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Verfahren zur Herstellung von N-Glykosiden Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von N-Glykosiden aus Zuckern und bestimmten Stickstoffbasen
in Gegenwart von Polyphosphorsäureestern. Letztere werden im folgenden meist kurz
als PPE bezeichnet.
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Nucleoside waren bisher sehr schwer synthetisch zugänglich. Gerade
diese Nucleoside haben eine große Bedeutung, da sie zum Teil in verschiedenen pharmazeutisch
wichtigen Naturstoffen vorkommen und auch als antibiotisch wirksam bekannt sind.
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Im allgemeinen wird zur Herstellung von Nucleosiden zunächst die Stickstoffbase
chloriert. dann hieraus das Chlorquecksilber- oder Silbersalz hergestellt und dieses
mit dem Cl-Halid eines peracetylierten Zuckers umgesetzt. Die nächsten Reaktionsschritte
bestehen dann in einer Entacetylierung des Zuckers und der reduktiven Halogenabspaltung
mit Hilfe eines Katalysators. Entsprechend der großen Anzahl der Reaktionsstufen
sind die Ausbeuten im allgemeinen sehr gering. Hinzu kommt, daß die Halide der Ketosen,
insbesondere der 2-Desoxyaldosen und der 2-Desoxy-2'-amino-aldosen, sehr unbeständig
sind. So gelang die Synthese des Desoxyribosyladenins erst 1960 -H. V e n n e r
mit einer Gesamtausbeute unter 1% (»Chemische Berichte«, Bd. 93, 1960, S. 140).
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Ferner wurde beobachtet, daß die Silber- oder Quecksilbersalze verschiedener
Stickstoffbasen nur schwer mit den Zuckerhaliden reagieren und sich in der Hitze
zersetzen.
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Es wurde nun gefunden, daß man N-Glykoside in einfacher Weise und
in guter Ausbeute herstellen kann, wenn man in einem inerten Lösungsmittel auf einen
Zucker oder ein Zuckerderivat mit freier Carbonylfunktion in Gegenwart überschüssigen
Polyphosphorsäureesters, der durch Umsetzung von Phosphorpentoxyd mit einer Alkoxygruppen
enthaltenden Verbindung hergestellt worden ist, eine heterocyclische Verbindung,
die im Ring mindestens eine Iminogruppe enthält, im Uberschuß bei einer Temperatur
von etwa 0 bis 60°C einwirken läßt und das N-Glykosid in üblicher Weise abtrennt.
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Als Zucker eignen sich für das Verfahren gemäß der Erfindung sowohl
Aldosen, wie Triosen, Tetrosen, Pentosen, Hexosen und Heptosen, als auch die entsprechenden
Ketosen. Beispielsweise seien Arabinose, Ribose, Fructose, Glucose, Galactose, Erythrose
und Threose genannt. Außer diesen einfachen Zuckern kommen Zuckerderivate, die eine
freie Carbonylfunktion aufweisen, wie Desoxyzucker, z. B. Rhamnose und Desoxyribose,
acylierte Aminozucker, z. B. N-Acetylglucosamin und Oligosaccharide wie Lactose
und Maltose in Betracht. Selbstverständlich können auch solche Zuckerderivate, in
denen eine oder mehrere Hydroxylgruppen veräthert oder verestert sind, als Ausgangsstoffe
eingesetzt werden. Es sei besonders erwähnt, daß als Zuckerkomponente auch Apurinsäuren,
die bekanntlich (»J. Biol. Chem.«, Bd. 195, 1952, S. 49) dadurch entstehen, daß
man aus Nucleinsäuren in schwach saurer Lösung die Purinreste abspaltet und die
Aldehydfunktion der Ribose bzw. Desoxyribose freilegt, ohne daß dabei der Polymerisationsgrad
der Nucleinsäuren beeinträchtigt wird, verwendet werden können.
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Als Stickstoffbasen kommen heterocyclische in Betracht, die am Stickstoffatom
ein Wasserstoffatom tragen. Hierunter sind auch solche zu verstehen, die nur in
der tautomeren Form dieser Bedingung genügen. Als Beispiele seien Piperidin, Morpholin,
Pyrrolidin, Indol sowie Basen, die sich vom Pyrimidin ableiten, wie Cytosin, 5-Methylcytosin,
5-Hydroxymethylcytosin, Uracil, Thymin, Orotsäure und solche, die sich vom Imidazol
ableiten, wie Adenin und Guanin, genannt.
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Die erfindungsgemäß als Kondensationsmittel dienenden Polyphosphorsäureester
können z. B. nach der in »Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft«, Bd.43,
1910, S. 1857, beschriebenen Methode hergestellt werden.
Der Reaktionsverlauf
sei am Beispiel der Herstellung von Adenosin schematisch wiedergegeben.
PPE reagiert zunächst mit der acetalischen Hydroxylgruppe des Zuckers zu einer reaktionsfähigen
Verbindung, die keine reduzierenden Eigenschaften und keine Aldehydfunktion mehr
zeigt. Bei der Aufarbeitung der aktiven Verbindung der Glucose wurde Glucose-l-phosphat
erhalten. Es kann somit als sicher angesehen werden, daß zunächst eine Veresterung
der acetalischen Hydroxylgruppe mit PPE erfolgt. Die aktive Verbindung ist jedoch
nicht identisch mit dem 1-Phosphat, da dieses nicht reaktionsfähig ist. Es ist besonders
bemerkenswert, durch PPE bevorzugt die acetalische Hydroxylgruppe aktiviert wird
und daher ein Schutz der übrigen Hydroxylgruppen wie bei den üblichen Verfahren
nicht mehr nötig ist. Das Verfahren gemäß der Erfindung stellt somit eine wesentliche
Vereinfachung der Nucleosidsynthese dar.
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Es wird angenommen, daß durch den Rest des PPE die Elektronenkonfiguration
am Cr-Atom so verändert wird. daß nunmehr leicht eine Substitution durch eine Stickstoffbase
erfolgen kann. Es ist bemerkenswert. daß bei Stickstoff enthaltenden Heterocyclen,
die außerdem noch eine Aminogruppe besitzen, z. B. Aminopurin, bevorzugt das ringständige
Stickstoffatom reagiert. So erhält man z. B. aus Adenin und Ribose das 9-ß-Ribosyladenin.
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Die Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung erfolgt zweckmäßig
in der Weise, daß man den Zucker in Gegenwart von PPE auf einen Uberschuß an Stickstoffbase
einwirken läßt. Vorteilhaft verfährt man so, daß man die überschüssige Base in einem
inerten Lösungsmittel löst, PPE zusetzt und eine Lösung des Zuckers langsam zugibt.
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Die Isolierung der Verfahrensprodukte erfolgt zweckmäßigerweise so,
daß man zunächst das Lösungsmittel abdampft oder durch Fällung der Reaktionsprodukte,
z. B. mit Äther, das Lösungsmittel entfernt. Anschließend kann man das Reaktionsprodukt
mit Wasser versetzen, wobei PPE in Orthophosphat zerlegt wird. Dann wird das Phosphat,
z. B. mit Bariumhydroxyd, entfernt, und aus der eingeengten Mutterlauge werden die
Nucleoside in der üblichen Weise durch Kristallisation oder Chromatographie weitergereinigt.
Man kann aber auch so vorgehen. daß man zunächst die Reaktionsprodukte mit Chloroform
oder einem ähnlichen polaren Lösungsmittel ausfällt, wobei der nicht umgesetzte
PPE in Lösung bleibt und dann anschließend die ausgefällten Nucleoside weiterreinigt.
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,Als Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich
solche, in denen die Zucker und die Basen gut löslich sind und die selbst nicht
mit den Reaktionskomponenten reagieren. In Frage kommen insbesondere Ester und Alkylamide
verschiedener Säuren, z. B. Diäthylphosphit, Phosphorsäure - tris - dimethylamid,
Dimethylsulfoxyd, Formamid oder besonders Dimethylformamid. Die Gegenwart kleiner
Mengen Wasser stört nicht. Es kann sogar, wenn auch mit geringerer Ausbeute, in
wäßriger Lösung gearbeitet werden.
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Der Vorteil des Verfahrens gegenüber den bekannten Methoden liegt
vor allem darin, daß es die Herstellung von Nucleosiden aus Zuckern und Basen in
einer einstufigen Reaktion gestattet und die umständliche Bereitung der obenerwähnten,
teilweise sehr labilen Zwischenprodukte überflüssig macht. Das Verfahren zeichnet
sich ferner durch sehr milde Reaktionsbedingungen aus. so daß es auch bei empfindlichen
Reaktionspartnern anwendbar ist. Ein weiterer bemerkenswerter Vorzug ist, daß weder
die Komponenten noch die Lösungsmittel in wasserfreier Form eingesetzt werden müssen.
so daß z. B. die übliche kristallwasserhaltige Glucose verwendet werden kann. Schließlich
läßt sich der überschuß der Base leicht unverändert zurückgewinnen.
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Die Verfahrensprodukte können auf Grund ihrer pharmakodynamischen
Wirkung teils direkt als Arzneimittel, teils als Zwischenprodukte zur Herstellung
von Pharmazeutika verwendet werden. So dienen z. B. Adenosin als Kreislaufmittel
und Psicofuranin als Cytostaticum, während 2-(2'-Desoxy - D - ribofuranosyl) - 6
- methyl - asym - triazin-3,5-(2,4)-dion (Azathymidin, »J. Am. Chem. Soc.«, Bd.
80, 1958, S. 1138) als Inhibitor der DNS-Synthese wirkt. Die bei Verwendung
von Apurinsäuren nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhältlichen Nucleinsäuren
haben erheblichen Einfluß auf den Zellstoffwechsel und können als Cytostatika. z.
B. als Inhibitoren von Bakterien, oder zur Transformation von Organismen, z. B.
zur Herstellung von Virus-Mutanten, verwendet werden. Beispiel 1 9-N-[I'-ß-Ribosyl]-adenin
Es werden 1 g Adenin in 50 ml Dimethylformamid unter Zugabe einiger Tropfen konzentrierter
Salzsäure gelöst, 5 g PPE hinzugegeben und langsam unter Rühren 100 mg D-Ribose
- gelöst in 50 ml Dimethylformamid - zugetropft. Nach einer Reaktionsdauer von etwa
20 Stunden bei 50 bis 60°C wird die Lösung in Chloroform eingegossen. Hierbei fällt
das Reaktionsgemisch aus, und unverbrauchter PPE bleibt in Lösung. Zur Reinigung
wird der Niederschlag in Wasser gelöst, die Lösung mit Bariumhydroxydlösung und
einem gleichen Volumen
an Äthanol versetzt, mit Schwefelsäure neutralisiert,
vom ausgefallenen Bariumsulfat abzentrifugiert und im Rotationsverdampfer eingeengt.
Hierbei fällt der größte Teil des Adenins aus. Die vollständige Reinigung des Adenosins
erfolgt nach W. E. C o h n (»J. Am. Chem. Soc.«, Bd. 72, 1950, S. 1471) über
eine »Dowex - 1 - formiat« - Ionenaustauschersäule. Ebenso gut ist die Reinigung
über eine »Dowex-1-borat«-Säule nach J. X. K h y m und W. E. C o h n (»The Nucleic
Acids«, Bd. I, S. 237).
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Die Ausbeute an Adenosin, bezogen auf die eingesetzte Ribosemenge,
beträgt 400(0. Das so erhaltene Adenosin ist, wie der Vergleich der IR- und UV-Spektren
mit den Spektren eines authentischen Präparates zeigt, mit diesem identisch.
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Systematische Variation der Versuchsbedingungen ergab, daß die Ausbeute
an Nucleosid von dem Mengenverhältnis Base-Zucker abhängt. Bei einem Verhältnis
von 2 : 1 beträgt die Ausbeute 10 bis 200io, bei einem Verhältnis von 10: 1 4001o
und bei einem Verhältnis von 20 : 1 rund 800j0, jeweils bezogen auf eingesetzten
Zucker. Beispiel 2 9-N-[1'-@-(2'-Desoxy)-ribosyl]-adenin 500 mg Adenin werden. wie
oben beschrieben, unter Zusatz einiger Tropfen konzentrierter Salzsäure in 20 ml
Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 0,5 g PPE und läßt im Laufe von
5 Stunden 50 mg 2'-Desoxyribose, gelöst in 10 ml Dimethylformamid, unter Rühren
zutropfen. Nach etwa 20 Stunden bei 50 bis 60°C wird die Reaktionslösung ähnlich
wie im Beispiel 1 durch fraktionierte Kristallisation und Säulenchromatographie
aufgearbeitet. Die Ausbeute beträgt 300/0, bezogen auf eingesetzte 2'-Desoxyribose.
Die Identifizierung des 2'-Desoxyadenosins erfolgte spektroskopisch durch Vergleich
der UV-Extinktionskurve und papierchromatographisch durch Vergleich der Rf-Werte
mit den entsprechenden Werten einer authentischen Probe. Beispiel 3 N-(2'-Fructosyl
)-adenin 500 mg Adenin werden. wie oben beschrieben. in 20 ml Dimethylformamid und
etwas konzentrierter Salzsäure gelöst, etwa 0,5 g PPE hinzugefügt und im Laufe von
5 Stunden 50 mg D-Fructose, gelöst in 10 ml Dimethylformamid, zugetropft. Die Reaktionsbedingungen
und die Aufarbeitung entsprechen der im Beispiel 1 angegebenen Arbeitsweise. Die
Ausbeute an Fructosyl-adenin, bezogen auf eingesetzte Fructose. ist annähernd quantitativ.
Das Reaktionsprodukt liefert bei der Hydrolyse wieder Adenin und eine Zuckerkomponente,
welche sich chromatographisch wie Fructose verhält.
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UV-Absorption im", 285 m#t. Rf-Wert im System Amylalkohol-5%iges sekundäres
Phosphat (1 : 1) 0,82.
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Beispiel 4 9-N-[1'-(2'-Desoxy-2'-N-acetylamino)-glucosyl]-adenin Nach
der im Beispiel l angegebenen Vorschrift erhält man durch Umsetzung von 500 mg Adenin
in 20 ml Dimethylformamid unter Zusatz von 0.5 g PPE und 50 mg N-Acetylglucosamin,
gelöst in 10 ml Dimethylformamid, die obengenannte Verbindung in einer Ausbeute
von rund 30% (bezogen auf eingesetztes N-Acetylglucosamin).
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UV-Absorption ama2 260 m#z. Rf-Wert im System Amylalkohol-5%iges sekundäres
Phosphat (1 : 1) 0,73.
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Beispiel 5 Einbau von Adenin in Apurinsäure a) Eine Lösung von 1 g
Thymus-Desoxyribonucleinsäure in 100 ml Wasser wird durch Zugabe von Salzsäure auf
einen pH-Wert von 2,4 eingestellt und 20 Stunden auf 37°C gehalten. Hierbei werden
die Purinbasen weitgehend abgespalten. (Die Hydrolyse der so erhaltenen Apurinsäure
ergibt auf dem Chromatogramm keine nennenswerten Mengen an Adenosin und Guanosin.)
b) Durch Dialyse gegen steigende Konzentrationen an Dimethylformamid wird die nach
a) erhaltene Apurinsäure in reinem Dimethylformamid gelöst. Dieser Lösung (etwa
120 ml) werden 5 g PPE zugegeben. Ferner wird 1 g Adenin mit einigen Tropfen konzentrierter
Salzsäure in 60 ml Dimethylformamid gelöst und diese Lösung zu der Apurinsäure-PPE-Lösung
unter Rühren hinzugegeben. Nach 20 Stunden bei 55'C wird der Ansatz mit Wasser verdünnt
und mehrere Tage gegen Wasser dialysiert.
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Das Reaktionsprodukt zeigt im Gegensatz zur Apurinsäure keine Aldehydreaktion
mehr. Chromatographisch läßt sich die theoretisch zu erwartende Menge an Adenosin
nachweisen. Hieraus ergibt sich eine quantitative Umsetzung der freien Aldehydgruppen
der 2-Desoxyribose. Für die natürliche Konfiguration des Syntheseproduktes spricht,
daß dieses durch Desoxyribonuelease und Schlangengiftdiesterase hydrolysiert wird.
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Beispiel 6 Einbau verschiedener radioaktiver Heterocyclen in Apurinsäure
Zu einer Lösung von 10 mg Apurinsäure und 0,5 g PPE in 20 ml Dimethylformamid gibt
man eine Lösung von 160 mg Adenin in 5 ml Dimethylformamid. Die Radioaktivität des
Adenins betrug 8 #tC. In einer Kontrolle wird der PPE durch eine gleiche Menge an
Phosphorsäure ersetzt. Nach einer Reaktionszeit von 23 Stunden bei 37°C werden die
beiden Ansätze in der im Beispiel s beschriebenen Weise durch mehrtägige Dialyse
aufgearbeitet. Der Vergleich der Radioaktivität zwischen Versuchsansatz und Kontrolle
ergab eine Einbaurate von 96%. Der Einbau wurde durch enzymatische Hydrolyse und
Isolierung des markierten 2-Desoxyadenosins bestätigt.
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In analoger Weise wurden die nachstehend aufgeführten radioaktiven
Basen mit der oben beschriebenen Apurinsäure umgesetzt und die jeweilige Einbaurate
bestimmt. Guanin . . . . . . . . . . . . . . . Einbaurate 40% Orotsäure . . . .
. . . . . . . . . Einbaurate 40% Thymin ............... Einbaurate 50?c, Uracil
................ Einbaurate 80,',) Die Pyrimidine werden im allgemeinen langsamer
eingebaut als Purine. Durch Verlängerung der
Reaktionszeiten läßt
sich jedoch die Einbaurate erhöhen.
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Beispiel 7 2'-Desoxy-2'-amino-glucosyl-adenin 500 mg Adenin und 4
g PPE werden in 75 ml Dimethylformamid unter Rühren gelöst und mit 100 mg D-Glucosaminhydrochlorid
versetzt. Nach einer Reaktionsdauer von 3 Stunden bei 50°C wurde das Dimethylformamid
im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in Wasser aufgenommen und mit Natronlauge
neutralisiert. Das Nucleosid wird aus der Lösung chromatographisch in einer Ausbeute
von 20% als einheitliche Substanz abgetrennt.
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Rf-Wert im chromatographischen System Butanol-Eisessig-Wasser (5 :
1 : 4) 0,36 (vgl. Rf-Werte im gleichen chromatographischen System von Adenosin:
0,407 und von Adenin: 0,513). UV-Absorption ;.max 260 mu.. Beispiel 8 3-[D-Ribosyl]-1,5-Dimethyl-5-cyclohexenylbarbitursäure
500 mg 1,5-Dimethyl-5-cyclohexenylbarbitursäure und 1,3 g PPE werden in 75 ml Dimethylformamid
gelöst und unter Rühren mit 100 mg Ribose versetzt. Nach einer Reaktionsdauer von
4 Stunden wird das Dimethylformamid im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in
etwa 5 ml Wasser aufgenommen. Hierbei fällt die nicht umgesetzte 1,5-Dimethyl-5-cyclohexenylbarbitursäure
vollständig aus. Aus der filtrierten Lösung läßt sich das Ribosid der 1,5-Dimethyl-5-cyclohexenylbarbitursäure
als einheitliche Substanz in einer Ausbeute von 220% isolieren.
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Rf-Wert im System Amylalkohol-5%iges sekundäres Phosphat (1 : 1) 0,56
(vgl. Rf Wert von 1.5-Dimethyl-5-cyclohexenylbarbitursäure im gleichen System: 0,11).
Das UV-Spektrum ähnelt dem der 1,5-Dimethyl-5-cyclohexenylbarbitursäure, ist jedoch
nicht damit identisch. Beim Besprühen mit Silbernitrat gibt die Substanz die für
Riboside charakteristische Zuckerreaktion. Auffallend ist die gegenüber 1,5-Dimethyl-5-cyclohexenylbarbitursäure
stark erhöhte Löslichkeit in Wasser.