DE2724597C3

DE2724597C3 - 3'-Desoxykanamycin C und 3\4'-Didesoxykanamycin C, deren Salze, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende antibakterielle Mittel

Info

Publication number: DE2724597C3
Application number: DE2724597A
Authority: DE
Inventors: Shinichi Yokohama Kanagawa Kondo; Hamao Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1976-06-16
Filing date: 1977-06-01
Publication date: 1980-12-11
Also published as: FR2371460B1; CA1081692A; FR2371460A1; DE2724597A1; US4120955A; DE2724597B2; FR2372843A1; JPS616835B2; FR2372843B1; GB1564164A; JPS52153942A

Description

in welcher R eine Hydroxylgruppe oder ein WasserstoffatO'.n bedeutet, und deren Salze.

2. Verfahren zur Herstellung von 3'-Desoxy- oder 3',4'-Didesoxykanamycin C gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich

^-CH₂NH

bekannter Weise

A) das 6'-N-(terL-Butoxycarbonyl)- oder 6'-N-Benzyloxycarbonyl-Derivat von 3'-Desoxy- oder 3',4'-Didesoxykanamycin B der allgemeinen Formel

-C-O-R¹

H₂N

in welcher R die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen hat und R¹ eine tert-Butyl- oder Benzylgruppe ist, N-acetyliert,

B) aus dem jeweiligen gemäß Verfahrensstufe A) erhaltenen 1 -3-,2 '-,3"-Tetrakis-N-aceiyl-6'-N-(tert.-butoxycarbonyl-)- oder -benzyloxycarbonyl-desoxykanamycin B die tert.-Butoxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe abspaltet.

C) das jeweilige, so erhaltene I -,3-.2'-,3"-Tetrakis-N-acetyl-desoxykanamycin B in wäßriger Essigsäure mit einer wäßrigen Lösung eines Alkalimetallnitrits unter Eiskühlung und anschließend

NH₂ bei Umgebungstemperatur umsetzt,
D) die Acetylgruppen aus dem gemäß Verfahrensstufe C) erhaltenen l-^-^'-X-Tetrakis-N-acetyl-3'-desoxy- oder -3',4'-didesoxy-kanamycin C abspaltet und gegebenenfalls
E) 3'-Desoxy- oder 3',4'-Didesox«/-kanamycin C in >() ein Salz überführt.

3. Mittel mit antibakterieller Wirkung, bestehend aus wenigstens einem der Desoxykanamycin C-Derivate gemäß Anspruch 1 in Verbindung mit einem üblichen Trägermaterial.

Die Erfindung betrifft J'-DesQxykanamycin C und 3',4'-Didesoxykanamycin C, deren Salze, ein Verfahren zu deren Herstellung und antibaktenelle Mittel, welche die genannten Kanamycine C enthalten. 3'-Desoxykanamycin C und 3',4'-Didesoxykanamycin C sind neue halbsynthetische Aminoglykosid- Antibiotika.

Die Herstellung von Desoxyderivaten des Kanamycins C erfolgt aus den entsprechenden Dssoxyderivaten des Kanamycins B.

(,ο Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind umfangreiche Untersuchungen über neue halbsynthetische Derivate von aminoglykosidischen Antibiotika durchgeführt worden, die sich auf die früheren Feststellungen von H. Umezawa et al. stützen, die sich

_h-, auf den Mechanismus der Resistenz von Bakterien gegen aminoglykosidische Antibiotika unter dem Einfluß verschiedener inaktivierender, von den resistenlen Bakterien produzierten Enzyme beziehen. So

wurden beispielsweise 3',4'-Didesoxykanamycin B und 3'-Desoxykanamycin B als Desoxyderivate von Kanamycin B synthetisiert, die gegen resistente Bakterien, die A minoglykosid-S'-phosphotransferasen produzieren, wirksam sind (vgL US-PS 37 53 973 und 39 29 762; H. Umezawa's »Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry« Bd. 30, Seite 183 (1974) und »Drug Action and Drug Resistance in Bacteria« Bd. 2, Seite 211 [1975]).

3',4'-Didesoxykanamycin B wurde und wird weitgehend zur therapeutischen Behandlung von Infektionen, die durch eine Reihe von resistenten Bakterien einschließlich Pseudomonas aeruginosa hervorgerufen werden, verwendet Es hat sich jedoch gezeigt, daß diese Desoxyderivate des Kanamycins B durch Aminoglykosid-6'-Acetyltransferasen, die zur Acetylierung der 6'-Aminogruppe des Desoxykanamycin-Moleküls fähig sind, inaktiviert werden können und dann nicht mehr fähig sind, das Wachstum solcher resistenter Bakterien zu unterbinden, die "j'-Acetyltransferasen erzeugen.

ErfindungsgemäS ist es jetzt möglich geworden, Desoxyderivate des Kanamycins C zu synthetisieren, die durch e'-Acetyltransferasen nicht inaktiviert werden können. Die Synthese der Desoxyderivate des Kanamycins C wird so durchgeführt, daß ircan die 6'-Aminogruppe in den entsprechenden Desoxyderivaten des Kanamycins B durch eine Hydroxylgruppe ersetzt Es hat sich dabei gezeigt, daß die neuen Desoxyderivate des Kanamycins C gemäß vorliegender Erfindung zwar keine verbesserte antibakterielle Wirkung gegen sensitive Bakterien aufweisen, jedoch den Vorteil einer bemerkenswert verringerten akuten Toxizität aufweisen, wenn man sie mit den vorstehend erwähnten Desoxyderivaten des Kanamycins 3 vergleicht

Aufgabe der vorliegenden Erfindung .far es also, neue Desoxyderivate des Kanamycins C zu finden, die durch 6'-Acetyltransferasen nicht inaktiviert werden können und die eine geringe Toxizität besitzen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung lag in der Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Synthese von solchen Desoxyderivaten des Kanamycins C, welches in einfacher Weise mit hohem Wirkungsgrad durchgeführt werden kann.

Die Lösung dieser Aufgaben ergibt sich aus den Verbindungen, dem Verfahren und dem Mittel, die in den Patentansprüchen beschrieben und beansprucht sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der nachfolgend beschriebenen Weise durchgeführt. Man verwendet als Ausgangsmaterial ein 6'-N-geschütztes Derivat von 3'-Desoxykanamycin B oder 3',4'-Didesoxykanamycin B, d. h. Verbindungen der im Anspruch 2 angegebenen Formel. In diesen Ausgangsderivaten des Kanamycins B werden zunächst die 1-,3-,2'- und 3"-Aminogruppen durch Acetylgruppen geschützt.

Die zur Blockierung der I-,3-,2'- und 3"-Aminogruppen ausgewählten Acetylgruppen sind unter den Reaktionsbedingungen der anschließenden Entfernung der Aminoschutzgruppe von der 6'-Aminogruppe nicht abspaltbar. Die Blockierung dieser Aminogruppen des 6'-N-geschützten Derivates mit Acetylgruppen kann so durchgeführt werden, daß eine Lösung der betreffenden Verbindung in wasserfreiem Methanol mit einem Überschuß an Essigsäureanhydrid bei Umgebungstemperatur in verhältnismäßig kurzer Reaktionszeit, vorzugsweise 5 Stunden umgesetzt wird.

In der nächsten Stufe wird das penta-N-geschützte Derivat weiterbehandelt, so daß selektiv die Aminoschutzgruppe von der primären 6'-Aminogruppe entfernt wird; auf diese Weise erhält man das l,3,2',3"-tetra-N-geschützte Derivat des Desoxykanamycins B.

Die Reaktion zur selektiven Entfernung der Aminoschutzgruppe von der primären 6'-Aminogruppe des penta-N-geschützten Derivates kann in bekannter Weise durchgeführt werden. Handelt es sich bei der Aminoschutzgruppe an der primären 6'-Aminagruppe um die Benzyloxycarbonylgruppe, so kann diese ckirch

ίο katalytische Reduktion mit Wasserstoff in Lösung in Wasser, Methanol, Essigsäure oder einem Lösungsmittelgemisch aus zwei oder mehreren der vorstehend genannten Substanzen in Gegenwart eines Katalysators wie Palladium oder Platin entfernt werden. Handelt es

is sict um die tert-Butoxycarbonylgruppe, so kann diese durch Hydrolyse in einer schwachsauren Lösung entfernt werden, beispielsweise durch Behandlung mit ' einer Lösung von 90% Trifluoressigsäure in Wasser bei

Umgebungstemperatur im Verlauf einer Stunde oder

weniger.

In einer weiteren Verfahrensstufe wird die so gewonnene 6'-Aminoverbindung mit einem Nitrit behandelt, wodurch die 6'-Aminogruppe in eine Hydroxylgruppe umgewandelt wird Diese Umwand lung kann als eine Desaminierung bezeichnet werden. Man erhält auf diese Weise das 6'-Hydroxylderivat Zur Durchführung dieser Oesaminierungsstufe, d.h. der Umwandlung der 6'-Aminogruppe, verwendet man ein Alkalimetallnitrit, vorzugsweise Natriumnitrit Die Des aminierung der 6'-Aminoverbindung mit einem Nitrit kann in einfacher Weise so durchgeführt werden, daß man eine Lösung der 6'-Aminoverbindung in wäßriger Essigsäure mit Natriumnitrit unter Eiskühlung (bei 0 bis 10⁰C) und unter Rühren vermischt und die Mischung dann stehen läßt bis sie Umgebungstemperatur angenommen hat so daß bei Umgebungstemperatur die Reaktion in zwei Stunden oder etwas mehr abläuft Auf diese Weise erhält man das 6'-Hydroxylderivat

In der abschließenden Verfahrensst-Je wird das so

gewonnene 6'-HydroxyIderivat behandelt um die Acetylgruppen von den vier Aminogruppen des 6'-Hydroxylproduktes zu entfernen. Die Entfernung der Acetylgruppen von den sekundären Aminogruppen kann in bekannter Weise durch alkalische Hydrolyse erreicht werden, vorzugsweise so, daß die Verbindung in 2n wäßriger Natriumhydroxidlösung sieben Stunden oder mehr zum Rückfluß erhitzt wird.

Die Desoxykanamycin C-Derivate gemäß der Erfindung können isoliert uttd gereinigt werden, indem man sie der Säulenchromatographie an Silikagel oder an einem Kationenaustauscherharz unterwirft. Es ist ratsam, die Reinigung chromatographisch unter Verwendung eines schwach-sauren Kationenaustauscherharzes, welches Carboxylfunktionen enthält, durchzu- führen und zur Entwicklung verdünntes wäßriges Ammoniak als Laufmittel zu verwenden. Dabei muß betont werden, daß die Produkte aus jeder der aufeinanderfolgenden Verfahrensstufen zwar durch Chromatographieren über Silikagel gereinigt werden können, bevor man sie in die nächstfolgende Verfahrensstufe einführt, daß dies jedoch nicht unbedingt notwendig ist, sondern daß die jeweiligen Produkte auch durch Einengen der Reaktionslösung unter vermindertem Druck zur Trockne als Rohprodukte

oj gewonnen und in dieser Form, d. h. ohne Reinigung direkt in der jeweils nächsten Verfahrensstufe verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen 3'-Desoxykanamycin C und

3',4'-Didesoxykanamycin C sind neue Verbindungen, welche als halbsynthetische Aminoglykosid-Antibiotika verwendbar sind.

Die neuen Verbindungen 3'-Desoxykanamycin C und 3',4'-Didesoxykanamycin C gemäß der Erfindung weisen folgende chemische, physikalische und biologische Eigenschaften auf:

3'-Desoxykanamycin C ist ein farbloses kristallines Pulver, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sondern sich bei einer Temperatur zwischen 180 und 220⁰C zersetzt Die Substanz zeigt eine spezifische optische Drehung (et)*= +110° (ti, Wasser). Die Gewichtsanalyse der Substanz stimmt mit den theoretischen Werten für

C₁₈H₃₆N₄O₁₀ · '/2 H₂O

(C 43,81%; H 7,56%; N 11,35%) überein. Die Substanz gibt einen Einzelfleck mit positiver Ninhydrinreaktion bei Rf 0,22 in der Dünnschichtchromatographie an Silikagel, wenn zur Entwicklung ein Gemisch von Butasiol, Äthanol, Chloroform, 17%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4:5:2-5' verwendet wird, sowie einen weiteren Fleck bei Rf 0,39 in demselben Dünnschichtchromatogramm, wenn man zum Entwickeln ein Gemisch aus Chloroform-Methanol-17%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 1 : 4 :2) verwendet

3',4'-Didesoxykanamycin C liegt als farbloses kristallines Pulver vor, welches ebenfalls keinen definierten Schmelzpunkt aufweist und sich im Bereich von 200 bis 22O⁰C zersetzt Die Substanz zeigt eine spezifische optische Drehung von (κ)*= + US°(c 1, Wasser). Die Gewichtsanalyse stimmt mit den theoretischen Werten für

C₁₈H₃₆N₄O₉ · '/a H₂O

(C 46,84%; H 8,08%; N 12,14%). Bei der Massenspektrometrie erhält man den Wert m/e452 (M+). Die

ίο Substanz ergibt bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel einen gegen Ninhydrin positiv reagierenden Einzelfleck bei Rf 033, wenn man von den Jforstehend genannten Lösungsmittelgemischen das erstere verwendet sowie einen Fleck bei Rf 0,48 in demselben Dünnschichtchromatogramm, wenn man das letztere der genannten Lösungsmittelgemische zum Entwickeln verwendet

Die Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml) von Kanamycin C, 3'-Desoxykanamycin C und 3',4'-Didesoxykanamycin C gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der seriellen Verdünnungsmethode unter Verwendung von Nähragar als Medium bei 37°C bestimmt wobei die Beurteilung jeweils nach 18stündiger Bebrütung vorgenommen wurde. Zum Vergleich wurden die Mindesthemmkonzentrationen von 3',4'-Didesoxykanamycin B (abgekürzt als DKB bezeichnet), 3'-Desoxykanamycin B (abgekürzt als DKMB bezeichnet) in derselben Weise bestimmt
Die antibakteriellen Wirkungsspektren dieser Sub-

jo stanzen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt

Tabelle

Mindest-Hemmkonzentration (mcg/ml)

Test-Organismus

Kanamycin C	3'-Desoxykana-	3'-4'-Didesoxy-	DKB	DKMB
	mycin C	kanamycin C
1,56	3,13	6,25	<0,20	<0,20
12,5	25	50	0,39	0,39
3,13	12,5	12,5	C,39	0,78
3,13	12,5	25	0,78	0,39
3,13	12,5	12,5	-	-
>100	12,5	12,5	0,78	1,56
>100	12,5	12,5	0,78	1,56
6,25	12,5	12,5	1,56	1,56
>100	50	50	1,56	1.56
>100	>100	>1CO	50	25
25	100	100	12,5	3,13
25	50	100	625	3,13
3,13	6,25	6,25	0,20	0,39
>100	>100	>100	50	50
3,13	6,25	25	0,39	0,39
>100	>100	>100	100	50
>100	12,5	100	1,56	1,56
100	100	100	0,78	0,73
>100	50	100	1,56	0,78
>100	50	100	>100	100
>IOO	100	>100	3,13	1,56
>100	50	100	—	_

Staphylococcus aureus FDA 209P
Mycobacterium smegmatis ATCC 607
Escherichia coli NIHJ
Escherichia coli K-12
Escherichia coli K-12 R5
Escherichia coli K-12 ML 1629
Escherichia coli K-12 ML 1630
Escherichia coli K-12 ML 1410
Escherichia coli K-12 ML 1410 R8I
Escberichia coli LA 290 R55
Escherichia coli LA 290 R56
Escherichia coli LA 290 R64
Escherichia coli W 677
Escherichia coli JR 66/W677
Klebsieila pneumoniae PCI 602
KJebsieNa pneumoniae 22 Nr 3038
Pseudomonas acruginosa A3
Pseudomonas aeruginosa Nr. 12
Pseudomonas aeruginosa TI-13
Pseudomonas aeruginosa GN 315
Pseudomonas aeruginosa 99
Pseudomonas aeruginosa H Il

Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen 3'-Desoxykanamycin C und 3',4'-Didesoxykanamycin C das Wachstum verschiedener Bakterienarten verhindern. Die neuen Verbindungen besitzen eine geringe Toxizität für Tiere und Menschen, was aus der Tatsache hervorgeht, daß die Verbindungen einen LDso-Wert von mehr als 300 mg/kg bei intravenöser Injektion bei Mäusen aufweisen. Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen eignen sich infolgedessen zur chemotherapeutisehen Behandlung von Infektionen, die durch gramnegative und gram-positive Bakterien hervorgerufen werden.

Das 3'-Desoxykanamycin C und das 3',4'-Didesoxykanamycin C gemäß vorliegender Erfindung werden nicht durch Aminoglykosid-3'-phosphotransferasen und 6'-Acetyltransferasen inaktiviert. Die 6'-Acetyltransferasen. weiche die 6'-Aminogruppe von Kanamycin A und B, 3'-Desoxykanamycin B und 3',4'-Didesoxykanamycin B acetylieren, finden sich in weiter Verbreitung unter klinisch isolierten resistenten Bakterien. Das 3'-Desoxykanamycin C ist noch stärker aktiv als Kanamycin B-Derivate gegenüber resistenten Stämmen, welche 6'-Acetyltransferasen erzeugen, beispielsweise Pseudomonas aeruginosa GN 315. Infolge des Fehlens der 3'-Hydroxylgruppe sind die Desoxykanamycin C-Derivate gemäß vorliegender Erfindung auch gegen resistente Bakterien wirksam, welche 3'-Phospho-transferasen produzieren. 3'-Desoxykanamycin C und 3\4'-Didesoxykanamycin C verhindern infolgedes- )o sen Infektionen durch verschiedene Arten von resistenten Bakterien; sie können außerdem als synthetische Zwischenprodukte für die Synthese wertvoller anderer Präparate verwendet werden, beispielsweise für die 1-N-Acylderivate mit L-4-Amino-2-Hydroxybuttersäu- ;-, re.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen zeichnen sich, wie vorstehend bereits gesagt, durch eine bemerkenswert niedrige Toxizität für Menschen und Tiere aus. Dies steht im Gegensatz zu der Tatsache, daß die bekannten 3'-Desoxykanamycin B und 3',4'-Didesoxykanainyuiii B eine erheblich höhere Toxizitäi iüi Tiere besitzen; diese letztgenannten Substanzen weisen LD₅₀-Werte von 159 mg/kg bzw. 109 mg/kg bei intravenöser Injektion bei Mäusen auf. 3'-Desoxykanamycin C und 3',4'-Didesoxykanamycin C sind in ihrer antibakteriellen Wirkung gegen einige Bakterienarten dem 3'-Desoxykanamycin B und 3\4'-Didesoxykanamycin B unterlegen, dieser Mangel wird aber durch die erheblich viel niedrigere Toxizität von 3'-Desoxykanamycin C und 3',4'-Didesoxykanamycin C gegenüber den entsprechenden Desoxyderivaten des Kanamycin B ausgeglichen, weil die Desoxykanamycin C-Derivate gemäß vorliegender Erfindung mit Sicherheit in der 2-bis 3fachen Dosis verglichen mit der bei den Desoxyderivaten von Kanamycin B üblichen Dosis verabreicht werden können.

Die erfindungsgemäßen Desoxykanamycin C-Derivate können leicht in die pharmazeutisch akzaptablen Säureanlagerungssalze umgewandelt werden, z. B. in die μ Hydrochloride, Sulfate, Phosphate, Nitrate, Acetate, Maleate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Oxalate, Citrate, Ascorbate, Methansulfonate, Äthansulfonate, indem man das 3'-Desoxykanamycin C oder 3\4'-Didesoxykanarnycin C in Form der freien Base mit einer geeigneten Säure in wäßrigem Medium umsetzt Die erfindungsgemäßen Desoxykanamycin C-Derivate und deren pharmazeutisch akzeptable Säureanlagerungssalze können oral, intraperitoneal, intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden, und zwar in beliebigen pharmazeutischen Formen, die für die genannten Arten der Verabreichung geeignet sind und in entsprechender Weise für bekannte Kanamycine verwandt werden. So !können beispielsweise die neuen Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung oral verabreicht werden, und zwar beispielsweise in Form von Pulvern, Kapseln, Tabletten, Sirupen. Die zur wirksamen Behandlung von bakteriellen Infektionen erforderliche Dosis der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen liegt im Bereich von 0,25 bis 2 g pro Person und Tag bei oraler Verabreichung.

Vorzugsweise verabreicht man die genannte Dosis oral in drei bis vier gleichen Teilmengen pro Tag. Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen können auch durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden, wobei die Dosis 100 bis 1000 mg pro Person — bei zwei bis vier Teildosen — pro Tag liegt. Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen in Salben zur äußeren Anwendung einarbeiten, wobei die Konzentration an aktiver Verbindung bei 0,5 bis 5 Gew.-°/o in Mischung mit einer bekannten Salbengrundlage wie Polyäthylenglykol liegt. Schließlich lassen sich die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen auch zum Sterilisieren von chirurgischen Instrumenten verwenden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel I
Synthese von 3'-Desoxykanamycin C

Herstellung von
ö'-N-t-Butoxycarbonyl-S'-desoxykanamycin B

Eine Lösung von 2.0 g (4,3 mM) 3'-Desoxykanamycin B in 40 ml Wasser wurde in einer Lösung von 1,03 g (4,7 mM) t-Butyl-S-4,6-dimethylpyrimid-2-ylthiocarbonai in 40 1111 uri

vci iimum.

Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der feste Rückstand wurde in 32 ml Wasser aufgenommen. Die entstandene wäßrige Lösung wurde durch eine Kolonne mit 160 ml eines Kationenaustauscherharzes der im Beispiel 1 bereits genannten Art geleitet, um die Adsorption des gebildeten 6'-N-t-Butoxy-carbonyl-3'-desoxykanamyc^;-i B zu erreichen. Die Harzkolonne wurde mit 800 ml Wasser gewaschen und dann mit 800 ml 0,1 η wäßrigem Ammoniak eluiert Das Eluat wurde in 15-ml-Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen Nr. 26 bis 42 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt so 1,06 g eines weißen Pulvers, welches aus ö'-N-t-Butoxy-carbonyl-S'-desoxykanamycin B bestand.

Ausbeute 44%. Die Harzkolonne wurde dann weiter mit 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert, wodurch 452 mg von nicht umgesetztem 3'-Desoxykanamycin B zurückgewonnen werden konnten. Rückgewinnungsgrad 23%.

A) Acetyüerung

Eine Lösung von 211 mg (037 mM) von 6'-N-t-Butoxycarbonyl-3'-desoxykanamycin B in 5 ml Methanol

030 250/263

wurde mit 2,5 ml Essigsäureanhydrid vermischt und die Mischung wurde 5 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, um die Acetylierung der verbliebenen Aminogruppen zu er; eichen. Danach wurde die Reaktionslösung mit Wasser vermischt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt so ein Pulver, welches aus ö'-N-t-Butoxycarbonyl-tetra-N-acetyl y-desoxykanamycin B bestand. Ausbeute 296 mg.

B) Abspaltung der t-Butoxycarbonwlgruppe

Das pulverförmige ö'-N-t-Butoxycarbonyl-tetra-N-acetyl-3'-desoxykanamycin B (235 mg), welches in der vorangegangenen Stufe A) erhalten worden war, wurde in 2 ml 9O°/oiger Trifluoressigsäure gelöst. Die entstandene Lösung ließ man 45 Minuten bei Umgebungstemperatur stehen, damit die Entfernung der BOC-Grupp; aus d?r 6'-St?!!ung ?rfolg^pn Wnnntp Da«: Reaktionsgemisch wurde anschließend unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Der verbleibende feste Rückstand wurde mit etwa 2 ml Äthyläther gewaschen, wonach 227 mg eines weißen Pulvers zurückblieben, welches aus dem Tetra-N-acetylderivat, d. h. dem 1.3,2',3"-Tetra-N-acetyl-3'-desoxykanamycin B bestand.

C und D) Überführung in das 6'-Hydroxylderivat und Entfernung der Schutzgruppen

Das pulverförmige 6'-Aminoderivat (193 mg), welches in der voraufgegangenen Verfahrensstufe B) gemäß diesem Beispiel erhalten worden war, wurde in 3,2 ml einer 33%igen wäßrigen Essigsäurelösung gelöst und die entstandene Lösung wurde mit einer weiteren Lösung von 265 mg Natriumnitrit in 3,2 ml Wasser und dann mit 1,6 ml Essigsäure unter Eiskühlung und Rühren versetzt. Die danach vorliegende Mischung wurde 1 Stunde unter Eiskühlung und dann weitere 16 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, damit die Umwandlung der 6'-Aminogruppe in eine 6'-Hydroxylgruppe ablaufen konnte. Danach wurde die Reaktionslösung unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 240 ml eines festen Rückstandes. Dieser feste Rückstand bestand aus 1,3,2',3"-Tetra-N-acetyl-3'-desoxykanamycin C und wurde in 4 ml 2 π wäßrigem Natriumhydroxid aufgenommen. Die so gewonnene Mischung wurde 7 Stunden zum Rückfluß erhitzt, um die Entfernung der Acetylgruppen zu erreichen.

Die so gewonnene Reaktionslösung wurde mit 200 ml Wasser vermischt und durch eine Kolonne (Innendurchmesser 1,6 cm) mit 50 ml Kationenaustauscherharz der bereits mehrfach erwähnten Art geleitet, um die Adsorption des gebildeten Kanamycin C-Derivates zu erreichen. Die Harzkolonne wurde mit 250 ml Wasser gewaschen und dann mit 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert Das Eluat wurde in 10-ml-Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen Nr. 58 und 59 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Man erhielt so 89 mg rohes pulverförmiges 3'-Desoxykanamyein C Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde in 2 ml Wasser aufgenommen. Die entstandene wäßrige Lösung wurde erneut über eine Säule (Innendurchmesser 0,75 cm) mit 10 ml des bereits mehrfach erwähnten Kationenaustauscherharzes Chromatographien, wobei die Kolonne zunächst mit 30 ml gewaschen und dann nacheinander mit 45 ml 0,1 π wäßrigem Ammoniak, sowie 45 ml 0,2 η wäßrigem Ammoniak eluiert wurde. Das Eluat wurde in l-ml-Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen Nr. 78 bis 91 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 3'-Desoxykanamycin C als farbloses Pulver in reiner Form in einer Menge von 54mg(0,ll mM).Ausbeute45%.

Beispiel 2

Synthese von 3',4'-Didesoxykanamycin C

ö'-N-Benzyloxycarbonyl-S'^'-didesoxykanamycin B (1,59 g; 2,72 mM) wurde mit 160 ml Essigsäureanhydrid und 16 g Natriumacetat vermischt. Die entstandene Mischung wurde 2 Stunden zum Rückfluß (HO⁰C) erhitzt, um die Acetylierung zu erreichen. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trorkne eingeengt und der verbliebene feste Rückstand wurde mit etwa 100 ml Aceton extrahiert. Der Acetonextrakt wurde wiederum unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt wobei ein fester Rückstand verblieb (2,5 g). Dieser feste Rückstand wurde in 10 ml Chloroform aufgenommen und die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne (Innendurchmesser 2,6 cm) mit 150 g Silikagel geleitet, um die Adsorption des gebildeten Acetylierungsproduktes zu erreichen. Die Silikagelkolonne wurde mit 350 ml Chloroform gewaschen und dann aufeinanderfolgend mit 900 ml Chloroform-Methanol (Volumenverhältnis 30 :1), 900 ml Chloroform-Methanol (Volumenverhältnis 15:1) und Chloroform-Methanol (Volumenverhältnis 10 :1) eluiert. Das Eluat wurde in etwa 14-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 91 bis 149 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 1,80 g eines weißen Pulvers, welches aus 6'-N-Benzyloxycarbonyltetra-N-acetyl-tetra-O-acetyl-S'/i'-didesoxykanamycin B bestand.

Das weiße Pulver (1,18 g), welches gemäß vorstehender Verfahrensstufe dieses Beispiels erhalten worden war, wurde in einer Mischung aus 20 ml Methanol und 5 ml Wasser gelöst Die entstandene Lösung wurde der katalytischen Reaktion unterworfen und dazu 45 Minuten in einem Wasserstoffstrom in Gegenwart von 1,61 g eines 5%igen Palladium-auf-Bariumcarbonat-Katalysators, der zu der Lösung gegeben wurde, behandelt. Auf diese Weise wurde die Benzyloxycarbonylgruppe entfernt Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch man 942 mg eines weißen Pulvers erhielt welches das 6'-Aminoderivat, d. h. das 13^'3"-Tetra-O-acetyl-3',4'-didesoxykanamycin B war.

Das weiße Pulver (942mg), d.h. das gemäß vorstehender Verfahrensstufe gewonnene 6'-Aminoderivat, wurde in 16 ml einer 33%igen Essigsäurelösung in Wasser gelöst Zu dieser Lösung wurden dann 16 ml einer weiteren Lösung von 1,24 g Natriumnitrit sowie 8 ml Essigsäure unter Eiskühlung und Rühren gegeben. Die gewonnene Mischung wurde eine Stunde unter Eiskühlung und weitere drei Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt um so die Umwandlung der 6'-Aminogruppe in eine 6'-Hydroxylgruppe zu erreichen. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt Der verbleibende feste Rückstand wurde in 3 ml Chloroform gelöst Die Chloroformlösung wurde durch eine Kolonne (Innendurchmesser 2 cm) mit 100 g Silikagel geleitet Die

,1

Kolonne wurde mit 210 ml Chloroform gewaschen und anschließend nacheinander mit

660 ml Chloroform-Methanol

(Volumenverhältnis 50 : I),
1750 ml Chloroform-Methanol

(Volui(ienverhältnis30 : 1),
900 ml Chloroform-Methanol

(Volumenverhältnis 10 :1)und
700 ml Chloroform-Methanol

(Volumenverhältnis 5 :1)

eluiert.

Das Eluat wurde in Fraktionen von 14 ml aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 220 bis 270 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt so 587 mg eines weißen Pulvers, welches das Tetra-N-acetyl-tetra-O-acetyl-S'/l'-didesoxykanamycin C darstellte.

Dieses weiße Pulver (234 mg) wurde in 4 ml 2 η wäßrigem Natriumhydroxid aufgenommen. Die entstandene Lösung wurde 7 Stunden zum Rückfluß erhitzt, um die Entfernung der Acetylgruppen zu erreichen. Danach wurde die Reaktionslösung in 200 ml Wasser gelöst und durch eine Kolonne mit einem Innendurchmesser von 1,6 cm, welche mit 50 ml des bereits mehrfach genannten Kationenaustauscherharzes gefüllt war, geleitet, um die Adsorption des gewünschten

j Produktes zu erreichen. Nach dem Auswaschen mit 250 ml Wasser wurde die Harzkolonne mit 0,5 π wäßrigem Ammoniak eluiert. Auf diese Weise erhielt man 122 mg eines pulverförmigen Rohproduktes, welches aus 3',4'-Didesoxykanamycin C bestand. Eine

ίο Lösung des pulverförmigen Rohproduktes in 2 ml Wasser wurde durch eine Kolonne mit einem Innendurchmesser von 0,8 cm, welche mit 14 ml des bereits erwähnten Kationenaustauscherharzes gefüllt war, geleitet. Nach dem Auswaschen mit 45 ml Wasser

ι -, wurde die Harzkolonne mit 40 ml 0,05 η wäßrigem Ammoniak, danach mit 70 ml 0,1 η wäßrigem Ammoniak und schließlich mit 70 ml 0,2 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 1-ml-Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen Nr. 119 und 146 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 90 mg eines farblosen gereinigten Pulvers, welches aus 3'.4'-Didesoxykanamycin C bestand. Gesamtausbeute 23%.

Claims

Patentansprüche: J. 3'-Desoxy- und 3',4'-Didesoxykanamycin C der allgemeinen Formel (I)

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