DD287509A5 - Verfahren zur herstellung antibiotischer verbindungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung antibiotischer Verbindungen. Es handelt sich dabei um die N-Alkylderivate der antibiotischen Verbindungen BU-3608, BU-3608 B, C, D und E. Die erfindungsgemaesz erhaeltlichen Verbindungen koennen als Antifungus-Mittel eingesetzt werden.{Verfahren; Herstellung; antibiotische Verbindungen; Antifungus-Mittel}

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG ANTIBIOTISCHER VERBINDUNGEN

Anwendungsgebiet der Erfindung

Bei den erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen handelt es sich um N-Alkylderivate des antibiotischen BU-3608-Komplexes. Diese Verbindungen stellen antifungale Wirkstoffe dar bzw. besitzen eine gegen Pilze gerichtete Aktivität.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Fermentation sowie die Isolierungs- und Reinigungsvorfahren für die Antibiotika BU-3608, BU-3608 B und BU-3608 C sind ausführlich in der Europaischen Patentanmeldung EP-A-88 101 410 beschrieben. Die Isolierungs- und Reinigungsverfahren für die Antibiotika BU-3608 D und BU-3608 E sind in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-89 110 234 beschrieben. Auf diese Anmeldungen wird hiermit Bezug genommen. Die Strukturen der oben aufgeführten Antibiotika entsprechen den nachstehend bezeichneten Formeln Ia bis Ie.

R¹ CONHCHCO₂H

¹⁼

= CH

Ia: BU-3608; R¹⁼CH₃; R² = 0-»/losy 1 ; Ib: BU-3608 B; R¹^CH₃; R²=H; R³=CH₃ Ic: BU-36C3 C; R¹³CH₃J R² = 0-Xylosy 1 ; R³ = H Id: BU-3608 0; R^X = H ; R²^O-Xy Iosy1 j R³ = CH₃ Ie: BU-3608 E; R¹^H; R^?=0-Xylosyl} R³=H

Die Verbindung BU-3608 besitzt jedoch nur eine geringe Wasserlöslichkeit.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung war es, die Wasserlöslichkeit der BU-3608 zu verbessern, damit sie den an sie gestellten Formulierungsanforderungen besser gerecht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung wasserlöslicher Derivate der verschiedenen Komponenten des antibiotischen BU-3608-Komplexes bereitzustellen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der" folgenden allgemeinen Formel (II)

worin

R ein Wasserstoffatom bedeutet oder R eine Methylgruppe darstellt/ wobei in letzterem Fall die sich ergebende

Alanylgruppe eine D-Alanylgruppe ist.. < ein Wasserstoffatom oder eine (b -D-Xylosylgruppe bedeutet und Y für

NR³R⁴ oder N⁺R³R⁴R⁵X" steht, worin R³, R⁴ und R⁵ gleiche oder verschiedene C, c-Ai»>.ylreste bedeuten und X~ ein Anion darstellt, und der pharmazeutisch verträglichen Salze dieser Verbindungen.

_A

Mit [o-D-Xylosyl wird dabei das folgende Fragment bezeichnet :

Die Erfindung betrifft auch die Desxylosyl-Derivate von BU-3G08 C (IHa), BU-3608 D (HIb) und BU-3608 E (HIc) sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.

' CONHCHCO₂H

H,C

ΠΙ«: R¹^CH₃J R³=H !lib« R¹««! R³^CH₃ Hie« R¹^Hj R³=H

Die Antibiotika BU-3608, BU-3608 B, BÜ-3608 C, BU 3608 D und BU-3608 E werden als Ausgangsverbindungen für die Herstellung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen eingesetzt und können durch Kultivieren eines ' ^e^ⁿ Antibiotikum produzierenden Stammes von Actinomadura hibisca sp. nov. hergestellt werden. Die Actinomadura hibisca Stämme Nr. P157-2 und Q278-4 wurden bei der American Type Culture Collection (Rockville/ MD) hinterlegt. Diesen Stämmen wurden die Nummern ATCC 53557 bzw. ATCC 53646 zugeteilt. Ein Mutantenstamm_; der aus dem Stamm P157-2 durch Behandeln mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) erhalten wurde/ produziert die D- und Ε-Komponenten in größeren Anteilen als sowohl der Pl57-2-Stamm oder de.·; Q278-4-Stamm. Dieser als A2660

OQ bezeichnete Mutantenstamm wurde ebenfalls bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Nummer ATCC 53762.

BU-3608 B ist das Desxylosyl-Derviat von BU-3608. BU-3608 B, Desxylosyl-BU-3608 C, D und E kann man hergc stellen/ indem man BU-3608/ BU-3608 C/ D bzw. E in Chlorwasserstoffsäure solange erhitzt/ bis. die Xylosegruppe

abgespalten wird und den pH-Wert der Lösung derart einstellt/ daß das gewünschte Produkt ausfällt.

Die Aminogruppe von BU-3608/ BU-3608 C/ D und E und die entsprechenden Desxylosyl-Derivate kann man mittels reduktiver Alkylierung alkylieren/ wobei man zuerst die antibiotische Ausgangsverbindung mit einem Aldehyd oder einem Keton zu einem Imin umsetzt und anschließend das so gebildete Imin reduziert. Die Kondensation und Reduktion kann man in dem gleichen Reaktionsgefäß in einer Stufe oder in zwei Stufen durchführen. Die primäre Amingruppe von BU-3608 C/ E .ode.t die Desxylosyl-Derivate kann man in ein tertiäres Amin mit zwei identischen Alkylgruppen überführen/ indem man mit mindestens zwei Äquivalenten der Carbonylverbindung/ bezogen auf das Antibiotikum/ behandelt und anschließend reduziert. Ein tertiäres Amin mit zwei verschiedenen Alkylsubstituenten kann man erhalten/ indem man eine bestimmte Menge eines ersten Carbonylreaktanden einsetzt/ um die primäre Amingruppe in ein sekundäres Amin zu überführen/ das man dann mit einer zweiten unterschiedlichen Carbonylverbindung zum gewünschten tertiären Amin umsetzt.

Der Carbonylreaktand kann ein Aldehyd oder ein Keton mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sein/ beispielsweise Formaldehyd/ Acetaldehyd, Propionaldehyd und Aceton. Die Reduktion des Imins kann man herbeiführen/ indem man Reduktionsmittel zur Anwendung bringt/ beispielsweise Metallhydride/ wie Natriumborhydrid/ Natriumcyanoborhydrid und Lithiumaluminiumhydrid. Die Umsetzung führt man in einem polaren organischen Lösungsmittel oder einer Mischung davon aus/ wozu beispielsweise zählen: Wasser/ Acetonitril/ niedrige Alkanole und Dimethylsulfoxid. Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders eingeschränkt und kann von Raumtemperatur bis zu etwa 100⁰C reichen. Es hat sich herausgestellt/ daß die bei Raumtemperatur durchgeführte Alkylierungsreaktion

nach 24 h beendet ist. Die optimalen Reaktionsbedingungen hängen natürlich von der Art und der Reaktivität der eingesetzten Reaktanten ab.

Man kann die Aminogruppen euch dadurch alkylieren, daß 5

man mit e^;.iem Alkylhaiogenid umsetzt. Verbindungen mit einer quaternären Ammoniumgruppe kann man durch erschöpfendes Alkylieren der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), (III) oder (II), worin Y für NR³R⁴

steht, erhalten

10

Die Löslichkeit der v» rschiedenen Antibiotika wurde in phosphatgepufferten Kochsalzlösungen (PBS) bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt. PBS(-) bezeichnet eine Lösung/ die pro Liter 0/2 KCl, 0,2 g KH₂PO., 8 g NaCl und 1/15 g Na₀HPO^, enthält; PBS(+) enthält außerdem 100 mg MgCl₂*oh^ü und 100 mg CaCl

₂.

Verbindung des Beispiels	Löslichkeit PEiS (-)
5	330 !
6	>2100
7	1800
8	3100
9	73
10	>2700

J^ P J \ *T* /

42

>20Ö0 3 ο τι 22

Die Löslichkeit von BU-3608 betrag. i.,i Vergleich dazu 16 bis 18 μg/ml bzw. 9 bi° 23 μg/ml in PBS(-) - bzw. PBS(+)-Lösungen. Somit besitzen die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen der allgemeinen Formel (II)

eine wesentlich bessere Wasser löslichkeit als BU-3608. 35

Die nachstehenden Ausführungen befassen sich mit den biologischen Eigenschaften der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen.

. Die Antifungusaktivitäten repräsentativer erfindungsgemäß erhältlicher Verbindungen wurden sowohl in vitro als auch in vivo untersucht. Die minimalen .Hemmkonzentrationen (MHK) gegen verschiedene Pilze wurden mittels der Serien-Agarverdünnungsrnethode unter Verwendung von Sabouraud-Dextrose-Agar bestimmt. Es wurden somit etwa 0/003 ml der Pilzsuspension mit einem Gehalt von 10' Zellen/ml auf die Oberfläche von Agarplatten aufgetragen/ welche die untersuchten Antibiotika enthielten. Die MHK-Werte wurden aufgezeichnet/ nachdem die Kulturen 44 h bei 28 C inkubiert worden waren. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I wiedergegeben.

TABELLE I

In vitro Antifungu'saktivität

Verbindung vom

HHK

Beispiel	C.albicans	C.neoformans	A.fumigatus	T.mentagrophtei
3	3.1	1.6	>100	>100
5	6.3	1.6	6.3	6.3
6	3.1	1.6	12.5	25
7	6.3	1.6	12.5	25
8	3.1	0.8	6.3	6.3
9	6.3	1.6	25	12.5
10	12.5	12.5	>100	>50

?87 50

Die in vivo-Aktivität der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen wurde gegenüber Candida albicans A9540-Infektion bei Mäusen getestet. Die Testorganismen wurden 18 h bei 28°C in YGP-Medium (Hefeextrakt/ Glukose# Pepton; K_?HP0₄/ ' MgSO.) kultiviert und dann in Kochsalzlösung suspendiert.

Männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 24 g wurden intravenös mit etwa der 10-fachen mittleren letalen Dosis des Testpilzes infiziert. Das Antibiotikum wurde in verschiedenen Dosishöhen an Gruppen von jeweils 5 Mäusen unmittelbar nach der Fungusinfektion intravenös verabreicht. Diejenige Dosis; die 50 % der Tiere vor einer Infektion (PDc₀/ mg/kg) schützt/ wurde aus den Uberlebensraten berechnet/ aufgezeichnet am Tag 20 nach der Pilzchallenge. Alle Kontrolltiere starben innerhalb von 7 bis 15 Tagen nach

IB der Infektion. Die PD,-₀-Werte für die Verbindungen der Beispiele 5/ 7 und 8 betragen 14 mg/kg (toxisch)/ 11 mg/kg bzw. 3/5 mg/kg.

Erfindungsgemäß ist es somit möglich/ Pilzinfektionen zu behandeln/ wobei man an den Wirt / der mit einen Pilz infiziert ist, .eine .wirksame Antifungusmenge einer erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung verabreicht. Zur Behandlung von Pilzinfektionen bei Tieren und Menschen können die erfindungsgemäß erhältlichen Antibiotika auf jede anerkannte Verabreichung^art in einer antifungal wirksamen Menge verabreicht werden. Dazu zählen die intravenöse/ intramuskuläre/ orale/ intranasale und für Oberflächeninfektionen die topische Verabreichung. Zu den Präparaten für eine parenterale Verabreichung zählen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen/ Suspensionen oder Emulsionen. Diese können auch in Form steriler fester Zusammensetzungen hergestellt werden/ die in sterilem Wasser/ physiologischer Kochsalzlösung oder jedem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor der Anwendung gelöst werden können. Eine orale Formulierung kann in Form von

Tabletten/ Gelatinekapseln/ Pulvern/ Pastillen/ Sirupen und dergleichen vorliegen. Für eine topische Verabreichung kann man die Verbindung in Lotionen/ Salben/ Gele/ Cremes/ Tinkturen und dergleichen inkorporieren. Einheitdosis-' formen kann man herstellen/ indem man Methoden zur Anwendung bringt/ die dem Fachmann für die Herstellung pharmazeutischer Formulierungen im allgemeinen gut bekannt sind.

Es ist ersichtlich/ daß bei der Behandlung eines Wirtes/ der mit einem Fungus infiziert ist/ welcher auf die erfindungsgemäfl erhältlichen Antibiotika anspricht/ die aktuell bevorzugte Verabreichungsart und Dosierung in die Befugnis des verabreichenden Arztes gestellt ist/ welcher für die Behandlung von Pilzinfektionen bzw. viralen Infektionen ausgebildet ist. Der Verabreichungsweg und die Dosierung hängen natürlich auch von dem verursachenden Organismus/ seiner Sensitivität bezüglich des Antibiotikums/ der Schwere und dem Ort der Infektion sowie den Charakteristika des Patienten ab/ wozu beispielsweise das Alter/ das Körpergewicht/ die Ausscheidungsrate/ parallele Medikationen und der allgemeine physische Zustand zählen.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Fermentation von Actinomadura hibisca-Stamm P157-2

a) Schrägagar

Actinomadura hibisca-Stamm P157-2 wurde auf einem Agarslant gezogen/ der wie folgt zusammengesetzt war: 0/5 % lösliche Stärke (Nichiden Kagaku Co.); 0/5 % Glukose;.0/1 % Fischmehlextrakt (Mikuni Kagaku); 0/1 % ' Hefeextrakt (Oriental Yeast Co.); 0/2 % NZ case (Sheffield);

ίο

0/1 % CaCO₃; 0/2 % NaCl; 1/6 % Agar. Die Kultur wurde 7 Tage bei 28°C inkubiert.

b) Impfkultur

Ein Teil des mikrobiellen Wachstums wurde von der Schrägkultur in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert/ der 100 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung enthielt: 1/0 % Glukose; 2/0 % lösliche Stärke (Nichiden Kagaku Co.); 0,5 NZ-Amin-A (Sheffield); 0,5 % Hefeextrakt (Oriental Yeast Co.) und 0,1 % CaCO-. Der pH-Wert des Mediums wurde vor der Sterilisierung auf 7,2 eingestellt. Die Impfkultur wurde 4 Tage auf einem Drehschüttler bei

200 Umdrehungen/Min, und bei 28°C inkubierto 16

c) Flaschenfermentation

5 ml des mikrobiellen Wachstums wurden von der Impfkultur in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert/ der 100 ml eines sterilen Produktionsmediums folgender Zusammensetzung enthielt: 3/0 % Glukose; 3/0 % Sojabohnenmehl (Nikko Seiyu Co.); 0/5 % Pharmamedia (Traders Protein); 0/1 % Hefeextrakt (Oriental Yeast Co.) und 0/3 % CaCo.,. Die Fermentation wurde während eines Zeitraums von 5 bis 6 Tagen auf einem Drehschüttler bei einer Temperatur von 28 C durchgeführt. Die Antibiotikaproduktion in der Fermentationsbrühe wurde mittels der Brühenverdünnungsmethode unter Verwendung von Candida albicans A9540 als Indikatororganismus in Sabouraud-Dextrose-Brühe überwacht; 30

UV-Assay bei 500 nm in 0,01 N NaOH-MeOH (l:l)-Lösung wurde auch eingesetzt. Die Antibiotikaproduktion erreichte ein Maximum bei 650 μg/ml am Tag 5.

d) Tankfermentation

3 1 der Impfkultur wurden eingesetzt, um 120 1 des sterilen Produktionsmediums zu inokulieren, das in einem 200 1 Tankfermentor vorhanden war. Die Zusammensetzung des Produktionsmediums ist diegleiche wie diejenige des bei der Flaschenfermentation eingesetzten Mediums. Der Tank wurde bei einer Temperatur von 28°C gehalten, wobei mit 250 UpM gerührt wurde. Die Belüftungsrate betrug 120 l/Min. Nach 96-stündiger Fermentation wurde eine antibiotische Wirksamkeit von 500 μg/ml erzielt; der pH-Wert der Brühe betrug 7,9.

Beispiel 2

Isolierung und Reingung der Antibiotika

Eine ausführliche Beschreibung der Verfahren für die Isolierung und Reinigung der Antibiotika BU-3608, BU-3608 B und BU-3608 C ist in der EP-A-88 101 410 enthalten. Die Isolierung und Reinigung der D- und E-Komponenten ist in der EP-89 110 234 beschrieben. Auf diese Anmeldungen wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Das Verfahren zur Isolierung und Reinigung der verschiedenen Komponenten des antibiotischen Komplexes ist nachstehend beschrieben.

Die geerntete Brühe (pH 7,8) wurde zentrifugiert und der überstand wurde mit 6 N HCl auf pH 2,0 angesäuert, um bio-inaktive ,feststoffe auszufällen. Nach Entfernung des Präzipitats wu.cde das Filtrat mit 6N NaOH auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Die Lösung wurde vorsichtig 30 Min.

bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende dunkelrote

Feststoff wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Dieser Feststoff wurde in einer 3:1:4-Mischung von n-Butanol/ Methanol/l % NaCl gelöst. Die Mischung wurde 30 Min. gerührt. Die untere wäßrige Schicht wurde abgetrennte erneut mit · einer frischen oberen Schicht gewaschen/ auf einen pH-Wert von 2/0 mit 6N HCl angesäuert und dann mit n-Butanol extrahiert. Der n-Butanolextrakt wurde mit Wasser gewaschen/ im Vakuum konzentriert und lyophilisiert und ergab das semi-reine BU-3608-Hydrochlorid. Eine Lösung dieses Fest-Stoffs in n-Butanol wurde mit alkalischem Wasser (pH 9/0) geschüttelt. Die wäßrige Schicht wurde auf pH 2/0 angesäuert und mit Methylacetat gewaschen. Die Extraktion mit n-Butanol und die anschließende Verdampfung des Lösungsmittels ergab eine reinere Probe von BU-3608 HCl. Dieses Material wurde dann einerUmkehrphasen-Silikagel-Chromatographie (ODS-60/ 350/250 Mesh/ Yamamura Chemical Lab./ Säule 4/5 χ 90 cm) unterworfen. Die Probe wurde in Wasser gelöst und auf die Säule aufgegeben/ die zuvor mit einer·Mischung aus Acetonitril-0/15 % KH₃PO₄(PH 3,5) = 17:83 (V/V) äquilibriert worden war. Die Säule nacheinander mit jeweils 5 1 einer Acetonitril-0/15 % KH₂PO₄-Mischung mit den folgenden Verhältnissen gewaschen: 17:83/ 18:82/ 19:81/ 20:80. Anschließend wurde diese Säule mit derselben Lösungsmittelmischung bei einem Verhältnis 22:78 entwickelt. Das Eluat wurde in 100 ml Fraktionen gesammelt/ die mittels eines Mikroplatter.assays überwacht wurden/ und zwar unter Verwendung von C. albicans A9540 und Dünnschichtchromatographie (SiO₂/ Methylacetat-n-propanol-28 %-Ammoniumhydroxid = 45:105:60 V/V). Diejenigen Fraktionen/ die die Hauptmenge an homogener Verbindung enthielten, wurden vereinigt und weiter gereinigt/ so daß sie BU-3608 ergaben.

In den oben beschriebenen Verfahren zur Durchführung der Umkehrphasen-Silikagel-Chromatographie wurden die Fraktionen, die vor und nach der homog; an BU-3608-Haupt-

fraktion eluierten; vereinigt. Das vereinigte Eluat wurde unter Verwendung von HP-20-Harz entsalzt; um einen BU-3608 B enthaltenden Feststoff und· einen BU-3608 C enthaltenden Feststoff zu erhalten. Der BU-3608 B enthaltende Feststoff · wurde in Wasser gelöst und auf eine Säule von ODS-60 (Yamamura Chem. Lab. 8/0 χ 90 cm) aufgegeben/ die zuvor mit einer 22:78 (V/V) Mischung von Acetonitril-O/15 % KH₃PO₄ (pH 3/5) gründlich gewaschen worden war. Dieselbe Lösungsmittelmischung wurde eingesetzt/ die beladene Säule zu eluieren. Die Fraktionen wurden gesammelt und mittels HPLC untersucht. Die BU-3608 B enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt/ im Vakuum konzentriert und mittels HP-20 Harz-Chromatographie entsalzt/ wobei unreines BU-3608, reines BU-3608 und BU-3608 B erhalten wurde. BU-3608 B wurde mittels präparativer HPLC unter Verwendung einer Mikrosorb Short One C.g-Säule (4/6 mm I.D. χ 100 mm/ 3 μπυ Rainin-Instrument Co.) gereinigt. Die Elution erfolgte mit einer 29:71 (V/V) Mischung von Acetonitril-0,15 % KH₂PO₄ (pH 3,5). Der BU-3608 C enthaltende Feststoff wurde auf ähnliche Weise

unter Verwendung der ODS-Säule gereinigt, wobei mit einer 21:79 (V/V)-Mischung aus Acetonitril-0,15 % KH₃PO₄ (pH 3,5) eluiert wurde. HPLC wurde zur überwachung des Eluats eingesetzt; BU-3608 C enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde mittels HP-20-Chromatographie entsalzt und ergab fast reines BU-3608 C und fast reines BU-3608.

In dem oben beschriebenen Umkehrphasen-Silikagel-Chromatographie-Verfahren wurden die vor BU-3608 C eluierenden Fraktionen getrennt gesammelt und vereinigt. Die vereinigten schwach-orange gefärbten Fraktionen wurden unter Verwendung von Diaion HP-20-Chromatographie entsalzt. Der so erhaltene Feststoff war mit den D- und Ε-Komponenten verhältnismäßig stark angereichert, enthielt jedoch immer noch eine große Menge der C-Komponente. Die vereinigten Feststoffe wurden

auf eine Säule von Umkehrphasen-Silikagel (ODS-60/

Yamamura Chem. Lab./0 8/0 χ 90 cm) und mit einer 21:79-Mischung aus Acetonitril-0,15 % KH₃PO₄ (pH 3/5) eluiert. Das Eluat wurde mittels HPLC unter Verwendung einer B ' Mikrosorb-Short-One-C, „-Säule (Rainin Instrument Co./ 4,6 mm I.D. χ 100 mm/ 3 μπι) untersucht; eine 7:17-Mischung aus Acetonitril-0/15 % KH₃PO₄ (pH 3/5) wurde als mobile Phase bei einer Flußrate von 1/2 ml/Min, eingesetzt. Detektiert wurde mittels UV-Absorption bei 254 nm. Zuerst eluierte BU-3608 E und dann BU-3608 D. Die BU-3608 E enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt/ im Vakuum konzentriert und mittels HP-20-Chromatographie entsalzt/ wobei sich fast homogenes BU-3608 E HCl ergab. Eine wäßrige Lösung von BU-3608 E HCl wurde mit 0/1 N NaOH auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt,- um reines BU-3608 E in der zwitterionischen Form abzuscheiden. In ähnlicher Weisewurde BU-3608 D als Zwitterion erhalten.

Beispiel 3 20

Herstellung von Desxylosyl-BU-3608 E (HIc)

Eine Lösung von BU-3608 E-Hydrochlorid (97 mg) in 2N HCl (12 ml) wurde 70 Min. in einem verschlossenen Röhrchen auf 115 C erhitzt. Die erhaltene Lösung wurde durch Zugabe von 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 5/5 eingestellt und dann zentrifugiert. Der so erhaltene Feststoff wurde mit Isopropanol und Aceton gewaschen, wobei sich 87 mg von Desxylosyl-BU-3608 E ergaben.

FP: 205 - 209⁰C (Zers.)/ UV >~ 0,0lN NaOH

nm (&): 235,2 (23600), 319,2 (11100); 498,4 (108.00) 35

15 Beispiel 4

Herstellung von Desxylosyl-BU-3608 C (HIa)

Das im Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von BU-3608 C-Hydrochlorid wiederholt; um die Titelverbindung bereitzustellen.

FP: 208 - 215°C (Zers. )

Beispiel 5

Herstellung von N-Methyl-BU-3608 B (II; R²=H; R¹=R³=R⁴=CH₃)

Eine Mischung aus BU-3608 (540 mg) in 2 N HCl (60 ml) wurde 70 Min. in einem verschlossenen Röhrchen auf 115°C erhitzt und dann abgekühlt. Das erhaltene feste Material wurde abzentrifugiert (3000 UpM) in H₃O suspendiert; der pH-Wert wurde durch Zugabe von 6N NaOH auf 11/7 eingestellt. Die

^Q Lösung (60 ml) wurde zu 300 ml Aceton gegeben. Das resultierende BU-3608 B wurde als Feststoff gesammelt. Der Feststoff wurde in 20 ml H_0 gelöst. 1 N HCl wurde zugegeben/ um den pH-Wert auf 8/3 einzustellen. Anschließend wurde mit 20 ml CH,CN verdünnt. Wäßriges HCHO (37 %, 0/8 ml) und NaBH₃CN 120 mg) wurden nacheinander bei Raumtemperatur zu der Lösung gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur während ein3s Zeitraums von 15 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der wäßrige Rückstand wurde zu gerührtem Aceton zugetropft. Der sich bildende

"0 Feststoff wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet/ wobei 440 mg N-Methyl-BU-3608 B-Natriumsalz erhalten wurden. Ein Teil dieses Salzes (50 mg) wurden in H₂O gelöst; die Lösung wurde mit IN HCl auf einen pH-Wert von 6/0 eingestellt. Der erhaltene Feststoff wurde mit H₃O gewaschen und lyophilisiert/ wobei 33 mg der zwitterionischen Form erhalten wurden; FP.: 211-215°C (Zers.).

²⁴⁰'⁸ (19700), 319,2 (13400), 499,2 (13100)

. Beispiel 6

Herstellung von N,N-Dimethyl-desxylosyl-BU-3608 E (II,

ι ο -j λ R =R =H; R =R =CH₃)

Eine Lösung von Desxylosyl-BU-3608 E (52,9 mg) in H_?0 (5 ml, pH 8,4) wurde mit 5 ml CH₃CN verdünnt. 0,2 ml wäßriges HCHO und 30 mg NaBH₃CN wurden nacheinander bei Raumtemperatur zu der Lösung gegeben; die erhaltene Lösung wurde 14 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der wäßrige Rückstand (pH 11,3) wurde zu gerührtem Aceton hinzugetropft. Das gesammelte Präzipitat wurde in H_O gelöst und der pH-Wert wurde auf 5,5 eingestellt, wobei ein Feststoff erhalten wurde, der nacheinander mit H_O, Isopropanol und Aceton gewaschen wurde. Nach Trocknen wurden 28', 7 mg von N, N-Dimethyldeäxylosyl-BU-3608 E erhalten mit Fp.: 205-208°C (Zers.).

_uv^ 0,01N NaOH_{nm (ε)} . _{232Q (34000); 319/2} (15700),

!Ώα Χ

497,6 (14900).

Beispiel 7

Herstellung von N, N-Dimethyl-BU-3608 E (II, R^1-=H; R²=D-xylosyl; R³=R⁴=CH₃)

Zu einer Lösung von BU-3608 E (485 mg) in einer Mischung aus 40 ml H₃O und 40 ml CH₃CN wurden bei pH 8,0 iacheinander wäßriges HCHO (37 %, 1,6 ml) und NaBH₃CN (MO mg) bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Lösung wurde 15 h bei Raumtemperatur gerührt; das Lösungsmittel wurde im Vakuum

entfernt. Der in 50 ml H_?O gelöste Rückstand wurde nach Einstellen des pH-Wertes auf 11,0 zu 300 ml gerührtem Aceton hin.zugetropf t. Das resultierende Präzipitat wurde gesammelt, in H₂O gelöst; und der pH-Wert wurde mit . 6N HCl auf 2,0 eingestellt. Die Lösung wurde durch Passieren über HP-20 entsalzt. Der pH-Wert der das Produkt enthaltenden Lösung wurde auf 5,5 eingestellt, um einen Feststoff auszufällen, der gesammelt mit Η«0 und Aceton gewaschen und getrocknet wurde. Es wurden 364 mg N,N-Dimethyl-BU-3608 E erhalten; Fp.: 214 - 218°C (Zers.)

UV >. 0,0lN NaOH_{nm {&)} . ₂₂₃₆ (33900), _319/2 (15500),

ΓΠ3 X

497,6 (15100)

Analyse für ^c ₄₀ ^H44^N2°18" ^{1/5 H}2°

	C	H	N
berechnet:	55,36	5,46	3,23
gefunden:	55,26	5,45	3,19

Beispiel 8

Herstellung von N-Methyl-BU3608 (II; R¹=R³=R⁴=CH₃; R²=D-Xylosyl)

Zu einer gerührten Lösung von BU-3608-Natriumsalz (550 mg) in 50 %-igem wäßrigen CH₃CN (55 ml) wurden HCHO (37 %, 0,75 ml) und NaBH-CN (150 mg) hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 18 h gerührt. Nach Konzentrieren wurde das wäßrige Konzentrat verdünnt (200 ml), bis zu einem pH-Wert von 3,0 angesäuert und an HP-20 (300 ml) einer Säulenchromatografie unterzogen. Nach Waschen mit Wasser und nach anschließendem Eluieren mit 60%-igem wäßrigen Aceton (pH 3,0) wurde das rotgefärbte Eluat im

Vakuum konzentriert. Der pH-Wert wurde auf 5/5 eingestellt/ um N-Methyl-BU-3608 zu präzipitieron, das abfiltriert wurde (425 mg); Fp.": 190-195⁰C (Zers.).

· IR(KBr) cm"¹: 3400, 1605, 1450, 1295

UV>_S[nax ^{50% Me0H} nm ( 8 ) 220 (33.700), 278 (26.800), 488 (11.400);

SI-MS m/z 855 (MH-H) ⁺

Beispiel 9 Herstellung von N-Propyl-BU-3608 (II; R¹=R³=CH,; R²=D-

Xylosyl; R =(CH₂)₂CH₃)

Das im Beispiel 8 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von BU-3GG8-Natriumsalz (200 mg), Propionaldehyd (1 ml) und NaBH-CN (200 mg) wiederholt, wobei N-Propyl-BU-:608 (127 mg) erhalten wurde· Fp.: 187-192°C (Zers.)

IR(KBr) cm"¹ 3380, 1605, 1450, 1295, 1255;

UVA_m ^{50% lMe0H} nm(£ ) : 223 (33.000), 278 (27,500).· 488 (11.700);

SI-MS m/z 883 (f<+H) ⁺

Beispiel 10

Herstellung des quaternären Ammoniumderivats von BU-3608 (II; Y=N(CH₃J₃ Cl)

140 mg BU-3608-Natriumsalz wurden mit 1,5 ml Methyl-

iodid und 200 mg Kaliumbicarbonat in 5 ml Dimethylsulfcxid

und 20 ml Methanol bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von 43 h behandelt. Die Mischung wurde konzentriert; mit 20 ml 0,5 N NaOH verdünnt und 30 Min. bei 70⁰C gehalten. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 3,0 eingestellt. Die . Lösung wurde dann auf eine HP-20-Säule (150 ml) gegeben, um sie zu entsalzen. Das die Titelverbindung enthaltende Eluat wurde verdampft, wobei ein roher Feststoff des quaternären Ammoniumderivats von BU-3608 (144 mg) erhalten wurde . Der rohe Feststoff wurde durch Umkehrphasen-Silikagel-Chromatographie (^ 2,0 χ 45 cm) mit CH₃CN-O,15 % KH₂PO₄, pH 3,0 (20:80) Elution gereinigt. Das Eluat wurde mittels HPLC untersucht. Die das reine quaternäre Derivat enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mittels HP-20-Chromatographie (150 ml) entsalzt, wobei die reine Titelverbindung erhalten wurde (71 mg). Fp.: 205 - 210⁰C (Zers.)

IR(KBr) cm"¹ 3400, 1620, 1600, 1440, 1255

UV-λ „^{50% Me0H}nm (6) 276 (22.300), 498 (9.800)

IHa X

SI-MS m/z 860 (M⁺) Bruttoformel: ^C4₂ ^H49^N2°18^C1

Beispiel 11 25

Herstellung von Desxylosyl-BU-3608 D (HIb)

Das im Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von BU-3606 D-Hydrochlorid wiederholt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde. Fp.: 205 - 211°C (Zers.)

Claims (8)

1. M/30 142

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung von antibiotischen Verbindungen r folgenden allgemeinen Formel (II)

   J

   CONHCHCOjH

   H₃C
   15

   worin

   R ein Wasserstoffatom bedeutet oder R eine Methylgruppe darstellt und die sich ergebende Alanylgruppe eine D-Alanylgruppe ist;

   R ein Wasserstoffatom oder eine β-D-Xylosylgruppe bedeutet und

   Y für NR³R⁴ oder Sr³R⁴R⁵X" steht, wobei R³, R⁴ und R⁵

   gleiche oder unterschiedliche C,__-Alkylgruppen darstellen und X~ ein Anion darstellt/

   und der pharmazeutisch verträglichen Salze davon/ dadurch gekennzeichnet/

   daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)/

   3 3

   worin Y für NHR steht/ wobei R ein Wasserstoffatom oder eine C.-Cc-Alkylgruppe bedeutet, alkyliert.

   M/30 142
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man
   a) eine Verbindung der allgemeinen Formel (II), worin Y für NHR³ steht, wobei R³ ein Wasserstoffatom ' oder eine C^-C5-Alkylgruppe bedeutet, oder ein Salz davon, mit einem Aldehyd oder einem Keton mit ein bis fünf Kohlenstoffatomen zu einem Imin umsetzt; und

   b) das Imin aus Stufe a) mit einem geeigneten Reduktionsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel II, worin Y für NR³R⁴ steht, reduziert; oder

   c) eine Verbindung der allemeinen Formel II,

   worin Y für NR⁷R⁸ steht, und R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine C^-C5 gruppe bedeuten, oder ein Salz davon, mit einem C^-C₅-Alkylhalogenid in ausreichender Menge zu einer Verbindung der allgemeinen Formel II,

   worin Y für ⁰NR³R⁴R⁵X⁹ steht, umsetzt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet,

   daß man die Verbindung der folgenden Formel 25

   T Π ~ I ' ⁽hS^S^CH'

   \ N(CH

   OH

   oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon her stellt.

   M/30 142

   Zl
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der folgenden Formel

   CONHCH(CHj)COiH

   oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon herstellt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der folgenden Formel

   COHHCH(CHj)CO_aH HOL JL ,CHi

   H₃C

   oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon herstellt.

   M/30
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1,'dadurch gekennzeichnet,

   daß man die Verbindung der folgenden Formel

   (0)

   CONHCH(CHj)CO₂H

   H₃C

   (CH₁XCH₂CH₂CH₃)

   herstellt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dia Verbindung der folgenden Formel

   CONHCHjCOjH HOL Jl .CH₁

   ,°, "V W H,C

   M/30

   oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon herstellt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der folgenden Formel

   C0NHCH<CHj)C02H

   herstellt.