DE1595937A1 - Kristalline 5'-Guanylsaeure und Verfahren zu deren Gewinnung - Google Patents

Description

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF DR. HANS-A. BRAUNS

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19· Juni 1969 9167 (M 65 442)

P 15 95 937. Neue Unterlagen

MERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065* V. St. A.

Kristalline 5'-Guanylsäure und Verfahren zu deren Gewinnung

5¹~Guanylsäure* die auch als Guanosin-5¹-monophosphat bekannt 1st, und ihre Salze sind wertvolle Aromatlsie-

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"*'./ i ti ja Änckirungsgea. v. 4. 9.1987?

Neue Unter!·-:"..-η ./■' n-^- -.: r.r.. y^

rungsmittel für Nahrungsmittel, Getränke und Würzen. Die Zugabe kleiner Mengen dieser Guanylsäure oder ihrer Salze erhöht den Oeschmaok verschiedener Nahrungsmittel, Oetränke und Würzen erheblich.

Da 5*-Quanylsäure in kristalliner Form schwierig zu gewinnen ist, hat man die Isolierung und Gewinnung dieses Pro» dukts aus verschiedenen Quellen, wie beispielsweise FermentatlonsbrUhen. und auf enzymatischem Weg erhaltenen Ribonueleinetturehydrolysaten, unter Anwendung kostspieliger und mühsamer Trennungs- und Reinigungsarbeitsweisen vorgenommen. Aueserdem wird das Problem der Gewinnung von Guanylaäure aus Hibonucleinsäurehydrolysaten durch das Vorhandensein anderer 5'-Nucleotide, die schwierig von der 5*-Guanylsäure zu trennen sind, kompliziert.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrene zur Gewinnung von 5*-Ouanylsäure in kristalliner Form aus wässrigen Lösungen dieses Produkte. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines Verfahrene zur " Isolierung von 5'-Guanylsäure aus enzymatisch erhaltenen RibonuoleinsHurehydrolysaten und aus Fermentationsquellen. Ein nooh anderes

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Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen kr-istalli· nen 5 '-Guanylsäuresolvats*. Andere Ziele und Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind aus der nachstehenden eingehenden Beschreibung,ersichtlich.

Es wurde nun gefunden, dass 5'»Guanylsäure in Form eines Dioxa= nat-Solvats aus sauren turässrigen Lösungen, die 1,4-Dloxan enthalten, kristallisiert. Dieses kristalline Solvat, das ia folgenden mit 1,4-Dioxanat bezeichnet wird, ist in V/asser praktisch unlöslich und kann daher aus der wässrigen Lösung leicht abgetrennt und gewonnen werden. Dieses neue kristalline Produkt bildet somit ein bequemes Eiittel zur Gewinnung von 5' -Guanylsäure aus Lösungen dieser Säure, die andere wasserlösliche Substanzen enthalten, wie beispielsweise Ribonucleinsäuren hydrolysate, Fermentaticnsquellen und dgl..

Das kristalline Dioxanat wird durch Zugabe von 1,4~Dio2:an zu einer sauren Lösung der 5^!-Guanylsäure, die einen pH-Wert zwischen etwa 0,5 und 5,0 aufweist, gebildet. Im allgemeinen wird <^as Produkt vorzugsweise aus Lösungen mit einem pH°Wert zwischen etwa 1,0 und 3,0 ausgefällt, da unter optimalen Bedingungen maximale Ausbeuten des kristallinen Dioxanats bei diesem pH-Bereich erhalten werden.

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Die Konzentration der 5'-Guanylsäure in der wässrigen Lösung ist nicht kritisch, und es wurde gefunden, dass das Produkt aus Lösungen mit einem Gehalt von nur etwa 0,2 # ausgefällt werden kann« Dies hängt jedoch teilweise von dem Vorhandensein und der Art anderer Substanzen, die ausser der 5'-Guanylsäure vorliegen, ab. Im allgemeinen ist es bevorzugt, die Ausfällung aus Lösungen mit einem Gehalt von etwa 1 bis 5 % 5'-Guanylsäure vorzunehmen, da unter diesen Bedingungen maximale Mengen an 5' · 'Guanylsäure in Form des kristallinen ^ Dioxanats gewonnen werden»

Im allgemeinen ist die zur Erzielung einer maximalen Ausbeute an 5'-Guanylsäure-dioxanat erforderliche Menge an 1,4-Dioxun weit grosser als die theoretische Menge von 1 Mol 1,4-Dioxan · je Mol 5'-Guanylsäure. Experimentell wurde festgestellt, dass unter optimalen Eedinungen für maximale Ausbeuten an 1,4-Dioxanat etwa die 16,0-fache theoretische Menge an 1,4-Dioxan erforderlich ist. Kombinationen von 1,4-Dioxan und anderen P mit Dioxan mischbaren Lösungsmitteln, wie beispielsweise

Methanol, können ebenfalls unter Erzielung ausgezeichneter ' Ausbeuten an 1,4-Dioxanat verwendet werden.

Das nach den hier beschriebenen erfindungsgemässen Verfahrensweisen erhaltene S'-Guanylsäure-dioxanat existiert als Solvat, das aus 1 Mol 5^f-Guanylsäure, 1 Mol Wasser und 1 Mol 1,4-Dioxan besteht. Das Produkt ist tatsächlich ein stabiles Solvat, das

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unter vermindertem Druck für eine beträchtliche Zeitspanne bei 1OO^eC erhitzt werden muss, bevor es gespalten wird«

Das 5'~Guanylsäure"dioxanat lässt sich leicht in ein Salz der 5'~Guanylsäure überführen, indem man es in Wasser löst, die Lösung mit Alkali neutralisiert, ein mit V/asser mischbares Lösungsmittel, in dem das Salz unlöslich ist, zu der Lösung zugibt, und das ausgefallene Alkalisalz gewinnt. Im einzelnen kann so das Natriurnsalz der 5^S-Guanylsäure durch Verwendung von Natriumhydroxyd zur Neutralisation der wässrigen 5'~Quanyl~ säure-dioxanat-Lösung und Äthanol zur Ausfällung des Natriumsalzes hergestellt werden_o Technisch kann die 5'~Guanylsäure leichter in Form eines Salzes als in Form der freien Säure ver·= wendet werden«.

Bei einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die 5'-Guanylsäure aus Lösungen von Guanin und Guanosin gewonnen werden, da weder Guanin noch Guanosin ein kristallines Dioxanat nach Zugabe von 1,4-Dioxan zu der Lösung bildet_o %

Obgleich die physikalischen und chemischen Eigenschaften der 5^f-Guanylsäure und ihrer Salze denen von Phosphorsäure ziemlich ähnlich sind, kann das. 1,4-Dioxanaftrotzdem aus einer wässrigen Phosphorsäurelösung, die 5'-Guanylsäure enthält, nach Zugabe von 1,4-Dioxan zu der Phosphorsäurelösung ausgefällt werden.

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Gemäss einer weiteren Ausführungsweise der Erfindung kann, wie ferner gefunden wurde, die 5'-Guanylsäure aus Ribonucleinsäurehydrolysaten, die andere 5'-Nucleotide, wie beispielsweise Ädenylsäure, Cytidylsäure und üridylsäure, enthalten, gewonnen werden. Keines der anderen 5'-Nucleotide bildet kristalline Solvate mit 1,4-Dioxan, und es ist daher möglich, die 5'-Guanylsäure aus wässrigen Lösungen, die diese anderen 5'»Nucleotide soTJie 5'-Guanylsäure enthalten, abzutrennen. In ähnlicher Weise ist das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von 5*-Guanylsäure aus wässrigen Lösungen, die aus Fermentationsbrühen stammen, viertvoll»

Die folgenden Beispiele erläutern die Eigenschaften und die Herstellung von 5'-Guanylsäura als 1,^-Dioxanat und verschiedene Arbeitswelsen zur Isolierung desselben aus verschiedenen Arten von Lösungen und Brühen» Die Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung der Erfindung, ohne diese zu beschränken.

Beispiel 1 Kristallisation von 5'-Guanylsäure~dioxanat

Zu einer Lösung von 2 g Dinatrium-5*-guanylat in 25 ml Wasser werden etwa 10 ral Sulfonsäurelonenaustauscherharz im Wasserstoff zyklus unter Rühren zugegeben» Die erhaltene Aufschlämmung wird filtriert und der Niederschlag mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen, wobei 27 ml einer wässrigen 5'-Guanylsäure-

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lösung mit elnesa pH~Werfc von etwa 1,7 erhalten v/erden. 1 ml dieser Lösung wird dann mit 1 ml 1,4-I>ioxan vermischt» Nach Stehenlassen für eine kurze Zeitspanne fällt ein kristallines Produkt aus, das durch Filtrieren gewonnen wird. Eine Probe dieses kristallinen Solvats zeigte die folgenden chemischen und physikalischen Charakteristiken:

Slipirische Formel: Guanos in -5 '-mcnophosphafc-1,0 HgO-1,0

Dioxan (G₁₄H₂₄N₅O₁₁P)

Molekulargewicht: 469,10 Äquivalentgewicht

(Titration): 460s PK₁ = 2,6, Äquivalentgewicht =

PK₂ = 6,5 Karl Fischer (H₂O): 3,9 %

NMR: Zeigt 1 Mol Dioxan

Röntgenstrahlens Kristallin (Aufschlämmung)

Beispiel 2

Isolierung und Kristallisation \-on 5'~Guanylsäure~dioxanat aus Ferasentationsbrühen

Ein wie im nachfolgenden beschrieben erhaltenes Fermentations filtrat wird in eine Säule eines stark basischen Anionenaustauscherharzes eingeführt, und die Säule wird mit Wasser und verdünnter Säure gewaschen, um jegliches Guanin oder Guanosin

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das absorbiert sein kann, zu entfernen«. Die 3'-Guanylsäure wird aus der Säule mit wässriger 0,3 bis 0,>6m-*Phosphorsäure eluiert. Das Eluat wird im Vakuum bis zu einer Guancsin-S⁰-monophosphat-Konzentration von etwa 20 rag je ml eingeengte Ein gleiches Volumen 1,4-Dioxan wird zu diesem Konzentrat zugegeben, worauf 5^f-Guanylsäure~dioxanat aus der Lösung auskristallisiert β Die Kristalle werden durch Filtrieren gewonnen, gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Zur Herstellung der Fermentatlonsbrühe für die anfängliche Absorption an der Säule werden 650 ml Fersnentaticnsbrühe, die etwa 650 mg 5'-Guanylsäure enthalten, mit einem Sulfonsäuren ionenaustauscherharz in der Wasserstofforrn auf pH J_P0 angesäuert. Die Aufschlämmung wird filtriert und das Filtrat mit Magnesiumoxyd auf pH 8,0 und dann mit Ammoniumhydroxyd aufpH 9,5 gebracht. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt. Das Filtrst wird dann wie oben beschrieben behandelt.

Beispiel 3

Isolierung tind Kristallisation von 5^c~&uanylsäure~dioxanafr aus dialysierten Permentationsbrühen

Eine vollständige Fermentationsbrühe, die 5'«Guanylsäure enthält, wird über Nacht durch Rotieren eines Cellulosedialysebeutels, der die Brühe enthält, in einem 4 1-Becher mit Wasser

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iert. Das Dialysat wird dann elnßeenst und filtriert. Ein Sulfonsäureionenaustauscherhars in der Wasserstofform (Atnberlite IR-120) wird chargenweise zugegeben, bis ein pH-Wert von etwa 2,1 erreicht ist« Dann wird das Harz a'jfil'criert, Das Piltrat wird eingeengt, und Phosphorsäure wird zugegeben, bis ein pH-Wert von etwa 1,5 erreicht ist. Ein gleichss Volumen 1,4-Dloxan wird zugesetzt, um 5'~Guanylsäure-dioxanat zu kristallisieren.

Das 5'-Guanylsäure-dioxanat wird durch Papierchromatographie und Prüfung der biologischen Wirksamkeit identifiziert.. Das Produkt zeigt bei Prüfung durch UV-Absorption einen Reinheitsgrad von 9δ % und durch Prüfung auf biologischem Weg einen Reinheitsgrad von 100$«,

Baispiel 4

Isolierung und Kristallisation von S'-Guanylsäure-dloxanat aus Riobnucleinsäiirehydro.lysaten

Gereinigte Ribonucleinsäura (RNS) wird mit einem rohen Enzym- ' präparat hydrolysiert, und die erhaltenen 5'-Nucleotide werden von den Enzymen entv/eder durch Dialyse oder durch Chromatographie an einer Säule eines Dextranpolymeren (Sephadex) abgetrennt« Die die Nucleotide enthaltende Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, und der pH~Wert wird mit einem kationischen Harz auf etwa 5,0 eingestellt. Der pH-Wert der

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harafreien Lösung x?ird weiter mit Phosphorsäure auf 1,0 bis 2,0 herabgesetzt, 2 Volumina 1,4-Dloxan worden zugegeben, w?-3 zur Ausfällung von 5⁹-Gu£Uiyloäure«dioxanat führt.

Kristallisation von 5^>-Guanylgäure-aioxc_ir'.at aus einem Gemisch von (juanosln~5^?'^.onophoi5phat, Guarioain \mü Guanin

Su einer Lösung von 4,0 ml ΟΑ-Έ,ΡΟ^ Dit einem Gehalt von βθ rag Gusnosin-5^f-monophasphat, 9*0 Kg Guanosin und 2,0 mg Guanin werden 8,0 ml 1,4-Dioxan unter Rühren zugegeben. Die ge bildete kristalline Ausfällung wird abfiltriert, mit wässrigem Dioxan und Methanol gewaschen und getrocknet.

Ein Papierchromatografie des kristallinen Produkts in einem lso buttersäure-Ammoniak-Wasser-System (Pabst Nr₀ 4) zeigt das Vor liegen von nur Guanosln-S^ssonophosphato Ein entsprechendes Chromatogramm der Kristallisationsmutterlaugen zeigt das Vorhandensein von Guanosln-S'-raonophosphat, Guanosin und Guanine

Beispiel 6

Isolierung und Kristallisation von 5'-Suanylsäure-dloxanat aus Phosphorsäurglgsungen

100 ml einer 0,3m~Phosphorsäurelösung mit einem Gehalt von 500 mg 5'«Guanylsäure wird im Vakuum bei 25 ⁹C zu einem Sirup eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird mit einer Lösung mit

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einem Gehalt von 80 # Diäthyläthcr und £0 % Äthanol extrahiert und der erhaltene Rückstand wird in einem kleinen Volumen 0 ,^-Phosphorsäure aufgencnj;i3n_o 2 Volumina 1,4-Dioxan v/erden dann zugegeben, und das ausgefallene kristalline *>'-Guanylsäure-dioxanat wird durch Filtrieren isoliert.

Beispiel 7

feerfiüirraift von S'-Cmanylsäixre-dioxanat in Salze

5 g 5^t~Ouanylsäure»diox£nat werden in 50 ml waraiesn Wasser ge= löst. Die Lösung vjird mit 6n-NaOH auf pH 8,0 neutralisiert* Dann werden 25 rai Sthorioi zugegebene Nach etwa 2-sttindiges Stehen bei ZißimertGaperatur fällt e-irs la^istallines Produkt aus. Das Produkt wird abfiltriert, mit 50 % Äthanol und Aceton gewaschen und im Valiuum bei Zimmertemperatur getroclcnet.

Eine Karl Fishery-Analyse des Produkts ergibt 8,17 % V/asser. Die theoretische Menge an Wasser für Guanosin-5*-raonophosphat 2Na · 2H₂O beträgt 8,15 ^-

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Claims (7)

P 15 95 957. 2 *9. Juni 1969 Merol: & Co., inc ^ 9167 (M 65 442) Patentansprüche

1. Kri/stalline Verbindung, bestehend aus einem Mol 5'-Guanylsäure, Mol Wasser und einem Mol 1,4-Dioxan.

2. Verfairen zur Herstellung des Produkts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man 1,4-Dioxan mit einer wässrigen sauren Lösung, die 5'~Guanylsäure enthält, unter Bildung eines kristallinen 5^l-0uanyleäure-dioxanats mischt.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine w leerige Lösung verwendet, welche einen pH-Wert von etwa 0>5 bis 5 aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung verwendet, die 5'-Guanylsäure und andere Nucleotide enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man dialyslerte FennentationsbrUhen, die S'-Quanylsäure enthalten, verwendet.

6. Verfahren naoh Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nan enzymatisch erhaltene Ribonuoleinsäurehydrolysate, die 5'-0uAnylsüur« enthalten, verwendet.

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7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man PhosphorsHurelösungen mit einen Gehalt an 5'-Guanylsäure verwendet.

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