mutation-induzierenden Behandlung, ähnlich, wie vorstehend beschrieben, unter Erhalt von Bacillus subtilis AJ12644 (FERM BP-3855) unterworfen, der eine weiter verringerte Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP aufwies. In Tabelle 3 sind deren Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-GMP und die Menge an in den Kulturbrühen angereichertem Riboflavin angegeben. Tabelle 3
- Riboflavin wird in vivo über ein Nukleotid, wie 5'-IMP, 5'-GMP und 5'-GTP, synthetisiert.. Deshalb werden, wenn ein Mikroorganismus eine hohe Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-Nukleotiden aufweist, 5'-Nukleotide dephosphoryliert und aus der Zelle freigesetzt. Vermutlich sind die erfindungsgemäßen Mutanten, die eine verringerte Aktivität zur Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-Nukleotiden aufweisen, mit größeren Mengen an Ausgangsstoffen für die Synthese von Riboflavin ausgestattet, wodurch Riboflavin in erhöhter Menge angereichert werden konnte.
- Zur Herstellung von Riboflavin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mutanten kann ein übliches Flüssigmedium verwendet werden, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffguellen, anorganische Salze und, erforderlichenfalls, geringe Mengen an organischen Nährstoffen, wie auch von den Mikroorganismen benötigte Nährstoffe enthält. Jegliche Kohlenstoffquellen können verwendet werden, mit der Maßgabe, daß sie durch die eingesetzten Mutanten assimilierbar sind. Beispiele für solche einsetzbaren Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Sucrose, Melassen, hydrolysierte Produkte aus Stärke und dergleichen. Beispiele für einsetzbare Stickstoffquellen umfassen Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniak und dergleichen. Beispiele für organische Spurennährstoffe umfassen Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren und Nukleinsäuren. Es ist ebenso möglich, andere Materialien zu verwenden, die organische Spurennährstoffe enthalten, z.B. Hefeextrakt, Pepton, Casaminosäuren und Hydrolyseprodukte von Soyabohnenproteinen.
- Das Züchten kann unter Belüftung unter kontrollierten Bedingungen bei einer Temperatur von 30 bis 40 ºC, vorzugsweise bei 34 bis 37 ºC erfolgen. Der pH-Wert des Kulturmediums wird bei 6,0 bis 7,5, vorzugsweise 6,5 bis 7, gehalten, sowohl am Beginn als auch während des Züchtvorgangs. Zum Einstellen des pH-Werts kann eine Organische oder anorganische Säure, oder eine alkalische Substanz, einschließlich Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniakgas und dergleichen, verwendet werden. Somit kann eine bemerkenswerte Menge an Riboflavin hergestellt und in 1 bis 5 Tagen im Medium angereichert werden.
- Nach dem Kultivieren kann Riboflavin aus dem Medium anhand bekannter Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel wird nach dem Entfernen der Zellen eine geeignete Menge an Hydrogensulfit zugegeben. Die erhaltene Mischung wird sanft gerührt und sodann einer Zentrifugation bei 20 ºC unter Erhalt von Rohkristallen reduzierten Riboflavins unterworfen. Die Rohkristalle werden in 1 n Essigsäurelsung suspendiert und durch Erhitzen gelöst. Verunreinigungen werden dann durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird unter Ausfallen von Kristallen abgekühlt. Die Kristalle werden danach durch Filtration gewonnen und unter Erhalt der gewünschten Riboflavinkristalle getrocknet.
- Die Erfindung soll ferner durch ein Beispiel veranschaulicht werden:
- In einen 5 l Fermenter wurden 2 l Medium mit der in Tabelle 4 angeführten Zusammensetzung gegeben, das Medium wurde erhitzt und bei 121 ºC 15 min sterilisiert. In dieses Medium wurden 100 ml einer vorstehend, durch Kultivieren von Bacillus subtilis AJ12644 in einem Flüssigmedium bei 34 C während 16 h erhaltenen Kultur inokuliert, und das Züchten wurde bei einer Temperatur von 34 ºC während 3 Tagen unter Belüften von 0,5 vvm und Rühren bei 700 upm durchgeführt, wobei der pH-Wert des Mediums unter Verwendung von Ammoniak bei 6,5 gehalten wurde. Es wurden 1,8 l einer 1,05 g/l Riboflavin enthaltenden Kultur gewonnen. Die Zellen wurden von der Kultur durch Zentrifugation entfernt und es wurden sodann 20 g Hydrogensulfit zugegeben. Nach sanftem Rühren wurde das Gemisch unter Erhalt von 1,8 g Riboflavin-Rohkristalle zentrifugiert. Die Rohkristalle wurden in 500 ml 1 n Essigsäurelösung suspendiert und durch Zugabe einer kleinen Menge gesättigtem Permanganats oxidiert. Das erhaltene Gemisch wurde sodann unter Auflösen der ausgefallenen Kristalle gekocht und daraufhin heiß futriert. Nach dem Abkühlen wurden die ausgefallenen Kristalle durch Filtration unter Erhalt von 750 mg Riboflavin gewonnen. Das Produkt wurde danach umkristallisiert, wodurch 560 mg reiner Riboflavinkristalle gewonnen wurden. Tabelle 4
- (Hinweis) * : Produkt der Ajinomoto Corp.
- Vorteilhafte Wirkung der Erfindung:
- Die erfindungsgemäßen Mutanten zeigen eine verbesserte Fähigkeit zur Produktion von Riboflavin und sind zur Produktion und Anreicherung einer bemerkenswert erhöhten Menge von Riboflavin im Vergleich zu dem Elternstamm befähigt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist deshalb als Verfahren zur Herstellung von Riboflavin in effizienter Weise bei geringeren Kosten geeignet.
Claims (7)
1. Zur Produktion von Riboflavin befähigter
Mutantenstamm von Bacillus subtilis, der eine Aktivität zur
Freisetzung von Phosphorsäure aus 5'-Guanylsäure von nicht mehr
als 0,081 µMol/min/mg Protein aufweist.
2. Mutantenstamm von Bacillus subtilis nach Anspruch 1
mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-3855.
3. Mutantenstamm von Bacillus subtilis nach Anspruch 1
mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-3856.
4. Verfahren zur Herstellung eines Mutantenstammes von
Bacillus subtilis nach einem der Ansprüche 1 bis 31 bei dem
ein Riboflavin produzierender Stamm von Bacillus subtilis
mutiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der zu mutierende
Riboflavin produzierende Stamm Adenin benötigt,
GMP-Reductase-defizient ist und gegen Purin/8-Azaxanthin resistent
ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei der
Riboflavin produzierende Stamm durch Behandlung mit chemischen
Mitteln oder durch Bestrahlung mutiert wird.
7. Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch
Fermentation, welches folgende Schritte umfaßt:
- Züchten einer Mutante von Bacillus subtilis nach einem
der Ansprüche 1 bis 3 oder einer nach einem der
Ansprüche 4 bis 6 erhaltenen Mutante von Bacillus subtilis
in einem flüssigen Fermentationsmedium,
- Anreichern von Riboflavin in dem Medium und
- Gewinnen von Riboflavin aus dem Medium.
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