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Clavam-Verbindungen
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Die Erfindung betrifft ein neues durch Fermentation gebildetes Clavamderivat,
seine Salze und Stoffgemische, die das Clavamderivat oder seine Salze enthalten,
sowie Verfahren zur Herstellung dieses Clavamderivats, seiner Salze und von Stoffgemischen,
die das Clavamderivat oder seine Salze enthalten, pharmazeutische Präparate, die
solche Verbindungen enthalten und die Verwendung dieser Verbindungen als Antibiotika
oder tumorhemmende Mittel.
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In der europäischen Patentanmeldung 57664 werden das lipophile Antibiotikum
Tü 1718 A1 (2S,5S)-2-(2-Hydroxyethyl)clavam, das aus den Rulturbruen von Streptomyces
antibioticus subsp. antibioticus erhältlich ist, und Derivate davon offenbart. Ueberraschenderweise
konnte jetzt aus den gleichen Rulturbruen eine bisher unbekannte hydrophile Verbindung
Tü 1718 Z erhalten werden.
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Der Unterschied im Löslichkeitsverhalten ermöglicht die leichte Trennung
von Tü 1718 A1 und Tü 1718 Z. Das Wirkungsspektrum der hydrophilen Verbindung Tü
1718 Z unterscheidet sich von demjenigen des lipophilen Antibiotikums Tü 1718 A1.
Die Unterschiede in Löslichkeit und Wirkung erlauben es, im Hinblick auf pharmazeutische
Präparate die Palette der Darreichungsformen zu erweitern.
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Clavamverbindungen können als substituierte Clavame oder als Verbindungen
mit einem Clavamsubstituenten bezeichnet werden. Im ersten Fall legt man das Clavam-Gerüst
mit folgender Numerierung zugrunde:
Im zweiten Fall wird der Clavamrest als 7-Oxo-4-oxa-1-azabicyclo-[3.2.O3heptyl bezeichnet,
wobei die Numerierung der Ringatome folgendermassen ausfällt:
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verbindung Tü 1718 Z der Formel
Salze dieser Verbindung und aus Kulturbrühen isolierbare Stoffgemische, die diese
Verbindung oder ihre Salze enthalten, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen
sowie pharmazeutische Präparate mit einem Gehalt an solchen Verbindungen, und die
Verwendung dieser Verbindungen oder pharmazeutischen Präparate als antibiotische
und tumorhemmende Mittel.
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Die Verbindung Tü 1718 Z der Formel I ist somit unter Berücksichtigung
der Konfiguration an den beiden asymmetrischen C-Atomen des Ringsystems und der
Stereochemie der Valylseitenkette als (2S,5S)-2-(3-Carboxy-3-hydroxy-2-(L)-valylaminoprop-l-yl)clavam
oder als
2-Hydroxy-4-((3s1ss)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo3.2.ohept-3-yl
)-3-(L)-valylaminobuttersäure zu benennen. Im folgenden wird für die Verbindung
der Formel I die Kurzbezeichnung Tü 1718 Z verwendet.
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Die Zuordnung von Formel 1 erfolgt aufgrund von 3C-NMR-, H-NMR-, darunter
auch partiell entkoppelten H-NMR-Spektren, sowie anderen physikalischen und chemischen
Untersuchungen. Die Konfiguration an den Kohenstoffatomen C-2 und C-5 des Clavamgrundgerüsts
wird durch Datenvergleich mit den NMR-Daten des bekannten (2S,5S)-2-(Hydroxyethyl)clavams
wahrscheinlich gemacht.
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Der saure hydrolytische Abbau des Dipeptidclavams der Formel 1 führt
zu (+)-Valin, so dass der Valylrest der (L)-Reihe zuzurechnen ist.
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Hinsichtlich der Kohlenstoffatome C-2 und C-3 des Carboxypropylrestes
liegt die Verbindung der Formel I angesichts der Spektren und der mikrobiellen Herkunft
der Verbindung wahrscheinlich auch als reines Enantiomer vor. Die Konfiguration
an diesen Kohlenstoffatomen konnte aber bisher nicht eindeutig zugeordnet werden.
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Aufgrund der Anwesenheit einer basischen und einer sauren Gruppierung
vermag Tü 1718 Z, im Gegensatz zu Tü 1718 A1, Salze zu bilden, die auch Gegenstand
der Erfindung sind. Solche Salze sind insbesondere pharmazeutisch verwendbare, nicht
toxische Salze.
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Ausserdem können Doppelsalze z.B. mit quartären Ammoniumhalogeniden
der Formel (R)4NX hergestellt werden1 worin X Halogen bedeutet, z.B.
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Chlor oder Brom, aber auch Fluor oder Iod, und (R)4 für eine beliebige
Kombination von vier Resten der Art Alkyl oder Arylniederalkyl steht.
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Alkyl bedeutet hier einen Rohlenwasserstoffrest mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen,
insbesondere bis zu 16 Kohlenstoffatomen, z.B.
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Methyl, Butyl, Octyl, Decyl oder Hexadecyl.
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Niederalkyl bedeutet einen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 7, insbesondere
bis zu 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl. Aryl bedeutet einen
unsubstituierten oder substituierten Phenylrest, wie z.B. Phenyl. Arylniederalkyl
ist z.B. Benzyl.
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Die vier Reste R haben zusammen z.B. bis zu 30 Kohlenstoffatome, zumindest
jedoch 10, vorzugsweise zwischen 16 und 25 Kohlenstoffatome.
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Entsprechende Ammoniumhalogenide sind beispielsweise Benzyldimethyl-n-hexadecylammoniunchlorid,
Tricaprylmethyl ammoniumchlorid Tetra-n-butylammoniumchlorid, Dimethyldioctylammoniumchlorid
oder Dimethyldidecylammoniumchlorid.
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Die Erfindung betrifft insbesondere auch Stoffgemische, die die Verbindung
Tü 1718 Z enthalten, z.B. Kulturbriihen von Streptomyces antibioticus subsp. antibioticus,
deren lipophile Bestandteile extrahiert worden sind, Lyophilisate solcher Kulturbruhen
oder durch Reinigungsoperationen erhältliche Lösungen oder Feststoffe, die einen
Gehalt an Verbindung Tü 1718 Z haben.
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Das neue Clavamderivat, die diese Verbindung enthaltenden Stoffgemische
und seine Salze besitzen pharmakologisch wertvolle Eigenschaften. Insbesondere wirken
sie antibakteriell, antifungisch und tumorhemmend und können daher z.B. in Form
pharmazeutischer Präparate, z.B. zur Behandlung von bakteriell oder durch Pilze
verursachten Infektionen oder von Tumoren bei Mensch und Tier verwendet werden.
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Die antibiotische Wirkung tritt gegenüber pathogenen und nicht pathogenen
Pilzen auf. So weist die Verbindung Tü 1718 Z gegenüber
einigen
Pilzen die folgenden minimalen Hemmkonzentrationen (MIC-Werte, in pg/ml) auf: Trichophyton
mentagrophytes: 5 Aspergillus fumigatus: 50 Sporotrichum schenkii: >50 Microsporum
canis: >50 Diese Werte werden nach der Agar-Verdünnungsmethode erhalten.
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Zur Bestimmung der mikrobiologischen Aktivität kann auch der Plattendiffusionstest
eingesetzt werden1 wobei vorzugsweise die folgenden Teststamme verwendet werden:
Mucor miehei, Pythium debarianum und Botrytis cinerea. Die Hemmhofdurchmesser von
mit wässrigen Lösungen der Verbindung Tü 1718 Z beschickten Filterrondellen betragen
bei einer Konzentration von l/oo 0.17.0 Mucor miehei 40 mm 36 mm Pythium debarianum
20 mm (P) 16 mm (P) Botrytis cinerea 36 mm (P) 25 mm (P), wobei (P) für eine partielle
Hemmzone steht.
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Die Verbindung Tü 1718 Z besitzt zudem auch eine tumorhemmende Wirkung.
Diese kann in vitro festgestellt werden1 z.B. indem abgestufte Konzentrationen des
Clavamderivats der Formel I mit 3 x 10 Tumorzellen während 48 Stunden inkubiert
werden. Die Beurteilung des Zellwachstums und die Ermittlung der minimalen Hemskonzentration
MIC (in yg/ml) können unter Zuhilfenahme eines Mikroskopes erfolgen. Auf einen Gehalt
von 38% angereichertes Tü 1718 Z führt beispielsweise zu den folgenden MIC-Werten:
Tumor-Zellinie MIC (yg/ml) Melanoma A 375-Met.Mix, human 7,5 - 15 Colon Carcinoma
CT 26, Maus 15 Mamma Carcinoma 2661, Maus 15
Die neue Verbindung
Tü 1718 Z der Formel I ist erhältlich durch Züchtung des bereits in der europäischen
Patentanmeldung 57664 offenbarten Stammes des Mikroorganismus Streptomyces antibioticus
subsp. antibioticus, welcher durch die Bezeichnung Tü 1718 charakterisiert ist,
und welcher aus einer Bodenprobe am Flussufer von Karen-Village in Nordthailand
isoliert wurde. Der Stamm ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse
8, Göttingen, am 12. November 1980 hinterlegt worden und wird dort unter der Hinterlegungsnummer
DSM 1951 aufbewahrt. Im folgenden wird gelegentlich für diesen Stamm die abgekürzte
Schreibweise Tü 1718 verwendet.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der Verbindung
Tü 1718 Z der Formel I ist somit dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Tü 1718
oder eine sich von diesem Stamm ableitende, die Verbindung Tü 1718 Z produzierende
Mutante, in einem wässrigen Nährmedium aerob züchtet, bis das Nährmedium die gewünschte
Substanz in genügender Menge enthält, das entstandene Tü 1718 Z oder die diese Verbindung
enthaltenden Stoffgemische in freier oder in Salzform aus der Kulturbrühe isoliert
und, wenn erwünscht, eine erhaltene freie Form in ein Salz oder eine erhaltene Salzform
in die freie Form überfUhrt.
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Die zur Züchtung benötigte Nährlösung muss eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle
und kann zusätzlich anorganische Salze enthalten.
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Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu nennen: assimilierbare
Kohlenhydrate, z.B. D-Glucose, D-Xylose, L-Arabinose, L-Rhamnose, D-Fructose, D-Galactose,
Raffinose, D-Mannit, Inosit, Lactose, insbesondere D-Mannit oder Lactose. Als stickstoffhaltige
Nährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine, sowie deren Abbauprodukte,
wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, Getreidemehle, z.B. von Mais, Weizen,
Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze,
Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Hefeextrakte usw., aber auch Ammoniumsalze
und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die
Nährlösung
beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Phosphate von Alkali- oder Erdalkalimetallen,
von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
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Besonders gut verläuft die Bildung der Verbindung in einer wässrigen
Nährlösung, die ca. 2t Mannit und 2t Sojamehl enthält.
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Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln
oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelkolben oder Bioreaktoren. Als Temperatur
eignet sich eine solche zwischen etwa 18 und etwa 40"C, vorzugsweise ca. 28-C. Eine
wesentliche antibiotische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach
2-5 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst
eine oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche
Produktionsmedium der Hauptkultur, z.B. im Verhältnis 1:10 bis 1:40, überimpft werden.
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Eine Vorkultur erhält man beispielsweise, indem man versportes Mycel,
das nach ca. 7-tägigem Wachstum einer Agar-Schrägkultur erhalten werden kann, in
eine Nährlösung überimpft und etwa 30 bis etwa 60, z.B. 48 Stunden1 wachsen lässt.
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Der Fermentationsverlauf kann anhand des pH-Wertes, des zentrifugierbaren
Zellvolumens (10 ml Kulturbrühe werden 5 Minuten bei 2000 g zentrifugiert und die
Menge des abzentrifugierten Sediments ermittelt) und der biologischen Aktivität
der vom Antibiotikum Tü 1718 A1 befreiten wässrigen Phase überwacht werden.
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Zur Feststellung des Gehalts an Tü 1718 Z in der Kulturbrühe - wie
auch in den einzelnen Isolierungsstufen - kann die Dünnschichtchromatographie z.B.
auf Silicagel (z.B. mit Chloroform-Methanol) und/oder die Bioautographie mit verschiedenen
Mikroorganismen und/oder die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (im folgenden
als HPCL abgekürzt) verwendet werden. Die Menge der gebildeten Verbindung wird mit
einer Eichlösung verglichen.
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Die Isolierung von Tü 1718 Z oder der Tü 1718 Z enthaltenden Stoffgemische
aus der Kulturbrühe erfolgt nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichtigung
der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften.
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Zweckmässigerweise wird die Kulturbrühe zunächst von lipophilen Bestandteilen,
z.B. auch Tü 1718 A1, befreit, indem sie mit einem in Wasser nicht löslichen organischen
Lösungsmittel, wie einem Halogenkohlenwasserstoff, worin Halogen Fluor, Chlor oder
Brom bedeutet, z.B. Chlorform oder Methylenchlorid, einem Ether, z.B. Diethylether,
oder einem Carbonsäureester, wie einem Niederalkancarbonsäureniederalkylester, z.B.
Essigester, extrahiert wird.
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Stoffgemische, die Tü 1718 Z enthalten, lassen sich direkt aus der
filtrierten Kulturbrühe gewinnen, indem man diese nach Abtrennung lipophiler Bestandteile
wie oben beschrieben z.B. auf etwa 5 Volumenprozent einengt. Der z.B. durch Lyophilisation
der wässrigen Phase gewonnene Rückstand lässt sich zunächst z.B. durch gegebenenfalls
wiederholte Chromatographie an makroporösen Harzen anreichern.
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Die betreffende wässrige Lösung wird in der üblichen Weise mit dem
makroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharz in Kontakt gebracht.
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Dazu verwendet man vorzugsweise Säulen, welche das Harzbett enthalten.
Der Adsorptionsvorgang erfolgt während der Perkolation der wässrigen Lösung durch
die Säule und ist, bezogen auf die Verbindung Tü 1718 Z, nahezu quantitativ. Das
Perkolat enthält keine oder nur geringe Mengen an Tü 1718 Z. Durch Wasser verdrängt
man die restliche Menge an Kulturfiltrat aus der Säule. Auch das Waschperkolat enthält
keine oder nur geringe Mengen Tü 1718 Z.
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Als makroporöse, nicht-ionische Adsorptionsharze sind synthetische
Harze mit einem aromatischen Grundgerüst, beispielsweise Harze auf Polystyrolbasis,
z.B. Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, geeignet.
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Solche Harze lassen sich durch verschiedene gebräuchliche statistische
Kenngrössen, z.B. Porenvolumen, spezifische Oberfläche,
durchschnittliche
Porendurchmesser, häufigster Porendurchmesser, Porengrössenverteilung, Korngrössenverteilung
und dergleichen charakterisieren.
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Geeignete Adsorptionsharze haben ein Porenvolumen von ca. 0,5 bis
ca. 4,5 ml/g, eine spezifische Oberfläche von ca. 100-1000 m2/g und einen durchschnittlichen
Porendurchmesser von ca. 4 bis ca. 130 nm und sind beispielsweise unter den Handelsnamen
AMBERLITE XAD-1, XAD-2, XAD-4 und ER-180 der Fa. Rohm & Haas, DIAION HP-10,
HP-20, HP-21, HP-30, EP-40, HP-50 der Fa. Mitsubishi, DUOLITE S-861, S-862, S-863
und ES 866 der Fa. Dia-Prosimt IMAC Syn 46 und Syn 72 der Firma Akzo Chemie, KASTEL
S-lll, S-112, S-114 der Fa. Montedison, LEWATIT OC.1031 der Fa. Bayer und RELITE
ADS der Fa. Resindion, erhältlich.
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Zur Eluierung der Verbindung Tü 1718 Z vom Harz verwendet man bevorzugt
Wasser. Zur Eluierung können ebenfalls Gemische von Wasser mit organischen Lösungsmitteln,
insbesondere wässrige Niederalkanollösungen, wobei Niederalkanole bis zu 7, vorzugsweise
bis zu 4 Kohlenstoffatome enthalten und z.B. Methanol1 Ethanol, Propanol, Butanol
sind, z.B. 10-20-iges 2-Propanol, verwendet werden.
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Durch erneutes Lyophilisieren lässt sich die Verbindung jetzt als
braungefärbtes Pulver erhalten. Die weitere Reinigung kann durch Chromatographie
an Harzen1 wie Amberlite ER 180, mit dem Laufmittel Wasser erfolgen und führt zu
bereits 45-proz. Aktivsubstanz.
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Stoffgemische, die über so/. an Tü 1718 Z enthalten, können z.B.
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durch Chromatographie an mit C12-Kohlenwasserstoffketten beschichtetem
Kieselgel erhalten werden1 wobei als bewegliche Phase z.B.
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Wasser oder 2t wässriges Methanol dienen.
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Stoffgemische, die Tü 1718 Z enthalten, lassen sich unmittelbar nach
Extraktion lipophiler Bestandteile, wie z.B. Tü 1718 A1, auch durch Ionenpaarextraktion
weiter reinigen. Dazu werden die hydrophilen Bestandteile der Kulturbrühe mit einem
mit Wasser nicht mischbaren
Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid,
extrahiert, das z.B. 0122/.
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einer quartären Ammoniumverbindung (R4)NX enthält. Dazu können die
bereits erwähnten Ammoniumhalogenide verwendet werden.
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Rückextraktion mit Wasser, das z.B. 3t Alkalihalogenid, z.B.
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Natriumiodid, enthält, überführt das Ionenpaarsalz dann wieder in
die hydrophile Form der Formel I. Die weitere Reinigung so erhältlicher Stoffgemische
kann z.B. durch Chromatographie erfolgen.
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Das reine Clavamderivat der Formel I kann durch wiederholte Chromatographie
wie zuvor oder durch die Anwendung weiterer Trennverfahren, z.B. durch HPLC erhalten
werden1 ausgehend von einem Stoffgemisch, das das Clavamderivat in einer Konzentration
von über 50 enthält.
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Das reine Tü 1718 Z oder natürliche Stoffgemische, die Tü 1718 Z enthalten,
können auch nach anderen Varianten dieser an sich bekannten Reinigungsmethoden,
z.B. mit anderen Lösungsmitteln bzw.
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Lösungsmittelgemischen und anderen Adsorptionsmitteln erhalten werden.
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Das reine (2S,5S)-2-(1-Carboxy-l-hydroxy-2-(L)-valylaminoprop-3-yl)clavam
stellt ein weisses Lyophilisat dar, das in Wasser sehr gut löslich ist.
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Stoffgemische, die die Verbindung Tü 1718 Z enthalten, sind in festem
Zustand bei -20°C stabil.
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Die Salze der reinen Verbindung oder der die Verbindung enthaltenden
Stoffgemische können in an sich bekannter Weise hergestellt werden.
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Man stellt insbesondere pharmazeutisch anwendbare Salze her.
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Zur Isolierung oder Reinigung der neuen Verbindung können auch pharmazeutisch
ungeeignete Salze Verwendung finden.
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Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des obigen
Verfahrens, bei denen man von einem auf irgendeiner Stufe als Zwischenprodukt erhältlichen
Gemisch, das die Verbindung Tü 1718 Z enthält, ausgeht und die fehlenden Schritte
durchfuhrt oder man das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mutanten des beschriebenen
Mikroorganismen-Stammes, die ebenfalls das neue Antibiotikum Tü 1718 Z, gegebenenfalls
mit erhöhter Ausbeute, zu produzieren vermögen. Solche Mutanten können z.B. durch
Behandeln mit chemischen Mitteln, z.B. mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin,
oder mit Senfölen oder durch Bestrahlung, z.B. mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen,
erhalten werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Präparate,
welche eine Verbindung der Formel I oder gegebenenfalls ein Salz davon als Wirksubstanz
enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung. Bei den erfindungsgemässen pharmazeutischen
Präparaten handelt es sich um solche zur enteralen, z.B. oralen, oder parenteralen,
z.B. topischen oder durch Injektion oder Infusion vorzunehmenden Verabreichung,
welche den pharmakologischen Wirkstoff allein oder zusammen mit einem entsprechenden
pharmazeutisch anwendbaren Trägermaterial enthalten.
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Geeignete pharmazeutische Präparate zur oralen Verabreichung, welche
den pharmakologischen Wirkstoff oder den Wirkstoff enthaltende Stoffgemische allein
oder zusammen mit einem pharmazeutisch anwendbaren Trägermaterial enthalten, sind
Präparate in Dosiseinheitsform, wie Dragees, Tabletten oder Kapseln und enthalten
von etwa 10 bis etwa 90 des Wirkstoffs, insbesondere 20-75. Sie werden in an sich
bekannter Weise, z.B. mittels konventioneller Misch-, Granulier-oder Dragierverfahren
hergestellt.
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Geeignete Trägerstoffe für Tabletten und/oder Dragees sind insbesondere
Füllstoffe, wie Zucker, z.B. Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit, Cellulosepräparate
und/oder Calciumphosphate, z.B. Tricalciumphosphat
oder Calciumhydrogenphosphat,
ferner Bindemittel, wie Stärkekleister unter Verwendung z.B. von Mais-, Weizen-,
Reis-oder Kartoffelstärke, Gelatine, Tragacanth, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon, und/oder, wenn erwünscht,
Sprengmittel, wie die obgenannten Stärken, ferner Carboxymethylstärke, quervernetztes
Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon1 wie Natriumalginat. Hilfsmittel
sind in erster Linie Fliessregulier- und Schmiermittel, z.B. Kieselsäure, Talk,
Stearinsäure oder Salze davon1 wie Magnesium- oder Calciumstearat, und/oder Polyethylenglkyol.
Dragée-Kerne werden mit geeigneten, gegebenenfalls Magensaft-resistenten Ueberzügen
versehen, wobei man u.a. konzentrierte Zuckerlösungen, welche gegebenenfalls arabischen
Gummi, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid enthalten,
Lacklösungen in geeigneten organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen
oder1 zur Herstellung von Magensaft-resistenten Ueberzügen, Lösungen von geeigneten
Cellulosepräparaten, wie Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat,
verwendet. Den Tabletten oder Dragee-Ueberzügen können Farbstoffe oder Pigmente,
z.B. zur Identifizierung oder zur Kennzeichnung verschiedener Wirkstoffe beigefügt
werden.
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Weitere oral anwendbare pharmazeutische Präparate sind Steckkapseln
aus Gelatine, sowie weiche, geschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher,
wie Glycerin oder Sorbitol. Die Steckkapseln können den Wirkstoff in Form eines
Granulats, z.B. im Gemisch mit Füllstoffen, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärken,
und/oder Gleitmitteln, wie Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren,
enthalten.
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Als topisch anwendbare pharmazeutische Präparate kommen z.B. Cremen
und Salben in Betracht, die von etwa 0,02jt: bis etwa 2t des Wirkstoffes enthalten.
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Cremen sind Oel-in-Wasser-Emulsionen, die mehr als 50t Wasser aufweisen.
Als ölige Grundlage verwendet man in erster Linie Fettalkohole, z.B. Lauryl-, Cetyl-
oder Stearylalkohol, Fettsäuren, z.B. Palmitin- oder Stearinsäure, flüssige bis
feste Wachse, z.B.
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2-Propylmyristat, Wollwachs oder Bienenwachs, und/oder Kohlenwasserstoffe,
z.B. Vaseline (Petrolatum) oder Paraffinöl. Als Emulgatoren kommen oberflächenaktive
Substanzen mit vorwiegend hydrophilen Eigenschaften in Frage, wie entsprechende
nichtionische Emulgatoren, z.B. Fettsäureester von Polyalkoholen oder Ethylenoxidaddukte
davon1 wie Polyglycerinfettsäureester oder Polyoxyethylensorbitan-fettsäureester
(Tweens), ferner Polyoxyethylen-fettalkoholether oder -fettsäureester, oder entsprechende
ionische Emulgatoren, wie Alkalimetallsalze von Fettalkoholsulfaten, z.B.
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Natriumlaurylsulfat, Natriumcetylsulfat oder Natriumstearylsulfate
die man üblicherweise in Gegenwart von Fettalkoholen, z.B. Cetylalkohol oder Stearylalkohol,
verwendet. Zusätze zur Wasserphase sind u.a. Mittel, welche die Austrocknung der
Creme vermindern, z.B.
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Polyalkohole, wie Glycerin, Sorbit, Propylenglykol und/oder Polyethylenglykole,
ferner Konservierungsmittel, Riechstoffe etc.
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Salben sind Wasser-in-Oel-Emulsionen, die bis zu 70je, vorzugsweise
jedoch von etwa 20 bis etwa 50 Wasser oder wässrige Phase enthalten. Als Fettphase
kommen in erster Linie Kohlenwasserstoffe, z.B.
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Vaseline, Paraffinöl und/oder Hartparaffine in Frage, die zur Verbesserung
des Wasserbindungsvermögens vorzugsweise geeignete Hydroxyverbindungen, wie Fettalkohole
oder Ester davon1 z.B. Cetylalkohol oder Wollwachsalkohole, bzw. Wollwachs, enthalten.
Emulgatoren sind entsprechende lipophile Substanzen, wie Sorbitan-fettsäureester
(Spans), z.B. Sorbitanoleat und/oder Sorbitanisostearat.
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Zusätze zur Wasserphase sind u.a. Feuchthaltungsmittel, wie Polyalkohole,
z.B. Glycerin, Propylenglykol, Sorbit und/oder Polyethylenglykol, sowie Konservierungsmittel,
Riechstoffe, etc.
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Die Herstellung der topisch verwendbaren pharmazeutischen Präparate
erfolgt in an sich bekannter Weise1 z.B. durch Lösen oder Suspendieren des Wirkstoffs
in der Grundlage oder in einem Teil davon1 falls
notwendig. Bei
Verarbeitung des Wirkstoffs als Lösung wird dieser in der Regel vor der Emulgierung
in einer der beiden Phasen gelöst; bei Verarbeitung als Suspension wird er nach
der Emulgierung mit einem Teil der Grundlage vermischt und dann dem Rest der Formulierung
beigegeben.
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Zur Verabreichung als Injektion oder Infusion, vorzugsweise intravenös,
intramuskulär oder subkutan, eignen sich in erster Linie Lösungen1 vorzugsweise
isotonische wässrige Lösungen oder Suspenionen, wobei diese z.B. aus lyophilisierten
Präparaten, welche die Wirksubstanz allein oder zusammen mit einem Trägermaterial,
z.B.
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Mannit enthalten, vor Gebrauch hergestellt werden können. Solche Präparate
können sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe, z.B.
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Konservier-, Stabilisier-, Netz- und/oder Emulgiermittel, Löslichkeitsvermittler,
Salze zur Regulierung des osmotischen Druckes und/oder Puffer enthalten.
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Die Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung der neuen Verbindung
oder seiner pharmazeutisch verwendbaren Salze als pharmakologisch wirksame Stoffe,
insbesondere als antifungische und tumorhemmende Mittel, vorzugsweise in Form von
pharmazeutischen Präparaten. Die Dosierung des Wirkstoffes hängt von der Warmblüter-Spezies,
dem Körpergewicht und Alter und vom individuellen Zustand, sowie von der Applikationsart
ab. Durchschnittlich wird einem Warmblüter von etwa 70 kg Körpergewicht eine Tagesdosis
im Bereich zwischen 3 mg und 3000 mg, vorzugsweise zwischen 30 mg und 600 mg, Wirkstoff
verabreicht.
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Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die oben beschriebene Erfindung;
sie sollen jedoch diese in ihrem Umfang in keiner Weise einschränken. Temperaturen
werden in Celsiusgraden angegeben. Alle Nährmedien für Submers-Kulturen werden1
wenn nicht anders angegeben, 20 Minuten bei 121° im Autoklaven sterilisiert, 10
Liter Fermentationsmedien 30 Minuten bei 134°.
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Beispiel 1: Der Inhalt einer Ampulle einer lyophilisierten Kultur
des Stammes DSM 1951 wird zur Animpfung von 5 Hefeagar-Schrägkulturen verwendet,
welche während 5-7 Tagen bei 28§ inkubiert werden.
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Das Agar setzt sich wie folgt zusammen: Hefeextrakt (Difco) 4 g/l;
Malzextrakt (Difco) log/l; Glucose 4 g/l, Agar (Difco) 20 g/l.
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In einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben mit einer Schikane werden 100 ml
des folgenden wässrigen Nährmediums gegeben: Sojabohnenmehl (nicht entfettet) 20
g/l, Mannit 20 g/l, pH nach Sterilisation 7,0-7,2.
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Der Inhalt wird mit einer Agar-Schrägkultur von Streptomyces antibioticus
subsp. antibioticus Tü 1718 angeimpft. Es wird auf einer Schüttelmaschine mit 120-250
Umdrehungen pro Minute und 5 cm Auslenkung bei 28e inkubiert. Man erhält nach 48
Stunden 100 ml Submerskultur mit einem pH-Wert von 6,9 und mit etwa 29t zentrifugierbarem
Zellvolumen.
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Beispiel 2: Ein 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit vier Schikanen wird mit
500 ml des oben beschriebenen Nährmediums beschickt und mit 12,5 ml oder 25 ml einer
gemäss Beispiel 1 hergestellten Kultur angeimpft.
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Die Inkubation erfolgt bei 28° auf einer Schüttelmaschine mit 120
Umdrehungen pro Minute und einer Auslenkung von 5 cm. Die fermentierte Lösung weist
nach 48 Stunden einen pH-Wert von 6,4 und ein zentrifugierbares Zellvolumen von
etwa 19t auf.
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Beispiel 3: Ein Fermenter von 50 1 Fassungsvermögen mit vier Schikanen
wird mit 30 1 der in Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung beschickt und mit 750 ml
einer gemäss Beispiel 2 hergestellten Kultur angeimpft. Die Fermentation wird unter
folgenden Bedingungen vollzogen: 600 Umdrehungen pro Minute des sechsblättrigen
Turbinenrührers von 11,5 cm Durchmesser; 0,5 1 Luft pro Liter Brühe und Minute bei
einem Druck von 015 bar, 28e. Zur Vermeidung von übermässiger
Schaumbildung
werden 0,1 g/l SAG 471 (Produkt der Firma UNION CARBIDE) zugegeben. Das Fermentationsgut
weist nach 24 Stunden einen pH-Wert von 6,5 und ein zentrifugierbares Zellvolumen
von 24/o auf und kann erneut zum Animpfen verwendet werden.
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Beispiel 4: Ein Fermenter von 50 1 Fassungsvermögen mit vier Schikanen
wird mit 30 1 der in Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung beschickt und wie in Beispiel
3 oder mit 1,5 1 eines gemäss Beispiel 3 erhaltenen Impfguts angeimpft. Die Fermentationsbedingungen
zur Produktion gleichen denen des Beispiels 3, sieht man von der auf 750 Umdrehungen
pro Minute erhöhten Rührgeschwindigkeit ab. Die Produktion ist nach etwa 120 Stunden
beendet.
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Beispiel 5: Für die Produktion von Tü 1718 Z im grösseren Massstab
werden drei Pilotfermenter von 500 1 Fassungsvermögen mit vier Schikanen und einem
sechsblättrigen Turbinenrührer mit einem Durchmesser von 23 cm mit je 300 1 der
im Beispiel 1 aufgeführten Nährlösung und 0,1 g/l des Antischaummittels SAG 471
beschickt und mit 15 1 einer gemäss Beispiel 3 erhaltenen Vorkultur angeimpft. Die
Fermentationsbedingungen sind wie folgt: Rührgeschwindigkeit: 600 Umdrehungen pro
Minute; Belüftungsrate: 0,5 1 pro Liter Kulturbrühe und Minute bei 0,5 bar Druck,
28". Nach 66 Stunden bei einem pH-Wert von 6,8 und einem zentrifugierbaren Zellvolumen
von 28t wird die Fermentation abgebrochen.
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Beispiel 6: Eine gemäss Beispiel 5 erhaltene Kulturbrühe wird zur
Isolierung der Verbindung der Formel I folgendermassen aufgearbeitet: 3 Fermenteransätze
mit je ca. 330 1 Kulturbrühe werden nach einer Fermentationsdauer von 70 Stunden
filtriert. Das abgetrennte Zellmaterial wird mit Wasser nachgewaschen. Dabei werden
ca. 1100 1 klares Kulturfiltrat mit einem pH-Wert von 7,1 erhalten. Dieses wird
in einem Gegenstromextraktor (EG 2001) mit Essigester im Verhältnis 1:1 mit einem
Durchsatz von 450 1 pro Stunde extrahiert. Das wässrige Raffinat (1200 1) wird bei
einer Innentemperatur von 40-45'
auf ein Volumen von 50 1 konzentriert
und in Gefriertrocknungsschalen eingefroren. Die Lyophilisation ergibt 3,7 kg Trockenrückstand.
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Für die erste Anreicherung des hydrophilen Wirkstoffs Tü 1718 Z wird
eine Stahlsäule mit einem Durchmesser von 35,7 cm und einer Länge von 115 cm eingesetzt,
welche mit 115 1 des makroretikulären Harzes DIALOG HP-20/1 gefüllt wird. Die Lösung
des Rohlyophilisats in 40 1 deionisiertem Wasser wird durch die Säule perkoliert.
Adsorption, Waschung und Elution werden mit einer konstanten Durchflussgeschwindigkeit
von 172 1 pro Stunde durchgeführt. Nach der Auftragung des Rohprodukts wird mit
240 1 deionisiertem Wasser nachgewaschen. Das Perkolat (40 1) und die ersten 180
1 Waschlösung werden verworfen.
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Die anschliessende Fraktion von 60 1, welche mikrobiologische Aktivität
aufweist, wird bei 11-20 Torr, Badtemperatur 25-3O konzentriert und lyophilisiert.
Weitere Mengen Aktivsubstanz werden mit 170 1 20-proz. und 60 1 30-proz. wässrigem
Methanol eluiert.
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Nach Konzentration und Lyophilisation werden insgesamt 483 g angereichertes
Material in Form eines braungefärbten Pulvers erhalten.
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Die aktiven Lyophilisatfraktionen, die 10-13/, Wirkstoff enthalten,
werden durch Chromatographie an Amberlite ER-180 Harz (Produkt der Firma ROHM und
HAAS) weiter gereinigt. Eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm und 50 cm Länge
wird mit 1 1 dieses Harzes gefüllt und mit deionisiertem Wasser gespült. 50 g angereichertes
Lyophilisat werden in 300 ml deionisiertem Wasser gelöst und auf die Säule aufgegeben.
Adsorption, Waschung und Elution werden mit einer Durchflussgeschwindigkeit von
1 1 pro Stunde durchgefurt. Die ersten 350 ml Perkolat werden verworfen. Die Elution
wird mit deionisiertem Wasser fortgesetzt. Zunächst werden mit 800 ml 7,0 g mikrobiologisch
inaktives Material eluiert. Die folgenden 400 ml Eluat enthalten 8,65 g ca. 45-proz.
Aktivsubstanz. Weitere 3,04 g ca. 30-proz. Material werden mit den nächsten 300
ml eluiert.
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Bei dem nichtaktiven Bestandteil dieser Eluate handelt es sich sehr
wahrscheinlich um ein Zersetzungsprodukt der Verbindung der Formel 1, da dessen
Konzentration gemäss Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie mit der Zeit zunimmt.
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Mit 900 ml 30-proz. wässrigem 2-Propanol lassen sich noch 5,42 g eines
Gemisches aus Aktivsubstanz und mehreren Nebenprodukten erhalten.
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Beispiel 7: Durch Chromatographie an mit C12-Kohlenwasserstoffketten
beschichtetem Kieselgel (Opti-Up C12 der Firma ANTEC) können die gemäss Beispiel
6 erhaltenen l0-15jl-igen Lyophilisatfraktionen noch höher angereichert werden als
dort beschrieben.
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Eine Säule mit 2,5 cm Durchmesser und 60 cm Länge wird mit 10-pm-Partikeln
dieses Kieselgels gefüllt. 10 g angereichertes, ca.
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12-proz. Lyophilisat werden in ca. 30 ml Wasser gelöst und auf die
Säule aufgetragen. Die Elution erfolgt mit 2-proz. wässrigem Methanol mit einer
Durchflussgeschwindigkeit von 35 ml pro Minute.
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Fraktionen von je 10 ml werden gesammelt und mit Hilfe einer analytischen
HPLC-Methode charakterisiert; HPLC-Kenndaten: Instrument: SPECTRA PHYSICS, Trennsäule:
Durchmesser 4,6 mm, Länge 25 cm, Füllmaterial Lichrosorb RPC8, 7 p Partikel, mobile
Phase (in ml/l): Wasser (795), Methanol (175), Acetonitril (25), Phosphatpuffer:
(pH 7,0), 0,041 M Na2HP04, 0,028 M KH2PO4 (5). Durchflussgeschwindigkeit 2 ml pro
Minute, Nachweis mit UV-Detektor bei 215 nm, Temperatur 25', Konzentration 0,1/9:
Lösungsmittel: Wasser, Retentionszeit: 4,83 Minuten, siehe Fig. 1. Die Fraktionen
40-60 werden vereinigt, konzentriert und lyophilisiert. Es werden 1,41 g Lyophilisat
mit einem Reinheitsgrad von 58/, erhalten. Bei den 42 Nebenprodukt (ad 100/,) handelt
es sich vorwiegend um den in Beispiel 6 erwähnten Bestandteil.
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Beispiel 8: Analytisch reines Tü 1718 Z der Formel 1 wird durch präparative
Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie erhalten. Die HPLC-Kenndaten gleichen denen
bei der analytischen Bestimmung bis auf folgende Abweichungen: Säulendurchmesser
22,5 mm, Durchflussgeschwindigkeit bis zu 10 ml pro Minute, Konzentration 5-10.
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Mit Hilfe einer Probeschlaufe von 2 ml Inhalt werden Mengen von 50-100
mg auf die Säule gegeben. Die Elution des gewünschten Clavams wird durch analytische
HPLC überprüft. Die einheitlichen Eluatfraktionen werden bei reduziertem Druck von
organischen Lösungsmitteln befreit, entsalzt und lyophilisiert, wobei 30-60 mg reine
Substanz erhalten werden.
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Das reine (2S,5S)-2-(3-Carboxy-3-hydroxy-2-(L)-valylaminoprop-1-yl)-clavam
ist zusätzlich zu den im Beispiel 7 angegebenen HPLC-Kenndaten durch die nachfolgenden
spektroskopischen Daten charakterisiert: IR (KBr): 3360, 2960, 1775, 1610, 1520,
1380, 1190, 1120, 1045, 870, 635 cm C-NMR (D20), (Signallage in ppm, Zuordnung):
182.990 (COOH), 176.588 (NHCO-), 170.326 (ß-Lactam-CO), 84.846 (Clavam-C-5), 80.630
(Clavam-C-2), 70.206 (CH(OH)), 60.343 (CH(NH)), 59.602 (CH(NH2)), 51.345 (Clavam-C-3),
45.409 (Clavam-C-6), 37.733 (CH2), 30.970 (CH(CH3)2), 18.674 und 17.631 (CH(CH3)2).
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Beispiel 9: 1,7 mg reines Tü 1718 Z werden in 1,7 ml 6N HC1 gelöst
und während 72 Stunden im verschlossenen Glasrohr auf 110° erwärmt.
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Das Hydrolysat wird zur Trockene eingedampft. Die Aminosäureanalyse
ergibt Ammoniak, Valin und eine unbekannte Aminosäure.
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Zur Chiralitätsbestimmung wird das Valin im Hydrolysat nach Standardmethoden
in den entsprechenden N-Trifluoracetyl-2-propylester übergeführt. Durch Gaschromatographie
mit Chirasil-val als stationärer Phase können 98,7/. (+)-Valin und 1,3 des entsprechenden
(-)-Isomeren
nachgewiesen werden. Aufgrund von Erfahrungswerten dürfte das (-)-Isomere durch
geringfügige Racemisierung bei der sauren Hydrolyse entstanden sein.
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Beispiel 10: Trockenampullen oder Vials, enthaltend 50 mg, 200 mg
oder 500 mg (2S,5S)-2-(3-Carboxy-3-hydroxy-2-(L)-valylaminoprop-lyl)-clavam oder
entsprechend grössere Mengen eines Stoffgemisches, das 50 mg, 200 mg oder 500 mg
(2S,5S)-2-(3-Carboxy-3-hydroxy-2-(L)-valylaminoprop-l-yl)-clavam enthält, als Wirksubstanz
werden wie folgt hergestellt: Je 5 ml einer sterilen, bezogen auf (2S,5S)-2-(3-Carboxy-3-hydroxy-2-(L)-valylaminoprop-l-yl)-clavam
1%eigen, 4eigen oder 10%eigen wässrigen Lösung dieser Verbindung werden unter aseptischen
Bedingungen in 5-ml-Ampullen oder 5-ml-Vials der Gefriertrocknung unterworfen und
die Ampullen bzw. Vials verschlossen und geprüft.
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