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Antifungaler Wirkstoff BH890 und seine Herstellung Die Erfindung
bezieht sich auf einen neuen antifungalen Wirkstoff, auf seine Herstellung durch
Fermentation, auf Methoden zu seiner Isolierung und Anreicherung aus rohen Lösungen
und auf Verfahren zu seiner Reinigung. Die neuen Produkte sind gegen verschiedene
Fungi wirksam und die Wirkungen des neuen antifungalen Wirkstoffs auf bestimmte
Mikroorganismen in Verbindung mit seinen chemischen und physikalischen Eigenschaften
unterscheiden sich von bekannten antifungalen Wirkstoffen.
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Der neue antifungale Wirkstoff, der die Bezeichnung BH 890 erzielt,
entsteht während der Züchtung eines Streptomyceten, der aus einer aus Pennsylvania
stammenden Waldbodenprobe isoliert wurde. Eine lebensfähige Kultur des neuen Mikroorganismus
wurde bei der bekannten Kulturensammelstelle Culture Collection Laboratory, Northern
Utilization Research and Development Division, Inited States Department of Agriculture,
Peoria, Illinois hinterlegt und in deren ständige Sammlung aufgenommen. Die Kultur
hat ton dieser Hinterlegungastelle die Kennbezeichnung NRRL 3609 erhalten und ist
für Jedermann frei erhältlich.
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Die Beschreibung und Identifizierung dieses neuen Mikroorganismus,
der auch in der Kulturensammlung der Lederle Laboratories, Pearl River, New York
gehalten wird, wurde von dem Experten Dr. H. D. Tresner dieser Laboratorien vorgenommen.
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Die Kultur wurde auf die Kulturmerkmale,physiologischen Merkmale und
morphologischen Merkmale nach den Methoden untersucht, die von Shirling et al.,
["Methods for Characterization of Streptomyces Species", Internat. journ.
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of Syst. Bacterioi. 16:313-340,(1966)] ausführlich beschrieben wurden.
Die für die Untersuchung verwendeten Medien wurden unter den Medien ausgewählt,
die von Pridham et al., £A Selection of Media for Maintenance and Taxonomic Study
of Streptömyces", Antibiotics Annual (1956~1957), S. 947-953] für die Züchtung von
Streptomyceten empfohlen wurden.
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Einzelheiten sind in den Tabellen I bis IV aufgeführt, und eine allgemeine
Beschreibung der Kultur wird nachstehend gegeben. Die unterstrichenen Farbbezeichnungen
stammen aus Jacobson et al., ["Color Harmony Manula". 3. Aufl. Container Corp. of
America, Chicago (1948)].
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Wachstum Gut auf den meisten Medien, schwach auf Czapek'a-Lösungs-Agar.
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Luftmycel und/oder Sporenfarbe en masse Luftmycel weißlich bis gräulich
oder bräunlich; Sporenmassen in gräulichen Tönungen, die von gedeckt-bräunlich;
Cover Tan ( 2 ge) bis naturfarben; Natural (2 dc) bis schieferbräunlich; Slate Tan
(2 ig) bis gedeckt-grau; Covert Gray (2 fe) bis beige-braun; Beige-Brown (3 ig)
reichen; Sporulation je nach Medium schwach bis stark.
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Lösliche Pigmente Auf den verwendeten Medien werden keine löslichen
Pigmente gebildet.
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Reversfarbe In gelblich-en bis gräulichen bis dunkelgrünlichen Tönungen.
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Verschiedene physiologische Reaktionen Reduktion von Nitraten zu Nitriten
in organischer Nitratbrühe; vollständige Gelatineverflüssigung in 14 Tagen; keine
Bildung von melanoiden Pigmenten auf Pepton-Eisen-Agar; verträgt bis zu 7 % NaCl
im Wachstumamedium. C-Quellen verwertungsspektrum nach Pridham et al., ["The Utilization
of Carbon Compounds by Some Actinomycetales : an Aid for Species Determination".
J. Bacteriol. 56:107-114 (1948U: Mittlere bis gute Verwertung von 1-Arabinose, d-Fructose,
i-Inosit, Lactose, d-Mannit, d-Melibiose, d-Raffinose, 1-2hamnose, Salicin, d-Trehalose,
d-Xyloae und Glucose; keine Verwertung von Adonit, d-Melezitose und Saccharose..
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Mikromorphologie Luftmycel stark, bildet kurze kompakte Spiralenketten
aus kugeligen bis kurzen zylindrischen Sporen mit den Abmessungen 0,5-0,6/u x 0,9-
1,1 µ; Sporenoberflächen glatt (durch Elektronenmikroskopie bei 8000-facher Vergrößerung
bestimmt).
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Aufgrund der beobachteten allgemeinen Charakteristika ist die Kultur
ein Vertreter des Genus Streptomyces. Die gräuliche Sporulation die spiralige Ketten
von glatten Sporen und das Fehlen von melanoidem Pigment verbindet die
Kultur
mit einer verhältnismäßig großen Gruppe von Streptomycesarten. Einige Merkmale,
z.B. ihre kompakten Spiralen aus kugeligen bis gelegentlich kurzen zylindrischen
Sporen legen jedoch eine nahe Verwandschaft mit Arten des Streptomyces hygroscopicus-Komplexes
nahe.
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Durch Vergleich9,die mit Vertretern dieser Gruppe durchgeführt wurden,
stellte sich heraus, daß sich die neue Kultur davon dadurch unterscheidet, daß ihr
der auffallende hygroskopische Charakter der Sporenmassen fehlt, der normalerweise
mit S. hygroecopicus verbunden ist. Perner sind für diese letztere Art Sporen mit
kurz-cylindrischem und fingerknochenartigem (phalangiformem) Aussehen typisch, (vergleiche
Trenner et al., E "Morphological Spore Types in the Streptomyces hygroscopicuslike
Complex". Appl. Microbiol. 15:637-639, (1967)], während die Sporen von NRRL 3609
häufig kugelig aind. Es wurde jedoch eine sehr auffallende Ähnlichkeit mit der Species
Streptomyces misionensis, Cercos et al., ["Misionina; antibiotico polienica producido
por Streptomyces misionensis n@ sp. Revista de Investigaciones Agricolas 16:5-28
(1962)] gefunden.
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Gute Übereins timmung wurde in Bezug auf Sporenfarbe, Sporophoren-Morphologie,
Sporenform, Sporenoberflächenbeschaffenheit, Melaninpigmentbildung und C-Quellenverwertungsspecktrum
gefunden. Ferner sind solche Kulturmerkmale, wie Wachstumehabitus, Parbe des vegetativen
Mycels und das gesprenkelte Aussehen der Kulturunterseiten auf manchen Medien bemerkenswert
ähnlich, Bei Vergleichen mit den veröffentlichten Beschreibungen und/oder Referenzkulturen
anderer Arten wurde keine Art gefunden, die dieser Kultur ähnlicher wäre als 5.
misionensis . Deshalb wird NRRL 3609 im folgenden als Stamm dieser Art angesehen.
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Tabelle I Kulturcharakteristica von Streptomyces misionensis NRRL
3609 Inkubation 14 Tage Temperatur: 28°C
| Medium Wachstum Luftmycel und/oder lösliches Revers- Bemerkungen |
| Sporen Pigment farbe |
| Czapek's Lösungs- schwach Luftmycel weißlich. keines farblos |
| Agar Sporulation schwach |
| Revers |
| Asparagin-Dextrose- Luftmycel weißlich, Schiefer- gesprenkelt |
| Agar gut wird gedeckt-bräun- bräunlich; |
| lich; Covert Tan (2 keines Slate Tan |
| ge) in Sporulations- (2 ig) bis un- |
| zonen. Sporulation benannt (18 pn) |
| mäßig [ dunkelgrün ] |
| bambusfarben; Revers ge- |
| Hickey- und Tresner's gut Luftmycel weißlich |
| Bamboo (2 gc) sprenkelt; |
| Agar bis grau, wird natur- keines |
| bis unbenannt mäßige Sektor- |
| farben; Natural (2 dc) |
| (18 pn) bildung |
| in Sporulationszonen. |
| Sporulation schwach |
Tabelle I (Forts.)
| Medium Wachstum Luftmycel und/oder lösliches Revers- Bemerkungen |
| Pigment farbe |
| Sporen |
| Hefeextrakt-Agar gut Luftmycel grau bis keines lehmbraun; Revers
ge- |
| bräunlich, wird schiefer- Adobe Brown sprenkelt; mäßige |
| nelken- |
| bräunlich; Slate Tan (2is) (3ig) bis Sektorbildung |
| braun |
| in Sporulationszonen. Spo- Clowe Brown |
| rulation stark (3 ni) bis un- |
| benannt (18 |
| pn) |
| Revers ge- |
| Kuster's Hafermehl gut Luftmycel grau bis bräun- hellsenf-bräun- |
| sprenkelt; mäs- |
| lich, wird schiefer-bräun- keines lich; Lt. Mustard |
| sige Sektor- |
| lich, Slate Tan (2 ig) in Tan (2 ie) bis un- |
| bildung |
| Sporulationszonen. Sporu- benannt (18 pn) |
| lation mäßig |
| ahorn-gelb; Revers ge- |
| Tomatenpaste-Hafer- Luftmycel grau bis bräun- |
| keines Yellow Maple sprenkelt |
| mehl-Agar gut lich, wird schiefer-bräun |
| ( 3 ng) bis un- |
| lich; Slate Tan ( 2 ig) in |
| benannt (18 pn) |
| Sporulationszonen. Sporu- |
| lation schwach |
| Kartoffel-Dextrose- Luftmycel weiß bis gräu- kamelfarben; Revers
gesprenkel |
| Agar gut lich, wird gedeckt-grau; keines Camel (3 ie) Stärkehydrolyse |
| Convert Gray (2 fe) in bis unbenannt schwach |
| Sporulationszonen. Spo- |
| (18 pn) |
| rulation mäßig |
Tabelle I (Forts.)
| Medium Wachstum Luftmycel und/oder lösliches Revers- Bemerkung@n |
| Sporen Pigment farbe |
| Benett's Agar gut Luftmycel grau bis bräun- |
| keines gedeckt-braun; Revers ge- |
| lich, wird schiefer-bräun- |
| Covert Brown sprenkelt; |
| lich; Slate Tan (2 ig) in |
| (2 li) bis unbe- mäßige Sek- |
| Sporulationszonen. Spo- nannt ( 18 pn) torbildung |
| rulation mäßig |
| Anorganische Salze- Luftmycel weißlich, wird keiner biskuitfarben;
Revers ge- |
| Stärke-Agar gut beige-braun; Beige Brown Biscuit (2 ec) sprenkelt; |
| (3 ig) in Sporulations- bis schiefer- mäßige Sek- |
| zonen. Sporulation stark bräunlich; Sla- torbildung |
| te Tan (2 ig) |
| bis unbenannt |
| (18 pn) |
Tabelle II Micromorphologie von Streptomyces misionensis NRRL 3609
| Medium Luftmycel und/oder Sporo- Sporenform Sporengröße Sporenoberfläche |
| phoren-Strukturen |
| Hefeextrakt- Luftmycel stark, bildet kurze, kugelig, gele-
0,5 - 0,6 µ X glatt (elektro- |
| Agar kompakte, spiralige Sporen- gentlich kurz- nenmikros- |
| 0,9 - 1,1 µ |
| ketten zylindrisch kopisch bei |
| 8000 facher Ver- |
| größerung be- |
| stimmt) |
Tabelle III Verschiedene physiologische Reaktionen von Streptomyces
misionensis NRRL 3609 Temperatur: 28°C
| Medium Incubations- Wachstum Physiologische Reaktion |
| dauer |
| Organische Nitrat- |
| brühe 7 Tage gut schwache Reduktion von Nitrat zu |
| Nitrit |
| " 14 Tage gut Nitrat zu Nitrit reduziert |
| Gelatine 7 Tage gut schwache Verflüssigung |
| " 14 Tage gut vollständige Verflüssigung |
| Pepton-Eisen-Agar 24 Stunden gut keine Melaninpigmentbildung |
| 4-13 % NaCl in Hefe- |
| extrakt-Agar 10 Tage bis zu 7 % NaCl in Wachstums- |
| medium werden vertragen |
Tabelle IV C-Quellen-Verwertungsspektrum von Streptomyces misionensis
NRRL 3609 Incubation: 10 Tage Temperatur: 28°C
| C-Quelle Verwertung* |
| Adonit O |
| 1-Arabinose 3 |
| d-Fructose 3 |
| i-Inosit 2 |
| Lactose 3 |
| d-Mannit 3 |
| d-Melezitose Q |
| d-Melibiose 3 |
| d-Raffinose 3 |
| 1-Rhamnose 3 |
| Salicin 3 |
| Saccharose 0 |
| d-Trehalose 3 |
| d-Xylose 2 |
| Dextrose 3 |
| Negative Kontrolle |
* 3-gute Verwertung 1-schlechte Verwertung 2-mittlere Verwertung 0-keine Verwertung
Es
wird darauf hingewiesen, daß für die Produktion des neuen antifungalen Wirkstoffs
die Erfindung nicht auf diesen bestimmten Mikroorganismus oder auf Mikroorganismen
beschränkt ist, die den oben zur Erläuterung angegebenen Wachstumscharakteristika
und mikroskopischen Merkmalen völlig entsprechen. Im Rahmen der Erfindung liegt
vielmehr auch die Verwendung von Mutanten, die aus dem beschriebenen Mikroorganismus
durch verschiedene bekannte Maßnahmen, z.B.
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Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstofflost,
Phagenangriff und dergleichen erhältlich sind.
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Das Fermentationsverfahren Die Züchtung des Mikroorganismus S. miaionensis
kann in einer Vielzahl von flüssigen Kulturmedien durchgeführt werden. Medien, die
für die Produktion des neuen Antibioticums geeignet sind, enthalten eine assimilierbare
Quelle für Kohlenstoff, z.B. Stärke, Zucker, Melasse und Glycerin, eine assimilierbare
Quelle für Stickstoff, z.B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptite, Aminosäuren
und Maisquellwasser und anorganische Anionen und Kationen, z.B. Kalium, Natrum,
Calcium, Sulfat, Phosphat, Chlorid und dergleichen.
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Spurenelemente wie Bor, Molybdän, Kupfer und dergleichen werden als
Verunreinigungen anderer Bestandteile der Medien geliefert. Für die Belüftung in
Tanks und Plaschen wird durch Durch. oder Aufleiten von steriler Luft durch oder
auf die Oberfläche des Permentationsmediums gesorgt .Eine weitere Mischung in Tanks
besorgt ein mechanischer Rührer oder Impeller. Bei Bedarf kann ein Entschäumer z.
B. 1 , Octadecanol in Schmalzöl zugesetzt werden.
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Inoculumherstellung Ein Schüttelkolben-Inoculum von S. misionensis
wird durch Inoculieren von 100 ml sterilem flüssigem Medium in 500 ml Kolben mit
abgeschabten oder abgewaschenen Sporen einer Agarschrägkultur des Mikroorganismus
hergestellt. Gewöhnlich wird folgendes Medium verwendet: Cerelose 20 g Soyamehl
10 g Maisquellwasser 5 g Calciumcarbonat 3 g Wasser ad 1000 ml Die Kolben werden
bei einer Temperatur von 25 bis 299C, vorzugsweise 2600 inkubiert und auf einer
Rotationsschüttelvorrichtung 30 bis 46 Stunden intensiv bewegt.
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Diese 100 ml Inocula werden zum Inoculieren von 1 1 und 12 l Ansätzen
des gleichen Mediums in 21 und 20 l Gla3fermentern verwendet. Die Inoculummaische
wird während einer ZUchtungsdauer von 30 bis 48 Stunden mit steriler Luft belüftet.
Diese Inoculumansätze werden zum Inoculieren von Tankfermentern verwendet.
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Tankfermentation Für die Produktion von BH890 in Tankfermentern wird
gewöhnlich das folgende Fermentationsmedium verwendet: Stärke 52,5 g Maismehl 14,5
g Maisquellwasser 15,0 g Calciumcarbonat 9,5 g Ammoniumsulfat 6,75 g
Casein
3,0 g Baumwollsamenmehl 2,5 g Ammoniumchlorid 2,0 g Mangansulfat 0,10 g Wasser ad
1000 ml Schmalzöl wird dem Medium in einer Menge von 0,8 % (Volumen/Volumen) zugesetzt.
Jeder Tank wird mit etwa 3 ffi des wie oben beschrieben hergestellten Inoculuins
inoculiert.
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Die Belüftung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 0,5 bis 1,0 1
steriler Luft pro Liter Brühe und Minute und die Fermentationsmir;chung wird durch
einen Impeller-Rührer bewegt. der mit 300 bis 800 UpM betrieben wird. Die Temperatur
wird bei 25 bis290C, gewöhnlich bei 28°C gehalten.
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In der Kegel wird die Fermentation 60 bis 90 Stunden lang fortgesetzt,
worauf die Maische geerntet wird.
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Isolierung Nach beendeter Fermentation wird die fermentierte Maische,
die das antifungale Antibioticum nach der Erfindung enthält, filtriert, vorzugsweise
unter Zusatz von Dlatomeenerde oder einer anderen Pilterhilfe. Gewöhnlich wird der
Nycelfilterkuchen mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen. Filtrat und Waschwasser
werden verworfen. Das antifungale Produkt wird aus dem Mycelkuchen mit Methanol
extrahiert, wobei etwa 1 1 Methanol Je 2,5 bis 3,0 1 Maische angewandt werden. Eine
vollständige Extraktion wird gewöhnlich durch eine zweite Extraktion des Kuchens
mit einem kleineren Anteil an Methanol gewährleistet.
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Die Extrakte werden vereinigt und unter verminderten Druck zu einer
wässrigen Phase eingeengt. Die wässrige Phase wird über Nacht bei 4 0C stehengelassen.
Beim Stehen bildet sich ein festes Rohprodukt, das Komponenten enthält, welche als
BH890a
und BH89Oß bezeichnet werden. Der Feststoff wird abgetrennt und mit Aceton gewaschen.
Der gewaschene Feststoff wird zuerst an der Buft und dann unter-vermindertem Druck
über Phosphorpentoxid oder einem anderen Trockenmittel getrocknet.
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Die a-Komponente wird aus einem Teil des so erhaltenen Rohprodukts
durch wiederholtes Umkristallisieren gewonnen.
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Praktisch wird die ß-Komponente dabei als Verunreinigung entfernt,
so daß die gereinigte a-Romponente in isolierter Form zurückbleibt. Zum Umkristallisieren
wird ein Teil des rohen BH890 in Dimethylformamid gelöst und die Lösung wird filtriert
Auch andere Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylacetamid und Dimethylsulfoxid
können verwendet werden. Zur Abscheidung des antifungalen Produkts wird Äthylacetat
oder Äthylacetat und Wasser verwendet, Gewöhnlich wird die Mischung in einen "Kälteraum"
(Temperatur um 0 bis 5 5°C) gestellt, um eine vollständige Abscheidung zu erreichen.
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Der kristalline Feststoff wird abf iltriert, mit Wasser und Aceton
gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Umkristallisieren wird gewöhnlich zweimal
wiederholt, damit ein gereinigtes Produkt BH890α erhalten wird, das frei von
der ß-Komponente ist. Die ß-Komponente wird aus einem Teil des rohen BH890 durch
Auftrennen des Materials in die a- und ß-Komponente durch Lo durch Lösungsmiiitelgegenstromverteilung
gewonnen. Ein brauchbares Lösungemittelsystem besteht aus Athylacetat, sec.-Butanol,
Methanol und Puffer im Volumenverhältnis 900 : 303 : 160 : 600. Der -Puffer wird
durch Vermischen von 6,3 ml Triäthylamin mit 2 1 Wasser, Einstellen mit Eisessig
auf pH 7,5 und Verdünnen mit Wasser auf 2 400 ml bereitete Mit einem Gegenstromverteilungsapparat
mit 200 Rohren reichen etwa 300 Überführungen für eine gute Trennung der Komponenten
aus0 Das Portechreiten der Trennung kann durch Messen der optiachen Dichte bei 303
F und Auftragen der
gemessenen Werte gegen die Rohrzahlen verfolgt
werden. Geeignete Fraktionen werden vereinigt, die Flüssigkeit wird eingedampft
und die a- und ß-Komponente werden durch Byophilisieren gewonnen.
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PhYsikalische Eigenschaften Die beiden Komponenten BH890a und BH890ß
können von-' einander durch bestimmte physikalische Eigenschaften unterschieden
werden. Die analysenreinen Proben beider Komponenten sind praktisch aschefrei. BH890a
wird unter vermindertem Druck in einem Abderhalden-Trocknungsgerät über siedendem
Aceton 16 Stunden und BH890ß wird unter vermindertem Druck über P205 und siedendem
Aceton über Nacht getrocknet. Die Komponenten BHB90« und BH890ß enthalten die Elemente
Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff praktisch in folgenden Gewichtsprozentsätzen:
BH890α BH890ß Kohlenstoff 58,52 57,78 Wasserstoff 8,73 7,74 Stickstoff 1,78
1,59 Sauerstoff (Differenz) 30,97 32,89 Die «-Komponente hat keinen scharfen Schmelzpunkt.
Ein in üblicher Weise erhaltenes Infrarotabsorptionsspektrum von BH890α als
KBr-Preßling weist im Infrarotgebiet des Spektrums charakteristische Absorptionen
bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron auf: 3,00, 3,42, 5,85, 6,13, 6,40,
6,48, 6,68, 6,87, 7,17, 7,57, 8,45, 8,87, 9,35, 9,65, 9,95, 10,02, 11,10, 11,35,
11,82, 13,35 und 14,37,Die Infrarotabsorptionskurve ist in Figur 1 der beigefügten
Zeichnungen dargestellt.
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Die a-Komponete zeigt in Mothanol Ultraviolottabsorptionsmaxima bei:
230 mµ (E11% cm = 315) 279 mµ (E11% cm = 298) 290 mZ (E11% cm - 588) 302 mµ (E11%
cm = 905) 318 mµ (E11% cm = 815) Bei Titration von BH890a in Eisessig mit Perchlorsäure
wird ein Nautralisationsäquivalent von 936 und bei Eitration in Pyridin mit Tetrabutylammoniumhydroxid
ein Neutralisationsäquivalent von 962 gefunden.
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Der spezifische Drehwert von BH89Oa. wurde in verschiedenen Lösungsmitteln
bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V angegeben: Tabelle
V Spezifischer Drehwert von BH890a in verschiedenen Lösungsmitteln Lösungemittel
Konzentration [α]25D Dimethylformamid 0,988 % + 19,2° Dimethylsulfoxid 1,031
* + 588 Eisessig 0,863 % + 10,4° Pyridin 0,930 % + 18,29
Die ß-Komponerte
hat keinen definierten Schmelzpunkt. Ein in üblicher Weise erhaltenes Infrarotabsorptionsspektrum
von BH890B als KBr-Preßling weist im Infrarotgebiet des Spektrums charakteristische
Absorptionen bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron auf: 3,00, 3,45, 5,85,
6,36, 6,70, 6,90, 7,25, 8,50, 9,40, 10,00, 11,85, 13,33 und 14,40.
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Die Infrarotabsorptionskurve ist in Figur ? der beigefügten Zeichnungen
dargestellt.
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Die ß-Komponente zeigt in Methanol Ultraviolettabsorptionsmaxima bei:
230 mµ (E11% cm = 370) 278 my (E11% cm = 320) 289 mµ (E11% cm = 616) 302 mµ (E11%
cm = 934) 318 mµ (E11% = 840) Der spezifische Drehwert von BH890B wurde in verschiedenen
Lösungsmitteln bestimmt. Die erhaltenen Werte sind -in der folgenden Tabelle VI
angegeben.
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Tabelle VI Spezifischer Drehwert von BH890ß in verschiedenen Lösung
mitteln Lösungsmittel Konzentration ga g 25 Dimethylformamid 0,747 % - 4,03 Dimethylsulfoxid
0,951 ffi -Eisessig 0,993 * - 8,07 Pyridin 1,038 % - 9,7 Das antifungale Antibioticum
BH890 unteracheidet sich von anderen antifungalen Mitteln durch die oben angegebenen
Kennzeichnungsdaten und durch s eine antifungale Aktivität. Die Aktivität dieses
neuen antifungalen Wirkstoffs in vitro zeigt die folgende Tabelle VII, in der die
minimale Hemmkonzentration angegeben ist, die zur Inhibierung des Wachstums repräsentativer
Mikroorganismen in einem Nährmedium erforderlich ist.
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Tabelle VII in vitro antifungale Aktivität von BH890* Organismus
minimale Hemmkonzentration mcg/ml Candida albicans 300 (E83) 2 Cryptococcus neoformans
SP (E138) 2 Epidermophyton floccosum ATCC 10227 tE139) 1 Microsporum audouini ATCC
14057 (E140) 2 Microsporum canis ATCC 10214 (E55) 5 Microsporum gypseum ATCC 14683
(E130) 2,5 Phialophthora Jeanselmei NIH 8724 (E16) 5 Trichophyton rubrum (E97) 2,5
Trichophyton tonsurans NIH 662 (E10) 2 Trichophyton mentagrophytes (E11) 2,5 * Standard-Agarverdünnungsmethode
Ausserdem
zeigt BH890 hohe Aktivität in vitro gegen phatogene Organismen, darunter Stämme
von Blastomyces dermatitidis und Coccidioides immitis , die tiefsitzende Mykosen
verursachen.
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Aktivität gegen Fungi. die tiefsitzende Mykosen verursachen Organismus
und Stamm Konz. mcg/ml minimale Hemm- fungicide Konz.** konz.* ~~~~~~~~~~~~~~~~~
Coccidioides immitis 658 0,78 1,56 660 0,78 1,56 691 0,20 0,20 Blastomyces dermatitidis
5,10 0,39 5,17 0,39 1,56 5,27 0,20 0,20 Amphotericin B, das als Kontrolle dient,
wirkt auf die drei Stämme von Coccidioides immitis bei 0,2 bis 0,39 mcg/ml hemmend
und bei 0,39 bis 0,78 mcg/ml fungicl.
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Amphotericin B, das als Kontrolle dient, wirkt auf die drei Stämme
von Blastomyces dermatitidis bei 0,1 bis 0,2 mcg/ml hemmend und bei 0,39 bis 1,56
mcg/ml fungicid.
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* Zur Inhibierung des Wachstums des Mikroorganismus erforderliche
Konzentration ** Zur Abtötung des Mikroorganismus erforderliche Konzentration.
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Das antifungale Antibioticum BH890 ist in vivo gegen Candida albicans
und Cryptococcus neoformans wirksam.
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Der neue antifungale Wirkstoff kommt daher als therapeutisches Mittel
zur Behandlung von Pilzinfektionen bei Säugetieren in Betracht, die durch. diese
Mikroorganismen verursacht werden. Die Behandlung oder Bekämpfung solcher Infektionen
ist mit Vorteil durch örtliche Anwendung oder parenterale oder orale Verabreichung
des neuen antifungalen Antibioticums möglich.
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Die Vorteile des neuen antifungalen Antibioticums zeigen sich an seiner
Fähigkeit, letale Systeminfektionen durch diese odr mit diesen Mikroorgamismen bei
Mäusen zu bekämpfen.
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Tests mit C. albicans wurden an weiblichen Mäusen, (Oarworth Farm),
mit einem Gewicht von etwa 20 g durchgeführt, die intravenös mit einer letalen Dosis
einer 1 : 20-Verdüngung einer 24-stündigen Tryptica,s,e-Soyabrühe-Kultur des Mikroorganismus
infiziert wurden. Die infizierten Mäuse wurden mit BH890 in verschiedenen Dosen
durch subkutane Injektion innerhalb einer Stunde nach der Infizierung, oder durch
subkutane InJektion innerhalb einer Stunde nach der Infizierung und einer zweiten,
4 Stunden späterverabreichten Dosis behandelt. Die Größe Jeder Gruppe sowie die
Zahl der Mäuse, die 6 Tage nach der Infektion am Leben blieben, wurde festgestellt.
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Die folgende Tabelle VIII zeigt die antifungale Aktivität von BH890
gegen C. albicans.
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Tabelle VIII Aktivität von BH890 . Amphotericin und Nystatin bei
mit Candida albicans infizierten Mäusen Subcutane Dosis lebende/Samtliche Mäuse
(%) mg/kg 14 Tage nach InfektIon BH890 Amphotericin Nystatin 800 22/30 (73) 400
15/20 (75) 10/10 (100) 200 10/30 (33) 6/20 (30) 27/30 (90) 100 8/20 (40) 3/10 (30)
15/20 (75) 50 - 12/30 (40) 5/20 (25) 15/30 (50) 25 o/io (O) - 2/20 (10) 12 0/20
(0) 0/10 (0) 3/30 (10) Mittlere wirk Dosis, mg/kg taae 200 (140-290)- 200 (geschätzt)
60 (40-70) Infizierte, unbehandelte Kontrolltiere: 58/60 (97 %) Mäuse starben innerhalb
von 3 Tagen nach Infizierung (mittlere Überlebensdauer 1,3 Tage) (a) Grenzen für
95 % Wahrscheinlickeit in Klammern.
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Die Dosis-Wirkungs-Kurven sind nicht parallel.
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Tests mit 0. neoformans wurden an weiblichen Mäusen,-(Carworth Farms
CF 1), mit einem Gewicht von etwa 20 g durchgeführt, die intravenös mit einer letalen
Dosis einer 24 Stunden-Trypticase-Soyabrühe-Kultur des Organismus infiziert wurden.
Die infizierten Mäuse wurden mit BH890 in verschiedenen Dosen durch subkutane Injektion
innerhalb einer Stunde nach der Infizierung oder durch subkutane Injektion innerhalb
einer Stunde nach der Infizierung und einer zweiten, 24 Stunden später verabreichten
Dosis behandelt. 7 Tage nach der Infizierung wurde das Verhältnis
der
Zahl der lebenden Mäuse zu der Gesamtzahl der Mäuse festgestellt. Die folgende Tabelle
IX zeigt die antifungale Aktivität von BH890 gegen 0. neoformans.
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Tabelle IX Aktivität von BH890, Amphotericin und Nystatin bei mit
Cryptoccus Neoformans infizierten Mäusen Subcutane Dosis, lebende/sämtliche Mause
(%) mg/kg 7 Tage nach Infektion BH890 Amphotericin Nystatin 800 41/50 (82) 48/50
(96) Toxic 400 29/30 (97) 17/20 (85) 10/10 (100) 200 47/60 (78) 39/50 (78) 55/60
(92) 100 23/30 (77) 12/20 (60) 26/30 (87) 50 37/60 (62) 35/50 (70) 40/60 (67) 25
1/io (io) - 13/30 (43) 12 - 13/30 (43) 17/50 (34) mittlere wirksame Dosis,mg/kg
(a) 77(24-250) 20(12-32) 24(18-32) infizierte, unbehandelte Kontrolltiere: 104/120
(87 *) Mäuse starben zwischen dem 2. und 7. Tag nach der Infizierung.
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(a) Grenzen für 95 % Wahrscheinlichkeit in Klammern. Die Dosis-Wirkungs-Kurven
sind nicht parallel.
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Durch folgende Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.
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B e i 8 p i e l Inoculllmherstellung Ein typisches Medium für die
Erzeugung des ersten Inoculums wird nach folgender Rezeptur bereitet: Cerelose 20
g Soyamehl 10 g Maisquellwasser Calciumcarbonat 3 g Wasser ad 1000 ml Von einer
Agarschrägkultur von S. misionensis abgewaschene oder abgeschabte Sporen werden
zum Inoculieren von zwei 500 ml Kolben verwendet, die Jeweils 100 ml des oben beschriebenen
sterilen Mediums enthalten. Dann werden die Kolben auf eine Rotationsachütteleinrichtung
gestellt und 48 Stunden bei 28°C intensiv bewegt. Das erhaltene Kolbeninoculum wird
in einen 19 1 (5 gallon) Glasfermenter überführt, der 12 1 des sterilen Mediums
enthält. Die Züchtung in dem Glasfermenter wird etwa 48 Stunden unter Belüften mit
steriler Luft durchgeführt. Dann wird der Fermenterinhalt zum Animpfen eines 300
1 Mediums in einem Tankfermenter verwendet.
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Beispiel 2 Fermentation Ein Fermentationsmedium wird nach folgender
Rezeptur bereitet:
Stärke 52,5 g Maismehl 14,5 g Maisquellwasser
15,0 g Cnlciumcarbonat 9,5 g Ammoniumsulfat 6,75 g Casein 3,0 g Baumwollsamenmehl
2,l5 g Ammoniumchlorid 2,0 g Mangansulfat 0,10 g Wasser ad 1000 ml Schma5öl wird
in dem Medium in einer Menge von 0,8 % (Volumen/Volumen) verwendet. Das Fermentationsmedium
wird bei 12090 45 bis 60 Minuten mit Wasserdampf mit einem Druck von 1,4 kg/cm2
(20 pai) sterilisiert. Nach dem Sterilisieren beträgt der pH-Wert des Mediums etwa
6,6. 300 1 steriles Medium in einem 400 1 Tankfermenter werden mit 12 1 von wie
in Beispiel 1 hergestelltem Inoculum inoculiert. Die Fermentation wird bei 28°C
unter Verwendung eines Entschäumere (Hodag LG-8 Öl) durchgeführt. Die Belüftung
erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l steriler Luft pro Liter Maische und
Minute. Die Maische wird durch einen Impeller bewegt, der mit etwa 300 Umdrehungen
pro Minute betrieben wird. Nach einer Fermentationsdauer von etwa 66 Stunden wird
die Maische geerntet.
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Isolierung 300 1 fermentierte Maische werden mit etwa 2 % (Gewicht/
Volumen) Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert undder Filterkuchen wird mit etwa
30 1 Wasser gewaschen. Das P trat und das Waschwasser werden verworfen. Der gewaschene
Kuchen wird etwa 1/2 Stunde in etwa 100 1 Methanol gerührt. Die Suspension wird
filtriert und der Kuchan wird
mit weiteren 20 1 Methanol gewaschen.
Der Methanolextrakt und die Methanolwaschlösung werden vereinigt und zu einer wäsorigen,
Phase eingeengt, (Volumen etwa 6 1). Dieses Konzentrat wird ueber Nacht bei etwa
4 0C stehengelassen. Ein doppolbrechenden Feststoff, der sich beim Stehen bildet,
wird durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Aceton gewaschen. Das restliche Aceton
wird durch Abdampfen an der Luft entfernt und der Feststoff wird huber P205 unter
vermindertem Druck getrocknet. Der getrocknete kristalline Fe-ststoff aus rohem
BH890 wiegt 118 g.
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Beispiel :4 Gewinnung von BH890a Ein Anteil des nach dem vorhergehendem
Beispiel erhaltenen rohen BH890 von 40 g wird in 150 ml Dimethylformamid gelöst
und die Mischung wird filtriert. Das Filtrat wird mit Äthylacetat versetzt, bis
der "Trübungspunkt" erreicht ist.
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Nach Zusatz von etwa 150 ml Wasser werden unter Rühren weitere 150
ml Äthylacetat zugegeben. Die erhaltene Mischung wird über Nacht bei 4UC stehengelassen.
Der hellgelb gefärbte Feststoff, der sich bildet und in dem Zweiphasensystem suspendiert
ist, wird abfiltriert und zuerst mit Wasser und dann mit Aceton gewaschen. Der an
der Luft getrocknete Feststoff wiegt 29 g. Das Rohprodukt wird zweimal umkristallisiert,
indem man es zuerst in Dimethylformamid löst und dann von diesem Punkt an die oben
angegeben Arbeitsweise wiederholt. Nach dreimaligem Umkristallisieren werden etwa
4,4 g gereinigtes BH890α erhalten, das die oben beschriebenen physikalischen
und chemischen Kennzahlen aufweist.
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Beispiel 5 Gewinnung von BH890 Als Ausgangsmaterial wird rohes BH890,
wie es in Beispiel 9 erhalten wurde, verwendet und durch Lösungamittelgegenstromverteilung
in die a- und ß-Komponente aufgetrennt.
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Das Lösungsmittelsystem besteht aus Athylacetat, sec.-Butanol, Methanol
und Puffer im Volumenverhältnis 900:303:160:600. Der Puffer wird durch Vereinigung
von 6,3 ml Triäthylamin und 2 1 Wasser unter Rühren, Einstellen des pH-Werts der
Lösung mit Eisessig auf 7,5 und Verdünnen mit Wasser auf 2 400 ml bereitet. Die
Gegenstromverteilung wird in einer Vorrichtung mit 200 Rohren unter Anwendung von
10 ml unterer Phase und 10 ml oberer Phase pro Rohr und 310 Überführungen durchgeführt.
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Die Probenbeschickung wird in die ersten 15 Rohre durch Herstellung
einer gesättigten Lösung von BH890 in 150 ml unterer Phase und 150 ml oberer Phase
gegeben, so daß sich eine Nettobeschickung von 350 mg ergibt. Nach 310 Ub"erführungen
wird ein Anteil der unteren Phase von 1/2 ml aus einigen Rohren entnommen. Jede
Probe wird mit 10 Dl Methanol verdünnt und auf ihre optische Dichte bei 303 geprüft.
Durch Auftragen der optischen Dichte gegen die Rohrnummern wird eine Kurve erhalten,
die zuerst ein kleineres Maximum und dann ein größeres Maximum zeigt. Die Rohrnummern
85 bis 120 enthalten BH890ß udie Rohrnummern 113 bis 150 enthalten BH890α.
Der Inhalt der entsprechenden Rohre wird vereinigt und die Flüssigkeiten werden
getrennt zu einer wässrigen Phase eingeengt, filtriert und lyophilisiert.
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Jeder der durch Lyophilieierung erhaltenen Peststoffe wird mit Aceton
verrieben, filtriert, erneut mit Aceton gewaschen und dann an der Luft getrocknet.
Es werden analysenreine Proben von BH890ß mit einem Gewicht von 38 Ig und von BH890α
mit einem Gewicht von 140 mg erhalten.
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B e i 5 p i e 1 6 Herstellung von Tabletten die BH890 enthalten Der
antifungale Wirkstoff BH890 wird nach folgender Rezeptur zu -üblichen pharmazeutischen
Tabletten verarbeitet.
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pro Tablette Ingrediens mg für 10 000 Tabletten,g BH890 50 500 Lactose
2?5 2250 Maisstärke (:zum Mischen) 50 500 Maisstärke(für Paste) 25 250 Magnesiumstearat
5 50 355 :3350 Der Wirkstoff BH890, die Lactose und -die Maisstärke zum Mischen
werden miteinander vermischt. Die Maisstärke für Paste wird in Wasser in einem Verhältnis
von 100 g Maisstärke pro 800 ml Wasser suspendiert und durch Erwärmen unter Rühren
in eine Paste übergeführt. Die erhaltene Paste wird dann zum Granulieren der Pulvermischung
verwandet. Bei Bedarf wird weiteres Wasser angewandt.
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Das feuchte Granulat wird durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite
von 2,38 mm (Sieb Nr. 8) geführt und bei 49gC (120°F) getrocknet. Das trockene Granulat
wird durch ein -Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1,19. mm (Sieb Nr. 16) geführt
und mit dem Magnesiumstearat gleitfähig gemacht.
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Dann wird das Granulat in einer Tablettiermaschine zu, Tabletten verpreßt
(Tablettengewicht 355 mg). Jede Tabeltte enthält 50 mg Wirkstoff.
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Beispiel 7 Herstellung von hartschaligen Kapseln, die BH890 enthalten
Der Wirkstoff BH890 kann in Form hartschaliger Kapseln verabreicht werden. Zur Herstellung
solcher Kapseln ist folgende Rezeptur geeignet: pro Kapsel Ingrediens mg für 1000
Kapseln, g BH890 50 50 Lactose 90 90 Magnesiumstearat 1 1 141 141 Der Wirkstoff,
die Lactose und das Magnesiumstearat werden miteinander vermischt. Mit der Mischung
werden hartschalige Kapseln entaprechender Größe mit einem Füllgewicht von 141 mg
pro Kapsel gefüllt.
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Beispiel 8 Herstellung einer oralen Sud tension die BH890 enthält
Ingrediens Menge % (Gew./Vol.) BH890 1,00 Magnesiumaluminiumsilicat.Gel 0,50 Saccharose
60,00 Methylparaben 0,08 Propylparaben 0,02 Aromamittel destilliertes Wasser t ad
100,00
Die Parabene und die Saccharose werden in etwa 2/3 des Endvolumens
an destilliertem Wasser bei 809C gelöst und das Gel (Veegum) wird unter Rühren zugesetzt.
Die Suspension wird auf 40UC abgekühlt und unter Rühren mit dem Wirkstoff und dem
Aromamittel versetzt. Die abgekühlte Suspension wird mit destilliertem Wasser auf
das Endvolumen eingestellt.
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Die Suspension enthält 50.mg Wirkstoff pro ml Suspension.
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Beispiel 9 Herstellung einer InzektionsusPension die BH890 enthält
Der Wirkstoff BH890 kann nach folgender Rezeptur zu einer injizierbaren Suspension
verarbeitet werden.
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Ingrediens. Menge % (Gew./Vol.) BH890 5,0 Polyäthylenglycol 4000 U.S.P,
4,0 Natriumchlorid U.S.P, 0,90 Benzylalkohol, reagensrein 0,90 Wasser für Injektionszwecke
ad 100,0 Der Träger wird durch Vermischen aller vorstehend genannten Bestandteile,
mit Ausnahme von Dz890 bereitet. Der Träger und der feingemahlene Wirkstoff werden
sterilisiert. Eine Dispersion des Wirkstoffs in dem Träger wird hergestellt, indem
man den Wirkstoff zuerst mit einem Teil des Trägers aufschlämmt und dann den Rest
des Trägers unter Rühren zugibt.
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Eine Dosis dieser Suspension von 1 ml enthält 50 mg Wirkstoff.
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Tabelle X Orale Aktivität von BH890-alpha und Nystatin bei Mäusen
mit einer C.albicans-Darminfektion Orale Dosis, Zahl der Mäuse mit einer Verminderung
(2) an C. albicans um 90% mg/kg BH890-alpha Nystatin Test 1 Test 2 Test 1 Test 2
25 7/10 9/10 10/10 9/10 12 - - 7/10 7/10 6 6/10 6/10 6/10 3 - - 7/10 6/10 1,5 2/5
6/10 4/10 0,8 - - 4/10 4/10 mittlere wirksame Dosis mg/kg (Grenze für 95 % Wahrscheinlichkeit)
3,0(1-9) 1,9 (0,5-8) (1) zwei Dosen in 0,5 ml 0,85 %-igem NaCl, 3 Stunden Abstand.
Die erste Dosis wird 1 Stunde nach der Infizierung verabreicht.
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(2) Verminderung von C. albicans in der Fäcesflora um wenigstens 90%
in Vergleich zu dem entsprechenden Mittel der mit 0,85 %-igem NaCl behandelten Kontrollmäuse;
durch Kolonienzählungen auf Platten bestimmt, die mit einem aliquoten Teil eines
Homogenats eines Kotkügelchens von jeder Maus inokuliert wurden. Folgende Druchschnittszahl
von Kolonien von C. albicans in der Kotprobe der Kontrollmäuse wurde gefunden: Test
I - 300 (Standardabweichung - 180); Test II- 60 (Standardabweichung - 45);
Tabelle
XI Acuta Toxicität von BH890-alpha, Amphotericin und Nystatin bei Mäusen tote/sämtliche
Mäuse, 14 Tage nach Verabreichung Einzeldosis, subcutan intraperitoneal oral mg/kg
BH890 Ampho- Nysta- BH890 Ampho- Nysta- BH890 Ampho- Nystatericin tin tericin tin
tericin tin 1600 0/20 0/10 - - 0/10 - 0/20 0/10 0/20 800 0/20 0/10 12/20 - 0/10
- - - -400 - - 5/20 9/10 - 10/10 - - -200 - - 3/20* 5/10 - 9/10 - - -100 - - - 1/10
- 10/10 - - -50 - - - 0/10 - 4/10 - - -25 - - - - - 0/10 - - -* Eine Dosis von 200
mg/kg war bei späteren Tests mit infizierten Mäusen nicht letal.