DE1197423B

DE1197423B - Verfahren zur biochemischen Herstellung von Orotsaeure

Info

Publication number: DE1197423B
Application number: DEK43988A
Authority: DE
Inventors: Shukuo Kinoshita; Katsunobu Tanaka; Kazuo Kimura
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1960-06-15
Filing date: 1961-06-13
Publication date: 1965-07-29
Also published as: MY6600119A; US3086917A; GB922359A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES /fflt^S PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Inf. α.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C12d

Deutsche Kl.: 6b-16/02

1197423
K 43988IV a/6 b
13.Juni 1961
29. Juli 1965

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von Orotsäure durch aerobe Züchtung einer Pyrimidinsubstanzen erfordernden Mikroorganismenmutanten in einem hierfür üblichen Nährmedium unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes über 5,5.

Orotsäure ist eine Vorstufe von Pyrimidinverbindungen, die Bestandteile von Nucleinsäuren sind, und wird als die gleiche Substanz wie Vitamin B₁₃ angesehen, das wichtig für den Stoffwechsel von Nucleinsäuren, die Vermehrung der Zellen im lebenden Körper, die Vererbung, die Proteinsynthese und den Stoffwechsel von Sacchariden und Lipoiden ist. Bei neueren Untersuchungen an der Orotsäure wurde gefunden, daß sie eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei der Behandlung von Leberkrankheiten und eine blutbildende sowie eine wachstumsfördernde Wirkung hat. Orotsäure nimmt also eine immer wichtigere Stellung ein.

Es ist bekannt, daß Mutanten von Neurospora crassa, die Pyrimidine erfordern, eine kleine Menge Orotsäure im Kulturmedium anhäufen (Journ. of Biological Chemistry, 172, S. 525, 1948). Es wurde jedoch noch kein technisch brauchbares Verfahren zur Herstellung von Orotsäure durch Gärung vorgeschlagen.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von Orotsäure durch aerobe Züchtung einer Pyrimidinsubstanzen erfordernden Mikroorganismenmutanten in einem hierfür üblichen Nährmedium unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von über 5,5 vorgeschlagen, das darin besteht, daß man die Mikroorganismenmutanten Mikrokokkus glutamicus (534-615-305) ATCC 14275, Mikrokokkus glutamicus (588-208) ATCC 14276 oder Brevibakterium ammoniagenes ATCC 6871 verwendet.

Erfindungsgemäß wird Orotsäure in höherer Ausbeute in einer Kulturflüssigkeit unter Verwendung einer billigen Kohlenstoffquelle, wie Kohlenhydrate, organische Säuren u. dgl., und einer anorganischen Stickstoffquelle als Ausgangsmaterial gebildet. Durch Züchten der genannten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen wird fast nur Orotsäure in beträchtlicher Menge unter Entstehung nur geringer Mengen an Nebenprodukten, wie Aminosäuren, organischen Säuren u. dgl., angesammelt. Die gebildete Menge an Orotsäure ist so groß, daß sie bei weitem die Löslichkeit der Säure, ihres Ammoniumsalzes oder anderer Salze in dem Gärungsmedium überschreitet. So wird ein großer Teil der Orotsäure oder ihres Salzes in kristalliner Form in dem Kulturmedium während der Gärung ausgeschieden, und die

Verfahren zur biochemischen Herstellung
von Orotsäure

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke, Patentanwalt,

Berlin 33, Auguste-Viktoria-Str. 65

Als Erfinder benannt:

Shukuo Kinoshita,

Katsunobu Tanaka, Tokio;

Kazuo Kimura, Sagamihara-shi (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 15. Juni 1960 (27 737)

gebildete Orotsäure kann nach Beendigung der Züchtung in einfacher Weise abgetrennt und gewonnen werden.

Die Erscheinung, daß eine derart große Menge an Orotsäure in kristalliner Form in dem Kulturmedium gebildet wird, wurde noch nie beobachtet und ist daher neu. Es wurde also ein vorteilhaftes neuartiges Verfahren zur technischen Herstellung von Orotsäure gefunden.

Der erfindungsgemäße Mikrokokkus-glutamicus Stamm (534-615-305) ATCC 14275 braucht Uracil zum Wachstum und wurde durch künstliche Mutation von Mikrokokkus glutamicus 534 erhalten. Die bakteriologischen Eigenschaften von Mikrokokkus glutamicus sind in der japanischen Patentschrift 243 382 und in Bulletin of the Agricultural Chemical Society of Japan, 22, Nr. 3, S. 176 bis 185, beschrieben. Die Mutante (534-615-305) ATCC 14275 wurde durch ultraviolette Bestrahlung des Originalstammes erhalten und unterscheidet sich von diesem dadurch, daß sie Uracil zum Wachstum braucht.

Alle organischen und synthetischen Kulturmedien können bei dem erfindungsgemäßen Gärungsver-

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fahren verwendet werden, soweit sie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Mineralstoffe und andere Nährstoffe enthalten, wie sie in den folgenden Beispielen gezeigt werden.

Als Kohlenstoffquelle können verschiedene Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, Glycerin, Mannit, Stärkehydrolysat, Melasse u. dgl., verwendet werden. Ferner können organische Säuren, wie Glucon-, Essig-, Milch-, Brenztrauben-, Citronen-, Aconit-, «-Ketoglutar-, Fumar-, Äpfel-, Oxalessigsäure und andere Säuren, allein oder in Verbindung mit dem Kohlenhydrat verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, -chlorid, -nitrat, -phosphat, -carbonat, -acetat u. dgl., verschiedene Nitrate, Harnstoff und andere Stickstoff enthaltende Verbindungen sowie Pepton, NZ-Amin, Fleichextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Aminosäuren, wie Glutamin-, Asparagin- und andere Säuren, und Hydrolysate von Proteinen, wie Casein, Fischmehl, Sojabohnentreber, Chrysalis, Gärungsrückstände u. a., verwendet werden. Wenn ein reines synthetisches Kulturmedium verwendet wird, wird bei Zusatz einer geeigneten Menge Biotin und Uracil, die für das Wachstum der Bakterien erforderlich sind, Orotsäure in gleichem Maße oder in wesentlich größerer Menge wie bei der Verwendung der obenerwähnten natürlichen organischen Nährstoffe.

Als Mineralstoffe können Dikaliumphosphat, Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat u. dgl. verwendet werden.

Die Gärung wird bevorzugt unter aeroben Bedingungen ausgeführt, z. B. durch Züchten unter Schütteln, Züchten unter Rühren und Belüften u. dgl. Die Wachstumstemperatur kann 24 bis 37⁰C, bevorzugt 28 bis 33° C, betragen. Der pH-Wert pflegt während des Wachstums unter 7,0 abzusinken, er kann aber bevorzugt zu Beginn oder während des Züchtern auf 5,5 bis 8,5 mittels eines geeigneten Neutralisationsmittels eingestellt werden, wenn höhere Ausbeuten erzielt werden sollen. Als Neutralisationsmittel können wäßriges Ammoniak, ein Alkalihydroxyd, wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd u. dgl., Ammoniumcarbonat, Calciumcarbonat, Calciumhydroxyd u. dgl. verwendet werden. Durch Zusatz von Harnstoff wird Ammoniak geliefert und ein pH-Wert eingestellt, der für die Bildung von Orotsäure günstig ist. Eine bemerkenswert große Menge an Orotsäure häuft sich in dem Kulturmedium innerhalb von 2 bis 3 Tagen an.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele eingehender erläutert.

55 Beispiel 1

In jeden von einer Reihe von 250-ccm-Erlenmeyerkolben wurden 20 ecm eines Gärungsmediums gegeben und vor der Verwendung sterilisiert. Das Medium enthält 5,0 % Glucose, 1,5 % Ammoniumacetat, 0,05 % Monokaliumphosphat, 0,05 % Dikaliumphosphat, 0,5% Harnstoff, 0,5% Hefeextrakt, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Mangansulfat, 0,5% Ammoniumsulfat und lOy/1 Biotin.

Die unten angegebenen Bakterienmutanten, die Pyrimidine erfordern, wurden auf je eines der Medien gegeben und bei 30⁹C unter Schütteln gezüchtet.

Nach 72 Stunden wurde die gebildete Menge Orotsäure wie folgt bestimmt:

Name des Bakteriums	Gebildete Menge an Orotsäure (g/100 ecm)
Mikrokokkus glutamicus (534-615-305) ATCC 14275 Mikrokokkus glutamicus (588-208) ATCC 14276 Brevibakterium ammoniagenes ATCC 6871	0,52 0,41 0,30

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde der Stamm Mikrokokkus glutamicus (534-615-305) ATCC 14275 verwendet. Je 500 Teile eines Kulturmediums wurden in einen 2000-ccm-Erlenmeyerkolben gegeben und vor der Verwendung sterilisiert.

Das Gärungsmedium hatte die folgende Zusammensetzung: Glucose 5,0%; KH₂PO₄ 0,05%; K₂HPO₄ 0,05%; MgSO₄ · 7 H₂O 0,05%; MnSO₄ · 4 H₂O 0,001%; FeSO₄-7 H₂O 0,001%; (NH^₂SO₄ 0,5%; Harnstoff 0,5%; Uracil lOOy/ccm; Biotin 25y/l (pH 7,0).

Nach dem Beimpfen mit dem Stamm wurde das Medium unter Schütteln gezüchtet, wobei die Temperatur bei 30° C gehalten wurde. Während des Züchtens wurde Harnstoff zugesetzt, um die Ammoniakquelle zu ergänzen und den pH-Wert der Gärungsflüssigkeit zwischen 6,0 und 8,0 zu halten. Im Verlauf des Wachstums werden Kristalle von Ammoniumorotat aus dem Medium abgeschieden. Nach 72 Stunden wird eine Flüssigkeit erhalten, die 0,8% Orotsäure enthält.

Beispiel 3

Das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei ein Kulturmedium verwendet wurde, das 10,0% Glucose, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% K₂PO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,001% MnSO₄-4H₂O, 0,001% FeSO₄-7 H₂O, 0,5% (NH^SO,, 0,5% Harnstoff, 20y/l Biotin und lOOy/ccm Uracil enthielt. Die Züchtung dauerte 72 Stunden. Die gebildete Menge an Orotsäure betrug 10 mg/ccm. Die Kristalle fielen während der Gärung aus und wurden isoliert, und die filtrierte Gärungsflüssigkeit wurde eingengt. Die beim Abkühlen des Konzentrats gebildeten Kristalle wurden abfiltriert. Aus 11 Gärflüssigkeit (die 10 g Orotsäure enthielt) wurde Ammoniumorotat in einer Menge isoliert, die 9,2 g Orotsäure entsprach. Das Salz der Orotsäure läßt sich leicht in die freie Säure überführen, indem es mit verdünnter Salzsäure erwärmt wird.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biochemischen Herstellung von Orotsäure durch aerobe Züchtung einer Pyrimidinsubstanzen erfordernden Mikroorganismenmutan-

5 6

ten in einem hierfür üblichen Nährmedium unter glutamicus (588-208) ATCC 14276 oder Brevi-

Aufrechterhaltung eines pH-Wertes über 5,5, bakterium anunoniagenes ATCC 6871 verwendet.

dadurch gekennzeichnet, daß man

die Mikroorganismenmutanten Mikrokokkus glut- In Betracht gezogene Druckschriften:

amicus (534-615-305) ATCC 14275, Mikrokokkus 5 USA.-Patentschrift Nr. 2 788 346.

509 628/66 7.65 © Bundesdruckerei Berlin