DE1803978C2 - Verfahren zur Gewinnung von S-Adenosyl-l-methionin und S-Adenosyl-l-ethionin - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von S-Adenosyl-l-methionin und S-Adenosyl-l-ethioninInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von S-Adenosyl-l-methlonln und S-Adenosyl-I-ethionln
aus Hefe.
S-Adenosyl-!-methionin (kurz SAM genannt) ist eine der wichtigsten biologisch vorkommenden Schwefelverbindungen,
die bei allen enzymatlschen Transmethylierungsreaktionen als Methyldonor auftritt. Diese Methylgitippenübertragung
Ist von fundamentaler Bedeutung für die Physiologie aller Organismen und erklärt das
große Interesse der Pharmazie und Biochemie für diese Verbindung. Beispielsweise ist SAM der Methyldonor in
der Biosynthese folgender Substanzen:
N-Methyltetrahydrofolsäure, Methionin, Cholin, Adrenalin, Metadrenalin, Creatln, Anserln, 1-Methylhlstamln,
N-Methylnlcotinamld, Spermldin, Spermin, verschiedenen Alkaloiden, Ribonuclelnsäure und Desoxyrlbonuclelnsäure.
Ähnliche Eigenschaften weist das S-Adenosyl-l-ethlonln (SAE) auf.
Die Darstellung von SAM erfolgte bisher durch Methyllerung von S-Adenosyl-1-homocysteln mit Methyljodld
zum Racemat oder durch Isolierung aus Hefe.
Eine weitere Methode ist die enzymatlsche Synthese aus Adenoslntrlphosphat und I-Methionln.
Diese Verfahren sind entweder sehr aufwendig oder sie führen wie bei der Isolierung aus Hefe nur zu einer wäßrigen Lasung eines sehr unreinen Produktes. Beispielsweise erfordert die chemische Synthese S-Adenosyl-I-homocysteln, ein Produkt, das nur schwer herzustellen ist und liefert bei mäßiger Ausbeute ein nur zu 50% 4> biologisch aktives Produkt.
Diese Verfahren sind entweder sehr aufwendig oder sie führen wie bei der Isolierung aus Hefe nur zu einer wäßrigen Lasung eines sehr unreinen Produktes. Beispielsweise erfordert die chemische Synthese S-Adenosyl-I-homocysteln, ein Produkt, das nur schwer herzustellen ist und liefert bei mäßiger Ausbeute ein nur zu 50% 4> biologisch aktives Produkt.
Für ein technisches Verfahren kam daher in erster Linie die Isolierung aus Hefe in Betracht. Nach J. Blol.
Chem. 229 (1957) S. 1051-1057 erfolgte diese Isolierung bisher durch Perchlorsäureaufschluß der an SAM und
SAE angereicherten Hefe, Kationenaustauscherchromatographie mit Perchlorsäure-Elutlon, Fällung mit Phosphowolframsäure.
Auflösen des Niederschlags In Aceton/Wassergemlsch, erschöpfende wiederholte Extraktion
so mit Isoamylalkohol/Ether und dnnach mit Ether, Zersetzung des so von Zersetzungsprodukten gereinigten
Phosphowolframates mit BaCOj, Abtrennung des Niederschlags und Wiederholung der Arbeltsschritte, beginnend
mit einer zweiten Chromatographie und anschließend Lyophllislerung bei pH 3 bis 4 durchgeführt. Gemäf3
den Angaben In J. Blol. Chem. 229, ioc. clt. Ist das Produkt auch nur einige Tage haltbar, wenn es Im Desiccator
bei niedriger Temperatur aufbewahrt wird. Auch ist dieses Verfahren nicht nur aufwendig, sondern führt
auch zu einem Produkt, welches weiterhin In erheblicher Menge eine störende, nicht entfernbare Verunreinigung
enthält. Außerdem 1st die Ausbeute unbefriedigend.
Bedingt durch die chemischen Eigenschaften von SAM und SAE bereitet die Isolierung und Reinigung dieser
Verbindungen aus Hefe erhebliche Schwierigkelten.
S-Adenosyl-l-methionln bzw. -ethionin ist sehr instabil und zerfällt, je nach den Bedingungen, In verschlcw
dene Bruchstücke durch Spaltung bei A. B. C, D und E, wie die nachstehende Strukturformel zeigt:
NH2
CA
NH2
N ^i N
nAn
CH2-S-CH2-CH2-Ch-COOH
NK1
OHOH
Die Bindung A wird bevorzugt bei erhöhter Temperatur gespalten, die von B, C und E bevorzugt Im alkalischen
Medium. Bei stark saurem pH wird ebenfalls die glyfcosirMsche Bindung B zerstört.
Daraus ergibt sich, daß die Substanz nur in schwach saurem pH-Bereich stabil sein kann, was andererseits die
Isolierung und Aufarbeitung sehr erschwert.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Bedarf an SAM zu befriedigen, die Nachteile der bekannten
Verfahren zu beseitigen und ein Verfahren zu schaffen, das auch in technischem Maßstab durchführbar ist.
Nunmehr wurde überraschenderweise gefunden, daß SAM mit guter Ausbeute ohne größere Degradation aus
der Hefe Isoliert ond in stabiler fester Form ohne nicht entfernbare Verunreinigungen erhalten werden kann mit %>
dem Verfahren gemäß Anspruch 1. Die limeranspruche geben vorteilhafte Ausfühningsforrr.en dieses Verfahrens
an.
Als Ausgangsprodukt für die Isolierung dient eine in bekannter Weise durch Zusatz von Methionin bzw.
Ethlonin an SAM und SAE angereicherte Hefe, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Torulopsis. Diese Hefe
wird in bekannter Weise in saurem Milieu aufgeschlossen.
Dieser bekannte saure Aufschluß wird mit 1,5N-Perchlorsäure oder Trichloressigsäure bei Raumtemperatur
durchgeführt, wobei in mittlerer Ausbeute eine wäßrige Lösung eines Rohproduktes erhalten wird, aus welchem
die Sauren von der weiteren Aufarbeitung entfernt werden müssen. In großtechnischem Maßstab 1st diese
Methode ungeeignet. Die zur Gewinnung von Coenzymen ebenfalls häufig durchgeführte Aufschlußmethode in
der Siedehitze ist bei SAM und SAE nicht durchführbar, da hierbei die Bindung A wie oben näher erläutert M
gespalten wird. Es wurde nunmehr überraschend gefunden, und vorzugsweise wird erfindungsgemäß der
Aufschluß auf diese Weise durchgebohrt, daß durch kurzzeitiges Erhitzen der Hefe bei pH O bis 3,5 auf eine
Temperatur vnn 50 bis 700C eine wesentliche Verbesserung des Aufschlußergebnisses erzielt werden kann.
Besonders bevorzugt wird hlerbef die Verwendung von verdünnter Ameisensäure, beispielsweise mit einer
Konzentration von 0,05 bis 0,5 M, ein pH-Wert von 2,0 bis 3,0 und eine Temperatur von 60° C. Die Verwendung
von Ameisensäure unter diesen Bedingungen führt zu keiner merklichen Zersetzung der gewünschten
Verbindungen, setzt SAM und SAE praktisch quantitativ aus den Hefezellen frei und erfordert keine vorherige
Abtrennung der zum Aufschluß verwendeten Säure vor der weiteren Reinigung über einen Kationenaustauscher.
Außerdem verläuft der Aufschluß sehr rasch und trotzdem vollständig. Gut geeignet is», auch Sssigsäure.
Nach dem Aufschluß wird der gewonnene wäßrige Extrakt entweder nach Entfernung der Perchlorsäure oder ·*ο
Trichloressigsäure In bekannter Welse oder bei Verwendung von Ameisensäure direkt auf einen Kationenuustauscher
gegeben und nach Waschen mit verdünnter Mineralsäure, beispielsweise O,1N-Schwefelsäure oder
Salzsäure elulert. Als Kationenaustauscher hat sich besonders Amberlite IRC-50 bewährt.
In dem so gewonnenen sauren Eluat wird SAM bzw. SAE entweder als Plcrat gefällt oder durch Borsäure-/usatz
In den Boratkomplex überführt und in schwach-alkalischem Medium über einen Anlonenaustauscher
Chromatographien. Nach beiden Methoden gelingt es, die nach dem bisherigen Verfahren nicht abtrennbare
störende Verunreinigung zu entfernen und ein sehr reines Produkt zu erhallen. Vorzugsweise werden die beiden
erfindungsgemäßen Verfahrensschritte kombiniert In beliebiger Reihenfolge angewendet. /
Die Plcratfällung erfolgt vorzugsweise durch Zusatz einer kaltgesättigten wäßrigen Picrinsäurelösung und
Stehenlassen der so erhaltenen Mischung bei Zimmertemperatur. Es ist jedoch auch möglich, hierbei in der
Kälte zu arbeiten. Nach dem Ausfällen des SAM- bzw. SAE-Plcrates wird der Niederschlag vom Überstand
getrennt, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugleren unJ wieder gelöst. Als Lösungsmittel dient eine
Mischung aus verdünnter Mineralsäure und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel. Wegen Ihrer leichten
Entfernbarkelt als schwer lösliches Salz wird hierbei Schwefelsäure bevorzugt. Als organisches Lösungsmittel
eignen sich vor allem Alkohole und Ketone, Insbesondere Aceton. Das auf diese Welse gebildete Mineralsalz
von SAM oder SAE läßt sich durch Zugabe von weiterem organisenen Lösungsmittel wieder ausfällen, wobei
die Plcrlnsäure gelöst Im Überstand zurückbleibt. Das so erhaltene Präparat weist einen Reinheitsgrad von etwa
40% auf und enthält vor allem eine störende Komponente nicht mehr, welche bei der bekannten Fällung als
Rclncckai bzw. Phosphorwolframat nicht abtrennbar ist. Außerdem Ist die PlcrlnsSure wesentlich billiger als
diese bisher verwendeten Fällungsmittel und daher unter jedem Gesichtspunkt vorteilhafter.
Alternativ oder zusätzlich werden SAM und SAE als Boratkomplex über einen Anlonenaustauscher gereinigt.
SAM und SAE besitzen einen protonlerten Schwefel und stellen daher ein starkes Kation dar, welches von
Anlonenaustauschcrn nicht absorbiert wurde. Nunmehr wurde gefunden, daß durch Zusatz von Borsäure oder
einem geeigneten Borsäurederivat SAM und SAE einen Boratkomplex bilden, welcher an Anionenaustauschern
iidsorblerbar Ist. Weiter wurde überraschenderweise gefunden, daß dieser Boratkomplex in schwachalkallschem
Milieu In Gegensatz zu freiem SAM bzw. SAE relativ stabil Ist. Während z. B. SAM bei pH 8,8 In 24 Stunden
zu 70% gespalten wird, sinkt die Aktivität des entsprechenden Boratkomplexes In 72 Stunden beim gleichen pH-Wert
nur um 30%. Diese Stabilität ermöglicht die alkalische Chromatographie ohne wesentliche Zerstörung, da
die Bindungen B, C und E hierbei sine wesentlich erhöhte Beständigkeit aufweisen.
Die Boratkomplexlösung wird in schwach-alkalischem Medium, günstig bei pH 7,0 bis 9, auf den Anloneaaustauscher
gegeben. Bevorzugt wird ein pH-Wert von 8.
Als Anionenaustauscher eignen sich die üblichen Produkte, wie z. B. Dowex 1 χ 2. vorzugsweise an der Boratform.
Die Chromatographie wird zur Erhöhung der Stabilität des SAM bzw. SAE vorzugsweise unter Kühlung
durchgeführt, Insbesondere bei einer Temperatur zwischen 0 und 5° C. Die Elution des Anionenaustausch^«
erfolgt mit verdünnter Säure, beispielsweise Ameisensäure.
Besonders vorteilhaft ist, wie erwähnt, eine kombinierte Anwendung der beiden erfindungsgemäßen Verfahrensschritte.
Diese erfolgt vorzugsweise derart, daß zuerst die Plcratfäliung und dann die Chromatographie des
Boratkompiexes durchgeführt wird. Man erhält auf diese Weise SAM und SAE In sehr hoher Reinheit. Das
Produkt wird aus seiner wäßrigen Lösung In Form des Bisulfates durch Zusatz einer Mischung von Methanol
mit einem weiteren organischen Lösungsmittel, insbesondere einem niedrigen Keton oder Alkohol, oder einem
;,.; Ether, gefällt. Man erhält so ein farbloses Pulver, welches In der Kälte monatelang stabil ist.
φ Zur weiteren Reinigung kann günstig auch noch eine Chromatographie über Aktivkohle durchgeführt werden.
Ig 15 um begleitende Salze zu entfernen. Vorzugswelse erfolgt die Elution von SAM und SAE von der Kohle bei pH 4
g bis 5 mit einem Pyridin als Base enthaltenden Lösungsmittelgemisch. Diese Arbeitsweise Ist vorteilhafter als die
Ü übliche Elution mit Ammoniak oder Natronlauge bei pH 8.
IJ Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß eine nach den bisher
i-'-. bekannten Verfahren nicht abtrennbare störende Verunreinigung entfernt werden kann. Hierbei handelt es sich
± 20 um eine Substanz, die eine schwache Anfärbung mit Ninhydrin ergibt. Sie Iiu3l sich weder «urch den Hefeauf-Schluß
noch durch Perchlorsäure fallen. Erst ein großer Überschuß an Trichloressigsäure führt zur Ausfällung
,;. eines eiweißartigen Produktes, welches aber anschließend Im Gegensatz zu normalem Eiweiß sehr gut wasserlöslich
ist.
[■: Ein weiterer wesentlicher Vorteil des Verfahrens der Erfindung besteht in der Möglichkeit, SAM bzw. SAE In
^ Form des Sulfates auszufällen. Bisher war eine Fällung Im üblienen Sinne nicht möglich. Die im Handel erhältlichen
SAM-Präparate liegen als Jodld vor und werden aus der Lösung durch Konzentrieren bis zur Trockne
;/.' und Homogenisieren des festen Rückstandes mit absolutem Alkohol gewonnen. Auf diese Weise werden die
Verunreinigungen praktisch alle welter mitgeschleppt, während sie bei der erflridungsgemäß durchführbaren
.; Fällung abgetrennt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern Ausführungsformen der Erfindung.
10 kg an SAM nach Schlenk [Enzymologie 29, 283 (1965)] angereicherte Bäckerhefe wird In 40 1 0,1 m-Amelsensäure
suspendiert, 5 Minuten auf 60° C erhitzt und sofort wieder gekühlt. Der durch Zentrifugleren von den
Zellfragmenten befreite Überstand wird bei 0 bis 100C über eine Chromatographiesäule (Länge ca. 140 cm, 0
5,5 bis 6 cm) mit Kationenaustauscherharz Amberlite IRC-50, Ammoniumform (mit Essigsäure auf pH f>
äqulllbriert) gegeben, mit 20 ml 0,1 m-EssIgsäure gewaschen und mit 0,1 η-Schwefelsäure elulert. Die SAM-haltlgen
Fraktionen werden vereinigt (Prüfung auf SAM durch Papier- oder Dünnschichtchromatographie System Isopropanol:
H2O : Eisessig = 50 : 50 : 25. RF von SAM = 0,4), mit 8 1 einer kaitgesättigten, wäßrigen Plcrlnsäurelösung
versetzt und über Nacht stehengelassen. Der Plcratniederschlag wird abfiltrieit, mit eiskalter Plcrlnsäurelösung
gewaschen und in einer Mischung aus 800 ml Aceton und 800 mi I η-Schwefelsäure gelöst. Diese Lösung wird
unter gutem Rühren In 8 1 Aceton eingegossen, der ausgefallene Niederschlag abzentrlfuglert, 2mal mit Aceton
gewaschen und Im Vakuum getrocknet (ca. 60 g Zwischenprodukt mit etwa 40% SAM).
Die Λ0 g Zwischenprodukt werden In 300 ml dest. H2O gelöst, auf 0° C gekühlt, mit 30 g Borsäure versetzt
und mit Barytlauge auf pH 8,0 gestellt. Das ausgefallene Barlumsulfat wird abzentrlfuglert und der klare Überstand
über einen Borat beladenen Anionenaustauscher (Dowex I χ 2, 50-100 mesh, Säuiendlmenslon Länge ca.
!00 cm, 0 3 cm) bei 0 bis 50C Chromatographien. Die Säule wird mit wenig dest. Wasser von 0°C gewaschen
und mit 0,5 n-Amei^nsäure eluiert. Die SAM-haltlgen Fraktionen werden vereinigt, mit Schwefelsaure aur pH
1 bis 2 angesäuert und auf eine 1,51 Chromatographlesäule mit Carboraffin C-Kohle bei 00C aufgezogen. Die
Säule^'ird mit 5 1 eiskaltem dest. Wasser gewaschen und mit Äthanol : H2O : Pyrldln-(= 100 : 100 : 5) Gemlscn
bei 0°C elulert. Die SAM-haltlgen Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum auf ca. 300 ml konzentriert und
mit Schwefelsäure auf pH 1 angesäuert.
Diese schweielsaure Lösung wird unter gutem Rühren in eine Mischung aus 3 I Aceton und 1,3 I Methanol
ν gegossen. Der ausgefallene Niederschlag von SAM · HSO4 wird abzentrlfugiert, 2mal mit Aceton gewaschen und
Im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 25 g SAM · HSO4 mit 70% SAM,
23% SO4, 5 bis 6% H2O
23% SO4, 5 bis 6% H2O
Es wird wie im Beispiel 1 verfahren, jedoch wird das getrocknete Zwischenprodukt In 500 ml dest. Wasser
gelöst und, wie unter Beispiel I beschrieben, über eine ChromatographlesäuU: mit Csrboraffln C Kohle chromate
tographlert. Durch den Wegfall der Boratchromatographie wird die Ausbeute aul" Kosten der Rclnhcl! etwas
höher. ' ■
Ausbeute· 32 g SAM · HSO4 mit ca. 60% SAM. |
Beliplel 3
Der Hefeaufschluß und die Chromatographie über Amberllte IRC-50 werden wie unter Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt. Die vereinigten SAM-haltigen Eluate werden auf i.5l Im Vakuum konzentriert und In 151
Aceton unter gutem Rühren eingegossen. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrlfuglert, 2ma! mit Aceton
gewuschen und fm Vakuum getrocknet. Es werden etwa 130 bis 150 g rohes SAM · HSO< erhalten, die wie unter
Beispiel I beschrieben als Boratkomplex über einen Anionenaustauscher und eine Kohlesäuie chromatographlert
und anschließend gefällt werden.
durchgeführt. Die vereinigten SAM-haltigen Eluate werden auf i.5l Im Vakuum konzentriert und In 151
Aceton unter gutem Rühren eingegossen. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrlfuglert, 2ma! mit Aceton
gewuschen und fm Vakuum getrocknet. Es werden etwa 130 bis 150 g rohes SAM · HSO< erhalten, die wie unter
Beispiel I beschrieben als Boratkomplex über einen Anionenaustauscher und eine Kohlesäuie chromatographlert
und anschließend gefällt werden.
Ausbeute: 30 bis 32 g SAM · HSO4 mit ca. 60% SAM.
Claims (7)
1. Verfahren zur Gewinnung von S-Adenosyl-l-methlonln und S-Adenosyl-I-ethionin aus Hefe durch
sauren Aufschluß der an SAM und SAE angereicherten Hefe, Kationenaustauscherchromatographie und
Reinigung und Isolierung Ober eine Ausfällung als Salz, dadurch gekennzeichnet, daß man die
gewünschten Verbindungen aus dem sauren Eluat der Kationenaustauscherchromatographie mit Picrinsäure
ausfällt und den Niederschlag in einer Mischung aus verdünnter Mineralsaure und einem organischen mit
Wasser mischbaren Lösungsmittel löst oder dem Eluat Borsäure zusetzt und die schwach-alkalisch gestellte
Boratkomplexlösung über einen Anionenaustauscher Chromatographien oder in beliebiger Reihenfolge die
■° Pikrinsäurefällung und Boratkomplexchromatographie kombiniert durchführt und man danach das Produkt
als festes Bisulfat aus einer schwefelsauren wäßrigen Lösung mittels einer Mischung von Methanol und
einem weiteren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem niedrigen Keton oder Alkanol, ausfällt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der saure Aufschluß der Hefe durch kurzes
Erhitzen auf 50 bis 70° C bei pH 0 bis 3,5, vorzugsweise 2,0 bis 3,0, durchgeführt wird.
i-s 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß verdünnte Ameisensäure verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausfallung >}·~μ Eluat
Picrinsäurelösung zugesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Boratkomplexlosung auf pH 7,0 bis 9,
vorzugsweise 8, eingestellt wird.
-°
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Böratkörnplex unter Kühlung,
vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 bis 5° C, Chromatographien wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt vor
der Ausfällung als Bisulfat erst noch durch Chromatographie über Aktivkohle und Elution mit einem pyridinhaltlgen
Lösungsmittelgemisch bei pH 4 bis 5 entsalzt wird.
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- 1968-10-18 DE DE1803978A patent/DE1803978C2/de not_active Expired
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1970
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