DE1815225C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung von Orotidin aus einer Fermentationsflüssigkeit - Google Patents

Description

Orotidin ist das N-Ribosid des 6-Carboxyuracils, d. h. der Orotsäure. Es weist nachstehende Strukturformel auf:

M g

vn üblichen Kohlenstoffquellen, n. r-irate. Vorzugsweise wird Sac '

HO OH

35

Da die Nachfrage nach Orotidin, insbesondere als Zwischenprodukt für Synthesen in der Pyrimidinreihe, ständig steigt, besteht Bedarf nach einem zur technischen Durchführung geeigneten einfachen Gewinnungsverfahren.

Es ist bekannt, Orotidin. aus dem Mycel von pyrimidinbedüftigen Neurospora crassa-Mutanten zu gewinnen. Dieses Verfahren (USA.-Patentschrift 2 788 346) hat jedoch den Nachteil, daß die Aufarbeitung des Mycels umständlich ist, viele störende Begleitsubstanzen und Verunreinigungen entfernt werden müssen und die Ausbeute unbefriedigend ist. Ferner ist es bekannt, Orotidin aus den Wachstumsbrühen pyrimidinbedürftiger Mutanten der Bakterien- stamme Micrococcus glutamicus, Brevibacterium ammoniagenes und Corynebacterium rathayi sowie Bacillus subtilis (britische Patentschrift 1 006 732) zu gewinnen. Diese von Bakterienmutanten ausgehenden Verfahren haben den Nachteil einer gegenüber der Verwendung von Pilzmutanten wesentlich erhöhten Infektionsgefahr der Ansätze, einer schwierigeren Trennung der Zellmasse vom Medium und einer weit stärkeren Verunreinigung mit Fremdsubstanzen und Farbstoffen, so daß die Aufarbeitung der Brühen und die Reinigung des Orotidins erschwert ist.

Die Nachteile dieser bekannten Verfahren werden beseitigt durch die erfindungsgemäße Verwendung voh durch Züchten von Neurospora crassa FGSC 36 601 in hierfür üblichen Pyrimidin enthaltenden Nährmedien erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Orotidin.

Die Züchtung von Neurospora crassa 36 601 in Pyrimidin enthaltenden Nährmedien, wöbe. . .,_ots^:iure in der Fermentationsflüssigkeit erhalten .:rd. is^bereks bekann. (Journal of Biol. Chem., Vol. :-.

1948 S ^25).

Im Rahmen · ¹^r Windung können bekannte WV. hstumsmedien u-r.wndot worden, die z. B. in der I/ Λ.-Patentschrif; : "^;'^:<-" ^'' beschrieben sind. Vor,iL-sweise wird"<■■'■■ vh ei:. Medium verwendet, weites mindester..-, lli'i. , -r/ugswcise 0.02 bis 0.04 Gewiss Volumprozent -numionen und mindestens 3. ■ n_r-7uasweise 30 l·:- .·■) mg 1 Zn-Ionen enthält. Es v...,de befunden. daü -'-- -'inern derartigen Medium ,iie Ausbeute an .-..rü/.ellulärem Orotidin \veser,;--.ii gesteigert wc: ■ ·;! '-.ann.

~ Die" Züch -^; ί·:->' Neurospora crassa-Mu;.:: te erfolgt erfirii ■■_ >;iß bei einem pH-Wc-^t zwis^i.n 3.5 und 5.5. -.■>. ^ · - :ise bei pH 4,0 bis 4,4. Wäh. nd der Züchhir.izv ■ '■ -'-' ^w'^rd darauf geachtet, dal.'· ',ie KohlenstiMtqüe:.·. im Medium in genügender konzentration μ■■-';:■ .'. ! !!orderlichenfalls werden nachträglich weit·.·:-.· ! r.iien der Kohlenstoffquelle /umsetzt. Als K-'hi_ii^i-"»ii"M^ue!Ie eig^{ner s}'^{cn d}'^{e bi I<}
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Die Züehtuivj^.iauer bis zur Abtrennung des Micriorganismu^ iicu' ?m illgemeinen zwischen 8 und 14Tacen. je nachdem, ob eine Infektion erfolgte und ob die optische Dichte bei 280 m;z noch zunimmt. Gewöhnlich wird ein Endwert OD₂₈₀ zwischen 20 und 60, m¹ er/ielt

Die Gewinnung des extrazellulär akkumulierten Orotidins erfolgt" au sehr einfache Weise durch physikalische Filtration des Mycels und Isolierung des Orotidins aus dem Medium. Verfahren zur Isolierung von Or tidin aus wäßrigen Nährmedien sind bekannt und können hierzu angewendet werden. Beispielsweise kann das Orotidin durch Fällung mit Bleisubacetat in bekannter Weise isoliert werden. Nach Abtrennung des Bleis aus dem so gewonnenen Niederschlag wird das Orotidin dann in das Cyclohexylaminsalz übergeführt und eingeengt und mit organischen Lösungsmitteln gefällt.

An Stelle des bekannten Verfahrens kann eine Kohlechromatographie in saurem Medium durchgeführt werden. Hierbei wird günstig ein pH-Wert zwischen 2 und 4, vorzugsweise 2,2 bis 2,5, eingestellt. Die Elution der Kohlesäule erfolgt günstig mit neutralem oder schwach basischem Wasser-Alkohol-Gemisch.

Die Kohlechromatographie kann vorteilhaft mit weiteren Reinigungsschritten kombiniert werden. Besonders günstig ist als nächster Schritt eine Chromatographie an einem Anionenaustauscher wie z. B. an einem kugelförmigem, stark basischem Polystyrol-Anionenaustauscherharz mit quaternären Benzylammoniumgruppen und mit 8% einpolymerisiertem Divinylbenzol. Zur Elution eignet sich beispielsweise eine 0,05 bis 0,1 N Ameisensäure-Ammoniumformiatlösung. An Stelle der Austauscherchromatographie oder im Anschluß an diese kann die Kohlechromatographie wiederholt werden, wobei ebenfalls vorteilhaft die oben angegebenen Bedingungen eingehalten werden. Weiterhin wurden günstige Ergebnisse erhalten, wenn im Anschluß an die erste oder an die zweite Kohlechromatographie eine erneute Ionenaustauscherchrpmatographie durchgeführt wird, beispielsweise unter Verwendung eines kernsulfonierten Poly-

Ntyrolharzes von kugelförmigem Korn mit 8% einpolymerisienem Divinylbenzol. Falls diese zweite lonenaustauscherchromatographie im Anschluß an eine zweite Kohlechromatographie durchgeführt wird, erhält man ein besonders reines Produkt. Bei An- »\ endung dieser zweimaligen Wiederholung der Kohlehromatographie und der Austauscherchromatographie erhält man eine Ausbeute von etwa 40 g pro i'iOl Medium an 95- bis 100%ig reinem Orotidin. Die Feinreinigung an einem kernsulfonierten PoIyi\rolharz von kugelförmigem Korn mit 8% ein- : ülymerisiertem Divinylbenzol läßt sich jedoch auch .iirekt nach der ersten Kohlechromatographie anu enden und führt auf diese Weise ebenfalls zu einem ; Todukt sehr guter Reinheit. Dies gilt in noch höherem Maße dann, wenn zwei Kohlechromatographieschritte unmittelbar hintereinandergeschaltet wurden ohne vnwcndung einer ernten Anionenaustauscherehroniatügraphk. Bei der Austauscherfeinchromatographie. z. B. an dem obigen kernsulionierten Polystyrolharz, wird der Austauscher gewöhnlich in H ⁺ -Form verwendet. Es ist jedoch auch möglich, statt dessen einen mit Cyclohexylamin beladenen Austauscher /u verwenden, wobei die Umsetzung des Salzes mit dem Cyvlohexylamin nach Durchführung der Reinigungsschritte in Wegfall kommen kann. Ein ganz besonders einfaches Verfahren besteht daher darin, nach Durchführung der ersten Kohlechromatographie sofort eine Ionenaustauscherchromatographie über einen mit Cjw-lohexvlamin beladenen Ionenaustauscher, wie des obige 1! ernsui'.mierte Polystyrolharz, durchzuführen und aus dem Durchlauf direkt das C yclohexylammoniumsalz des )rotidins zu kristallisieren.

Es ist auch möglich, das Orotidin in Form anderer Salze zu gewinnen, beispielsweise in Form des Natriumsalzes. So kann die jeweils erhaltene Orotidinfraktion bis zur Sirupkonsistenz eingeengt, mit Methanol oder einem anderen niedrigen Alkohol abgedampft und dann mit einem Natriumsalz, vorzugsweise NaJ-Lösung in Aceton, versetzt werden. Man erhält so direkt das Natriumsalz des Orotidins in nahezu quantitativer Ausbeute. Das Natriumsalz läßt sich hierbei mit Aceton frei von restlichem NaJ waschen. Auf die Isolierungsmethoden zur Gewinnung des Orotidins wird hier kein Wert gelegt.

Die Erfindung ermöglicht eine wesentliche einfachere Gewinnung von Orotidin als das bekannte Verfahren unter Verwendung von Neurospora crassa (USA.-Patentschrift 2 788 346) und ergibt demgegenüber eine etwa lOfach größere Ausbeute. Gegenüber der Verwendung von Bakterienmutanten (britische Patentschrift 1 006 732) erlaubt sie die Züchtung in einem sauren pH-Wert-Bereich, bei dem die sonst vorhandene Infektionsgefahr wesentlich herabgesetzt ist. Ferner ist die Abtrennung der Zellmasse vom Medium bei Neurospora crassa (FGSC 36601) wesentlich einfacher als beim Arbeiten mit Bakterien, was für das Arbeiten in technischem Maßstab von großer Bedeutung ist. Schließlich sind auch Bakterienkulturmedien erfahrungsgemäß stärker mit Fremdsubstanzen und Farbstoffen verunreinigt wie Neurospora crassa-Kulturmedien, so daß sich eine grundsätzlich einfachere Reinigung sowie reinere Endprodukte ergeben. Die Nacharbeitung der bekannten Verfahren unter Verwendung von Bakterien hat ergeben, daß es außerordentliche Schwierigkeiten bereitet, ein auch nur einigermaßen reines Produkt zu erhalten.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter. Beispiel 1

In einer 200-1-Umlaufapparatur werden 100 1 eines sterilen Mediums der nachstehend beschriebenen Zusammensetzung mit 4 1 einer Neurospora crassa-36601 Kultur beimpft.

Zusammensetzung des Mediums

Ammoniumtartrat 500 g

Ammoniumnitrat 100 g

K₂HPO₄ 100 g

werden in 85 1 entsalztem Wasser im Kessel aufgelöst und sterilisiert. Dann werden 2 kg Saccharose in 2x51 entsalztem Wasser sterilisiert.

MgSO₄ -7H₂O 50 g

NaCl 70 g

CaCI₂ 10 g

Cytidinsulfat 1.5 g

ZnSO₄-7 H₂O 10 g

Spurenelementlösung 100 ml

werden in 5 1 entsalztem Wasser gelöst und sterilisiert.

Dann werden sämtliche Lösungen steril vereinigt.

Während der Fermentation im Umlaufapparat

wird der pH-Wert durch Zusatz von Ammoniak zwischen 4,0 und 4,4 gehalten. Nach 3 Tagen wird die Saccharosekonzentration bestimmt und auf 10 g 1 nachgestellt. (Dann wird die Saccharosekonzentration täglich kontrolliert und auf den angegebenen Wert nachgestellt.) Die Fermentation wird fortgesetzt, bis die optische Dichte OD₂₈₀ZmI zwischen 20 und 60 liegt (etwa 8 bis 14 Tage).

Danach werden die Organismen abzentrifugiert. Der überstand wird auf pH "".,3 eingestellt und" dann auf eine Kohlesäule gegeben. Die Kohlesäule wird auf 340 ml Naßvolumenkohle pro 100 000 OD₂₆₀ dimensioniert. Nach saurem und neutralem Waschen wird mit einer Mischung von Äthanol und Wasser 1:1, die 2 ml Ammoniak im Liter enthält, eluiert.

Die Hauptmenge des Orotidins erscheint in den ersten 51 Eluat. Die orotidinhaltigen Fraktionen werden vereinigt, konzentriert und stehengelassen. Auskristallisiertes Uracil bzw. Orotsäure wird abgetrennt und das Konzentrat auf eine Säule mit einem kugelförmigen, stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherharz mit quaternären Benzylammonium-

5J Gruppen und mit 8% einpolymerisiertem Divinylbenzol in Formiatform gebracht. Nach Waschen mit Wasser wird mit 0,077 N-NH₄OOCH/HCOOH (Herstellung: 1,4N-HCOOH und 0,8N-NH₄OOCH 1 : 1 mischen und mit H₂O die Normalität an

. 55 NH₄OOCH einstellen) eluiert.

Die orotidinhaltigen Fraktionen werden vereinigt, auf pH 2,3 eingestellt und erneut auf einer Kohlesäule, wie oben, Chromatographien. Aus dem Eluat wird nach Zusatz von Cyclohexylamin das Orotidin-

.60 Cyclohexylaminsalz durch Stehenlassen in der Kälte kristallisiert.

Beispiel 2

Es wird wie im Beispiel 1 beschrieben vorgegangen. Das Eluat der zweiten Kohlechromatographie wird jedoch zur Entfernung von NH₃ und Alkohol eingeengt und auf eine Säule mit einem kernsulfoniertem Polystyrolharz von kugelförmigem Korn mit 8%

einpolymerisiertem Divinylbenzol in H'-lorni gegeben. Der Durchlaut'wird mn 2,5 g CvclolKxylamir. je (jramni Oroiidin versetzt, kenzentriert und mit Methanol aufgenommen. Das Einengen und Abdampfen mit Methanol wird mehrfach wiederholt

und das schließlich erhaltene sirupöse konzentrat mit wenig Aceton versetzt. Nach Stehenlassen und Anreiben in der Kälte tritt Kristallisation ein.

Ausbeute: etwa 40g pro 100 1 Medium 95- bi-, lOO'Oises Orotidin.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verwendung von durch Züchten von Neurospora crassa FGSC 36 601 in hierfür üblichen Pyrimidin enthaltenden Nährmedien erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Orotidin.