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Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12
Die Erfindung bezieht sich
aulf die Gewinnung von Vitamin Bt2, besonders auf Metallsalzkomplexe von Vitamin
B12 und' ein Verfahren zur Nutzbarmachung dieser Verbindungen zwecks Gewinnung des
Vitamins aus Konzentraten, die Verunreinigungen enthalten.
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Gemäß der Erfindung wird ein Metallcyanid-Vitamin-B12-Komplex aus
einer wäßrigen Lösung, die Vitamin Bt2 enthält, ausgefällt; als Meta'llcyanild wird
dabei Kupfer-, Kobalt-, Nickel-, Zink oder Silbercyanid verwendet.
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Vitamin Bl2, eine therapeutisch wichtige Substanz, wird großtechnisch
aus Fermentationsflüssigkeiten gewonnen, aus denen es in außerordentlich geringen
Mengen isoliert wird. Das bisher übliche Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B,
2 ist infolge der Gegenwart verschiedener Verunreinigungen, welche wegen ihrer gleichen
Löslichkeitseigenschaften nur schwierig vom Vitamin zu trennen sind, kompliziert.
Demgemäß ist es bisher als notwendig erachtet worden, die Vitamin B12 enthaltenden
Konzentrate einem chromatographischen Reinigungsverfahren zu unterwerfen, bei dem
als Adsorptionsmittel aktivierte Tonerde oder Aktivkohle zur Entfernung der Verunreinigungen
und zur Gewinnung von Vitamin B12 diente.
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Indessen sind solche Verfahren in großem Maßstab schwierig auszuführen,
und deshalb stellt. es einen erheblichen technischen Fortschritt dar, ein Mittel
zur Vermeidung chromatographischer Verfahren zu finden.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, durch welches die neuen,
Vitamin B12 enthaltenden Komplexverbindungen erhalten werden können. Ein
anderer
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, gemäß welchem die neuen Komplexverbindungen
angewendet werden, um eine Trennung von Vitamin B12 von Verunreinigungen vorzunehmen,
die in Vitaminkonzentraten, wie sie aus Fermentationsflüssigkeiten erhalten werden,
enthalten sind.
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Es wurde gefunden, daß Vitamin B12 zusammen mit den Metallsazen ausgefällt
wird, wenn die obengenannten wasserunlöslichen Schwermetallsalze in wäßrigen Lösungen,
die Vitamin B12 enthalten, gebildet werden, Diese ausgefällten Metallsaze, die Vitamin
B, 2 enthalten, haben anscheinend die Natur von Komplexen, in denen das Vitamin
an das Metallsalz in einer Weise gebunden ist, die bisher noch nicht völlig aufgeklärt
ist. Der unlösliche Komplex wird aus der Lösung durch übliche Maßnahmen, wie Filtration
oder Zentrifugieren, getrennt. Aus dem so isolierten Produkt wird dann das Vitamin
B12 leicht durch Methoden gewonnen, die weiter unten beschrieben sind.
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Gemäß einer besonderen Ausführungsform der erfindung liefern: diese
unlöslichen Metallsalz-Vitamin-B12-Komplexe einen bequemen und einfachen Ausgangsstoff
zur Gewinnung von Vitamin B12 aus dessen Konzentraten, in denen das Vitamin verunreinigt
vorliegt. So wird beim Auflösen eines Vitamin-Bl2-haltigen Konzentrats in Wasser
und beim Ausfällen eines Schwermetallcyanids in der verdünnten Lösung das Vitamin
mit dem Cyanid ausgefällt, während die Masse der begleitenden Verunreinigungen in
der Lösung zurückbleibt. Das Verfahren gemäß der Erfidnung zeigt einen einfachen
Weg zur Reinigung von Vitamin-'312-haltigen Konzentraten und zur Isolierung des
Vitamins.
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Es wurde gefunden, daß die wasserunlöslichen Salze von Schwermetallen,
wie Kupfer-, Kobalt-, Nickel-, $Zink- und Silbercyanide, Kupfer- und Silberthiocyanate,
Silber- und Bleijodide, Silberbromid, -triodid und -cyanat, zur Ausführung des Verfahrens
nach der Erfindung geeigent sind. In der Praxis wird so vorgegangen, daß diese Schwermetallsalze
in wäßrigen Lösungen, die Vitamin B12 enthalten, ausgefällt werden, wobei das Vitamin
mit dem unlöslichen Metallsalz zugleich ausfällt. Zum Beispiel wird ein unreines
Konzentrat mit einer geringen Menge Vitamin B12 in Wasser gelöst und ein wasserlösliches
Sallz eines Schwermetatl'sl und ein wasserlösliches Salz eines geeigneten Anions
der Lösung zugegeben, wodurch die Fällung des Schwermetallsalzes, das das mitgefällte
Vitamin B12 enthält, hervorgeruten wird Das ausgefällte Produkt wird von der Lösung
getrennt, und das Vitamin wird aus diesem Produkt durch Maßnahmen, die später im
einzelnen beschrieben werden, isoliert.
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Die Anwendung von unlöslichen Kupfer-, Kobalt-, Nickel-, Zink- oder
Silbercyaniden gestattet die Gewinnung der Hauptmenge des Vitamines B12.
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Außerdem kann Vitamin Bt2 aus den Schwermetallcyanidniederschlägen
leicht isoliert werden. Wenn auch zufriedenstellende Ergebnisse mit allen vorstehend
erwähnten Schwermetallcyandien erzielt werden, so wurde dooh gefunden, daß die Anwendung
von Kupfer- oder Zinkcyaniden besonders vorteilhaft ist. In Ausübund der Trennung
von Vitamin B12 von Konzentraten mit Hilfe des Kupfercyanidkomplexes wird das Vitaminkonzentrat
in Wasser aufelöst, zu welcher Lösung dann Kupfer- und Cyanidionen zugegeben werden,
wobei die Bildung und die Ausfällung des Kupfercyanid-Vitamin-B12-Komplexes erfolgt.
Wie Verscuhe ergeben haben, wird Vitamin Bl2 am vollständigsten ausgefällt, wenn
ein großer Überschuß an Kupfercyanid angewendet wird, Die optimale Menge des zuzufügenden
Kupfercyanids bängt natürlich von der Konzentration, und dem Reinheitsgrad der Lösung,
aus der das Vitamin, Bl2 gewonnen werden soll, ab. Im allgemeinen ist es zweckmäßig,
einen mehrhundertfachen Überschuß an Kupfer- und Cyanidionen pro Mol Vitamin B12
zuzugeben, wenn die Konzentration des Vitamins B12 sehr niedrig ist, d. h. I °/o
oder weniger beträgt. Wenn Konzentrate mit etwa 5% Vitamin B12 vorliegen, so wird
eine solche Menge Kupfer- und Cyanidionen zugegeben, daß die Lösung etwa 150 Mol
Kupfercyanid pro Mol Vitamin Bf2 enthält. Außerdem ist es zur Sicherung einer optimalen
Ausbeute an Vitamin B12 zweckmäßig, einen Überschuß an Kupferionen in der wäßrigen
Lösung vorliegen zu haben; vorzugsweise beträgt der Übereschuß etwa 100%.
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Der maximale Vitamin-B12-Gehalt eines Konzentrats kann in bequemer
Weise durch Messen der optischen Dichte einer Probe bestimmt werden, indem man Licht
von 5500 Ä anwendet, welche Wellenlänge einen der charakteristischen Höhepunkte
der Absorption von reinem Vitamin darstellt, und indem man den erhaltenen Wert mit
der optischen Dichte von reinem Vitamin B12 (Elc*m 63) vergleicht. Der so erhaltene
Wert wird auf einen Molekularwert umgerechnet, wobei I350 als angenähertes Molekulargewicht
von Vitamin B1, angenommen wird.
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In Ausübung dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
können Kupfer- und Cyanionen in jeder zugänglichen Form verwendet werden. Im allgemeinen
ist es am bequemsten, ein Alkalimetallcyanid als Ausgangsstoff für Cyanionen und
ein lösliches Kupfersalz, wie Kupfersulfat, als Ausgangs stoff für Kupferionen zu
verwenden.
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Andere übliche Ausgangsstoffe für diese Ionen können selbstverständlich
vom Fachmann auch verwendet werden.
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Das Vitamin B12 kann aus dem Kupfercyanid-Vitamin-B12-Komplex-Niederschlag
durch eine Reihe von einfachen Methoden gewonnen werden.
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Eine dieser Methoden besteht darin, eine wäßrige Cyanionen enthaltendelösungin
einer solchen Menge zuzugeben, daß der ganze Kupfercyanidkomplex gelöst wird. Das
Vitamin B12 wird dairn aus dieser Lösung durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht
mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Benzylakohol, mit einer Mischung
von Kresol und Kohlenstofftetrachlorid u. dgl., in dem der gebildete Vitamin-B12-Cyanid-Komplex
leicht löslich ist, abgeschieden. Ein anderes Verfahren zur Trennung von Vitamin
B12 aus dem Niederschlag besteht darin,
diesen innig mit einer wäßrigen
Säure, z. B. verdünnter Essigsäure oder Salzsäure, in Verbidung zu bringen. Diese
Säurelösungen lösen das Vitamin B12,, das dann aus der angesäuerten Lösung durch
Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel der vorstehend
erwähnten Art isoliert werden kann. Statt dessen kann des Vitamin B12 auch aus dem
Kupfercyanid-B12-Komplex durch unmittelbare extraktion mit einem geeigneten orgeanischen
Lösungsmittel, wie Kresol oder Benzylalkohol, gewonnen werden.
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Das Vitamin B12 wird dann aus den entstehenden Lösungsmittelextrakten
in üblicher Weise erhalten.
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Wenn das aus dem Kupfercyanid-Vitamin-B12-Komplex-Niederschlage gewonnene
Vitamin B12 noch beträchtliche Megen an Verunreinigungen enthält, wie es der Fall
sein kann, wenn von einem. sehr unreinen Konzentrat ausgegangen wird, empfiehlt
es sich, das gewonnene Produkt einem zweiten Reinigungsverfahren durch wiederholte
Fällung von Vitamin B12 als Kupfercyanidkomplex zu unterwerfen.
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In entsprechender Weise können Zink-, Kobalt-, Nickel- und Silbercyanide
an Stelle von Kupfercyaniden zur Isolation von Vitamin B12 aus dessen Konzentraten
angewendet werden.
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Die folgenden Beispiele veranschaulichen einige spezielle Ausführungsformen
der Erfindung.
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Beispiel I Ein festes Vitamin-B12-Konzentrat von 1,3 g mit einem
Gehalt von 155 mg (11,9%) an potentiellem Vitamin B12 wird in 100 ccm Wasser gelöst.
Dieses Vitamin-B12-Konzentrat war gewonnen aus einer Fermentationsflüssigkeit, die
durch Züchtung eines Stammes von S.griseus hergestellt wurde. Zu dieser Lösung wurden
31 ccm einer einmolaren wäßrigen Natriumcyanidlösung und 3I ccm einer einmolaren
wäßrigen Kupfersulfatlösung zugegeben. Der Kupferyanid- Vitamin-B12-Komplex-Niederschlag
bildet sich augenblicklich.
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Der Niederschlag wurde durch Filtration abgeschieden, mit 30 ccm
Wasser und anschließend mit 100 ccm einer 15%iger wäßrigen Essigsäure geweaschen.
Der Niederschlage wurde mit einer Gesamtmenge von 400 ccm einer 50%igen wäßrigen
Essigsäure extrahiert. Statt dessen kann auch eine größere Menge stärker verdünnter
Säure angewendet werden. DieExtrakte werden dann mit iiooccm Wasser verdünnt. Diese
Lösung wird mit 650 ccm einer Mischung von Kresol und Kohlenstofftetrachlorid im
Verhältnis 1:1 extrahiert. Zum Lösungsmittelextrakt werden dann 1 Raumteil Aceton
und 2 Raum-teile Ather zugegeben. Es entsteht ein Niederschlag, der durch Filtration
gewonnen wird.
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Der Niederschlag wird in 130 ccm Methanol gelöst, worauf I000 ccm
Äther zugegeben werden. Die entstandene Fällung wird gleichfalls durch Filtration
abgeschieden. Ihr Gewicht beträgt 380 mg und enthält I40 mg (36,80/0) an potentiellem
Vitamin B12.
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Diese Fällung von 380 mg wird in 1-00 ccm Wasser gelöst, worauf 28
ccm einmolare wäßrige Natriumcyanidlösung und 28 ccm einmolare wäßrige Kupfersulfatlösung
zugegeben werden. Der gebildete Niederschlag wird zunächst mit 20 ccm Wasser und
dann mit 50 ccm I5°/oiger wäßriger Essigsäure gewaschen. Der Niederschlag wird mit
einer Gesamtmenge von 200 cmm 50%iger wäßriger Essigsäure extrahiert und dann mit
120 ccm Wasser gewaschen.
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Die Extrakte und Waschwässer werden darauf mit Wasser auf 1000 ccm
verdünnt. Diese Lösung wird mit 500 ccm einer Kresol-Kohlenstofftetrachlorid-Mischung
im Verhältnis 1:1 extrahiert. Zum Extrakt werden 1 Raumteil Aceton und 3 Raumteile
Äther zugegeben. Der entstandene Niederschlag wird abgeschieden und in 170 ccm Methanol
gelöst, worauf 1700 ccm Äther zugegeben werden. Die hierauf entstehende Fällung
wird durch Filtration abgetrennt. Ihr Gewicht beträgt 247 mg und enthält, wie analytisch
ermittelt wurde, I30 mg (52,70/0) an potentiellem Vitamin B12.
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Die Fällung von 247 mg wird in 0,3 ccm Wasser gelöst. Man läßt die
Lösung über Nacht stehen. Die gebildeten Kristalle werden durch Filtration gewonnen
und mit 0,5 ccm kalten Wassers (0°) gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser enthalten
nach der Analyse 24 mg an potentiellem Vitamin B12. Die Kristalle werden in 9,5
ccm Wasser gelöst, und die Lösung wird mit 110 ccm Aceton verdünnt, Beim Kühlen
auf 0° und Stehenlassen bilden sich Kristalle, die man durch Filtrieren sbtrennt
und trocknet. Die Kristalle wiegen 103,3 mg und stellen zu etwa 95 bis 98% reines
Vitamin B12 dar.
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Beispiel 2 Zu 100 ccm eines wäßrigen Vitamin-B12-Konzentrats, das
aus einem Verfahren zur gewinnung von Vitamin Bl2 aus einer S.-griseus-Fermentationsflüssigkeit
stammt und etwa 30 bis 40 mg Vitamin Bt2 enthält, werden 50 ccm einer zweimolaren
wäßrigen Zinkchloridlösung und 50 ccm einer einmolarn wäßrigen Kaliumcyanidlösung
zugegeben.
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Der Zinkcyanid-Vitamin-B12-Komplex-Niederschlag bildet sich augenblicklich.
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Der Niederschlag wird durch Filtration abgeschieden, mit Wasser gewaschen
und dann mit 660 ccm 0,25 normaler wäßriger Salzsäure extrahiert. Die Sürelösung
wird nacheinander mit I32 und 60 ccm einer Mischung von Kresol und' Petroläther
(30 bis 600) im Verhältnis 1:1 extrahiert; hierbei liegt ein dreiphasiges Flüssig
keitssystem aus Wasser, Kresol und Petroläther vor. Die vereinigten Lös ungsmittelextrakte
werden mit etwa 500 ccm Wasser gewaschen, dann wird zu den Extrakten 190 ccm Wasser
und 95 ccm n-Butanol zugegeben, wodurch die Lösungsmittel in einer Phase vereint
und die aktiven Stoffe in die wäßrige Schicht übergführt werden. Nach Trannung der
beiden Phasen wird die Lösungsmittelphase mehrfach mit Wasser in der Gesamtmenge
von r8o ccm extrahiert. Die wäßrigen Extrakte werden vereint und auf ein geringes
Volumen konzentriert. Dann wird Aceton zur Ausfällung der aktiven Bestandteile zugegeben.
Die Untersuchung
des Niederschlages zeigt, daß eine wesentliche
Reinigung stattgefunden hat und daß das Vitamin B12 in guter Ausbeute vorliegt.
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Beispiel 3 Weitere wäßrige Vitamin-B12-Konzentrate der in Beispiel
1 und 2 beschriebenen Art werden unter Anwendung von Niederschlägen mit Kobaltcyaniden,
Nickelcyanilden oder Sibercyaniden gereinigt.
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In jedem Fall wird zunächst ein wasserlösliches Cyanid, wie Kaliumcyanid,
zur Vitamin-B12-haltigen Lösung zugegeben, und dann erst wird ein wasserlösliches
MetaLlsalz z. B. als Nitrat zugegeben. Die angewendeten Metall salz- und Cyanidmengen
sind von der gleichen Größenordnung wie in den Beispielen 1 oder 2 angegeben. Nach
jedem Niederschlag ergibt sich, daß im wesentlichen die Gesamtmenge an potentiellem
Vitamin B12 aus der Lösung abgeschieden ist.
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Die Niederschläge werden, in jedem Fall durch Filtration und Anwendung
von Diatomeenerde als Hilfsfiltersubs, tanz abgetrennt. Bei der Extraktion des Filterkuchens
mit Ammoniumhydroxyd, das in 1 bis 6 normaler Konzentration angewender wird, ergibt
sich, daß die Extrakte in allen Fällen etwa die Gesamtmenge an potentiellem Vitamin
Bi2 enthalten. Die alkalischen Lösungen werden auf PH7 eingestellt und dann mit
Kresol-Kohlenstofftetrachlorid extrahiert und, wie in Beispiel I beschrieben, ausgefällt.
Eine deutliche Reinigung, die mit der durch Ausfällung des Kupfercyanid-Vitamin-B12-Komplexes
vergleichbar ist, ist in jedem Fall festzustellen, wobei natürlich ein geringfügiger
Verlust an Vitamin Bj2 entsteht.