CN87106531A - 编码具有除莠剂抗性的植物乙酰乳酸合酶的核酸片段 - Google Patents

Abstract

公开了一种编码抗除莠剂的植物乙酰乳酸合酶蛋白的核酸片段。此核酸片段至少含有一个核苷酸突变，该突变在乙酰乳酸合酶的七个基本上是保守的氨基酸同源区的一个中导致一个氨基酸的变化。此突变产生的乙酰乳酸合酶蛋白与野生型蛋白相比对磺酰脲除莠剂具有抗性。用此片段转化除莠剂敏感性植物或植物细胞产生对除莠剂的抗性。

Description

本发明是关于编码除莠剂抗性型的乙酰乳酸合酶（ALS）的核酸片段。

磺酰脲类除莠剂如Sulfometuron    methyl（Ⅰ）和Chlorsulfuron（Ⅱ）通过阻断乙酰乳酸合酶（ALS，EC4·1·3·18）而抑制某些细菌、酵母和高等植物的生长，该酶是在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸的生物合成中的第一个共用酶。支链氨基酸的生物合成只在植物和微生物中进行，所以，磺酰脲类除莠剂的毒性也只限于植物和微生物中。一组在结构上并不相关的除莠剂咪唑啉酮也抑制ALS。

在肠道细菌中已鉴定了ALS的三种主要的同功酶，称为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。同功酶Ⅰ和Ⅲ对由缬氨酸产生的终端产物抑制敏感，但Ⅱ型不敏感。三种细菌同功酶都含有一大一小两个蛋白质亚基。已经部分确定了来自啤酒酵母（Saccharomyces    Cerevisiae）和某些高等植物的ALS的性质，它们表现出某种程度的终端产物抑制。还不了解酵母和植物的ALS酶是否由一个或多个不同的多肽组成。有证据表明，酵母和植物ALS酶在细胞内分别位于线粒体和叶绿体中。

已经从肠道细菌鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella    typhimurium）和大肠杆菌（Escherichia    Coli）以及啤酒酵母（S.cerevisiae）中分离出编码ALS酶的基因。大肠杆菌中编码ALS同功酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型两个亚基的基因，其核苷酸序列表明，它们分别由操纵子ilvBN、ilvGM和ilvIH组成。比较大肠杆菌ALS同功酶大亚基推测的氨基酸序列，发现包括该蛋白大约三分之二的三个区域具有大约50%的保守氨基酸，它们由很难分辩的同源性区域所隔开。氨基酸序列的保守性在细菌同功酶的小亚基中也明显存在，只是程度小一些。在啤酒酵母（S.cerevisiae）中，鉴定了对ALS活性至关重要的单基因ILV2。对ILV2基因的核苷酸序列分析表明，它编码的多肽与细菌ALS同功酶的大亚基具有同源性。酵母ALS推测的氨基酸序列揭示出与在细菌同功酶大亚基中观察到的同样程度的结构组成与同源性，只是酵母蛋白的氨基端有大约90个氨基酸，据信它们与该蛋白转移到线粒体中有关。本发明在此公开之前，还没有有关编码ALS的植物基因结构及植物ALS酶的氨基酸序列的报导。

肠道细菌同功酶Ⅰ是已知的天然存在的ALS酶中，唯一对Sulfometuron    methyl（SM）和Chlorsulfuron（CS）抑制不敏感的酶。因此，肠道细菌只在有缬氨酸存在时才对这类除莠剂敏感，因为缬氨酸抑制同功酶Ⅰ。在肠道细菌鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌（在缬氨酸存在下选择）、啤酒酵母和高等植物烟草（Nicot    iana    tabacum）、拟南芥（Arabidopsis    thaliana）以及玉米（Zea    mays）中，已经鉴定了磺酰脲类除莠剂抗性型的突变体。这些突变体的表现型通过遗传杂交与除莠剂抗性型的ALS发生共分离。在鼠伤寒沙门氏菌中，除莠剂抗性的突变与编码ALS的基因有遗传连锁。在大肠杆菌和啤酒酵母中，这些突变发生于ALS的结构基因中。在高等植物中，负责抗性的突变是单因子、显性或半显性遗传的核特性。在烟草中，这些突变位于两个非连锁的基因位点的任一个上。

用化学药物控制与有用的农作物一起生长的杂草，要求使用具有高度选择性的化学除莠剂。在某些情况下，要想找到任何一种既能杀除杂草而又不伤害作物植株的化学药物是很困难的。在作物植株中引进除莠剂抗性这一生物学特性将可克服这一困难。

虽然，许多涉及到分化的植物组织和器官的结构和功能的基因在未分化的组织中并不表达，但那些涉及细胞基本功能的基因可以在未分化成组织的愈伤组织或细胞悬浮培养中进行表达和被选择。在许多例子中已证实了这一点，通过组织培养选择某一表型，并再生相同表型的植株。这些例子包括在体外选择对除莠剂、致病毒素或病害、抗生素、氨基酸类似物、盐耐性等的抗性植株（见Chaleff，1981;Evans    et    al，1983;Vasil，1986的综述）。

由于乙酰乳酸合酶是涉及氨基酸生物合成这一基本细胞代谢活性的酶，因此，可以期望并已经证实对这个酶编码的基因在愈伤组织和完整植株中都能表达。本专利所述的磺酰脲抗性烟草突变体S4、C3和Hra，首先在组织培养中选择，然后再生完整植株，这些植株保留有遗传稳定的抗性表型（Chaleff    and    Ray，1984）。

来自再生植株或其后代的愈伤组织能够继续生长在抑制野生型愈伤组织生长的除莠剂浓度中。因此，从植物细胞水平上的磺酰脲除莠剂抗性，可以预见完整植株水平的抗性。此外，已在细菌、酵母和高等植物中证实，导致产生除莠剂抗性ALS的突变足以赋予细胞水平的抗性，如果是植物，则足以赋予完整植株水平的抗性。因此，从在植物细胞提取液中观察到的抗除莠剂的ALS，也可预见培养的植物细胞和完整植株的抗除莠剂生长。

通过组织培养或种子诱变获得除莠剂抗性的作物植株有一些局限性：1）组织培养法限于那些能够进行操作并能从组织培养中再生植株的作物;2）由种子诱变产生的植物可能具有不需要的表型，组织培养法可能也有这种情况，这需要进行多重遗传回交以消除之;3）通过育种转移抗性基因限于同一种的品种之间，并需要多重遗传回交。因此，分离能赋予除莠剂抗性的核酸片段，并进一步通过基因转化将其导入作物中，将能使除莠剂抗性进行迅速的种间转移，并克服许多上面述及的限制。

虽然从一种植物分离的基因已导入其它植物中并得到表达，但非植物基因在植物中还只以嵌合基因形式表达，其中，非植物基因的编码序列被融合入基因表达所需的植物调控序列中。然而，通过导入由细菌或酵母抗除莠剂形式的ALS的基因组成的嵌合基因，而将除莠剂抗性导入植物中是很困难的，这是因为（a）据信这些微生物ALS酶缺乏专一的信号（转移）肽序列，此序列是将其摄入植物叶绿体中所需的，而植物ALS正位于细胞的叶绿体中;（b）细菌同功酶由两种不同的多肽亚基组成;（c）高等植物的外源细胞环境对于微生物ALS酶的作用可能不是最适的。因此，需要核酸片段（1）对植物抗除莠剂形式的ALS进行编码，（2）当导入除莠剂敏感性植物后能赋予其除莠剂抗性。

本发明提供了一种核酸片段，它包含编码植物乙酰乳酸合酶的核苷酸序列。此核苷酸序列至少由一个这样的序列组成，它对图6中称为A、B、C、D、E、F和G其中之一的基本上是保守的氨基酸亚序列进行编码。核酸片段进一步的特征是，它至少满足下列条件之一：

a）核酸片段有一个对氨基酸亚序列A编码的序列，其中的ε₁是一个不是丙氨酸的氨基酸，或ε₂是一个不是甘氨酸的氨基酸;

b）核酸片段有一个对氨基酸亚序列B编码的序列，其中的α₁是一个不是脯氨酸的氨基酸;

c）核酸片段有一个对氨基酸亚序列C编码的序列，其中的σ₂是一个不是丙氨酸的氨基酸;

d）核酸片段有一个对氨基酸亚序列D编码的序列，其中的λ₁是一个不是赖氨酸的氨基酸;

e）核酸片段有一个对氨基酸亚序列E编码的序列，其中的γ₁是一个不是门冬氨酸的氨基酸;

f）核酸片段有一个对氨基酸亚序列F编码的序列，其中的β₃是一个不是色氨酸的氨基酸，或β₈是一个不是缬氨酸的氨基酸，或β₇是一个不是苯丙氨酸的氨基酸;

g）核酸片段有一个对氨基酸亚序列G编码的序列，其中的ο₁是一个不是蛋氨酸的氨基酸。

在另一个具体方案中，本发明提供了这样一种对植物乙酰乳酸合酶编码的核酸片段，它能够接入用以转化含有野生型乙酰乳酸合酶的植物的核酸构建体中（该植物对磺酰脲除莠剂化合物敏感），所述核酸片段相对于对植物乙酰乳酸合酶编码的野生型核酸片段至少有一个点突变，这样，用所述核酸构建体转化后，使所述植物含有所述核酸片段，并使所述植物对所述磺酰脲除莠剂化合物的施用具有抗性。

在另一个具体方案中，本发明提供了一种抗磺酰脲除莠剂化合物的乙酰乳酸合酶蛋白，它所包括的氨基酸序列中至少有一个氨基酸发生了置换。

在另一个进一步的具体方案中，本发明提供了核酸构建体，含有所述核酸片段的单子叶和双子叶植物、以及组织培养物。本发明进一步提供了用所述片段转化植物、选择转化的植物细胞、以及栽培转化植物的方法。

本发明还提供了选择用本发明的核酸片段转化的植物细胞的方法。该方法包括将片段导入其生长对除莠剂抑制敏感的植物细胞中，而该片段编码的ALS对除莠剂具有抗性，从而形成转化的植物细胞。通过在抑制非转化植物细胞生长的除莠剂浓度条件下进行选择，鉴定出其生长对选择性除莠剂具有抗性的转化植物细胞。

另一方面，本发明是一种在某一地点控制不期望植物生长的方法，该地点栽培有除莠剂抗性的有用的农业植物（由本发明的核酸片段所转化）。该方法包括在需要保护的地点施用有效量的除莠剂。另一方面，本发明提供了一个包括由两个核酸片段连锁的核酸片段，一个是对赋予除莠剂抗性的乙酰乳酸合酶编码的核酸片段，第二个是赋予第二特性的核酸片段，用所述的核酸片段转化植物，在施用磺酰脲化合物后，除莠剂抗性在所述植物中的表达被用来检测所述植物中是否存在所述的第二核酸片段。

图1是含有ALS基因的核酸***片段的物理图谱，这些片段是从Hra烟草变种DNA基因组文库中分离出的。

图2是质粒pAGS152的简图，给出了烟草中对抗除莠剂ALS编码的核酸片段的物理图谱。

图3是噬菌体克隆35中核酸***片段的物理图谱，该片段是从烟草C3变种DNA基因组文库中分离出的。

图4是一个基因的核苷酸序列及相应的推测氨基酸序列，此基因来自烟草Hra变种，编码烟草抗除莠剂的ALS的基因近缘的推测氨基酸序列。

图5是一个基因的核苷酸序列及相应的推测氨基酸序列，此基因来自烟草C3变种编码抗除莠剂的ALS。

图6是细菌ALS和酵母及植物ALS酶大亚基的推测氨基酸序列的比较。

图7是从甜菜DNA基因组文库中分离到的来自噬菌体克隆21的核酸***片段和亚片段的物理图谱。

图8是植物ALS酶的推测氨基酸序列的比较。

本发明提供了一组特殊的核酸片段，将它们导入除莠剂敏感的植物中会赋予该植物除莠剂抗性。这里所说的“核酸片段”是指单链或双链脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）的线性片段，它们可从任何来源产生。本发明的核酸片段最好是DNA片段。名词“植物”是指一种光合生物，包括藻类、苔藓类、蕨类、裸子植物和被子植物。但此名词不包括原核和真核微生物如细菌、酵母和真菌。“植物细胞”包括任何从植物产生的细胞，包括未分化的组织如愈伤组织或冠瘿瘤，以及原生质体、胚胎和配子细胞。名词“植物乙酰乳酸合酶”是指在植物或植物细胞中表达的特定酶。名词“核苷酸序列”是指DNA或RNA的聚合物，它可以是单链或双链的，含有或不含有合成的、非天然的或可以掺合进DNA或RNA聚合物中去的修饰核苷酸。这里所用的“基本上是保守的氨基酸序列”是指不同来源ALS酶的多肽间的氨基酸同源区。在本发明中，有7个基本上是保守的氨基酸序列示于图6中，它们分别称为A、B、C、D、E、F和G。技术熟练的人能够将不同来源的ALS酶的氨基酸序列根据图6所示排列起来，从中鉴别出那些此处定义为基本上是保守的氨基  序列的片段。然后，技术熟练的人能够确定鉴别出的片段是否具有本申请所公开并要求保护的特性。应当认为，这种表述包括对ALS酶的活性不产生不利影响的片段修饰。术语“核酸构建体”是指质粒、病毒、自我复制序列、噬菌体或者单链或双链DNA或RNA的线性片段，它们可从任何来源产生，并能够将核酸片段导入生物细胞中。

这里所用的“调控核苷酸序列”是指一个核苷酸序列，其5′和（或）3′端接于某核苷酸序列，后者的转录和表达受到与细胞蛋白合成机构结合的调控核苷酸序列的控制。正如熟练技术人员传统应用的术语，这里所用的“调控核苷酸序列”可包括启动子区，启动子区可以包括一个由RNA聚合酶识别的结合区域，一个或多个对生理条件作出反应的有效控制转录起始的区域，以及一个转录起始序列。

“转移肽”是指信号多肽，转译时它与由产物核苷酸序列编码的多肽连接在一起，形成一种多肽前体。在转移到细胞中的特定位点（如叶绿体）的过程中，转移肽可从多肽前体的剩余部分切下，以形成一种活性蛋白或成熟蛋白。

这里所用的“除莠剂”是指一种抗生素化合物，它抑制植物细胞或完整植株的代谢、生长或繁殖。用本发明的构建体转化的细胞，对某些结构上相关的磺胺化合物表现出可选择的交叉抗性，而这些化合物是出芽前后有效的广谱除莠剂。这里所用的“磺酰脲除莠剂”在一般意义上是指N-（杂环氨基羰基）芳基磺胺化合物，它们具有广谱除莠活性，对哺乳动物低毒。“选择浓度”是指抑制剂或抗生素化合物（如除莠剂）能够抑制野生型细胞或生物的代谢、生长或繁殖的浓度。这样一种生物及其无性繁殖系被称为“敏感”生物或细胞。“抗性”是指一种生物或细胞能够在抑制剂的选择浓度下生长的能力。涉及具体的酶或蛋白时，“敏感”是指酶或蛋白易于受到特异的抑制化合物（如一种抗生素或除莠剂）的专一性抑制。而将“抗性”用在具体的酶或蛋白上时，是指酶或蛋白由于具有不同的化学结构，在专一抑制剂的选择浓度下表现活性，而此浓度钝化该酶或蛋白的敏感性变体。术语“可选择的遗传标记”是指一种核苷酸序列，它结合进一种生物的基因组中以后，使该生物及其后代能够在抑制无此选择标记的此生物生长的条件下生长。例如，这样的基因可以作为可选择的遗传标记，它编码一种对特异的抗生素化合物（如除莠剂）的专一性抑制具有抗性的酶，从而使生物（如植物）能够在该化合物的选择浓度存在下生长和繁殖。可以将一种控制难以检测的性质的第二核酸片段与可选择的遗传标记共价连接，在这种情况下，生物在选择条件下的生长所表明的选择标记的存在，能够用来检测含有第二核酸片段的生物。

编码抗除莠剂ALS的DNA片段的制备

根据Chaleff所述方法（U.S.4，443，971），使敏感烟草（Nicotiana    tabacum    var.Xanthi）的愈伤组织培养物与2ppb的SM接触。选用命名为C3和S4的抗性细胞系。这些细胞系再生植株的标准遗传分析表明，C3和S4系都携有半显性的单个核基因突变（它决定除莠剂抗性），而且C3和S4突变没有遗传连锁，即它们分别在命名为SURA和SURB的不同基因中。C3和S4系产生的ALS酶的活性比来自野生型的ALS对于磺酰脲除莠剂（CS和SM）的抗性高一百倍。抗除莠剂的ALS活性的产生和对于除莠剂生长抑制的抗性在遗传杂交时进行共分离。可以期望观察到两个不同的基因发生突变而形成抗除莠剂ALS，因为烟草据信是由N.tomentosiformis和N.sylvestris形成的异源四倍体植物，它基本上包含两套完整的基因组。这样，S4和C3细胞系各自含有一个突变的和一个野生型的ALS基因。使S4细胞系与200ppb的SM接触，这是完全抑制S4生长的选择浓度。鉴别出抗200ppb的细胞系，一个这样的细胞系命名为Hra。Hra表现出来的SM耐受浓度比完全抑制野生型愈伤组织生长所需的浓度高一千倍。Hra对CS表现出交叉抗性。从Hra愈伤组织培养物中再生植株。植株的遗传分析表明Hra与S4突变相互连锁，这表明Hra系在亲本S4系的突变基因中含有第二个突变。测定了野生型和纯合的Hra烟草突变植株的叶片提取物的ALS活性。Hra突变株提取物的ALS活性比野生型植株的活性对于CS的抗性高大约一千倍。进一步表明，Hra突变株对下列化合物的叶片施用具有交叉抗性：

2-〔4，5-二氢-4-甲基-4-（1-甲基乙基）-5-氧代-1H-咪唑-2-基〕-3-吡啶羧酸，（1-甲基乙胺）盐;

5-乙基-4，5-二氢-2-〔4-甲基-4-（1-甲基乙基）-5-氧代-1H-咪唑-2-基〕-3-吡啶羧酸;

2-（2-氯乙氧基）-N-〔（4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基）氨基羰基〕苯磺酰胺;

2-氯-N-〔（4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基）氨基羰基〕苯磺酰胺;

2-〔〔（4-氯-6-甲氧嘧啶-2-基）氨基羰基〕氨基磺酰基〕苯甲酸，乙基酯;

N-〔（4，6-二甲氧嘧啶-2-基）氨基羰基〕-2，3-二氢-2-甲基苯并〔β〕噻吩-7-磺酰胺.1，1-二氧化物;

7-氯-N-〔（4，6-二甲氧嘧啶-2-基）氨基羰基〕-3，4-二氢-2-甲基-2H-1，2-苯并噻嗪-8-磺酰胺，S，S-二氧化物;

2-〔〔（4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基）氨基羰基〕氨基磺酰基〕-6-甲基苯甲酸，甲基酯;

5，7-二甲基-N-（2-甲基-6-硝基苯基）〔1，2，4〕-***〔1，5-A〕嘧啶-2-磺酰胺;

2-〔4，5-二氢-4-甲基-4-（1-甲基乙基）-5-氧代-1H-咪唑-2-基〕-3-喹啉羧酸;

6-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-间-甲苯甲酸和对-甲苯甲酸，甲基酯;

2-〔〔（4，6-二甲基嘧啶-2-基）氨基羰基〕氨基磺酰基〕苯甲酸，甲基酯;

N-（2，6-二氯苯基）-5，7-二甲基〔1，2，4〕***〔1，5-A〕嘧啶-2-磺酰胺;

N-（2-氯-6-甲基苯基）-5，7-二甲基〔1，2，4〕***〔1，5-A〕嘧啶-2-磺酰胺。

为了克隆抗除莠剂ALS基因，从烟草的S4纯合突变系中分离烟草DNA。取50g愈伤组织在液氮中冰冻，再进行冷冻干燥。然后于大约23℃下用捣碎器将得到的干组织捣碎，每次持续15秒钟，直至粉碎为止。加入10倍体积的蔗糖缓冲液（0.3M蔗糖，50mM Tris-HCl pH8.0，5mM MgCl₂），得到的悬浮液在0℃下保温5分钟。然后使悬浮液通过粗纱布过滤，350xg下离心10分钟。然后使核沉淀重新悬浮于溶解缓冲液中（20mM EDTA，50mM Tris-HCl pH8.0，1% Sarkosyl），加入CsCl，使每毫升缓冲液中含有0.95g，得到的混合物在17，000xg下于4℃离心20分钟。在得到的上清液中加入溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，使其浓度为400μg/ml，将折射率调整为1.39，所获溶液在Beckman Ti70转子中以90，000xg于20℃下离心3天。从梯度中取出所形成的DNA荧光带，用异丙醇处理以萃取其中的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。最后，DNA在TE缓冲液中透析，并通过加入乙醇而沉淀。

如下根据Frischauf等人（J.Mol.Biol.，170：827，1983）所述方法，利用入噬菌体载体EMBL4从此DNA制备烟草基因组文库。根据Davis    et    al.，Advanced    Bacterial    Genetics，（Cold    Spring    HarborLaboratory，New York，1980）制备琼脂糖平皿原种，再由此制备EMBL4噬菌体。根据Silhavy et al.，Experiments with Gene Fusions，（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1984）制备噬菌体DNA，即用聚乙二醇浓缩噬菌体，通过氯仿萃取除去聚乙二醇，利用甘油分步梯度纯化噬菌体。然后，所得到的纯化噬菌体用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶处理，再进行苯酚萃取，从乙醇中收集噬菌体DNA。为了制备EMBL4噬菌体的臂，用核酸内切酶Sal Ⅰ和Bam HI分步消化噬菌体DNA。根据Maniatis et al.，Molecular Cloniug：A Laboratory Manual.（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1982），使臂退火，然后以10-40%蔗糖梯度从中部片段上分离之。该臂与烟草DNA连接之前，使其完全变性并再退火。如前所述制备的烟草DNA，用核酸内切酶Sau3A部分消化，使其通过10-40%的蔗糖梯度沉降。来自蔗糖梯度的各组分再通过0.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。透析含有20-40kb大小片段的组分，使其沉淀，并与λ噬菌体的DNA臂连接。进行DNA连接的浓度是135μg/ml载体和45μg/ml***DNA。然后用λDNA的包装提取物包装所获连接好的连环体。所获噬菌体的产率约为每微克***DNA4.5×10⁵个噬菌体。建立了大约400，000个噬菌体的文库，代表全部烟草文库的大约99%，基因组含量大约有1.65微微克，或1.52×10⁹碱基对（Zimmerman，et al，Chromosoma 59：227，1977）。

根据Silhavy    et    al.，Experiments    with    GeneFusions，（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1984），将所获烟草DNA的噬菌体文库培养在大肠杆菌LE392菌株（ATCC33572）的平皿上。使涂布的噬菌体在90mm培养皿上产生2000-5000个噬菌斑，或150mm培养皿上50，000个噬菌斑。根据Benton et al.，Science 196：180（1977）的方法吸印噬菌斑。将噬菌体DNA转移到硝化纤维素滤器上后，使滤器在6×SSPE中于56℃下保温大约4小时进行预杂交，其中含有0.5%SDS，100μg/ml变性的小牛胸腺DNA，以及10×Denhardt氏溶液。然后根据Maniatis，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1982）P.326的方法完成杂交。在这一步中，加入一部分新鲜的杂交溶液，以及约10⁸cpm的放射性酵母ALS基因探针。使杂交于56℃下进行大约24-48小时。在这时，滤器首先用6×SSPE于56℃下洗涤大约4小时，然后用2×SSPE于大约23℃下再洗涤三次，每次20分钟。使滤器干燥，在-70℃下曝光2天，使用柯达XAR或XRP X光片和杜邦公司的增感屏（Cronex

Lightning Plus^TM）。胶片上的曝光点表明潜在的烟草ALS基因的噬菌斑位置。

使上述制备的放射自显影图片在原来含有噬菌体的培养皿上定位。利用无菌的巴氏吸管的大头，将对应于放射自显影图片上最暗点的噬菌斑切下。再将选择出的噬菌斑洗脱到SM缓冲液中，涂布在90mm的新鲜培养皿上。每个培养皿接受大约100-200个噬菌体。然后利用新制备的探针重复全部噬菌体定位过程。以这种方式重复进行噬菌体的定位和分离步骤，直至大多数噬菌斑表明，其中的噬菌体含有能与酵母ALS基因探针杂交的DNA。

根据Maniatis    et    al.，Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual（Cold    Spring    Harbor    Laboratory，New    York，1982），P.371从称为NtA13的噬菌斑纯化的噬菌体中分离和制备DNA微型制备物。用限制性核酸内切酶EcoRI消化DNA微型制备物，消化产物通过0.7%琼脂糖凝胶电泳，并转移到硝化纤维素滤器上。通过与酵母ALS基因探针杂交而鉴别含有ALS基因的片段。分离能够与探针杂交的片段并再克隆到载体pBR322、M13mp9、或M13mp18中。然后，基本上按照Sanger    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    74：5463（1977），用寡核苷酸引物通过双脱氧链终止法测定这些片段的序列。使用可从New    England    Biolabs（Beverly，Massachusetts，U.S.A.）购到的药盒。使用合成的寡核苷酸引物可使DNA序列沿着克隆片段在重叠片段中扩展。DNA序列的计算机分析鉴别出一个667个密码子的开放读码。此开放读码的推测氨基酸序列，基本上与前面由啤酒酵母ILV2基因和大肠杆菌ilvG基因确定的序列同源，表明从烟草基因组文库中回收到的DNA片段含有烟草ALS基因。为了确定此ALS基因是编码野生型除莠剂敏感性酶，还是编码S4系的突变的除莠剂抗性酶，将基因通过根癌农杆菌（Agrobacterium    tumefaciens）介导的转化作用导入除莠剂敏感的野生型烟草中。

为选择转化的植物细胞，需要一个遗传标记。应用了对抗生素G-418的抗性，该抗生素源于植物中对新霉素磷酸转移酶编码的细菌基因NPTⅡ的表达。为了使NPTⅡ表达，植物调控序列被融合到载体pKNK的NPTⅡ编码区中。载体pKNK是由常用的质粒pBR322衍生的，即去掉HindⅢ和BamHI位点，并在ClaI位点***大约2.3Kb的ClaⅠ片段，此片段由下列序列组成：

a）一个320bp的ClaⅠ-BglⅡ序列，它含有转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因的启动子区，该转座子是通过将HindⅢ位点转化成ClaⅠ位点产生的〔Beck，E.，Ludwig，G.，Auerswald，E.A.，Reiss，B.&    Schaller，H.（1982）Gene    19：327-336〕。

b）一个296bp的Sau3A-PstⅠ序列，它含有冠瘿碱合酶启动子（NOSP）（核苷酸-263至+33，参照转录起始位点）〔Depicker，A.，Stachel，S.，Dhaese，P.，Zambryski，P.&    Goodman，H.J.（1982）J.Mol.Appl.Genet.1：561-574〕，该启动子是通过在起始密码子处建立一个PstⅠ位点而从冠瘿碱合酶基因（NOS）产生的。

c）998bp的HindⅢ-BamHⅠ序列，它含有NPTⅡ基因的编码序列，这是通过分别在核苷酸1540和2518处建立HindⅢ和BamHⅠ位点而从Tn5产生的〔Beck，E.，Ludwig，G.，Auerswald，E.A.，Reiss，B.&    Schaller，H.（1982）Gene    19：327-336〕。

d）702bp的BamHⅠ-ClaⅠ序列，它含有NOS基因的3′端区域（核苷酸848至1550）〔Depicker，A.，Stachel，S.，Dhaese，P.，Zambryski，P.&    Goodman，H.J.（1982）J.Mol.Appl.Genet.1：561-574〕。

NOSP和NPTⅡ编码序列的融合处的核苷酸序列如下：

NOS序列    NPTⅡ序列

……AATAATCTGCAGCAAGCTTGCGGGGATCGTTCGCATG……

PstⅠ    HindⅢ

载体pKNK用限制酶SalⅠ（BRL）切割，得到的线性载体用苯酚提取，然后在T4DNA连接酶（New    England    Biolabs）存在下，与纯化的2.1kb    SalⅠ片段连接，此片段携有细菌新霉素磷酸转移酶Ⅰ（NPTⅠ）基因作为细菌对卡那霉素抗性的选择标记。用连接混合物转化感受态大肠杆菌HB101细胞，在含有100mg/l卡那霉素的平皿上选择转化体。纯化所得到的重组质粒，命名为pKNKS。

质粒pKNKS用限制酶EcoRⅠ（BRL）切割，用Klenow片段（BRL）使其末端纯化。所获的线性DNA在T4DNA连接酶（New    England    Biolabs）存在下与磷酸化的BglⅡ连接子相连。用限制酶BglⅡ（BRL）进行充分消化以除去多余的连接子，然后使DNA通过Sephadex    G-150（细型）（Pharmacia）凝胶过滤柱，以将其从连接子中分离出来。分离DNA片段并调整其体积以得到大约为78μg/ml的DNA浓度。使1μlDNA在T4DNA连接酶（New    England    Biolabs）存在下于5μl总体积中自我连接，并用来转化感受态大肠杆菌HB101细胞。抗氨苄青霉素的细胞表明含有质粒pKNKSG，它与pKNKS是一致的，只是用BglⅡ位点取代了EcoRI限制性位点。

噬菌体NtA13的SmaⅠ片段表明，它含有与酵母ALS基因杂交的区域。用限制酶SmaⅠ（New    England    Biolabs）部分消化噬菌体NtA13，用苯酚提取，然后在T4DNA连接酶（New    England    Biolabs）存在下与磷酸化的BamHI连接子（New    England    Biolabs）相连。用BamHI消化和通过琼脂糖凝胶电泳除去多余的连接子后，含有来自噬菌体NtA13的烟草ALS基因的16kb的BamHI限制片段通过电泳洗脱从凝胶上分离出并用作进一步克隆。

用限制酶BglⅡ（BRL）使载体pKNKSG线性化，用牛小肠磷酸酯酶（Boehringer    Mannheim）脱磷酸化，然后在T4DNA连接酶（New    England    Biolabs）存在下与来自噬菌体NtA13的16kb    BamHI限制片段相连接。用连接混合物转化感受态的大肠杆菌HB101细胞，具有氨苄青霉素抗性的转化体表明含有命名为pIV13的重组质粒。pIV13中***片段的定位是这样的：载体中的NOS：NPTⅡ基因的开放读码和插段中的ALS基因位于相反方向。通过三次单菌落划线培养纯化HB101（pIV13），用它进行三亲株杂交。

3ml大肠杆菌HB101（pIV13）和大肠杆菌HB101（pRK2013）（ATCC37159）在LB液体培养基（含有25mg/L卡那霉素）中的过夜培养物在37℃下培养，3ml土壤杆菌GV3850在LB培养基中的过夜培养物在28-29℃下培养。用医用离心机在室温下收集细胞，用没有药物的LB培养基洗涤一次，收集后再悬浮在3mlLB中。三种菌株各取0.25ml在试管中混合，将混合物转移到微孔滤器上（2.5cmHAWP，0.45μm），此滤器置于培养皿中的三层华特曼1号滤纸上。当所有的液体培养基都被华特曼滤纸吸收后（大约30分钟），将上表面带有细菌的微孔滤器置于（细菌面向上）没有药物的LB平皿上。在28-29℃下保温过夜后，将微孔滤器转移至5ml10mM MgSO₄中搅动，使细菌重新悬浮于溶液中。取每份0.1ml的量涂在选择平皿上〔Mg基本平皿，含有20%蔗糖，1mM MgSO₄，1mMCaCl₂，1mg/ml卡那霉素（Sigma公司）〕。在28-29℃保温大约4天后出现几个大菌落。在同一个选择平皿上连续三次进行单菌落划线培养，纯化出几个转移结合体。只有含有通过共有的pBR322序列与内源质粒pGV3850重组的pIV13质粒的农杆菌才可期望生长。在利用人工操作组成的农杆菌GVKNT13转化植物之前，通过Southern分析证实了这一点。

为进行植物细胞转化，应用了标准的无菌技术、无菌培养基和无污染的植物/细菌培养物，并在所有转移中使用了层流通风橱。实例6中给出了培养基配方。用于叶圆片感染实验的盆栽烟草植株种在白昼12小时，24℃，夜晚12小时，20℃，相对湿度大约为80%，冷白荧光和白炽光混合光照的生长室中。基本上按照Horsch    et    al.（1985）Science    227：1229的方法进行烟草叶圆片感染。

从大约4-6周的烟草植株（Nicotiana    tabacum    var.Xanthi）上，用解剖刀摘取长约4-6吋的未完全展开的幼叶。将叶片浸入约500ml10%Chlorox，0.1%SDS溶液中30分钟以对叶片进行表面消毒，然后用无菌的去离子水洗涤3次。用无菌的纸打孔器从完整叶片上制备直径6mm的叶圆片。

以1∶10的比例稀释含有质粒GCKNT13的农杆菌的过夜培养物，取20ml将叶圆片浸入其中几分钟以进行接种。用接种10ml具有取自R-琼脂平皿单菌落的γEB肉汤开始农杆菌的培养。培养物在18mm玻璃培养管内于28℃下的New    Brunswick平台摇床中，生长大约17-20小时。

接种以后，将叶圆片置于含有CN琼脂培养基的培养皿中。用帕拉胶膜（Parafilm）密封培养皿，在维持大约25℃的培养室中，在混合的荧光和“Gro和Sho”植物光（General    Electric公司）下保温2-3天。

为了使叶圆片去掉农杆菌并选择转化烟草细胞的生长，将叶圆片转移至含有500mg/L    Cefotaxima和100mg/L卡那霉素的CN新鲜培养基中。Cefotaxime以100mg/ml的冰冻母液保存并无菌加入高温灭菌后的培养基中（通过0.45μm滤器进行过滤灭菌）。每次使用时制备新鲜的卡那霉素母液（50mg/ml），并通过过滤灭菌加入灭过菌的培养基中。

在上述生长条件下使叶圆片保温3周，然后转移至同样组成的新鲜培养基中。

大约1-2周以后，用无菌解剖刀取下在含卡那霉素培养基上发育出来的苗，再植入含有10ppb    CS或100mg/L卡那霉素的培养基A中。在3周以内记录在选择和非选择培养基上根的形成。

在种植后两周内，从切下的苗上取下小叶片，在选择培养基上通过愈伤组织诱导试验测定对CS和卡那霉素的抗性水平。为了诱导愈伤组织的形成，用解剖刀切下小叶片并剪成几段，再植入含有10ppbCS或50mg/L卡那霉素的培养基B中。在3周以内记录选择和非选择培养基上愈伤组织的生长。

表1结果表明，以抗卡那霉素愈伤组织的生成为根据，用GVKNT13菌株已达到了对烟草的转化。抗卡那霉素愈伤组织仍对磺酰脲除莠剂CS敏感，表明从烟草S4突变株中分离出的噬菌体Nta13中的ALS基因是对野生型的除莠剂敏感酶编码的。此植物ALS基因被用作DNA杂交探针以分离其它的植物ALS基因，包括编码抗除莠剂ALS的基因。

表1.GVKNT13感染的烟草愈伤组织的

测定结果

转化的苗分离块在选择和非选择培养基

上生成的愈伤组织数目

GVKNT13¹GVKK²GV3850³

实验1

无选择    59/62    12/13    10/10

卡那霉素（50mg/L）    53/62    8/13    0/10

CS（10ppb）    0/62    0/13    0/10

实验2

无选择    96/102    21/23    22/25

卡那霉素（50mg/L）    81/102    16/23    0/25

CS（10ppb）    0/102    0/23    0/25

1、含有携烟草ALS基因和NOS/NPTⅡ基因的Ti质粒的农杆菌菌株（卡那霉素抗性）

2、含有只携NOS/NPTⅡ基因的Ti质粒的农杆菌菌株

3、含有Ti质粒（去掉了烟草ALS或NOS/NPTⅡ基因中任一个）的农杆菌菌株

在λ噬菌体中建立烟草Hra突变株DNA的基因组文库，并从S4突变株中筛选与野生型烟草ALS基因杂交的克隆。分离到了几个噬菌体克隆。用限制性核酸内切酶测定烟草DNA插段的物理图谱，结果表明，存在两类不同的DNA片段，它们代表两个烟草ALS基因SURA和SURB。比较烟草（N.tabacum）的SURA和SURB基因的物理图谱和其祖先种的图谱，表明SURA基因来自N.sylvestris，而SURB基因则来自N.tomentosifo-rmis。前面从S4突变株中分离的野生型ALS基因命名为SURA。Hra中高度抗除莠剂的突变与S4突变的遗传连锁表明，Hra突变发生在与S4突变相同的ALS基因中，即SURB。因此，可望从Hra突变株中分离出的SURB基因是一个突变基因（命名为SURB-Hra），它编码一种抗除莠剂的ALS。选出了一个含有SURB-Hra基因的噬菌体克隆作进一步分析。此噬菌体克隆命名为3，已寄存在ATCC（Rockville，MD），寄存号为ATCC40237。用限制性核酸内切酶SpeⅠ消化噬菌体克隆，产生一个8.3kbDNA片段，将其***质粒pMuc19的XbaⅠ位点中，得到重组质粒pAGS148，它已寄存于ATCC（Rockville，MD），寄存号为ATCC67124。质粒pAGS148和pAGS135按下述情形相互连接，并将得到的重组质粒pAGS152（图2）导入根癌农杆菌LBA4404中。所得到的根癌农杆菌LBA4404（pAGS152）已寄存于ATCC，寄存号为ATCC67126。

在λ噬菌体中建立C3烟草突变株DNA的基因组文库，并筛选与前面从烟草中分离的ALS基因杂交的克隆。分离到了几个噬菌体克隆，并用限制性核酸内切酶测定了烟草DNA插段的物理图谱。鉴别到了两类不同的DNA片段，对应于SURA-C3基因和SURB基因。选择称为35和38的携有SURA-C3基因的两种噬菌体克隆作进一步分析。

用限制性核酸内切酶SpeⅠ和SalⅠ消化噬菌体克隆35，产生图3所示的6.3kbDNA片段。此DNA片段已被***用限制性核酸内切酶XbaⅠ和SalⅠ消化的质粒载体PUC119中，得到的重组质粒pALS35已寄存于ATCC（Rockville，Maryland），寄存号为ATCC67424。

除了4种烟草ALS基因外，即除了编码野生型除莠剂敏感性ALS的SURA和SURB，编码突变型抗除莠剂ALS的SURA-C3和SURB-Hra以外，还从拟南芥、甜菜（Beta    vulgaris）中分离到了ALS基因，从玉米（Zea    mays）中分离到了部分ALS基因。来自除莠剂敏感性植物的这些ALS基因，是从λ噬菌体的基因组文库中得到的，该文库是通过筛选与先前从酵母或烟草中分离出的ALS基因进行杂交的DNA而建立的。野生型甜菜的ALS基因是从称为φ21的噬菌体中分离的，并用限制性核酸内切酶测定其物理图谱。图7给出了从此噬菌体中分离出的DNA片段，和两个被亚克隆到质粒载体pUC119中的DNA片段。质粒pSBALS216已寄存于ATCC（Rockville，Macyland），寄存号为ATCC67425。

图1表明从烟草Hra突变株分离的含有ALS基因的DNA片段的限制性核酸内切酶图谱。以这些图谱为基础，可以分辨出两类DNA片段。在噬菌体克隆3中，约18kb的核酸插段携有SURB-Hra基因。此插段含有本发明所期望有的DNA片段，它编码烟草Hra突变株的抗除莠剂ALS。此核酸片段由8.3±.5kb的双链DNA组成，分子量为5.5±.3百万道尔顿，在两个末端都有CTAG的5′伸出序列。两个SpeⅠ位点之间的8.3kb核酸片段与用来筛选基因组文库的ALS基因探针杂交。通过已知技术能够用限制性核酸内切酶SpeⅠ从噬菌体中将此片段切下。

图2表明质粒pAGS152的物理图谱。质粒pAGS135和pAGS148未按比例绘制。给出了限制性核酸内切酶位点EcoRI（RI）、BamHI（B）、XbaⅠ（X）、PstⅠ（P）、SalⅠ（S）、SpeⅠ（Sp）、NcoⅠ（N）、HindⅢ（H）、BstEⅡ（Bs）、SmaⅠ（Sm）、KpnⅠ（K）、SstⅠ（St）、SphⅠ（Sh）和BglⅡ（G）等。连接被BamHⅠ切割的质粒pAGS135（约27kb）和pAGS148（约12.1kb）则形成pAGS152。绘成圆环的质粒pAGS135是一个广宿主质粒，它含有植物卡那霉素抗性基因（NOS：NPTⅡ）和BamHⅠ克隆位点，两边邻接T-DNA的左边界（LB）和右边界（RB）。以线性BamHⅠ片段形式给出的质粒pAGS148，由本发明主题的SpeⅠ（Sp）片段（约8.3kb）组成（由X/Sp和Sp/X表明邻接），它含有Hra突变株的除莠剂抗性型ALS的编码序列，插在质粒pMuc19的XbaⅠ位点（X）中（空白框）。虽然限制酶SpeⅠ和XbaⅠ识别不同的序列，但它们的作用导致具有相同5′伸出序列的DNA片段，即5′-CTAG-3′。这样，SpeⅠ和XbaⅠ消化的片段能相互连接，但连接结果是两个位点都失去。插段上加阴影线的框对应于ALS基因的编码区，箭头表明编码序列的5′→3′的方向。核酸片段的一端邻接于HindⅢ、SphⅠ、PstⅠ和SalⅠ位点，另一端邻接于BamHⅠ、SmaⅠ、KpnⅠ、SstⅠ和EcoRⅠ位点。通过已知技术，可用这些酶通过完全或部分消化从质粒上切下此片段。消化以后，此片段的末端将具有用以切割此片段的核酸内切酶的特征：

5′伸出序列    3′伸出序列

5′-C-3′

Spe    Ⅰ    5′-CTAGT-3′    Sph    Ⅰ    3′-GTACG-5′

3′-A-5′

5′-G-3′

Hind    Ⅲ    5′-AGCTT-3′    Pst    Ⅰ    3′-ACGTC-5′

3′-A-5′

5′-C-3′

Sal    Ⅰ    5′-TCGAC-3′    Kpn    Ⅰ    3′-CATGG-5′

3′-G-5′

5′-C-3′

BamH    Ⅰ    5′-GATCC-3′    Sst    Ⅰ    3′-TCGAG-5′

3′-G-5′

EcoR    Ⅰ    5′-AATTC-3′

3′-G-5′

平头端

Sma    Ⅰ    5′-GGG-3′

3′-CCC-5′

利用琼脂糖凝胶电泳，可从限制性消化液中分离出8.3kb片段。可通过图2所示的限制性图谱确定此片段的特性，它含有烟草（Nicotiana    tabacum    cv.Xanthi）Hra突变株ALS的编码序列，此突变株对CS和SM的抑制作用具有抗性。此片段还含有该基因在植物中表达所需的调控核苷酸序列。

图3表明一个所期望的核酸片段的限制性核酸内切酶图谱，它大约为6.8kb并携有SURA-C3基因。此DNA片段是用限制性核酸内切酶SpeⅠ和SalⅠ消化λ噬菌体克隆35得到的，将它***用限制性核酸内切酶XbaⅠ和SalⅠ消化的质粒载体pUC119中，根据图2的说明进行。

图4表明一个较好的DNA片段的部分核苷酸序列，它编码烟草SURB-Hra基因的除莠剂抗性型ALS。核苷酸根据它们的碱基，用下列标准缩写来表示：

A＝腺嘌呤

C＝胞嘧啶

T＝胸腺嘧啶

G＝鸟嘌呤

核苷酸序列的起始点对应于图2所示的编码序列之前的PstⅠ位点（P）处885核苷酸碱基;序列终止于第2946碱基，它越过图2所示编码序列的终点67个碱基。从核苷酸1至核苷酸884的核苷酸序列据信含有表达ALS密码所需的5′端调控序列。图4还表明了ALS蛋白的推测氨基酸序列。

氨基酸残基由下列缩写表示：

A＝丙氨酸;

C＝半胱氨酸;

D＝天冬氨酸;

E＝谷氨酸;

F＝苯丙氨酸;

G＝甘氨酸;

H＝组氨酸;

I＝异亮氨酸;

K＝赖氨酸;

L＝亮氨酸;

M＝蛋氨酸;

N＝天冬酰胺;

P＝脯氨酸;

Q＝谷氨酰胺;

R＝精氨酸;

S＝丝氨酸;

T＝苏氨酸;

V＝缬氨酸;

W＝色氨酸;

Y＝酪氨酸。

这里所用的术语“氨基酸”是指上述天然氨基酸及其有效的等价物。

图5表明一个所期望的DNA片段的部分核苷酸序列及其相应的推测氨基酸序列，此片段编码烟草C3基因的除莠剂抗性型的ALS。核苷酸序列的起点对应于图3所示的BamHⅠ位点。编码序列始于核苷酸176，止于核苷酸2175。核苷酸1至核苷酸175的核苷酸序列据信含有表达ALS密码必要的（但并不充分）5′调控序列。核苷酸和氨基酸用上述的标准缩写表示。

图6表明ALS大亚基的推测氨基酸序列，它们来自大肠杆菌ALS同功酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ（分别为E、F和G行）、酵母（D行）和拟南芥（C行）的野生型ALS蛋白以及分别由SURB和SURA基因编码的烟草（A和B行）野生型ALS蛋白。氨基酸残基由上述标准缩写表示。酵母（图6，D行）和高等植物（A-C行）ALS蛋白的推测氨基酸序列的第一个氨基酸（蛋氨酸）是转移肽的假定起始点，此肽被认为与酶的转运有关，如果是酵母，酶被转运到线粒体中，如果是植物，酶则转运到叶绿体中。这些转移肽据信在蛋白转运到细胞器的过程中被切掉，并且不是ALS活性所需的。如果不了解酵母和高等植物活体ALS蛋白的N-末端，则很难确定这些转移肽的延伸程度。根据与细菌ALS蛋白的同源性，叶绿体和线粒体的转移序列估计可能为90个氨基酸。

序列中的虚线为***的间隔标记，用它们更好地使同源区连成一线。垂直线条标明图6中相邻序列间的保守氨基酸残基。烟草和拟南芥ALS蛋白（A-C行）的同源性非常显著，这两种植物来自不同的科。更出人意料的是（考虑到微生物和高等植物间的进化距离），发现细菌（E至G行）和酵母（D行）ALS蛋白间的保守氨基酸残基，在这些蛋白和植物ALS蛋白之间也大部分是保守的。

图7表明携有甜菜ALS基因的噬菌体克隆φ21中约17.5kb核酸插段的限制性核酸内切酶图谱。还给出了两个也含有甜菜ALS基因的较小的DNA片段，它们被亚克隆到pUC119质粒载体中。

图8表明来自烟草（N.tobacum）（A和B行）、拟南芥（Arabidopsis    thaliana）（C行）、甜菜（Beta    vulgaris    cv.sennica）（D行）的野生型ALS蛋白的推测氨基酸序列，以及玉米（E行）ALS蛋白的部分序列。序列中的虚线是为使同源区更好排列的间隔标记。垂直线标明相邻序列间的保守氨基酸序列。所有植物ALS蛋白间的同源程度很大。从此为基础，如果一种植物中的ALS基因的氨基酸置换突变导致抗磺酰脲除莠剂的ALS，则可以期望，如果此突变出现在任一种其它植物ALS基因中，则也会产生类似效果。

图6中所有ALS序列的保守氨基酸残基被认为对于底物、除莠剂、辅酶等的结合是很重要的。这些序列据信在所有ALS蛋白中基本上都是保守的。在不同ALS蛋白中部分保守的残基可能参与保守性较小的酶功能，例如控制其除莠剂敏感性和终端产物抑制的功能。这种例子包括细菌同功酶Ⅰ对SM和CS的抗性，以及细菌同功酶Ⅱ对缬氨酸终端产物抑制的抗性。最后，蛋白之间非保守的那些残基可能存在于ALS蛋白的结构骨架中，即此处的序列差异对酶的功能影响不大。

虽然并不希望受到理论的束缚，但人们仍然认为，乙酰乳酸合成时磺酰脲除莠剂与ALS的结合受到第一个丙酮酸分子与酶结合的促进。但是，磺酰脲除莠剂分子与酶的结合，与第二个丙酮酸分子与酶的结合发生竞争。在进化过程中，大多数ALS酶的磺酰脲除莠剂敏感性都是保守的。从这些事实推测，磺酰脲除莠剂的结合发生于ALS蛋白中一个或多个保守氨基酸上或其附近。事实上，本申请人已发现并要求保护，在A至G这7个基本上保守的亚序列的一个或多个中，10个特异氨基酸残基中的一个或多个的置换将产生除莠剂抗性。基本上是保守的亚序列中其它氨基酸残基的置换也可望产生除莠剂抗性。

细菌、酵母和高等植物中的磺酰脲除莠剂抗性产生于ALS结构基因的突变，此抗性与除莠剂抗性型的ALS进行共分离。比较生物中编码除莠剂敏感性和除莠剂抗性型ALS的ALS基因的核苷酸序列，能使人确定哪个氨基酸残基对于酶的除莠剂抑制是重要的。大肠杆菌ilvG基因中的一个突变被确定为是位置122（图6）处的丙氨酸至缬氨酸的置换，此突变导致了酶对SM抑制的抗性的增加和催化活性的降低。此基因中另一个SM抗性突变，被确定是导致同一位置的丙氨酸至丝氨酸的置换。除了具有天然抗性的细菌同功酶Ⅰ（图6）以外，此丙氨酸残基在所有ALS酶中都是保守的。

从磺酰脲抗性的自发的酵母突变株中，分离到了许多编码抗除莠剂ALS酶的基因。这些基因的序列分析表明，抗性的分子基础是碱基变化，这导致了蛋白中十个不同位置（表2）上的氨基酸置换，十个位置即残基121、122、197、205、256、359、384、588、591和595（相对于图6中的位置计数）。

表2.导致磺酰脲除莠剂抗性的酵母ALS

基因的自发突变

氨基酸    野生型    野生型    突变型    置换氨

位置    密码    氨基酸    密码    基酸

121    GGT    Gly    AGT    Ser

122    GCT    Ala    CCT    Pro

GAT    Asp

GTT    Val

ACT    Thr

197    CCA    Pro    TCA    Ser

CGA    Arg

205    GCT    Ala    GAT    Asp

ACT    Thr

256    AAG    Lys    GAG    Glu

ACG    Thr

AAC    Asn

359    ATG    Met    GTG    Val

384    GAC    Asp    GAA    Glu

GTC    Val

AAC    Asn

588    GTT    Val    GCT    Ala

591    TGG    Trp    CGG    Arg

AGG    Arg

TGT    Cys

TGC    Cys

GGG    Gly

TTG    Leu

TCG    Ser

GCG    Ala

595    TTC    Phe    TTA    Leu

从这些位置的6个中，即122、197、205、256、384和591（表2），得到了不止一个的产生除莠剂抗性的置换。在位置122处，除了大肠杆菌同功酶Ⅰ以外，所有已知的野生型ALS酶都是丙氨酸残基，将它置换成天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸导致抗磺酰脲的ALS。在位置197处，除了大肠杆菌同功酶Ⅱ和Ⅲ以外，所有已知的野生型ALS酶都是脯氨酸残基，将它置换成丝氨酸或精氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。在位置205处，所有已知的野生型ALS酶都是丙氨酸残基，将它置换成天冬氨酸或苏氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。在位置256处，所有已知的野生型ALS酶都是赖氨酸残基，将它置换成谷氨酸、天冬酰胺或苏氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。在位置384处，所有已知的野生型ALS酶都是天冬氨酸，将它置换成谷氨酸、天冬酰胺或缬氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。在位置591处，除了大肠杆菌同功酶Ⅰ以外，所有已知的野生型ALS酶都是色氨酸，将它置换成丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸或丝氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。

还得到了121、359、588和595其它四个位置单个氨基酸置换产生的抗磺酰脲除莠剂的突变体。在位置121处，所有已知的ALS酶都是甘氨酸，将它置换成丝氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。在位置359处，所有已知的ALS酶都是蛋氨酸，将它置换成缬氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。在位置588处，所有已知的ALS酶都是缬氨酸，将它置换成丙氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。在位置595处，除了大肠杆菌同功酶Ⅲ以外，所有已知的ALS酶都是苯丙氨酸，将它置换成亮氨酸则导致抗磺酰脲的ALS。

在编码ALS的酵母基因中完成了寡聚核苷酸引导的位点专一性突变，它们在位置122、205、256、359、384和591处导致了氨基酸置换（表3）。

表3.酵母ALS基因中导致磺酰脲除莠剂

抗性的定位突变

氨基酸    野生型    野生型    突变型    置换氨

位置    密码    氨基酸    密码    基酸

122    GCT    Ala    TCT    Ser

GTT    Val

ACT    Thr

CCT    Pro

AAT    Asn

ATT    Ile

CAT    His

CGT    Arg

CTT    Leu

TAT    Tyr

TGT    Cys

TTT    Phe

GAA    Glu

ATG    Met

AAA    Lys

CAA    Gln

TGG    Trp

205    GCT    Ala    CGT    Arg

TGT    Cys

GAA    Glu

TGG    Trp

256    AAG    Lys    GAC    Asp

GGG    Gly

CTG    Leu

CCG    Pro

TGG    Trp

表3（续）

氨基酸    野生型    野生型    突变型    置换氨

位置    密码    氨基酸    密码    基酸

359    ATG    Met    CCA    Pro

CAG    Glu

384    GAC    Asp    CCA    Pro

TGG    Trp

TCC    Ser

GGT    Gly

TGC    Cys

AAA    Lys

591    TGG    Trp    GAC    Asp

GAG    Gly

TTC    Phe

CAC    His

TAC    Tyr

ATA    Ile

GTG    Val

AAG    Lys

AGG    Arg

ATG    Met

AAC    Asn

CAG    Gln

ACG    Thr

在位置122处，已用18个氨基酸置换存在于野生型ALS中的丙氨酸得到了突变。以前作为自发突变分离到了第19个置换（天冬氨酸），因此没有重复进行此工作。除了甘氨酸以外，每一种置换都导致抗磺酰脲的ALS。在位置205处，用半胱氨酸、谷氨酸、精氨酸或色氨酸置换野生型中的丙氨酸残基，产生的突变导致了抗磺酰脲的ALS。在位置256处，用天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸或色氨酸置换野生型中的赖氨酸残基导致突变，产生了抗磺酰脲的ALS。在位置359处，用谷氨酸或脯氨酸置换野生型中的蛋氨酸残基导致突变，产生了抗磺酰脲的ALS。在位置384处，用半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸、丝氨酸或色氨酸置换野生型中的天冬氨酸残基产生的突变，导致了抗磺酰脲的ALS。在位置591处，用天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸或酪氨酸置换野生型中的色氨酸残基产生的突变导致了抗磺酰脲的ALS。

表2和表3中描述的所有突变，都产生比野生型受磺酰脲除莠剂抑制较小的活性酶。所有这些结果表明，这10个位置上的大多数置换都导致具有酶活性的抗除莠剂ALS。

图7给出了烟草、拟南芥、甜菜和玉米的野生型ALS蛋白的推测氨基酸序列。所有植物酶在位置121、122、197、205、256、359、384、588、591和595（根据图6的位置计数）的氨基酸残基均与除莠剂敏感的野生型酵母蛋白（图6）在这些位置的残基相同。图4显示了烟草ALS基因SURB-Hra的推测氨基酸序列，该基因编码抗除莠剂的ALS。图4中的突变基因产生于一组织培养系，它已经历了两次相继的自发突变。这两个突变已表明是连锁遗传的，将此片段导入敏感性烟草细胞中，使此细胞具有除莠剂抗性，其抗性水平与原来产生此片段的具高度抗性的烟草突变株的抗性水平相同。以这些事实为基础，可以期望由此片段编码的酶中有两个置换氨基酸。比较突变型ALS和野生型ALS的推测氨基酸序列表明，突变型ALS在位置197（图6）有一脯氨酸至丙氨酸的置换，在位置591（图6）有一色氨酸至亮氨酸的置换。根据前面讲的确定，脯氨酸197和色氨酸591残基的置换产生除莠剂抗性。图5给出了第二突变烟草ALS基因SURA-C3的推测氨基酸序列，该基因编码抗磺酰脲除莠剂的ALS。比较突变和野生型ALS酶的推测氨基酸序列（图5和图6，B行）表明，突变型ALS在位置197处有单个脯氨酸至谷氨酰胺的置换。可产生SURA-C3基因的C3细胞系，表现出选择性除莠剂抗性。这就是说，C3突变赋予了对于磺酰脲除莠剂CS和SM的抗性，但不赋予对咪唑啉酮除莠剂的抗性。

植物抗除莠剂ALS酶中氨基酸置换的鉴别（即C3和Hra突变株中的位置197处，Hra突变株中的591处）表明，在酵母ALS中可进行的置换在植物ALS中也可进行。

虽然，位置121、122、197、205、256、359、384、588、591和595处的氨基酸残基，在迄今从真核生物中鉴定出的所有野生型除莠剂敏感性ALS酶中都是保守的，但在野生细菌的ALS酶的这些位置发现了一些置换。大肠杆菌同功酶Ⅰ在位置122处有一个丝氨酸而不是丙氨酸，在位置591处有一个谷氨酰胺而不是色氨酸，大肠杆菌同功酶Ⅱ在位置197处有一个丝氨酸而不是脯氨酸，大肠杆菌同功酶Ⅲ在位置197有一个丙氨酸而不是脯氨酸，在位置595有一个异亮氨酸而不是苯丙氨酸。每一种这些大肠杆菌ALS同功酶都比植物或酵母ALS对（尤其是）磺酰脲除莠剂的抑制有更强的抗性（从50倍至大于10，000倍）。而且，在大肠杆菌ALSⅡ中，导致在位置197的丝氨酸至脯氨酸置换的定位突变，使突变型酶对抑制的敏感性增加100倍，就是说，和野生型高等植物酶对抑制的敏感性相同。因此，大肠杆菌ALSⅡ中位置197的脯氨酸与酵母和高等植物ALS中的一样参与除莠剂结合。

此外，还分别在大肠杆菌的ALSⅡ和ALSⅠ中，完成了位置591处的色氨酸至亮氨酸和谷氨酰胺至色氨酸置换的定向突变。ALSⅡ中的突变使酶对除莠剂抗性比野生型ALSⅡ更强，而ALSⅠ中的突变使它比野生型ALSⅠ更为敏感。

在大肠杆菌ALSⅠ和ALSⅡ中，位置197和591的定位突变影响除莠剂对突变酶抑制作用的方式，可从抗除莠剂的突变酵母和植物ALS蛋白作出预测。这些实验结果支持这一看法，即这些氨基酸残基普遍参与除莠剂与不同来源ALS酶的结合。

编码抗除莠剂ALS的核酸片段的鉴定

根据本发明，ALS中对应于图6的氨基酸亚序列A中的ε₁和ε₂、氨基酸亚序列B中的α₁、氨基酸亚序列C中的σ₂、氨基酸亚序列D中的λ₁、氨基酸亚序列E中的γ₁、氨基酸亚序列F中的β₃、β₇和β₈、以及氨基酸亚序列G中的σ₁的氨基酸残基（此后分别称为位置122、121、197、205、256、384、591、595、588和359）对于ALS酶除莠剂的敏感性或抗性很重要，不管这些酶的生物来源如何，并且通过在这些残基处置换氨基酸，能使任何一种编码植物ALS的核苷酸序列转而直接合成一种抗除莠剂的ALS。本发明核酸片段的特征在于，它至少满足下列条件之一：

a）核酸片段在位置121编码一个不是甘氨酸的氨基酸。该氨基酸优选丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸。最好的氨基酸是丝氨酸。

b）核酸片段在位置122编码一个不是丙氨酸的氨基酸。此氨基酸最好是除甘氨酸以外的任一种氨基酸。

c）核酸片段在位置197编码一个不是脯氨酸的氨基酸。优选的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺。最好的氨基酸是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺。

d）核酸片段在位置205编码一个不是丙氨酸的氨基酸。优选的氨基酸是苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或赖氨酸。最好的氨基酸是苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸或精氨酸。

e）核酸片段在位置256编码一个不是赖氨酸的氨基酸。优选的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸或苯丙氨酸。最好的氨基酸是甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺或色氨酸。

f）核酸片段在位置359编码一个不是蛋氨酸的氨基酸。优选的氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。最好的氨基酸是谷氨酸、脯氨酸或缬氨酸。

g）核酸片段在位置384编码一个不是天冬氨酸的氨基酸。优选的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸或苯丙氨酸。最好的氨基酸是甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或色氨酸。

h）核酸片段在位置588编码一个不是缬氨酸的氨基酸。优选的氨基酸是丙氨酸或甘氨酸。最好的氨基酸是丙氨酸。

i）核酸片段在位置591编码一个不是色氨酸的氨基酸。最好的氨基酸是脯氨酸以外的氨基酸。

j）核酸片段在位置595编码一个不是苯丙氨酸的氨基酸。优选的氨基酸是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。最好的氨基酸是亮氨酸。

在一个具体方案中，位置121如下所示存在于氨基酸亚序列A中：

PGε₂A

其中P、G和A如前面所定义。为了产生除莠剂抗性，ε₂是一个不是甘氨酸的氨基酸。ε₂最好是丝氨酸。此亚序列始于距基本上是保守氨基酸序列

HEQ

起始点约24个残基处，即

PGε₂A…HEQ

在一个具体方案中，如下所示位置122存在于氨基酸亚序列A中：

PGGε₁

其中P和G如前面所定义。为了产生除莠剂抗性，ε₁是一个不是丙氨酸的天然氨基酸。ε₁最好是除甘氨酸以外的任何氨基酸。此亚序列始于距基本上是保守氨基酸序列

HEQ

起始点约24个残基处，即

PGGε₁…HEQ。

在一个具体方案中，如下所示位置197存在于氨基酸亚序列B中：

GQVα₁

其中G、Q和V如前面所定义。为了产生除莠剂抗性，α₁是一个不是脯氨酸的氨基酸。α₁最好是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺。此亚序列始于距一个基本上是保守氨基酸序列

SGPGATN

终点约20个残基处，以及距基本上是保守的第二氨基酸序列

SGRPGP

起始点约55个残基处，即

SGPGATN…GQVα₁…SGRPGP

在一个具体方案中，如下所示位置205存在于氨基酸亚序列C中：

IGσ₁Dσ₂FQE

其中I、G、D、F、Q和E如前面所定义，σ₁代表一个根据酶的来源而可能改变的氨基酸残基，但最常见的是T。为了产生除莠剂抗性，σ₂是一个不是丙氨酸的氨基酸。σ₂最好是苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或色氨酸。此亚序列始于距基本上是保守氨基酸序列

GQV

终点约5个残基处，以及距基本上是保守的第二氨基酸序列

SGRPGP

起始点约43个残基处，即

GQV…IGσ₁Dσ₂FQE…SGRPGP。

在一个具体方案中，如下所示位置256存在于氨基酸亚序列D中：

Pλ₁D

其中P和D如前面所定义。为了产生除莠剂抗性，λ₁是一个不是赖氨酸的氨基酸。优选的λ₁是甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、色氨酸或脯氨酸。此亚序列D始于距基本上是保守的氨基酸序列

SGRPGP

终点约6个残基处，即

SGRPGP…Pλ₁D。

在一个具体方案中，如下所示位置359存在于氨基酸亚序列G中：

MLGσ₁HG

其中的M、L、G和H如前面所定义。为了产生除莠剂抗性，σ₁是一个不是蛋氨酸的氨基酸。σ₁最好是脯氨酸、谷氨酸或缬氨酸。此亚序列终止于距基本上是保守的氨基酸序列

RFDDR

起始点约20个残基处，即

MLGσ₁HG…RFDDR。

在一个具体方案中，如下所示位置384存在于氨基酸亚序列G中：

RFDγ₁R

其中R、F和D如前面所定义。为了产生除莠剂抗性，γ₁是一个不是天冬氨酸的氨基酸。γ₁最好是甘氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸、天冬酰胺或色氨酸。此亚序列始于距基本上是保守的氨基酸序列

MLGMHG

终点约20个残基处，即

MLGMHG…RFDγ₁R。

在一个具体方案中，如下所示位置588存在于氨基酸亚序列F中：

Gβ₁β₈β₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇

其中G和Q如前面所定义，β₁至β₈将根据酶的来源而变化。β₁通常是蛋氨酸，β₃通常是色氨酸，而β₇通常是苯丙氨酸。为了产生除莠剂抗性，β₈是一个不是缬氨酸的氨基酸。β₈最好是丙氨酸。此亚序列始于距基本上是保守的氨基酸序列

GLPAA

终点约49个残基处，即

GLPAA…Gβ₁β₈β₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇。

在一个具体方案中，如下所示位置591存在于氨基酸亚序列F中：

Gβ₁Vβ₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇

其中G、V和Q如前面所定义，β₁至β₇将根据酶的来源而变。β₁通常是蛋氨酸，而β₇通常是苯丙氨酸。为了产生除莠剂抗性，β₃是除了色氨酸以外的任何氨基酸。β₃最好是除脯氨酸以外的任何氨基酸。此亚序列始于距另一个基本上是保守的氨基酸序列

GLPAA

终点大约49个残基处，即

GLPAA……Gβ₁Vβ₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇。

在一个具体方案中，位置595存在于下列氨基酸亚序列F中：

Gβ₁Vβ₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇

其中G、V和Q如前面所定义。β₁至β₇将根据酶的来源而不同。β₁通常是蛋氨酸，而β₃通常是色氨酸。为了产生除莠剂抗性，β₇是一个不是苯丙氨酸的氨基酸。β₇最好是亮氨酸。此亚序列始于距基本上是保守的氨基酸序列

GLPAA

终点约49个氨基酸处，即

GLPAA…Gβ₁Vβ₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇。

上述氨基酸置换中的任一个或其结合都能产生除莠剂抗性。

一般说来，按照下述方法，可使任何所需植物的编码除莠剂敏感性ALS的核酸片段突变，从而产生除莠剂抗性所要求的准确的氨基酸置换：

1）从植物中分离基因组DNA或mRNA;

2）从分离的DNA制备基因组文库，或从分离的RNA制备cDNA文库;

3）鉴定含有编码ALS的DNA片段的噬菌体或质粒;

4）测定ALS编码片段的序列;

5）再将携有ALS基因的DNA片段亚克隆到-克隆载体中，它能够产生单链DNA;

6）合成大约15至20个核苷酸的寡核苷酸，它互补于编码上述氨基酸亚序列之一的特异的ALS核苷酸序列，但不改变使某一密码子突变所需改变的核苷酸，这一密码子编码了一个能产生除莠剂抗性的选择氨基酸;

7）使寡核苷酸退火形成含有突变区域的单链DNA，并用它作为离体合成互补DNA链的引物以形成异源双链核酸;

8）用异源双链DNA转化细菌细胞;

9）筛选含有突变DNA片段的那些转化细菌细胞，步骤是，a）将DNA固定在硝化纤维素滤器上，b）使之在室温下与5′-³²P标记的诱变寡核苷酸杂交，c）在提高温度的条件下洗涤，以选择性地从野生型基因上解离探针，但不解离突变基因上的探针;

10）从携有突变基因的细胞中分离含有突变的双链DNA片段;

11）分析DNA序列以确定突变的存在。

用另一个核苷酸序列置换植物ALS基因的核苷酸序列也能完成除莠剂抗性所需的氨基酸置换，此植物ALS基因编码的氨基酸序列中含有可被置换的氨基酸，用来置换的核苷酸序列编码含有所需置换的相应的氨基酸序列，它可从任何天然ALS基因（包括微生物）或从合成来源产生。

除莠剂抗性植物的制备

本发明的核酸片段能用来将除莠剂抗性导入植物中。为了将包括编码抗除莠剂ALS基因的核酸片段导入不同的植物中，根据所需的种和品种使用了大量不同的技术。一般说来，可从离体培养或土壤栽培的植物中取出或产生外植物或原生质体。外植体或原生质体可从子叶、茎、叶柄、叶片、根、未成熟胚胎、胚轴、花序等中产生。从理论上讲，任何能进行离体操作产生新愈伤组织或有序组织生长的组织都能用作基因转化。

为了完成转化作用，可将外植体或原生质体与农杆菌进行共培养，诱导它将位于Ti质粒的T-DNA边界间的核酸片段转移到植物细胞中。另一种用得较少的方法，是由植物原生质体直接吸收DNA。用这种方法，避开了使用农杆菌，而使DNA直接被原生质体在合适条件下吸收。

在实例中，大量来自不同植物的外植体与农杆菌进行了共培养，以完成除莠剂抗性的转化。培养这些外植体使之长出愈伤组织。然后直接检测愈伤组织对磺酰脲的抗性，或再生出植株后检测植株对磺酰脲的抗性。检测包括测定植物细胞提取物中的酶，看是否存在抗除莠剂的ALS活性，和（或）检测当有除莠剂的正常抑制浓度存在时，植物细胞培养物或完整植株的生长。

DNA片段包含编码合成抗除莠剂ALS的区域，和使植物中的编码序列进行表达的区域。图2所示的8.3kbDNA片段编码图4所示的抗除莠剂ALS蛋白，它在编码区的5′方向（上游）含有大约800bp，足够用于植物中该蛋白的表达。此DNA片段在转化的烟草愈伤组织中能够赋予对高达2000ppb    CS的抗性。从转化细胞再生的植株也表现出完整植株水平的抗性。图3所示的6.3kbDNA片段编码图5所示的抗除莠剂ALS蛋白，它在编码区的5′方向（上游）含有2.5kb，3′方向（下游）含有1.8kb，足以用于植物中该蛋白的表达。此DNA片段在转化的烟草愈伤组织中能够赋予对2ppb    CS的抗性。

在正在进展的工作中，已经得到了在SURA基因中含有定位突变的DNA片段，这些突变片段可望编码抗除莠剂的ALS。这些突变导致下列氨基酸置换：Ala122至Ser，已知在大肠杆菌ALS同功酶Ⅱ和酵母ALS中是可行的;Ala122至Val，已知在大肠杆菌同功酶Ⅱ和酵母ALS中是可行的;Ala122至Pro，已知在酵母ALS中是可行的;Pro197至Ser，已知在酵母ALS和大肠杆菌ALSⅡ中是可行的;Pro197至Ala，已知在烟草SURB-Hra基因编码的ALS中是可行的;Lys256至Glu，已知在酵母ALS中是可行的;Asp384至Val，已知在酵母ALS中是可行的;Trp591至Leu，已知在酵母ALS和由烟草SURB-Hra基因编码的ALS中是可行的。通过结合上述突变，已经得到一些导致两个氨基酸置换的双突变，例如Ala122至Ser和Pro197至Ser，或Ala122至Ser和Pro197至Ala，或Pro197至Ala和Trp591至Leu，或Pro197至Ser和Trp591至Leu。这些突变是在包括ALS编码序列5′方向（上游）仅仅约180bp和3′方向（下游）仅仅约600bp的DNA片段中完成的。这些DNA片段通过转化作用导入烟草中。除莠剂抗性未在这些转化体中得到表达。相信与SURA-C3突变基因的编码区一起使用足以用来表达除莠剂抗性的调控序列，即编码区5′方向（上游）的2.5kb和3′方向（下游）的1.8kb，将导致SURA编码区中所有的定位突变表达除莠剂抗性。

在甜菜ALS基因中也完成了可望编码抗除莠剂ALS的定位突变。这些突变导致下列氨基酸置换：Ala122至Pro，已知在酵母ALS中是可行的;Pro197至Ala，已知在烟草SURB-Hra基因编码的ALS中是可行的;Trp591至Leu，已知在酵母ALS和烟草SURB-Hra基因编码的ALS中是可行的;Pro197至Ala和Trp591至Leu的双突变体，已知在烟草SURB-Hra基因编码的ALS中是可行的。

本发明的核酸片段一般可直接导入植物中，或以含有所需核酸片段的核酸构建体导入植物中。核酸构建体可从细菌质粒或噬菌体产生、从Ti或Ri质粒产生、从植物病毒或从自我复制的序列产生。将核酸片段导入植物细胞的优选方法包括利用含有核酸片段的根癌农杆菌（Agrobacterium    tumefaciens），此DNA片段位于卸甲的Ti质粒（即去除了产生肿瘤基因的Ti质粒）的T-DNA边界之间，或位于带有Vir功能的Ti质粒反式双载体的T-DNA边界之间。可通过如茎或叶圆片等组织分离块接种农杆菌以转化植物，或通过农杆菌与植物原生质体共培养进行转化。导入本核酸片段的另一种较好的方法包括将片段或含有片段的载体直接导入植物原生质体或细胞中，导入过程中可利用或不利用电穿孔、聚乙二醇或其它已知改变膜对大分子透性的试剂或方法的帮助。

本发明的核酸片段可用来转化很大范围的高等植物的原生质体或细胞培养物，以形成本发明的植物组织培养物。这些物种包括双子叶植物烟草、矮牵牛、棉花、甜菜、土豆、番茄、莴苣、甜瓜、向日葵、大豆、油菜和其它芸苔属植物及杨树;还包括单子叶植物玉米、小麦、水稻、多花黑麦草（Lolium    multiflorum）和天门冬（Asparagus    officinalis）。可望所有原生质体产生的植物细胞系都能用本发明的片段进行稳定转化。

本发明的核酸片段也可导入植物细胞继而形成本发明的转化植株。完整植株的转化已完成;外源基因可在能再生完整植株的阶段导入其细胞以实现转化。在本发明中，转化植物包括单子叶和双子叶植物。转化植物从下列一组植物中优选：烟草、矮牵牛、棉花、甜菜、土豆、番茄、莴苣、向日葵、大豆、油菜和其它芸苔属植物、杨树、苜蓿、三叶草、甘蔗、大麦、燕麦和黍。参见“Handbook    of    Plant    Cell    Culture”Vols.1-3，Evans，D.A.et    al.，Sharp    et    al.，and    Ammirato    et    al.，MacMillan，N.Y.（1983，84）。转化植物最好是从下列一组植物中选出：烟草、矮牵牛、土豆、番茄、向日葵、甜菜、苜蓿、莴苣或芸苔属植物。随着组织培养和转化方法的改善，以及可得到的选择标记的出现（如本发明的片段，参见下面的讨论），可以导入外源基因的作物种的范围可望迅速扩大。

用已知的高水平和（或）组织专一性表达的合成或天然序列，取代核苷酸片段的天然调节序列（5′和3′至ALS编码序列），可以进一步提高本发明核酸片段的表达水平。也可用其它编码转移肽的合成或天然序列置换本发明核酸片段的核苷酸序列，这些转移肽将使本发明的核酸片段有效进入叶绿体。

本发明的核酸片段也可用作植物遗传研究和植物细胞转化的选择标记。一种通常赋予某种有用农艺性状（如抗病害）的有益基因，能导入与本发明的核酸片段进行了物理连锁的敏感性植物细胞群体中。然后使细胞在含有除莠剂的培养基上生长，本发明片段编码的ALS对此除莠剂具有抗性。存活的（转化的）细胞不仅可假定获得了除莠剂抗性表型，还获得了由有益基因赋予的表型。核酸片段可通过克隆载体导入，例如噬菌体和质粒、植物病毒等，也可直接导入核酸。其次，在育种计划中，通过常规的遗传杂交法将有益的农艺性状导入不同的栽培品种中，可应用很容易检测的与之连锁的除莠剂抗性表型这一遗传标记进行选择。

本发明的转化植物对许多磺酰脲、***嘧啶磺胺和咪唑啉酮除莠剂具有抗性。这些除莠剂公开于下列专利和公开的专利申请中。

磺酰脲

U.S.4，127，405    U.S.4，383，113

U.S.4，169，719    U.S.4，394，153

U.S.4，190，432    U.S.4，394，506

U.S.4，214，890    U.S.4，420，325

U.S.4，225，337    U.S.4，452，628

U.S.4，231，784    U.S.4，481，029

U.S.4，257，802    U.S.4，586，950

U.S.4，310，346    U.S.4，435，206

U.S.4，544，401    U.S.4，514，212

U.S.4，435，206    U.S.4，634，465

EP-A-204，513

***嘧啶磺胺

南非申请84/8844（85.5.14.出版）

咪唑啉酮

US4，188，487

EP-A-41，623（81.12.16.出版）

本发明的核酸片段编码的ALS抗下列磺酰脲除莠剂及它们的适于农业使用的盐类：

R₁是Cl、Br、NO₂、C₁-C₄烷基、C₂-C₄烯烃基、CF₃、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄卤代烷氧基、C₃-C₄烯烃氧基、C₂-C₄卤代烯烃氧基、C₃-C₄炔氧基、CO₂R₉、CONR₁₀R₁₁、S（O）mR₁₂、OSO₂R₁₂、苯基、SO₂N（OCH₃）CH₃、SO₂NR₁₀R₁₁，

R₂是H，Cl，Br，F，CH₃，NO₂，SCH₃，OCF₂H，OCH₂CF₃或OCH₃;

R₃是Cl，NO₂，CO₂CH₃，CO₂C₂H₅，SO₂N（CH₃）₂，SO₂CH₃或SO₂C₂H₅;

R₄是C₁-C₃烷基，Cl，Br，NO₂，CO₂R₉，CON（CH₃）₂，SO₂N（CH₃）₂，SO₂N（OCH₃）CH₃或S（O）mR₁₂;

R₅是C₁-C₃烷基，C₄-C₅环烷羰基，F，Cl，Br，NO₂，CO₂R₁₄，SO₂N（CH₃）₂，SO₂R₁₂或苯基;

R₆是H，C₁-C₃烷基或CH₂C＝CH₂;

R₇是H，CH₃，OCH₃，Cl或Br;

R₈是H，F，Cl，Br，CH₃，OCH₃，CF₃，SCH₃，或OCF₂H;

R₉是C₁-C₄烷基，C₃-C₄烯烃基或CH₂CH₂Cl;

R₁₀是H或C₁-C₃烷基;

R₁₁是H或C₁-C₂烷基;

R₁₂是C₁-C₃烷基;

R₁₃是H或CH₃;

R₁₄是C₁-C₃烷基或CH₂CH＝CH₂;

m是0，1，或2;

n是1或2;

Q是CH₂，CHCH₃或NR₁₅;

R₁₅是H或C₁-C₄烷基;

P是O或CH₂;

R₁₆是H或CH₃;

R₁₇是C（O）NR₁₈R₁₉;

R₁₈是H或CH₃;

R₁₉是CH₃;

R₂₀是H，Cl，F，Br，CH₃，CF₃，OCH₃，或OCF₂H;

R₂₁是H或CH₃;

X是CH₃，OCH₃，OC₂H₅或NHCH₃;

Y是CH₃，C₂H₅，OCH₃，OC₂H₅，OCF₂H，OCH₂CF₃，Cl，CH₂OCH₃或环丙基;

Z是CH或N;

规定：

a）如果Y是Cl，则Z是CH，X是OCH₃;

b）如果Y是OCF₂H，则Z是CH;

c）如果J是J-1，R₁是OSO₂R₁₂或苯基，则Y不是OCF₂H;

d）如果J是J-2，则Y不是OCF₂H或OCH₂CF₃;

e）如果J是J-3，R₄是S（O）mR₁₂，则Y不是OCH₂CF₃。

ALS对其特别具有抗性的磺酰脲除莠剂包括

1）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-1;

R₁是Cl，CH₃，C₁-C₄烷氧基，C₁-C₂卤代烷氧基，烯丙氧基，丙炔氧基，CO₂R₉，CONR₁₀R₁₁，SO₂N（OCH₃）CH₃，SO₂NR₁₀R₁₁，S（O）mR₁₂，OSO₂R₁₂，苯基或

2）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-2;

R是H;

R₃是SO₂N（CH₃）₂，CO₂CH₃或CO₂C₂H₅。

3）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-3;

R是H;

R₄是CO₂CH₃或CO₂C₂H₅;

4）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-4;

R是H;

R₅是Cl，Br，CO₂CH₃，CO₂C₂H₅或

R₆是CH₃;

R₇是H，Cl或OCH₃;

5）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-5;

R是H;

R₅是CO₂CH₃或CO₂C₂H₅;

R₇是H或CH₃。

6）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-6;

Q是CHCH₃或NR₁₅;

R是H;

R₈是H，F，Cl，CH₃，OCH₃，CF₃或SCH₃。

7）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-7;

R是H;

P是O;

R₈是H，F，Cl，CH₃，OCH₃，CF₃或SCH₃。

8）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-8;

R是H;

R₁₆是CH₃;

R₈是H，F，Cl，CH₃，OCH₃，CF₃或SCH₃。

9）式Ⅰ的化合物，其中

J是J-9;

R是H;

R₁₇是C（O）N（CH₃）₂。

10）式Ⅰ的化合物，其中

R是H;

R₁是Cl，C₁-C₄烷氧基，OCF₂H，OCH₂CH₂Cl，CO₂R₉，CON（CH₃）₂，SO₂N（CH₃）₂，SO₂R₁₂或OSO₂R₁₂;

R₂是H，Cl，CH₃，或OCH₃。

本发明的核酸片段编码的ALS抗下列***嘧啶磺胺：

Ⅱ

其中

Ar是

R_a是C₁-C₄烷基，F，Cl，Br，I，NO₂S（O）_pR_d，COOR_e或CF₃;

R_b是H，F，Cl，Br，I，C₁-C₄烷基或COOR_e;

R_c是H，C₁-C₄烷基，F，Cl，Br，I，CH₂OR_d，苯基，NO₂或COOR_e;

R_d是C₁-C₄烷基;

R_e是C₁-C₄烷基，C₁-C₄烯烃基，C₁-C₄炔烃基，或2-乙氧乙基;

V是H，C₁-C₃烷基，烯丙基，炔丙基，苯甲基或C₁-C₃烷基羰基;

X₁，Y₁和Z₁是H，F，Cl，Br，I，C₁-C₄烷基，C₁-C₂烷硫基或C₁-C₄烷氧基;

p是0，1或2。

ALS对其尤其具有抗性的***嘧啶磺胺除莠剂包括

1）式Ⅱ的化合物，其中

V是H。

2）选取1的化合物，其中

X₁是H或CH₃;

Y₁是H;

Z₁是CH₃;R_a和R_c不同时是H。

本发明的核酸片段编码的ALS抗下列咪唑啉酮：

R_f是C₁-C₄烷基;

R_g是C₁-C₄烷基或C₃-C₆环烷基;

A₁是COOR_i，CH₂OH或CHO;

R_i是H;由C₁-C₃烷基，C₃-C₆环烷基或苯基任意取代的C₁-C₁₂烷基;由苯基或1-2个C₁-C₃烷基，F，Cl，Br或I任意取代的C₃-C₅烯烃基;或由苯基或1-2个C₁-C₃烷基，F，Cl，Br或I任意取代的C₃-C₅炔烃基;

B是H，由Cl，NO₂或OCH₃任意取代的C（O）C₁-C₆烷基或C（O）苯基;

X₂是H，F，Cl，Br，I，OH或CH₃;

Y₂和Z₂分别是H，C₁-C₆烷基，C₁-C₆烷氧基，F，Cl，Br，I，苯基，NO₂，CN，CF₃或SO₂CH₃;

X₃是H，C₁-C₃烷基，F，Cl，Br，I或NO₂;

L、M、Q和R_h分别是H，F，Cl，Br，I，CH₃，OCH₃，NO₂，CF₃，CN，N（CH₃）₂，NH₂，SCH₃或SO₂CH₃，规定M或Q中只有一个可以是不是H，F，Cl，Br，I，CH₃或OCH₃的取代基。

ALS对其尤其具有抗性的咪唑啉酮除莠剂包括

1）式Ⅲ的化合物，其中

B是H;

A₁是COOR_i。

2）较好的化合物1，其中

R_f是CH₃;

R_g是CH（CH₃）₂;

X₂是H;

Y₂是H，C₁-C₃烷基或OCH₃;

Z₂是H;

X₃是H，CH₃，Cl或NO₂;

L、M、Q和R_h是H。

上述化合物中的任何一种可以在出芽之前和（或）之后单独或结合使用于田间。由于作物本身是抗除莠剂的，所以可根据控制不需要植物的效果来选择除莠剂的活性谱。

下述实例进一步阐述本发明，除非特别指出，其中所有的份和百分比都是指重量，温度为摄氏。应当理解这些实例是仅作为说明给出的，指出本发明较好的具体方案。从上述公开和这些实例，熟练的技术人员能够确定本发明的实质特征，并在不偏离本发明要旨和范围的情况下，能够对本发明作出各种改变和修饰，以使它适应于各种应用和条件。

实例1

根据Dunsmuir et al.（J.Mol.Appl.Genetics 1983，2：285），从Hra突变株制备烟草（Nicotianatabacum cv.Xanthi）DNA。从植株上取下2×13g 1-2吋的烟草叶片，立即用研钵和杵于冷室中在2×20ml缓冲液A（10mM Tricine-KOH pH 7.6，1.14M蔗糖，5mM MgCl₂，5mM2-巯基乙醇）中研碎。另外加入40-50ml缓冲液A，用16层粗纱布过滤匀浆。滤液用Sorvall GSA转子于4℃下以2500rpm离心5分钟。沉淀再悬浮于10ml缓冲液A中，再混入100ml缓冲液A，按上述条件离心细胞。然后，沉淀再悬浮于100ml缓冲液A+0.4%Triton X-100中，置于冰上10分钟后如上述离心。用后一种缓冲液洗涤沉淀两次以上。最终的沉淀再悬浮于5ml再悬浮缓冲液（50mM Tris-HCl pH8，20mM EDTA）中，加入1ml再悬浮液缓冲液和10%Sarkosyl，然后用再悬浮缓冲液调整体积至10ml。向溶解产物中加入蛋白酶K至100μg/ml，使溶解产物于37℃消化过夜。然后溶解产物中加入密度为1.55g/ml的CsCl，和最终浓度为300μg/ml的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。溶液在Beckman    Ti    70.1转子中于15℃下以40000rpm离心24小时，用长波紫外光显现后取出DNA荧光带。为了取出DNA，用18号标准针在异质同晶聚合物管的侧面打孔，使粘性DNA滴入收集管中。在细胞溶解后的所有步骤中要格外小心，防止DNA的剪切。小心地使DNA再悬浮于密度为1.55g/ml的CsCl溶液和300μg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓中，在Sorvall    TFT    65.13转子中于15℃下以40000rpm离心48小时。再次在管的侧面打孔以收集DNA。轻轻地用TE（10mM    Tris-HCl    pH8，1mM    EDTA）饱和异戊基乙醇提取10次，然后在TE中充分透析。

此处所用的常规的DNA重组和分子克隆技术见于R.W.Davis，D.Botstein    and    J.R.Roth，Advanced    Bacterial    Genetics，Cold    Spring    Harbor    Laboratory，Cold    Spring    Harbor，NY（1980）和T.Maniatis，E.F.Fritsch    and    Sambrook，Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual，Cold    Spring    Harbor    Labora-tory，Cold    Spring    Harbor，NY（1982）。

根据Maniatis等人的方法（见上）建立烟草DNA文库。用限制性酶Sau3A消化烟草DNA，由琼脂糖凝胶电泳检测，产生的大部分片段的大小在20kb的范围。此片段加到10-40%蔗糖（在1M    NaCl，20mM    Tris    pH8，1mM    EDTA中）梯度上，在Beckman    SW28型转子中于17℃下以26000rpm离心16小时以进行大小的分部分离。收集蔗糖梯度中的组分，进行琼脂糖凝胶电泳分析，含有大小为20kb范围片段的组分在TE中透析，并用乙醇沉淀。然后，它们以2∶1的摩尔比例与BamHⅠ切割的λ噬菌体EMBL3的臂连接，并包装进λ噬菌体头部，根据λ臂和包装反应的生产厂家提供的说明进行（Stratagene    Cloning    Systems，San    Diego，CA）。

将400000个噬菌体的烟草DNA文库涂布在10个平皿的宿主菌株大肠杆菌LE392上（Silhavy，T.J.，Berman，M.L.and Enquist，L.W.（1984），“Experiments with Gene Fusions”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.），密度为每个150mm培养皿50000个噬菌体。根据Maniatis等人的方法用双份硝化纤维素滤器吸印噬菌斑，并与³²P标记的探针杂交，该探针携有在核糖探针标记***中产生的5′或3′ALS基因片段。核糖探针根据Promega Biotech公司（Madison，WI）出售的核糖探针药盒附带的说明进行合成。挑出来自两套滤器并在胶片上产生阳性信号的噬斑，重复纯化过程，直至获得分离得很好的杂交噬菌斑为止。

通过限制性酶消化，分析来自噬菌斑纯化的噬菌体的DNA微量制备物。如图1所示，分辨出两类克隆的烟草DNA插段。噬菌体1、2、17和18含有与前面从SURA位点分离的ALS基因有关的插段，它编码除莠剂敏感性ALS。噬菌体3含有与上述不同的插段，它可能含有编码抗除莠剂ALS的SURB-Hra基因。将包围噬菌体3杂交区的EcoRI片段再克隆到M13噬菌体载体中，并进行DNA序列分析，用寡核苷酸在重迭区段扩展已测定序列的区域。发现一个单一的1992个核苷酸的开放读码，将它的推测氨基酸序列与其它种ALS蛋白氨基酸序列的保守区相比较，发现它是一个ALS基因。

从抗除莠剂的烟草Hra突变株中分离的ALS基因，利用根癌农杆菌通过“双载体”***导入敏感型烟草细胞中。ALS基因首先通过质粒结合导入根癌农杆菌中的双载体中，然后用人工操作组成的根癌农杆菌通过共培养用外源基因转化植物细胞。

A.将分离出的烟草ALS基因导入根癌农杆菌中：

1）双载体的构建：此处所用的常规的DNA重组和分子克隆技术见于R.W.Davis，D.Botstein    and    J.R.Roth，Advanced    Bacterial    Genetics，Cold    Spring    Harbor    Laboratory，Cold    Spring    Harbor，NY（1980）和T.Maniatis，E.F.Fritsch    and    Sambrook，Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual，Cold    Spring    Harbor    Laboratory，Cold    Spring    Harbor，NY（1982）。本发明纯化的8.3kb    SpeⅠ核酸片段是从Hra烟草突变株分离到的，它含有除莠剂抗性形式ALS基因的编码序列，将它***质粒载体pMuc19的XbaⅠ位点中（J.D.G.Jones，P.Dunsmiur    and    J.Bedbrook，EMBO    Journal    4：2411-2418（1985））。（虽然，SpeⅠ和XbaⅠ限制性酶识别的DNA序列不同，但它们的消化产物携有同样的5′伸出序列）。通过限制性酶分析，确定了所得到的一个质粒PAGS148中***片段的定向（图2）。

用双载体pAGS135将质粒pAGS148移入根癌农杆菌中。质粒pAGS135是从质粒pAGS112（P.Van  den    Elzen，K.Y.Lee，J.Townsend    and    J.Bedbrook，Plant    Mol.Biol.，5：149-154（1985））中产生的，用限制性核酸内切酶XhoⅠ消化质粒pAGS112的DNA，用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段处理，使DNA进行自身连接以消除T-DNA右边界外的XhoⅠ位点。质粒pAGS112是从广宿主载体pLAFR（A.M.Friedman，S.R.Long，S.E.Brown，S.E.Buikema    and    F.M.Ausubel，Gene，18：289-296，（1982），经***一个EcoRⅠ片段而产生的，此片段中，T-DNA左右边界邻接一个在植物中表达卡那霉素抗性的基因和一个用于克隆的单个BamHⅠ位点（Van    den    Elzen    et    al.，Plant    Mol.Biol.，5：149-154（1985））。用BamHⅠ消化CsCl纯化的质粒pAGS148和pAGS135，使所得到的BamHⅠ切割的质粒连接。连接混合物被离体包装进λ噬菌体颗粒中，并用于感染大肠杆菌HB101菌株。在氨苄青霉素上选择转化体。通过限制性分析，测定了一个转化体中的重组质粒pAGS152的物理图谱，见图2所示。

2）来自大肠杆菌的质粒pAGS152结合进根癌农杆菌中：基本上根据Ruvkun，G.and    Ausubel，F.M.，Nature，289：85-88（1981）的三交法，将质粒pAGS152通过结合作用导入根癌农杆菌中。使携有质粒pAGS152的大肠杆菌HB101菌株和携有运动载体pRK2013的大肠杆菌HB101菌株（ATCC37159）（D.Figurski    and    D.R.Helinski，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：1648-1652（1979））与携有质粒pAL4404的根癌农杆菌LBA4404菌株（A.Hoekema，P.R.Hirsch，P.J.J.Hooykaas    and    R.A.Schilperoort，Nature，303：179-180（1983））混合，使其在LB固体培养基（J.H.Miller，Experiments    in    Molecular    Genetics，Cold    Spring    Harbor    Laboratory，Cold    Spring    Harbor，NY（1972））上于28℃接合16小时。在含有100mg/L利福平和1mg/L四环素的平皿上选择转移结合体。根癌农杆菌LBA4404：pAGS152在含1mg/L四环素的基本培养基A上再次划线培养。

利用基本上相同的方法，得到含有质粒pAGS112（没有任何植物核酸插段的双载体）的根癌农杆菌LBA4404和含有质粒pAGS145（含有来自噬菌体克隆1的核酸片段的双载体）的根癌农杆菌LBA4404。后一片段也是从Hra烟草突变株分离到的，它携有除莠剂敏感型ALS的基因;此基因不是本发明核酸片段中抗除莠剂ALS的野生型等位基因，而是第二基因座位的SURA基因。

B.通过植物细胞与根癌农杆菌LBA4404（pAGS145）和LBA4404（pAGS152）的共培养，将分离的ALS基因导入敏感性烟草中。

无菌培养基和植物材料的所有操作都在合适的防护条件下，在层流通风橱中进行。植物的生长和植物细胞的培养均在27℃下进行。除非另外指出，所有原生质体的操作都在室温下进行。

第1天（下午）：

原生质体分离培养基是在K3/S（1）培养基中加入下列物质制备的：0.1%（w/v）MES缓冲液（Sigma化学公司），1%（w/v）纤维素酶（Onozuka或Cellulysin），0.1%离析酶（Onozuka）。轻轻搅动大约30分钟后，用KOH将pH调至5.6，使培养基过滤灭菌。

在Magenta培养箱中，在OMS培养基上用1cm顶端或辅助外植体培养无菌烟草（Nicotiana    tabacum    var.Wisconsin    38）植株，给予16小时光周期（6，000-8，000勒克司）和8小时的光暗周期。植物5-7周龄后，取下完全展开的叶片（从顶端向下第3-6叶），每两片叶子上表面向下放在100×25mm培养皿的20ml原生质体分离培养基中。然后浸没叶片并用锋利的外科刀片切得很细。抓住中脉，由此向叶片边缘以大约2mm间隔向外切割。然后用帕拉胶膜密封培养皿，使浸软的组织在暗中于27-29℃保温过夜（14-17小时），并轻轻地旋转搅动（20-25rpm）。

第2天（上午）：

将衬有4层粗纱布的75mm过滤漏斗固定在环架上。用乳胶管将一玻璃管（约15cm长，外径小于5mm）与漏斗相连。漏斗、粗纱布、乳胶和玻璃管用铝箔包裹后作为一个整体在高压灭菌器中灭菌。

将玻璃管置入具刻度的瓶中，粗纱布用K3/S（1）介质湿润。把两个培养皿中消化好的叶组织小心倒入漏斗中。洗涤粗纱布并将水挤入瓶中。装有液体的瓶加上一层K3/S（1）介质，用铝箔盖住，以大约100xg离心10分钟。用1ml血清吸液管收集漂浮的原生质体（1-2ml），置入另一具刻度瓶中的20mlK3/S（1）介质中。轻轻搅动使原生质体再悬浮，然后该具刻度瓶如前述加上介质进行离心。如上所述，收集漂浮的原生质体（1-2ml），置入30mlK3/G（1）培养基中。用血细胞计数器对原生质体计数，把体积调整为1×10⁺⁵原生质体/ml。取5ml等分的原生质体浮在培养皿上〔100×20mm组织培养皿（Corning）;后面所有的原生质体操作都使用这种培养皿〕在暗中培养。

第2天（下午）：

将基本平皿A上生长的含有所需的植物转化载体pAGS112（上述质粒载体）、pAGS152（含有本发明的核酸片段）或pAGS145（含有编码敏感型ALS的核酸）的单菌落根癌农杆菌接种入18mm试管中的5ml基本培养基A中，并在40-60rpm的旋转鼓上于27-28℃培养过夜。

第3天（上午）：

在550nm处测量根癌农杆菌培养物的光密度，并用基本培养基A将光密度调整至0.15，按上述条件让细菌继续生长。

第3天（下午）：

稀释后大约6小时，根癌农杆菌培养物的光密度（550nm处）为0.6（对数期培养物），此时，将细菌加入植物细胞中，倍数大约为50个细菌/植物细胞（550nm处的光密度1.0＝1.4×10⁹细菌）。细菌和植物细胞混合物于24℃和低光强（约500勒克司）下共培养66小时。未转化的原生质体对照进行类似的保温，只是不加入农杆菌。每一种共培养（不同农杆菌的转化细胞，以及未转化的细胞）按下列程序进行。

第6天（上午）：

在5ml共培养混合物中，加入20mlK3/G（2）培养基与培养基C1∶1的混合物以终止共培养，培养基C中加有500mg/L的Cefotaxime（对农杆菌的选择）。用5或10ml血清吸液管小心地搅拌，使共培养细胞充分地再悬浮在新培养基中。细胞密度为2×10⁴等价原生质体/ml（等价原生质体＝假定100%回收和存活的最初的原生质体），渗压剂为0.35M。每种培养物取三个5ml等份分装于新的培养皿中。

从此时直至将细胞包埋入固体培养基之前，细胞在静止状态下培养在低光强（500-1500勒克司）下，并在无菌条件下转移到不同培养基中。在指定的时间，把每种培养物一个平皿上的细胞转移到非选择性培养基中，而把每种培养物其它两个平板上的细胞转移到选择性培养基中，该培养基含有50mg/L卡那霉素或2ng/ml    CS，以选择转化的植物细胞。进行这些转移时，用5ml血清吸液管收集每个平皿上的细胞，分别置入15ml的圆锥形聚苯乙烯离心管中，以大约50xg离心5-10分钟。用吸液管取出上清液，不要搅动松散的沉淀物。然后，将来自每个平皿的共培养细胞沉淀小心地再悬浮于合适的新鲜培养基中。

第10天：

将未被选中的植物细胞转移入5ml加有500mg/L    Cefotaxime的培养基C中，而将选中的细胞转移入5ml加有500mg/L    Cefotaxime和50mg/L卡那霉素或2ng/ml    CS的培养基C中。把这些培养物的每一种都放回取出它们的培养皿中，用这种办法不是所有细胞都需要沉淀，使得培养基交换时细胞损失最小。

第13天：

未被选择的细胞转移入20ml培养基C：附加500mg/L Cefotaxime的培养基MSP为3∶1的混合物中，取5ml置于新的培养皿中（密度为5×10³等价原生质体/ml）。被选择的细胞再悬浮于5ml培养基C：培养基MSP为3∶1的混合物中，培养基MSP中加有500mg/L Cefotaxime和50mg/L卡那霉素或2ng/ml CS，然后将细胞悬浮物放回原来的平皿以进一步培养。

第16-17天：

对于未被选择的植物细胞，将其转移至5ml培养基C和培养基MSP（仅加有500mg/L    Cefotaxime）1∶1的混合物中，对于被选择的细胞，培养基MSP中加有500mg/L的Cefotaxime和50mg/L卡那霉素或2ng/ml    CS，如前所述进行培养。

第20天：

未被选择的细胞转移至25ml培养基C：培养基MSP为1∶1的混合物中，然后再将混合物加入25ml2倍MSP培养基与1%（w/v）Ⅶ型琼脂糖溶液1∶1的混合物中（50℃）。用25ml大口血清吸液管迅速搅拌得到的培养物，以5ml等分分配于新的培养皿中。琼脂溶液中悬浮的微型愈伤组织通过手的小心抖动均匀地铺在平皿上。盖上平皿，在通风橱中放1小时使其固化，用帕拉胶膜包裹好后移入培养箱中。细胞密度大约为5×10²等价原生质体/ml，渗压剂为0.15M。大约10天以后，在菌落计数器上计数包埋的细胞（下面的表1和表2）。

选择的细胞转移至20ml培养基C：含有50mg/L卡那霉素或2ng/ml CS的培养基MSP为1∶3的混合物中。每种选择培养物的再悬浮培养液（5×10⁺³等价原生质体/ml）取5ml等分分配于4个新培养皿中，如前述培养。

第23-24天：

被选择细胞的每个5ml培养物用7.5ml培养基MSP（加有50mg/L卡那霉素或2ng/ml CS）稀释，使细胞密度达到2×10⁺³等价原生质体/ml。这种调整过密度的培养物与12.5ml2倍MSP培养基和1.0%（w/v）Ⅶ型琼脂糖溶液（50℃）（加有50mg/L卡那霉素或2ng/ml CS）1∶1的混合物混合。混合的培养物迅速用25ml大口血清吸液管取5ml等分分配于新培养皿中。最终的铺开密度为1×10³等价原生质体/ml，培养物的渗压剂为0.1M。如前述使平皿固化。大约10天以后，用菌落计数器计算生长的包埋细胞的数目。

第25+天：

用11号解剖刀挑出10至12个单个的转化愈伤组织/菌落，并转移至含有MSR培养基的培养皿中，其中有或没有植株再生的合适的选择性试剂。于27℃下培养愈伤组织，光期为16小时（5000-8000勒克司），暗期为8小时。2-3周以后出现苗，继续生长几个月。用锋利的外科刀片切下2-3mm长的苗，转移至OMS培养基在Magenta培养箱中生根。

形成根以后（1-4周），根据R.S.Chaleff    and    M.F.Parsons，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：5104（1978）以及B.Tisserat    in    Plant    Cell    Culture：A    Practical    Approach，Ed.Dixon，R.A.，IRL    Press，Oxford（1985）的方法，将植株转移到土壤中再生。

共培养的结果：

共培养实验的结果表明，本发明的核酸片段（不是除莠剂敏感型ALS的烟草SURA基因）导入除莠剂敏感性烟草细胞中后赋予其除莠剂抗性（下面的表4和表5）。由于本发明的核酸片段以任一方向导入载体都能以相似的频率赋予其除莠剂抗性，所以相信它在编码序列的5′和3′端都含有除莠剂抗性ALS基因的表达所需的调控序列。

用pAGS152转化的抗2ppbCS的烟草细胞和非共培养的野生型烟草细胞各取100个菌落，涂布在不同浓度的CS上，以测定本发明核酸片段赋予的除莠剂抗性的水平。一个月以后，对在不同浓度CS上活跃生长的菌落进行计数（下面表6）。野生型菌落对2ppbCS敏感，但与含有pAGS152的根癌农杆菌共培养产生的菌落却能够耐受高达2000ppb的CS。转化体的这一抗性水平，可与从中分离出本发明核酸片段的抗除莠剂的Hra烟草突变株相比较，而且比抗除莠剂的S4烟草突变株（Hra的亲本）的水平高出大约10倍。

表4.将噬菌体克隆1的DNA转入敏感性烟草细胞

共培养一个月后，来自10⁵个等价原生质体中菌落形成

单位的数目

N.t.¹N.t./p145²

无选择 3.5×10⁴3.6×10⁴

50μg/ml卡那霉素 0 5.9×10²

2ng/ml    CS    0    0

1.没有共培养的（对照）植物细胞。

2.与含有pAGS145的根癌农杆菌共培养的植物细胞，pAGS145是卡那霉素抗性载体，含有来自噬菌体克隆1的除莠剂敏感性烟草ALS基因。

表5.将噬菌体克隆了的DNA转入敏感型烟草细胞

共培养一个月后，来自10⁵个等价原生质体的菌落形成单位

的数目

N.t.¹N.t./p112²N.t./p152³

无选择 2.0×10⁴2.0×10⁴1.6×10⁴

50μg/ml卡那霉素 0 2.5×10³6.2×10²

2ng/ml CS 0 0 6.5×10²

1.没有共培养的（对照）植物细胞。

2.与含有pAGS    112（卡那霉素抗性载体）的根癌农杆菌共培养的植物细胞。

3.与含有pAGS    152（含有噬菌体克隆了的卡那霉素抗性载体）的根癌农杆菌共培养的植物细胞。

表6.用突变体ALS基因转化的烟草（栽培品种W    38）细胞的CS抗性水平

在选择性培养基上一月后活跃生长的菌落数目¹

CS（ppb） 烟草²（N.Tabacum） 烟草（N.Tabacum）/

突变体ALS基因³

0    100    100

20    0    100

50    0    100

200    0    100

500    0    100

2000    0    99

20000 N.D.⁴6

50000 N.D.⁴0

1.每个CS浓度涂布100个菌落。

2.从没有共培养的（对照）植物细胞产生的菌落。

3.从与含有pAGS    152的根癌农杆菌共培养、最初以2ppb    CS抗性选择出来的植物细胞产生的集落。

4.未测定。

烟草培养基

K₃培养基

组分    母液    最终浓度    量/升

K₃主要盐类 10x 100ml

CaCl₂·2H₂O 100x 10ml

Fe    EDTA    100x    10ml

维生素B5    100x    10ml

MS次要盐类Ⅰ    1000x    1ml

MS次要盐类Ⅱ    1000x    1ml

葡萄糖或蔗糖    -    0.4M    72.08或136.8gm

K₃/S（1）-蔗糖，植物激素***1（高浓度）

K₃/G（1）-葡萄糖，植物激素***1（高浓度）

K₃/G（2）-葡萄糖，植物激素***2（低浓度）

1-NAA    3.0mg/L    2-NAA    0.1mg/L

BAP    1.0mg/L    BAP    0.1mg/L

pH调至5.7，过滤灭菌，5℃下保存。

C培养基

组分    母液    最终浓度    量/升

C培养基主要盐类    10x    100ml

Fe    EDTA    100x    10ml

维生素B5    100x    10ml

MS次要盐类Ⅰ    1000x    1ml

MS次要盐类Ⅱ    1000x    1ml

甘露醇    0.2M    36.44gm

蔗糖    0.1M    34.2gm

Mes缓冲液    3.0mM    590mg

NAA    1mg/ml    0.1mg/L    100μl

BAP    1mg/ml    0.1mg/L    100μl

pH调至5.7，过滤灭菌，5℃下保存。

MSP培养基（用于细胞增殖）

组分    母液    最终浓度    量/升

MS主要盐类    10x    100ml

组分    母液    最终浓度    量/升

Fe    EDTA    100x    10ml

维生素B5    100x    10ml

MS次要盐类Ⅰ    1000x    1ml

MS次要盐类Ⅱ    1000x    1ml

蔗糖    0.1M    34.2gm

Mes缓冲液    3.0mM    590mg

NAA    1mg/ml    0.1mg/L    100μl

BAP    1mg/ml    0.1mg/L    100μl

pH调至5.7，过滤灭菌，5℃下保存。

MSR培养基（用于植株再生）

组分    母液    最终浓度    量/升

MS主要盐类    10x    100ml

Fe    EDTA    100x    10ml

维生素B5    100x    10ml

MS次要盐类Ⅰ    1000x    1ml

MS次要盐类Ⅱ    1000x    1ml

蔗糖    0.1M    34.2gm

Mes缓冲液    3.0mM    590mg

NAA    1mg/ml    0.1mg/L    100μl

BAP    1mg/ml    1.0mg/L    1.0ml

调pH至5.7，→加入琼脂

琼脂（T.C.）    0.8%（W/V）    8.0gm

高温灭菌

卡那霉素硫酸盐    50mg/ml    50μg/ml    1.0ml

或CS    1mg/ml    根据需要    -

（在5mM    KOH中）

分装到100×25mm培养皿中，每个25ml，如果需要，当培养基冷至50℃时无菌地加入选择试剂。

OMS培养基（用于植物维持生长）

组分    母液    最终浓度    量/升

MS主要盐类    10x    100ml

Fe    EDTA    100x    10ml

MS次要盐类Ⅰ    1000x    1ml

MS次要盐类Ⅱ    1000x    1ml

维生素B5    100x    10ml

蔗糖    3.0%W/V    30gm

Mes缓冲液    3.0mM    590mg

pH5.7，→加入琼脂

琼脂（T.C.）    0.8%（W/V）    8.0gm

高温灭菌，分装到3″×4″Magenta培养箱中，每个50ml。

基本培养基A

组分    母液    最终浓度    量/升

K₂HPO₄10.5g

KH₂PO₄4.5g

（NH₄）₂SO₄1.0g

柠檬酸钠·2H₂O 0.5g

以990ml高温灭菌

MgSO₄·7H₂O 1M 1mM 无菌加入1.0ml

葡萄糖    20%    无菌加入10.0ml

使培养基固化：分别以500ml体积使琼脂Difco    Bacto（15gm/L）高温灭菌，然后在分装前与盐类混合。

母液    组分    最终浓度    量/升

MS主要盐类（10x） NH₄NO₃20.6mM 16.5g

KNO₃18.8mM 19.0g

MgSO₄·7H₂O 1.5mM 3.7g

KH₂PO₄1.25mM 1.7g

CaCl₂·2H₂O 3.0mM 4.4g

C培养基主要盐类（10x） NH₄NO₃5.0mM 4.0g

KNO₃15.0mM 15.2g

MgSO₄·7H₂O 3.0mM 7.4g

KH₂PO₄0.5mM 0.68g

CaCl₂·2H₂O 3.0mM 4.4g

K培养基主要盐类（10x） KNO₃25.0g

（NH₄）₂SO₄1.34g

MgSO₄·7H₂O 2.5g

KH₂PO₄2.01g

NH₄NO₃2.5g

CaCl₂·2H₂O（100x） CaCl₂·2H₂O 92.3g

Fe-EDTA（100x） Na₂EDTA 3.73g

FeSO₄·7H₂O 2.78g

（加进FeSO₄之前使EDTA完全溶解，pH调至3.0）

MS次要盐类Ⅰ（1000x） H₃BO₃0.620g

MnCl₂·4H₂O 1.980g

ZnSO₄·7H₂O 0.920g

MS次要盐类Ⅱ（1000x）    KI    83mg

Na₂MoO₄·2H₂O 25mg

CuSO₄·5H₂O 2.5mg

CoCl₂·6H₂O 2.16mg

维生素B5（100x）    烟酸    0.1g

盐酸硫胺素    1.0g

盐酸吡哆醇    0.1g

肌肌醇    10.0g

NAA    萘乙酸    1mg/ml    1.0g

（溶于稀KOH中）

BAP    苄氨基嘌呤    1mg/ml    1.0g

（溶于稀HCl中）

辅助用品、化学试剂及培养基

MES缓冲液

（2〔N-吗啉代〕乙烷磺酸）    Sigma    M-8250号

低凝结温度Ⅶ型琼脂糖

（母液在50℃下维持熔化状态）    Sigma    A-4018号

Cellulysin（商品名）    Calbiochem    219466

Macerase（商品名）    Calbiochem    441201

Cefotaxime，钠盐    Calbiochem    219380

稀释W/g.d.，无菌水

5℃下、暗中，以50mg/ml母液保存10天以下

卡那霉素硫酸盐    Sigma    K-4000号

稀释W/g.d.，H₂O，过滤灭菌

-20℃下暗中，以50g/ml的母液保存

Chlorsulfuron    E.I.du    Pont    de

Nemours    and    Company，

Wilmington，Delaware

19898

100mm×20mm组织培养皿    Corning    25020

具刻度瓶    Kimble公司

离心机（适于具刻度瓶）    Damon/IEC

Division    HN-S    Ⅱ

Magenta培养箱3″×4″    Magenta公司

4149    W.Montrose    Ave

Chicago，IL    68641

T.C.琼脂    KC    Biological

CR-100实例2

如实例1所述，由C3突变株制备烟草DNA，在噬菌体载体EMBL 3中建立基因组DNA文库。如实例1通过与³²P标记的5′烟草ALS基因片段探针杂交，鉴定携有ALS基因的噬菌体。

从600，000个C3文库的重组体中，筛选分离出6个独立的重组噬菌体。用限制性核酸内切酶分析这些分离的噬菌体表明，三个噬菌体的DNA插段能与Hra文库的SURA基因连成一线（噬菌体35、36和38）。另外三个噬菌体（噬菌体31、34和37）均具有对应于SURB基因的DNA插段。期望噬菌体35、36和38携带的ALS基因是SURA-C3基因，编码抗除莠剂的ALS，而噬菌体31、34和37携带的ALS基因是SURB基因，编码对除莠剂敏感的ALS。

基本上根据实例1中所述的方法，将噬菌体31、35和38的DNA片段再克隆到pUC    119质粒中，然后再克隆到pAGS    135双载体中。噬菌体31的大约8.3Kb的限制性核酸内切酶SpeⅠ片段与pAGS    148（图2）中的相似，但所携有的SURB基因编码除莠剂敏感性ALS，将它以两种可能的定向再克隆到该载体中。噬菌体35的大约6.3Kb的限制性核酸内切酶SpeⅠ-SalⅠ片段和噬菌体38的大约7.8Kb的SpeⅠ-SalⅠ片段分别再克隆以产生pALS    35（ATCC＃    67424）和pALS    38。这些片段包括位于ALS编码区5′方向（上游）的2.5Kb，编码除莠剂抗性酶的2.0Kb的ALS编码序列，位于ALS编码区3′方向（下游）的分别为1.8和3.3Kb的片段。后两个亚克隆片段含有一个BamHI限制性核酸内切酶位点。用BamHI部分消化或pALS    35和pALS    38，将这些质粒***双载体pAGS    135的BamHI位点中。双载体中的ALS基因称为p312、p313、p351和p381（表7），如实例1所述，将它们通过三亲本接合移入根癌农杆菌中。

如实例1所述，通过植物细胞与在双载体中携有ALS基因的根癌农杆菌的共培养，将ALS基因导入对除莠剂敏感的烟草中。这些共培养实验的结果示于表7中。正如所期望的，从噬菌体31中分离的ALS基因即编码除莠剂敏感性ALS的SURB基因，没有产生抗除莠剂的植物细胞。从噬菌体35和38中分离的ALS基因，即编码抗除莠剂ALS的SURA-C3基因，确实产生了抗除莠剂的植物细胞。抗除莠剂植物细胞的出现频率比抗卡那霉素植物细胞的该频率低，并且比用SURB-Hra基因时所观察到的频率低。这可能反映了，SURA-C3基因编码的ALS酶与SURB-Hra基因编码的酶相比，对除莠剂的抗性较低，或者SURA-C3基因的表达效率比SURB-Hra基因的要低，或者二者皆有。

表7.ALS再导入实验3

将噬菌体克隆31、35和36的DNA转入敏感性烟草细胞

共培养一月后，来自10⁵个等价原生质体的菌落形成单位数

N.t.¹N.t./p152²N.t./p312³

无选择 2.1×10⁴1.5×10⁴1.1×10⁴

50μg/ml卡那霉素    0    88    65

2ng/ml    CS    0    83    0

表7（续）

N.t./p313⁴N.t./p351⁵N.t./p381⁶

无选择 1.9×10⁴1.5×10⁴1.4×10⁴

50μg/ml卡那霉素    48    139    87

2ng/ml    CS    0    32    18

1.没有共培养的植物细胞。

2.与携有pAGS    152（S4/Hra亚克隆）的根癌农杆菌共培养的植物细胞。

3.与携有pAGS    132（C3亚克隆，φ31，定向1）的根癌农杆菌共培养的植物细胞。

4.与携有pAGS    313（C3亚克隆，φ31，定向2）的根癌农杆菌共培养的植物细胞。

5.与携有pAGS    351（C3亚克隆，φ35）的根癌农杆菌共培养的植物细胞。

6.与携有pAGS    381（C3亚克隆，φ38）的根癌农杆菌共培养的植物细胞。

实例3

使烟草的野生型SURA基因进行离体突变，使它编码除莠剂抗性的ALS。将含有部分SURA基因的限制性核酸内切酶片段亚克隆到M13噬菌体载体或含有M    13复制起点的质粒载体中，使之产生单链DNA。亚克隆的特异DNA片段取决于需进行离体诱变的区域和可得到的限制性核酸内切酶位点。

合成长度为16-17碱基的寡核苷酸，它能与SURA    ALS基因的单链DNA杂交，但有一些单个碱基的错配。这些错配的碱基用来将野生型ALS基因中的氨基酸密码转换成编码抗磺酰脲除莠剂ALS酶的ALS基因中的密码。这些寡核苷酸包括5′GTTCAATTGGAGGATC    3′（使trp    591变成leu），5′GTCAAGTGGCACGTAGG    3′（使pro    197变成ala），5′GTCAAGTGTCACGTAGG    3′（使pro    197变成ser），5′ATGTACCTGAGGATATT    3′（使lys    256变成glu），5′GAGGTTTGTTGATAGAG    3′（使asp    384变成val），5′AGGTTTGAGGATAGAGT    3′（使asp    384变成glu），5′TACTGATGATTTTCAGG    3′（使ala    205变成asp），5′CAGGTGGCCCTTCCATG    3′（使ala    122变成pro）。

按Carter    et    al.（Oligonucleotide    site    dire-cted    mutagenesis    in    M13，Anglian    Biotechnolo-gy    Limited，England，1985）的程序，使寡核苷酸与单链DNA杂交，并用作引物合成互补链，由DNA聚合酶I的Klenow片段催化反应。得到的DNA转化到感受态大肠杆菌mut    L细胞中（Kramer    et    al.1984，Cell    38：879）。纯化单个的噬菌斑或菌落，取决于所用的是M    13噬菌体载体（M13    mp    18/19）还是M13复制起点的质粒载体（pTZ    18R/19R）。制备单链DNA的微型制备物，用于DNA序列分析的反应，以鉴定携有突变碱基的克隆。

这些离体构建的位点专一性突变能单独或结合起来掺入野生型SURA基因中，此基因包含植物细胞中表达基因所需的5′和3′调控序列（见实例2）。这一步可以这样完成：从携带SURA基因的质粒中去除相似的片段，再将携有突变的限制性核酸内切酶片段置换进去。用来置换的限制性片段的选择，取决于基因中的突变位置和可得到的限制性核酸内切酶位点。然后，根据实例1和2所述，将突变的SURA基因导入植物细胞中。通过这种方法，基本上能产生任何含有突变的DNA片段，它们导致本发明说明书中公开的抗除莠剂ALS的产生。而且，突变不一定要仅仅在SURA基因中产生。类似的突变能够在SURB基因中产生，或在任何其它编码ALS的植物基因中产生，只要能得到它的DNA序列就行。

实例4

如实例1所述，从甜菜（Beta vulgaris cv.Sennika）中制备DNA，在λ噬菌体载体EMBL3中建立基因组DNA文库。如实例1所述，通过与³²P标记的5′烟草ALS基因片段探针杂交来筛选重组噬菌体（300，000个）。于42℃下洗涤滤器（0.1×SSC），分离出20个单独的克隆。在第二轮纯化中，重组噬菌体与烟草的3′ALS基因探针和5′探针二者杂交。此外，于55℃下洗涤与5′探针杂交的滤器。与5′和3′探针二者杂交的克隆，在55℃洗涤以后，只有一个克隆φ21还维持杂交状态。由20个克隆制备DNA微量溶解物并用EcoRⅠ和NcoⅠ消化。不同的分离产物具有不同的限制性核酸内切酶消化方式，又只有φ21与两种探针都杂交并在55℃洗涤后仍维持杂交状态。另一个噬菌体φ41在55℃洗涤后也保留有杂交带，但它不与3′探针杂交。图7表明噬菌体φ21的限制性核酸内切酶图谱，及由它建立的亚克隆的图谱。通过与烟草基因的5′和3′探针杂交，ALS编码区被定位于3.0kb的BamH Ⅰ-Hind Ⅲ片段上。对此片段的两条DNA链已作了序列分析。把BamH    Ⅰ-Hind    Ⅲ片段亚克隆到pUC    119或Bluescript载体中;这样便去除了核酸外切酶Ⅲ或Bal    31。使用了双脱氧序列测定法。比较甜菜基因与烟草基因编码的推测氨基酸序列表明，预测蛋白的前面88个氨基酸没有同源性（见图8）。此区域可能代表叶绿体转移肽。此后的同源性大约为90%，在烟草ALS的残基290附近有4个氨基酸的插段。对烟草和酵母中鉴定为决定除莠剂抗性位点的氨基酸残基的检查表明，这些残基在甜菜ALS中也是保守的。这些数据使人们能通过定位诱变，直接去构建编码抗除莠剂的甜菜ALS酶基因，正如实例3所述的那样。

在此甜菜基因中有3个位点进行了诱变。位置122（图6中氨基酸残基的计数）的丙氨酸密码GCA被变成脯氨酸的CCA，位置197的脯氨酸密码CCA被变成丙氨酸的GCA，位置591的色氨酸密码TGG被变成亮氨酸的TTG。将两个单突变结合起来还产生了双突变，与烟草SURB-Hra基因相似，此双突变导致位置197的脯氨酸变为丙氨酸，591处的色氨酸变为亮氨酸。

为了用这些在甜菜ALS基因中离体构建的突变转化植物，将含有突变的DNA片段克隆到质粒载体pUC    119中，此片段从编码区5′方向（上游）大约910bp的BamHⅠ位点延伸到编码区3′方向（下游）大约1000bp的Pst    Ⅰ位点（见图17）。如实例1所述，将它们导入双载体pAGS    140中用于转化植物细胞。双载体pAGS    140类似于pAGS    135（图2），不同的是，在BamH    Ⅰ位点和根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA右边界之间，***了一个赋予植物以抗生素潮霉素抗性的基因。

根据实例1和实例2所述，通过植物细胞与在双载体中携有ALS基因的根癌农杆菌进行共培养，将ALS基因导入除莠剂敏感的烟草和甜菜中。烟草共培养的实验结果示于表8。4个突变的甜菜ALS基因有3个得到了除莠剂抗性转化体。得到除莠剂抗性转化体的频率低于得到卡那霉素抗性转化体的频率，也低于用烟草SURB-Hra基因所得到的除莠剂抗性转化体的频率。相信这是由于突变体甜菜ALS基因在烟草中的表达效果不好的缘故。这可能反映出了所用DNA片段中突变体甜菜ALS基因上游或下游的核苷酸调控序列不充分，或者烟草不能很好地使用甜菜的核苷酸调控序列，或者二者皆有。如果得到更多的转化体并进行试验，不产生除莠剂抗性转化体的突变体甜菜ALS基因可望产生抗性转化体。

表8.用甜菜位点专一性突变的ALS基

因转化的植物细胞的除莠剂抗性

基因来源    烟草    甜菜    甜菜    甜菜    甜菜

突变    pro（197）-ala/  pro（197）-ala/  trp（591）  pro（197）  ala(122)-pro

trp（591）-leu    trp（591）-leu    -leu    -ala

CS抗性    698    91    2    35    0

卡那霉

素抗性    1083    1362    1080    1073    415

CS抗性/

卡那霉素

抗性 .645 .067 1.85×10^-3.033 -

根据常规的共培养方法导入基因。对于每一个构建体，取一等分共培养的植物细胞（2×10⁵起始植物细胞）测定CS抗性，另一等分测定卡那霉素抗性。以2ppb    CS或50ppm卡那霉素进行选择。

实例5

实例1中所述SURB-Hra基因，通过根癌农杆菌感染烟草叶圆片转化至烟草栽培品种中。分析转化体的后代，以证实完整植株水平抗性的表达和除莠剂抗性特征的遗传。根据标准无菌技术操作无菌培养基和无污染的植物或细菌培养物，包括在所有转移中层流通风橱的使用。将用于叶圆片感染的盆栽烟草植株培养在生长室中，维持白昼为12小时24℃，夜晚为12小时20℃的循环，相对湿度约80%，用冷白荧光和白炽光混合照射。基本上根据Hor

，R.B.，Fry，J.E.，Hoffman，N.L.，Eichholtz，D.，Rogers，S.G.，Fraley，R.T.，（1985）Science 227：1229-1231进行烟草叶圆片的感染。

用解剖刀从大约4-6周龄的烟草植株（Nicotiana    taba-cum    cv.NK    326或K    14）上，收集长约4-6吋未完全展开的幼叶。将叶片浸入大约500ml    10%Chlorox，0.1%SDS溶液中进行表面消毒30分钟，然后用无菌的去离子水洗涤3次。用无菌的纸打孔器从完整叶片上制取直径6mm的叶圆片。

取20ml1∶10稀释的携有质粒pAGS    152的农杆菌过夜培养物，将叶圆片浸于其中几分钟进行接种。农杆菌这样开始培养：从加有四环素的基本培养基A（实例6）平皿上取出单菌落，将它接种在10ml基本培养基A（实例1）肉汤中。培养物在18mm玻璃培养管中生长大约17-20小时，维持在28℃的New    Bruns-wick平台摇床中。

接种以后，叶圆后置于含有CN琼脂培养基的培养皿中（实例6）。用帕拉胶膜密封培养皿，在维持大约25℃的培养室中，在混合的荧光和“Gro与Sho”植物光（General    Electric公司）下保温2-3天。

为了从叶圆片去掉农杆菌并选择转化的烟草细胞的生长，将叶圆片转移至含有500mg/l    cefotaxime和100mg/l卡那霉素的新鲜CN培养基中。将100mg/ml的Cefotaxime母液保存在冰冻条件下。在高温灭菌后无菌加入（通过0.45μm滤器过滤灭菌）培养基中。每次使用时配制新鲜卡那霉素母液（50mg/ml），以过滤灭菌的方式加入高温灭菌过的培养基中。

叶圆片在上述生长条件下保温3周，然后转移至同样组成的新鲜培养基中。

大约1-2周后，用无菌解剖刀切下从卡那霉素选择的外植体发育的苗，置入含有100mg/L卡那霉素的培养基A中。在3周以内，记录选择性和非选择性培养基上的根部形成。将在具卡那霉素的培养基上形成根的苗转移至土壤中，使之如上述在培养室中生长。3-5周以后，但在开花以前，切下叶组织并如实例6所述用于ALS测定。这些测定结果示于表9中，表明产生了除莠剂抗性型的ALS。然后将表现除莠剂抗性ALS活性的植株转移至温室中，使它们在那里生长成熟。用袋子罩住单个花朵使其进行自花授粉，避免杂交授粉。收集成熟种子，对后代进行测定以确定除莠剂抗性特征的遗传。如上述对种子进行表面消毒，干燥后植入SG培养基中（1/4MS盐类，0.75%蔗糖，0.8%琼脂），其中有或没有除莠剂（DPX-F6025，Classic

）。敏感性种子虽然发芽，但不进一步发育。后代分析结果示于表9中。3个抗性后代对1个敏感性后代的分离比例表明，在转化体中存在SURB-Hra基因的单一位点***，它是稳定遗传的。17个转化体中有15个观察到这一点。抗性后代对敏感性后代的更高比例表明，在基因组的非连锁位置有多重***。15/1的比例表明在转化体K 14^＃40中有2个非连锁的SURB-Hra基因，255/1的比例表明在转化体K 14^＃7中有4个非连锁的SURB-Hra基因。

表9

后代    分离比率

未抑制ALS活性%¹抗性/敏感性²抗性/敏感性

100ppb    1000ppb

NK326（wT）    7    -    -    -

nk326    ＃1    36    98/37    90/35    3/1

NK326    ＃9c    47    163/49    99/63    3/1

NK326    ＃9d    37    288/67    150/58    3/1

NK326    ＃10    26    93/31    96/24    3/1

NK326    ＃10c    56    333/45    290/76    3/1

K14    wT    7    -    -    -

K14    ＃7    71    990/4    109/1    255/1

K14    ＃11    52    208/85    127/76    3/1

K14    ＃27    45    129/45    108/42    3/1

K14    ＃29    30    192/46    163/67    3/1

K24    ＃31    44    106/35    99/34    3/1

K14    ＃32c    32    140/65    63/86    3/1

K14    ＃40    41    218/18    212/26    15/1

K14    ＃41    40    255/35    296/74    3/1

K14    ＃42    29    162/74    77/72    3/1

K14    ＃53    37    130/59    149/139    3/1

K14    ＃54    34    99/38    92/43    3/1

K14    ＃54A    28    137/55    100/72    3/1

1.每一行的ALS活性以没有除莠剂时的活性为100%计而得到。所用磺酰脲除莠剂为DPX-F 6025（Classic

），浓度为10ppb。

2.抗性后代能在标明浓度的除莠剂DPX-F6025（Classic

）上生长。

实例6

为了转化除莠剂敏感性番茄为抗性植物，使用根癌农杆菌LBA4404菌株中双载体pAGS    152携带的烟草SURB-Hra基因（见实例1）。

遵循无菌培养基和无污染的植物或细菌培养物的标准无菌技术操作，包括在所有转移中层流通风橱的使用。

番茄（Lycopersicon    esculentum    var.Herbst    Red    Cherry）种子在10%Chlorox，0.1%SDS溶液中表面消毒30分钟，用无菌的去离子水洗涤3次。种子植入含有100ml    OMS琼脂培养基的Magenta培养箱中（Magenta公司），在维持大约25℃的培养室中，在混合的荧光和“Gro与Sho”植物光（General    Electric公司）下发芽。用10-15日龄幼苗上的子叶进行农杆菌接种。

用无菌解剖刀从每片子叶的基部切下大约2mm组织使子叶受伤。受伤的子叶植入培养皿中，含有或不含有75μM    acetosyrin-gone（Aldrich    Chemical公司）的CTM琼脂培养基上。

为了制备子叶接种物，将来自基本培养基A+四环素（1μg/ml）琼脂平皿的单菌落接种入含有30ml基本培养基A肉汤（实例1）的培养瓶中，在New    Brunswick平台摇床中于28℃下生长2天。在子叶接种的上午，用无菌基本培养基A肉汤稀释细菌培养物，使650nM处的OD值为0.1，并令其在上述生长条件下倍增至OD值为0.2。然后用此不稀释的培养物进行接种。

含有子叶外植体的CTM琼脂平皿用5ml细菌溶液浸没大约5分钟，然后除去该溶液。然后，用Time胶带（Shamrock    Scien-tific    Specialty公司）在培养皿两侧密封平皿，在混合的荧光和“Gro与Sho”植物光（General    Electric公司）下于大约25℃保温2天。

为了使植物培养物去掉农杆菌和选择转化的番茄细胞的生长，将子叶外植体转移至含有500mg/L    cefotaxime和50mg/L卡那霉素的新鲜CTM培养基中，在上述同样的培养条件下保温大约3周。然后将子叶转移至与CTM同样组成和选择试剂的新鲜培养基中，但玉米素浓度为1/10。

大约2-4周后，切下从卡那霉素选择的子叶上发育的苗，植入含有500mg/L cefotaxime和100mg/L卡那霉素的OMS培养基中。大约2-3周后，将在卡那霉素上生根的番茄苗转移至8″花盆的土壤中，用塑料袋罩住。植株在白昼为12小时混合的荧光和白炽光和24℃，夜晚为12小时和20℃的循环下生长，相对湿度约为80%，生长一周后去掉塑料袋。植株再生长2-4周后进行ALS测定。这些实验（表10）证实，转化植株的叶片提取物在有磺酰脲Classic

存在下使未被抑制的ALS活性增加。

表10.野生型和转化型番茄的ALS活性

未抑制的ALS活性的百分比¹

0ppb    10ppb    100ppb    1000ppb

野生型    100    15    5    4

转化体＃3    100    42    25    12

转化体＃4a    100    60    42    26

转化体＃4b    100    29    15    5

转化体＃4c    100    58    43    25

转化体＃4d    100    29    15    10

1.每一行的ALS活性以没有除莠剂时的活性为100%计而得到。所用磺酰脲化合物为DPX-F6025，它是Classic

除莠剂中的活性组分。

在有或没有除莠剂的情况下，测定转化或未转化植株ALS活性的方法如下：

1.在组织匀浆器中粉碎2.5g相对幼小的叶组织（4-6吋长），其中含有10ml提取缓冲液（100mM KHPO₄pH7.5，0.5M MgCl₂，10%甘油，1mM丙酮酸，0.5mM TPP，10nM FAD）和200mg Polyclar AT（BDH Biochemi-cals公司）。保存在冰上。

2.提取物在polytron（Brinkman Instruments公司）中以^＃7档速度匀浆大约10秒。

3.提取物在Sorvall    SS-34型转子中于16Krpm，4℃下离心20分钟。

4.用柱缓冲液（100mM K HPO₄pH7.5，0.5mM MgCl₂，10%甘油，1mM丙酮酸）洗涤5次，使PD-10柱（Pharmacia公司）平衡。

5.植物提取上清液中加入冷的饱和（NH₄）₂SO₄，以达到50%削减。在冰上保温30分钟。

6.提取物在SS-34型转子中于16Krpm，4℃下离心20分钟。去掉上清液。

7.在1ml冷的柱缓冲液中再悬浮沉淀。

8.提取液加到柱上，追加一定体积的柱缓冲液，使上柱的总体积等于2.5ml。使此溶液过柱。

9.用2倍于上柱提取液的体积洗脱蛋白。回收于柱下的15mlFalcon管中。

10.每种提取液如下述在微离心管中建立反应体系：350μl反应混合物（200mM丙酮酸，5mM TPP，0.9mM FAD，5mM KHPO₄pH7.0），50μl5mM KHPO₄或所需浓度的磺酰脲，100μl植物提取液。

11.于30℃使反应体系保温1小时。

12.加入50μl 6M H₂SO₄，在60℃下保温10分钟以终止反应。在微离心管中旋转5分钟。

13.如下述建立显色管：500μl0.5%肌酸的反应管上清液，0.5ml    α-萘酚溶液（1.5g    α-萘酚溶于30ml    2.5N    NaOH中）。混合并在60℃下加热20分钟。

14.搅动每根管，每个样品取100μl加入微量滴定板的孔中。在530nm处读OD值。

培养基B（愈伤组织诱导）

1包含3%蔗糖的MS盐类    每升

（Gibco    Murashige    Organics    pH5.8

Medium）

1ml    1mg/ml的NAA

0.2ml    1mg/ml    BAP

0.8%琼脂

培养基CN（苗诱导）

1包含3%蔗糖的MS盐类    每升

1ml    1mg/ml    NAA

1ml    1mg/ml    BAP    pH5.8

0.8%琼脂

培养基A（根诱导）

1包MS盐类（没有蔗糖）    每升

10g蔗糖    pH5.8

0.8%琼脂

培养基R（农杆菌）

440ml水中加入7.5g琼脂，高温灭菌，保存在55℃。加入下列无菌母液：

0.5ml 1M MgSO₄

0.5ml 1M CaCl₂

10.0ml    20%蔗糖

5.0ml    100mg/ml卡那霉素

50.0ml 10x盐类（Na₂HPO₄·7H₂O 60g/l;

KH₂PO₄，30g/l

NaCl，5g/l

NH₄Cl，10g/l）

CTM培养基

1包MS盐类

1ml维生素B5（每100ml：烟酸100mg，盐酸硫胺素

1000mg，盐酸吡哆醇100mg，肌肌醇

10，000mg）

3mM    MES

3%葡萄糖

0.7%琼脂

pH5.7

高温灭菌并加入1ml    1mg/ml玉米素母液

OMS培养基

1包MS盐类

1ml维生素B5（同上）

3mM    MES

3%蔗糖

0.8%琼脂

pH5.7

基本培养基A+四环素（1μg/ml）

1.400ml水中加入7.5g琼脂

2.母液配制：

K₂HPO₄5.25g

KH₂PO₄2.25g

（NH₄）₂SO₄0.5g

柠檬酸钠·2H₂O 0.25g

100ml

3.配制20g/100ml的MgSO₄·7H₂O母液，高温灭菌

4.配制葡萄糖母液：20%的溶液，高温灭菌

5.配制四环素母液：1.0mg/ml溶于1∶1（体积）的乙醇和水中，过滤灭菌

制备基本培养基A+1μg/ml四环素：

（1）与（2）混合

加入0.5ml（3），5ml（4），0.5ml（5）

YEB培养基

每升

Bacto牛肉提取物    5.0g

Bacto酵母提取物    1.0g

蛋白胨    5.0g

蔗糖    5.0g

MgSO₄·7H₂O 0.5g

琼脂（可加可不加）    15.0g

除莠剂溶液：

1mg除莠剂溶于100ml 0.01N NH₄OH中，然后用5mM KHPO₄pH7.0以1∶10稀释，这样可制得1ppm磺酰脲除莠剂的母液。此母液将满足100ppb或更低浓度的除莠剂测定。如果需要更高的浓度，如上述取1mg溶于10ml 0.01N NH₄OH中即可。

除莠剂稀释液：

在标准测定中，对于除莠剂以1∶10稀释来说，取50μl除莠剂加入450μl测定混合物和提取物中。这样，对于每一个待测浓度，由母液用5mM KHPO₄pH7.0稀释成10倍浓度的溶液。

实例7

通过下述用根癌农杆菌作为媒介的方法，利用编码抗除莠剂ALS的烟草SURB-Hra基因将甜菜转化成除莠剂抗性型。

为了对种子进行表面消毒，50-100个种子置于层流通风橱中的25×100mm无菌培养皿中，加入25-30ml    70%乙醇。用手搅动种子1-2分钟，倾倒出乙醇，加入25-30ml    20%Clorox（20ml市售漂白剂，80ml无菌水，1滴Tween    80）。种子在旋转摇床上以40rpm搅动20分钟，倾倒出漂白剂。重复2次总计为60分钟的漂白剂消毒，用无菌水将消毒种子洗涤3次，每次用25-30ml洗涤5分钟。

为了使种子发芽，将其置于1/2PG₀琼脂固化的培养基上（12个种子/50ml培养基/15×150mm培养皿），在暗中于24℃下培养。

注意：一批良好清洁的种子可能有10-20%的污染率。由于此原因，将种子置于大平皿上并相距较远，连续监测发芽情况，将未受污染的种子转移到新平皿上。如果污染物是真菌，则在关掉风扇的情况下在层流通风橱中作转移。

一批好的种子可望有60-80%的发芽率。发芽不是同步的。大约需要14天时间以使得（a）所有种子发芽和（b）提供大量合适外植体的足够长度。

如实例1所述，制备过夜（O/N）培养的农杆菌悬浮液。新培养农杆菌的迟滞期比5℃下长期保存培养物的要短。作为接种物使用的必须是对数期细菌，这一点是很重要的。因此，在对下胚轴接种之前，必须进行某些试验以确保过夜培养物达到了对数期（OD_550nm为0.4-0.8）。

为了制备植物外植体，用锋利的外科刀片将下胚轴切成大约0.5cm小片，立即置于琼脂固化的PG₀0.1/0.1中。防止脱水，并不要使用钝刀片或用摄子压迫而破坏伤口。

为了接种外植体，将它们分别浸于合适农杆菌株的对数期悬浮液中。短暂浸没后（1-3秒），以格网形式置于新鲜平皿中：25个外植体/100mm琼脂固化的PG₀0.1/0.1平皿。

平皿打开置于层流通风橱中10-30分钟使外植体变干。这样使农杆菌浓缩在创伤处。这样还可以限制水过多导致可能的伤害。重要的是不要使组织完全脱水。这一步需要密切的观察。然后用帕拉胶膜密封平皿，于24℃下培养3天。

外植体收集入25×100mm培养皿中，其中有含500μg/mlcefotaxime的液态PG    0.1/0.1，在旋转摇床上以40rpm轻轻摇动1小时。倾倒出培养液，用新鲜的反选择性培养基取代，再轻轻摇动2小时。外植体以格网状置于平皿上，每个100mm含有500μg/ml    cefotaxime的琼脂固化的PG    0.1/0.1平皿上放25个外植体，并于24℃下培养3天。

如下述程序选择转化的植物细胞。外植体转移至琼脂固化的PG    0.1/0.1新鲜平皿中，其中含有100μg/ml万古霉素或作为选择试剂的2ng/ml    CS。20-30天后计数抗性菌落的数目。每个创伤处可以观察到不止一个。如下述切下转化体。用外科刀片从创伤/外植体取下愈伤组织，独立培养于新鲜的选择性培养基中。某些农杆菌能够逃脱计数器选择。当重复转移至含有cefotaxime的琼脂固化平皿中时，用含有cefotaxime的液体培养基再洗涤是可能的。根据建议的程序，我们观察到大约15%的外植体污染，这是可以接受的损失。表11给出了用甜菜系（Beta    vulgaris    87193）作的转化实验的结果。用烟草SURB-Hra    ALS突变基因转化的甜菜愈伤组织的CS抗性水平与未转化的愈伤组织的抗性比较。这些结果表明，编码抗除莠剂ALS的烟草SURB-Hra基因，能够高效率地在甜菜中表达。

表11

Chlorsulfuron（ppb）

0    10    30    100    300    1000    3000    10000

87193/152¹15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 3/15 0/15

87193/0²15/15 0/15 0/15 未测 未测 未测 未测 未测

1.用携有质粒pAGS    152的根癌农杆菌LBA    4404转化的甜菜系87193。

2.未转化的甜菜系87193。

培养基及其改善

1/2PG₀

组分    母液    最终浓度    量/升

PG₀主要盐类A 10x 50ml

PG₀主要盐类B 100x 5

Fe-EDTA    100x    5

维生素B5    100x    5

MS微量养分    1000x    1

蔗糖    1.5%W/V    15gm

MES缓冲液    3mM    590mg

T.C.琼脂    0.8%W/V    8gm

pH5.7，高温灭菌，无菌地分装于15×150mm培养皿中。

PG₀0.1/0.1

组分    母液    最终浓度    量/升

PG₀主要盐类A 10x 100ml

PG₀主要盐类B 100x 10

Fe-EDTA    100x    10

维生素B5    100x    10

MS微量养分    1000x    1

蔗糖    3.0%W/V    30gm

Mes缓冲液    3mM    590mg

2，4-D    1mg/ml    100μl

BlAP    1mg/ml    100μl

pH5.7，高温灭菌。

PG₀0.1/0.1琼脂固化培养基如上述制备，只是加入T.C.琼脂0.8%（W/V）。分装于25×100mm培养皿中，每个25ml。

母液

PG₀主要盐类A（10x）

组分    MW    最终浓度    量/升

KNO₃101.1 19.8mM 20

（NH₄）₂SO₄132.14 3 4

KCl    74.55    8    6

MgSO₄·7H₂O 146.5 2 5

CaCl₂·2H₂O 147.0 2 3

PG₀主要盐类B（100x）

组分    MW    最终浓度    量/升

NaH₂PO₄120.0 2.1mM 25

Fe    EDTA（100x）M

FeSO₄·7H₂O 100μM 2.78gm

Na₂EDTA 100μM 3.72

首先溶解EDTA。pH3.0。4℃下暗中保存。

维生素B5（100x）

烟酸    1mg/L    0.1gm

盐酸硫胺素    10    1.0

盐酸吡哆醇    1    0.1

肌肌醇    100    10

MS微量养分（1000x）

MnCl₂·4H₂O 197.9 100μM 19800mg

H₃BO₃01.8 100 6200

ZnSO₄·7H₂O 287.5 30 8625

KI    166    5    830

NaMoO₄·2H₂O 206 1.2 250

CuSO₄·5H₂O 249.7 0.1 25

CoCl₂·6H₂O 237.9 0.1 25

在稀HCl中溶解MnCl₂·4H₂O。

每次溶解一种，完全溶解后加入下一种。

煮沸后冷却，pH4.0，4℃下暗中保存。

实例8

根据下述用根癌农杆菌介导的转化方法，利用编码抗除莠剂ALS的烟草SURB-Hra基因转化Brassica    napus    cv.Olga。

为了使种子表面消毒，将其浸入70%乙醇中1分钟，然后在Clorox/Tween中浸30-60分钟（见实例7）。表面消毒的种子在1/2MS、1/2PG₀（见实例7）上于24℃暗中发芽。发芽5-10天后，下胚轴分切成0.5cm小片，置于含有100μM Acetosyringone的固体培养基Ⅰ上（IAS 100）。

立即使外植体单个地浸入含有双质粒pAGS    15的LBA    4404对数期悬浮液中。

外植体重新涂布在IAS    100上。将平皿打开放在层流通风橱中，使农杆菌液滴小心地在组织上变干。在低光强下或暗中于24℃共培养3天。

3天以后，外植体收集入100×25mm培养皿中，内有含500mg/L    cefotaxime的液体培养基Ⅰ，在旋转摇床上以40rpm摇动3小时。

外植体涂布于含有500mg/ml    cefotaxime的固体培养基I上，在低光强下于24℃培养3天。

外植体涂布于含有100mg/L万古霉素和100mg/L卡那霉素的固体培养基I上。

大约1周后，在外植体基部以独立的小节出现了转化的愈伤组织。

小节出现后，用锋利的解剖刀切下，置于含有100mg/L卡那霉素的固体培养基I上。

当转化的愈伤组织达到足够的大小（直径为0.5cm）时，将其转移至含有100mg/L卡那霉素的KR培养基中。如果每两周在新鲜培养基上将它涂布一次，则其再生速度最快。根部在含有2μMIBA的1/2MS上再生。

在一个实验中，100个创伤位点（0.5cm下胚轴小片的两端）中有20个发育出了抗卡那霉素（100mg/L）的愈伤组织。然后，20个转化细胞系中有5个在卡那霉素上诱导再生，每个再生体基因型通过节增殖产生体细胞姊妹株。这些植株用不同浓度的CS喷雾处理，结果概括于表12中。5个转化体中有两个对于CS的抗性水平比对照（未转化）植株的致死浓度高大约10倍。

表12

0.3ppm    1ppm    3ppm    10ppm

未转化的    ++    +    -    -

R₀＃1 ++ ++ ++ +

R₀＃2 ++ + - -

R₀＃3 ++ + + -

R₀＃4 ++ + - -

R₀＃5 +++ ++ ++ +

+++正常生长，无中轴诱导

++    降低生长，尖端亚致死，中轴诱导

+    降低生长，尖端致死，中轴诱导

-    致死

为了进一步证实SURB-Hra基因在转化的Brassica napus中的表达，如实例6所述测定有除莠剂CS存在时的ALS活性。比较未转化母株和转化株R₀＃5（表12）的ALS活性（表13）。在转化株中观察到未抑制的ALS活性的百分比一致上升。因此，编码抗除莠剂ALS的烟草SURB-Hra基因能够在Brassica    napus中表达，但表达的效率不高。加入Brassica    napus的核苷酸调控序列，可望提高抗除莠剂ALS的表达水平和对除莠剂叶片喷洒的耐受水平。

表13.野生型和转化的Brassica    napus的ALS活性

未抑制ALS活性的百分比¹

0ppb    1ppb    10ppb    100ppb    1000ppb

野生型    100.0    86.6    28.2    10.1    7.6

转化株R₀＃5 100.0 88.1 36.6 20.1 14.5

1.ALS活性相对于没有除莠剂时的活性以100%计。所用的磺酰脲化合物为CS（DPX-W 4189）是Glean

除莠剂中的活性组分。

Brassica    napus培养基

培养基Ⅰ

组分    母液    最终浓度    量/升

MS主要盐类    10x    100ml

MS微量养分    1000x    1ml

Fe    EDTA    100x    10ml

维生素I    100x    10ml

2，4-D    1mg/ml    0.2ml

激动素    1mg/ml    3ml

蔗糖    3%W/V    30gm

甘露醇    1.8%W/V    18.2gm

T.C.琼脂    0.8%W/V    8gm

Mes缓冲液    3mM    0.59gm

pH5.7，高温灭菌

KR培养基

组分    母液    最终浓度    量/升

K₃主要盐类 10x 100ml

CaCl₂·2H₂O 100x 10ml

MS微量养分    1000x    1ml

Fe    EDTA    100x    10ml

维生素B5    100x    10ml

玉米素^＊1mg/ml 2ml

IAA^＊1mg/ml 0.1ml

蔗糖    1%W/V    10gm

木糖    0.025%W/V    0.25gm

琼脂糖（1型，低E/E₀） 0.25%W/V 2.5gm

Mes缓冲液    3mM    0.59gm

pH5.7，高温灭菌

^＊无菌加入这些过滤灭菌的组分

Brassica    napus母液

母液    组分    母液浓度    最终浓度    量/升

MS主要盐类 NH₄NO₃10x 20.5mM 16.5gm

KNO₃18.8 19.0

MgSO₄·7H₂O 1.5 3.7

KH₂PO₄1.25 1.7

CaCl₂·2H₂O 3.0 4.4

K₃主要盐类 KNO₃10x 25.0mM 25.0gm

（NH₄）₂SO₄1.0 1.34

MgSO₄·7H₂O 1.0 2.5

KH₂PO₄1.5 2.01

NH₄NO₃3.1 2.5

CaCl₂·2H₂O CaCl₂·2H₂O 100x 6.3mM 92.3gm

MS微量养分 MnCl₂·4H₂O 1000x 100μM 19800mg

H₃BO₃100 6200

ZnSO₄·7H₂O 30 8625

KI    5    830

NaMoO₄·2H₂O 1.2 250

CuSO₄·5H₂O 0.1 25

CoCl₂·6H₂O 0.1 25

Fe EDTA Na₂EDTA 100x 100μM 3.73gm

FeSO₄·7H₂O 100 2.78

维生素I    肌肌醇    100x    100mg/L    1000mg

硫胺素    0.5    50

甘氨酸    2.0    200

烟酸    5.0    500

吡哆醇    0.5    50

叶酸    0.5    50

生物素    0.05    5

实例9

根据用根癌农杆菌介导的转化方法，利用编码抗除莠剂ALS的烟草SURB-Hra基因将香瓜（Cucumis    melo    cv.Amarillo    Oro）转化为除莠剂抗性型。此方法的参考文献为Moreno，V.，et    al.Plant    regeneration    from    calli    of    melon.Plant    Cell    Tissue    Organ    Culture，5（1985）139-146。

首先去掉种皮极大地方便了种子的表面灭菌。然后使种子在70%乙醇中洗涤2分钟灭菌，再在Clorox/Tween（见实例7）中洗涤20分钟。无菌种子用无菌蒸馏水洗3次，使其在OMS上于24℃下发芽，给以16小时的白昼长度。

用一把新的锋利的解剖刀将7-14日龄的香瓜幼苗子叶切成5mm小片。这些外植体浸入如实例1所述制备的对数期农杆菌培养物中，转移至新鲜的共培养平皿中，于24℃下以16小时白昼培养3天。

用洗涤培养基洗涤外植体3小时（伴以轻轻搅动）以杀死细菌，在新鲜的选择平皿上培养。

外植体每3-4周亚培养一次，从白色较蓬松的愈伤组织上切下更为致密、绿色更深的部分。

可见到“形态建成”的愈伤组织时（很深的绿色、致密、也许还有些可识别的叶片），将它转移至再生培养基中。此组织能直接变成苗，而不通过形态建成阶段。使苗在生根培养基中生根。大约70%外植体发育出抗100μm/L卡那霉素的愈伤组织。转化的愈伤组织置于含有浓度上升的CS的培养基上，30天后称量愈伤组织以测定除莠剂存在下的生长（表14）。有些转化株在高浓度CS（1000ppb）存在下能够象没有CS时一样生长，例如转化株1、转化株2和转化株7。因此，烟草SURB-Hra基因能够将香瓜转化成高水平的除莠剂抗性型植株。

培养基

OMS

MS盐类和Fe    EDTA    1X

维生素B5    1X

蔗糖    3%

MES    3mM

PH5.7

T.C.琼脂    0.8%

高温灭菌20分钟

基本培养基

MS盐类和Fe    EDTA    1X

肌肌醇    100mg/L

硫胺素    1mg/L

蔗糖    3%

MES    3mM

PH5.7

T.C.琼脂    0.8%

高温灭菌20分钟

用于共培养的培养基是基本培养基加上：

Acetosyringone    100μM（以100mM母液保存在DMSO中）

激动素    6mg/L

IAA    1.5mg/L

洗涤培养基是基本培养基去掉琼脂加上：

Cefotaxime    500mg/L

激动素    6mg/L

IAA    1.5mg/L

选择培养基是基本培养基加上：

激动素    6mg/L

IAA    1.5mg/L

万古霉素    100mg/L

一种下列的选择性药物（根据农杆菌构建体而定）：

卡那霉素    100mg/L

潮霉素    50mg/L

CS    100mg/L

再生培养基是基本培养基加上：

BAP    0.1mg/L

万古霉素    100mg/L

上述的选择性药物

生根培养基是OMS加上：

IBA    2μm

万古霉素    100mg/L

上述的选择性药物

实例10

根据根癌农杆菌介导的转化方法，利用编码抗除莠剂ALS的烟草SURB-Hra基因将苜蓿（Medicago    sativa    cv.Range-lander）转化为除莠剂抗性型。此方法的参考文献为Deak，M.，Kiss，G.，Koncz，C.，and    Dudits，D.Transformation    of    Medicago    by    Agrobacterium    mediated    gene    transfer（印刷中）。

在OMS中对植株进行培养和亚培养。所用材料取自最后一次亚培养大约2月后的植株叶柄和茎段（5mm长）。

用一新的锋利的解剖刀将无菌植株的叶柄和茎切成5mm长。这些外植体浸入如实例1所述制备的对数期农杆菌培养物中，转移至新鲜的共培养平皿上，于24℃下以16小时白昼培养3天。

用洗涤培养基洗涤外植体3小时（伴以轻轻搅动）以杀死

在新鲜的选择平皿上培养。

外植体每3-4周亚培养一次。大约一个月内，可见到从外

体端头创伤处长出的转化的愈伤组织，从外植体上切下并涂在新鲜的选择培养基上。当愈伤组织变得更为组织化后（更绿和更致密的区域），转移至新鲜的成熟培养基中。

发育的胚胎出现后转移至发芽培养基上。发芽以后，把小植株培养在同样的培养基上。

少于1%的外植体发育出抗100mg/L卡那霉素的愈伤组织。发现卡那霉素抗性部分抗50ppb除莠剂CS。从卡那霉素抗性愈伤组织产生了三株苗。在一定范围的CS浓度内，评价了这些转化株组织的除莠剂抗性生长。一个转化株能够在1000ppb    CS上生长;另外两个能够在5000ppb上生长。因此，烟草SURB-Hra基因能够将苜蓿转化成高水平的除莠剂抗性植株。

培养基

OMS

MS盐类和Fe    EDTA    1X

维生素B5    1X

蔗糖    3%

MES    3mM

PH5.7

T.C.琼脂    0.8%

高温灭菌20分钟

基本培养基

MS盐类和Fe    EDTA    1X

维生素UM 1X^＊

蔗糖    3%

PH5.7

T.C.琼脂    0.8%

高温灭菌20分钟

^＊100x维生素UM

（对于100ml    100x母液给出的量）

盐酸硫胺素    1g

烟酸    0.5g

盐酸吡哆醇    1g

肌肌醇    10g

甘氨酸    0.2g

共培养用的培养基

基本培养基加上

Acetosyringone    100μm（以100mM母液保存在DMSO中）

2，4-D    0.5mg/L

BAP    0.2mg/L

洗涤培养基

基本培养基去掉琼脂加上

Cefotaxime    500mg/L

2，4-D    0.5mg/L

BAP    0.2mg/L

选择培养基

基本培养基加上

2，4-D    0.5mg/L

BAP    0.2mg/L

万古霉素    100mg/L

一种下列的选择性药物（根据农杆菌构建体而定）：

潮霉素    50mg/L

CS    100mg/L

成熟培养基

与选择培养基相同，但去掉2，4-D。

发芽培养基

基本培养基加上

万古霉素    100mg/L

上述的选择性药物

Claims (153)

1、一种包含编码植物乙酰乳酸合酶的核苷酸序列的核酸片段，所述核苷酸序列至少包含一种图6中称为A、B、C、D、E、F和G的亚序列，这些亚序列编码一个基本上是保守的氨基酸亚序列，核酸片段进一步的特征在于，它至少满足下列条件之一，

a)核酸片段有一个编码氨基酸亚序列A的序列，其中ε₁是一个不是丙氨酸的氨基酸，或ε₂是一个不是甘氨酸的氨基酸，

b)核酸片段有一个编码氨基酸亚序列B的序列，其中α₁是一个不是脯氨酸的氨基酸，

c)核酸片段有一个编码氨基酸亚序列C的序列，其中σ₂是一个不是丙氨酸的氨基酸，

d)核酸片段有一个编码氨基酸亚序列D的序列，其中λ₁是一个不是赖氨酸的氨基酸，

e)核酸片段有一个编码氨基酸亚序列E的序列，其中γ₁是一个不是天冬氨酸的氨基酸，

f)核酸片段有一个编码氨基酸亚序列F的序列，其中β₃是一个不是色氨酸的氨基酸，或β₃是一个不是缬氨酸的氨基酸或β₇是一个不是苯丙氨酸的氨基酸，

g)核酸片段有一个编码氨基酸亚序列G的序列，其中σ₁是一个不是蛋氨酸的氨基酸。

2、根据权利要求1的核酸片段，它至少满足下列条件之一，

a）核酸片段有一个编码氨基酸亚序列A的序列，其中ε₁是一个不是丙氨酸的氨基酸，

b）核酸片段有一个编码氨基酸亚序列B的序列，其中α₁是一个不是脯氨酸的氨基酸，

c）核酸片段有一个编码氨基酸亚序列C的序列，其中σ₂是一个不是丙氨酸的氨基酸，

d）核酸片段有一个编码氨基酸亚序列D的序列，其中λ₁是一个不是赖氨酸的氨基酸，

e）核酸片段有一个编码氨基酸亚序列E的序列，其中γ₁是一个不是天冬氨酸的氨基酸，

f）核酸片段有一个编码氨基酸亚序列F的序列，其中β₃是一个不是色氨酸的氨基酸。

3、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列A的序列，其中ε₂是一个不是甘氨酸的氨基酸。

4、根据权利要求3的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

PGε₂A

的氨基酸亚序列A的序列，其中

P是脯氨酸，

G是甘氨酸，

ε₂是一个不是甘氨酸的氨基酸，

A是丙氨酸。

5、根据权利要求3的核酸片段，其中的ε₂是一个从下列一组中选出来的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸。

6、根据权利要求5的核酸片段，其中ε₂是丝氨酸。

7、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列A的序列，其中ε₁是一个不是丙氨酸的氨基酸。

8、根据权利要求7的核酸片段，该片段有一个编码具有式子PGGε₁

的氨基酸亚序列A的序列，其中：

P是脯氨酸，

G是甘氨酸，

ε₁是一个不是丙氨酸的氨基酸。

9、根据权利要求7的核酸片段，其中ε₁是一个不是甘氨酸的氨基酸。

10、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列B的序列，其中α₁是一个不是脯氨酸的氨基酸。

11、根据权利要求10的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

GQVα₁

的氨基酸亚序列B的序列，其中：

G是甘氨酸，

Q是谷氨酰胺，

V是缬氨酸，

α₁是一个不是脯氨酸的氨基酸。

12、根据权利要求10的核酸片段，其中α₁是从下列一组中选出来的一个氨基酸：丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。

13、根据权利要求12的核酸片段，其中α₁是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺。

14、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列C的序列，其中σ₂是一个不是丙氨酸的氨基酸。

15、根据权利要求14的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

IGσ₁Dσ₂FQE

的氨基酸亚序列C的序列，其中：

I是异亮氨酸，

G是甘氨酸，

σ₁是一组氨基酸中选出，

D是天冬氨酸，

σ₂是一个不是丙氨酸的氨基酸。

16、根据权利要求15的核酸片段，其中σ₂是从下列一组中选出来的一个氨基酸：苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。

17、根据权利要求16的核酸片段，其中的σ₂是苏氨酸、半胱氨基、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸或精氨酸。

18、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列D的序列，其中λ₁是一个不是赖氨酸的氨基酸。

19、根据权利要求18的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

Pλ₁D

的氨基酸亚序列D的序列，其中：

P是脯氨酸，

λ₁是一个不是赖氨酸的氨基酸，

D是天冬氨酸。

20、根据权利要求18的核酸片段，其中的λ₁是从下列一组中选出来的一个氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸和苯丙氨酸。

21、根据权利要求20的核酸片段，其中λ₁是甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、色氨酸或脯氨酸。

22、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列G的序列，其中σ₁是一个不是蛋氨酸的氨基酸。

23、根据权利要求22的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

MLGσ₁HG

的氨基酸亚序列G的序列，其中：

M是蛋氨酸，

L是亮氨酸，

G是甘氨酸，

σ₁是一个不是蛋氨酸的氨基酸，

H是组氨酸，

G是甘氨酸。

24、根据权利要求22的核酸片段，其中的σ₁是一个从下列一组中选出来的一个氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。

25、根据权利要求24的核酸片段，其中σ₁是脯氨酸、谷氨酸或缬氨酸。

26、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列E的序列，其中γ₁是一个不是天冬氨酸的氨基酸。

27、根据权利要求26的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

RFDγ₁R

的氨基酸亚序列E的序列，其中：

R是精氨酸，

F是苯丙氨酸，

D是天冬氨酸，

γ₁是一个不是天冬氨酸的氨基酸。

28、根据权利要求26的核酸片段，其中的γ₁是从下列一组中选出来的一个氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和苯丙氨酸。

29、根据权利要求28的核酸片段，其中的γ₁是甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、半胱氨酸或色氨酸。

30、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列F的序列，其中β₈是一个不是缬氨酸的氨基酸。

31、根据权利要求30的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

Gβ₁β₈β₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇

的氨基酸亚序列F的序列，其中：

G是甘氨酸，

β₁、β₂、β₃、β₄、β₅、β₆和β₇是从由一组氨基酸中选择出来的，

Q是谷氨酰胺，

β₈是一个不是缬氨酸的氨基酸。

32、根据权利要求31的核酸片段，其中β₁是蛋氨酸，β₃是色氨酸，β₇是苯丙氨酸，β₈是一个不是缬氨酸的氨基酸。

33、根据权利要求30的核酸片段，其中的β₈是一个从由丙氨酸和甘氨酸组成的氨基酸组中选出来的氨基酸。

34、根据权利要求33的核酸片段，其中β₈是丙氨酸。

35、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列F的序列，其中的β₃是一个不是色氨酸或脯氨酸的氨基酸。

36、根据权利要求35的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

Gβ₁Vβ₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇

的氨基酸亚序列F的序列，其中：

G是甘氨酸，

β₁、β₂、β₄、β₅、β₆和β₇是由一组氨基酸中选择出来的，

V是缬氨酸，

Q是谷氨酰胺，

β₃是一个不是色氨酸或脯氨酸的氨基酸。

37、根据权利要求1的核酸片段，该片段有一个编码氨基酸亚序列F的序列，其中β₇是一个不是苯丙氨酸的氨基酸。

38、根据权利要求37的核酸片段，该片段有一个编码具有式子

Gβ₁Vβ₂Qβ₃β₄β₅β₆β₇

的氨基酸亚序列F的序列，其中：

G是甘氨酸，

β₁、β₂、β₃、β₄、β₅和β₆是由一组氨基酸中选择出来的，

V是缬氨酸，

Q是谷氨酰胺，

β₇是一个不是苯丙氨酸的氨基酸。

39、根据权利要求37的核酸片段，其中的β₇是一个从由亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸组成的一组氨基酸中选出来的。

40、根据权利要求39的核酸片段，其中β₇是亮氨酸。

41、一种编码植物乙酰乳酸合酶的核酸片段，它能够被掺入用于转化植物的核酸构建体中，该植物含有对磺酰脲除莠剂化合物敏感的野生型乙酰乳酸合酶，所述核酸片段相对于编码植物乙酰乳酸合酶的野生型核酸片段至少有一个点突变，以至用所述核酸构建体转化所述植物后，可使其含有所述核酸片段，并使所述植物对所述磺酰脲除莠剂化合物的施用具有抗性。

42、一种抗磺酰脲除莠剂化合物的乙酰乳酸合酶蛋白质，它包括一个其中至少有一个氨基酸发生置换的氨基酸序列。

43、权利要求42的乙酰乳酸合酶蛋白，其中所述至少一个氨基酸的置换发生于图6中称为A、B、C、D、E、F和G的保守的氨基酸亚序列之一中，所述蛋白质进一步的特征在于，所述置换至少与下述条件之一一致：

a）乙酰乳酸合酶蛋白在氨基酸亚序列A中掺入了一个氨基酸ε₁，其中ε₁不是丙氨酸，或在氨基酸亚序列A中掺入了一个氨基酸ε₂，其中ε₂不是甘氨酸，

b）乙酰乳酸合酶蛋白在氨基酸亚序列B中掺入了一个氨基酸α₁，其中α₁不是脯氨酸，

c）乙酰乳酸合酶蛋白在氨基酸亚序列C中掺入了一个氨基酸σ₂，其中σ₂不是丙氨酸，

d）乙酰乳酸合酶蛋白在氨基酸亚序列D中掺入了一个氨基酸λ₁，其中λ₁不是赖氨酸，

e）乙酰乳酸合酶蛋白在氨基酸亚序列E中掺入了一个氨基酸γ₁，其中γ₁不是天冬氨酸，

f）乙酰乳酸合酶蛋白在氨基酸亚序列F中掺入了一个氨基酸β₃，其中β₃不是色氨酸，或在氨基酸亚序列F中掺入了一个氨基酸β₈，其中β₈不是缬氨酸，或在氨基酸亚序列F中掺入了一个氨基酸β₇，其中β₇不是苯丙氨酸，

g）乙酰乳酸合酶蛋白在氨基酸亚序列G中掺入了一个氨基酸σ₁，其中σ₁不是蛋氨酸。

44、一种核酸构建体，它包括权利要求1中的核酸片段。

45、一种核酸构建体，它包括权利要求2中的核酸片段。

46、一种核酸构建体，它包括权利要求3中的核酸片段。

47、一种核酸构建体，它包括权利要求7中的核酸片段。

48、一种核酸构建体，它包括权利要求10中的核酸片段。

49、一种核酸构建体，它包括权利要求14中的核酸片段。

50、一种核酸构建体，它包括权利要求18中的核酸片段。

51、一种核酸构建体，它包括权利要求22中的核酸片段。

52、一种核酸构建体，它包括权利要求26中的核酸片段。

53、一种核酸构建体，它包括权利要求30中的核酸片段。

54、一种核酸构建体，它包括权利要求35中的核酸片段。

55、一种核酸构建体，它包括权利要求37中的核酸片段。

56、一种核酸构建体，它包括权利要求41中的核酸片段。

57、一种含有权利要求1的核酸片段的植物。

58、一种含有权利要求2的核酸片段的植物。

59、一种含有权利要求3的核酸片段的植物。

60、一种含有权利要求7的核酸片段的植物。

61、一种含有权利要求10的核酸片段的植物。

62、一种含有权利要求14的核酸片段的植物。

63、一种含有权利要求18的核酸片段的植物。

64、一种含有权利要求22的核酸片段的植物。

65、一种含有权利要求26的核酸片段的植物。

66、一种含有权利要求30的核酸片段的植物。

67、一种含有权利要求35的核酸片段的植物。

68、一种含有权利要求37的核酸片段的植物。

69、一种含有权利要求41的核酸片段的植物。

70、一种含有权利要求4的核酸片段的植物。

71、一种含有权利要求42的乙酰乳酸合酶蛋白质的植物。

72、含有权利要求1的核酸片段的大豆。

73、含有权利要求41的核酸片段的大豆。

74、含有权利要求1的核酸片段的玉米。

75、含有权利要求41的核酸片段的玉米。

76、含有权利要求1的核酸片段的甜菜。

77、含有权利要求41的核酸片段的甜菜。

78、含有权利要求1的核酸片段的向日葵。

79、含有权利要求41的核酸片段的向日葵。

80、含有权利要求1的核酸片段的芸苔属植物。

81、含有权利要求41的核酸片段的芸苔属植物。

82、含有权利要求1的核酸片段的烟草。

83、含有权利要求41的核酸片段的烟草。

84、含有权利要求1的核酸片段的土豆。

85、含有权利要求41的核酸片段的土豆。

86、含有权利要求1的核酸片段的番茄。

87、含有权利要求41的核酸片段的番茄。

88、含有权利要求1的核酸片段的苜蓿。

89、含有权利要求41的核酸片段的苜蓿。

90、含有权利要求1的核酸片段的香瓜。

91、含有权利要求41的核酸片段的香瓜。

92、含有权利要求1的核酸片段的棉花。

93、含有权利要求41的核酸片段的棉花。

94、含有权利要求1的核酸片段的莴苣。

95、含有权利要求41的核酸片段的莴苣。

96、含有权利要求1的核酸片段的小麦。

97、含有权利要求41的核酸片段的小麦。

98、含有权利要求1的核酸片段的水稻。

99、含有权利要求41的核酸片段的水稻。

100、一种用权利要求1的核酸片段转化的植物组织培养物。

101、一种用权利要求2的核酸片段转化的植物组织培养物。

102、一种用权利要求3的核酸片段转化的植物组织培养物。

103、一种用权利要求7的核酸片段转化的植物组织培养物。

104、一种用权利要求10的核酸片段转化的植物组织培养物。

105、一种用权利要求14的核酸片段转化的植物组织培养物。

106、一种用权利要求18的核酸片段转化的植物组织培养物。

107、一种用权利要求22的核酸片段转化的植物组织培养物。

108、一种用权利要求26的核酸片段转化的植物组织培养物。

109、一种用权利要求30的核酸片段转化的植物组织培养物。

110、一种用权利要求35的核酸片段转化的植物组织培养物。

111、一种用权利要求37的核酸片段转化的植物组织培养物。

112、一种用权利要求41的核酸片段转化的植物组织培养物。

113、栽培权利要求57的植物得到的种子。

114、栽培权利要求58的植物得到的种子。

115、栽培权利要求59的植物得到的种子。

116、栽培权利要求60的植物得到的种子。

117、栽培权利要求61的植物得到的种子。

118、栽培权利要求62的植物得到的种子。

119、栽培权利要求63的植物得到的种子。

120、栽培权利要求64的植物得到的种子。

121、栽培权利要求65的植物得到的种子。

122、栽培权利要求66的植物得到的种子。

123、栽培权利要求67的植物得到的种子。

124、栽培权利要求68的植物得到的种子。

125、栽培权利要求69的植物得到的种子。

126、栽培权利要求70的植物得到的种子。

127、栽培权利要求71的植物得到的种子。

128、一种用权利要求1的核酸片段转化植物细胞的方法，该方法包括将含有核酸片段的核酸构建体导入植物细胞中。

129、一种用权利要求2的核酸片段转化植物细胞的方法，该方法包括将含有核酸片段的核酸构建体导入植物细胞中。

130、一种用权利要求41的核酸片段转化植物细胞的方法，该方法包括将含有核酸片段的核酸构建体导入植物细胞中。

131、一种选择用权利要求1的核酸片段转化的植物细胞的方法，该方法包括

将核酸片段导入其生长对除莠剂抑制敏感的植物细胞中，而由此核酸片段编码的ALS对除莠剂具有抗性，从而形成转化的植物细胞;以及

在抑制未转化细胞生长的选择浓度上，选择其生长对所述除莠剂抑制具有抗性的转化植物细胞。

132、一种选择用权利要求2的核酸片段转化的植物细胞的方法，该方法包括

将核酸片段导入其生长对除莠剂抑制敏感的植物细胞中，而由此核酸片段编码的ALS对除莠剂具有抗性，从而形成转化的植物细胞;以及

在抑制未转化细胞生长的选择浓度上，选择其生长对所述除莠剂抑制具有抗性的转化植物细胞。

133、一种选择用权利要求41的核酸片段转化的植物细胞的方法，该方法包括

将核酸片段导入其生长对除莠剂抑制敏感的植物细胞中，而由此核酸片段编码的ALS对除莠剂具有抗性，从而形成转化的植物细胞;以及

在抑制未转化细胞生长的选择浓度上，选择其生长对所述除莠剂抑制具有抗性的转化植物细胞。

134、一种在栽培了一种用权利要求1的核酸片段转化的植物的地点控制不需要植物的生长的方法，该方法包括在该地点施用有效量的除莠剂。

135、一种在栽培了一种用权利要求41的核酸片段转化的植物的地点控制不需要植物的生长的方法，该方法包括在该地点施用有效量的除莠剂。

136、一种根据权利要求134的方法，其中的除莠剂是由

Ⅰ

构成的一组化合物中选择出的一种化合物及它们适于农业应用的盐类。

其中

R是H或CH₃;

J是

R₁是Cl，Br，NO₂，C₁-C₄烷基，C₂-C₄烯烃基，

CF₃，C₁-C₄烷氧基，C₁-C₄卤代烷氧基，

C₃-C₄烯氧基，C₂-C₄卤代烯烃氧基，C₃-C₄炔氧基，

CO₂R₉，CONR₁₀R₁₁，S（O）mR₁₂，OSO₂R₁₂，

苯基，SO₂N（OCH₃）CH₃，SO₂NR₁₀R₁₁，

R₂是H，Cl，Br，F，CH₃，NO₂，SCH₃，

OCF₂H，OCH₂CH₃或OCH₃;

R₃是Cl，NO₂，CO₂CH₃，CO₂C₂H₅，SO₂N（CH₃）₂

SO₂CH₃或SO₂C₂H₅;

R₄是C₁-C₃烷基，Cl，Br，NO₂，CO₂R₉，

CON（CH₃）₂，SO₂N（CH₃）₂，SO₂N（OCH₃）CH₃

或S（O）mR₁₂;

R₅是C₁-C₃烷基，C₄-C₅环烷羰基，F，Cl，Br，

NO₂，CO₂R₁₄，SO₂N（CH₃）₂，SO₂R₁₂或苯基;

R₆是H，C₁-C₃烷基，或CH₂CH＝CH₂;

R₇是H，CH₃，OCH₃，Cl或Br;

R₈是H，F，Cl，Br，CH₃，OCH₃，CF₃，SCH₃

或OCF₂H;

R₉是C₁-C₄烷基，C₃-C₄烯烃基或CH₂CH₂Cl;

R₁₀是H或C₁-C₃烷基;

R₁₁是H或C₁-C₂烷基;

R₁₂是C₁-C₃烷基;

R₁₃是H或CH₃;

R₁₄是C₁-C₃烷基或CH₂CH＝CH₂;

m是0，1或2;

n是1或2;

Q是CH₂，CHCH₃或NR₁₅;

R₁₅是H或C₁-C₄烷基;

P是O或CH₂;

R₁₆是H或CH₃;

R₁₇是C（O）NR₁₈R₁₉;

R₁₈是H或CH₃;

R₁₉是CH₃;

R₂₀是H，Cl，F，Br，CH₃，CF₃，OCH₃或

OCF₂H;

R₂₁是H或CH₃;

X是CH₃，OCH₃，OC₂H₅或NHCH₃;

Y是CH₃，C₂H₅，OCH₃，OC₂H₅，OCF₂H，

OCH₂CF₃，Cl，CH₂OCH₃或环丙基;

Z是CH或N;

规定

a）如果Y是Cl，则Z是CH，X是OCH₃;

b）如果Y是OCF₂H，则Z是CH;

c）如果J是J-1，R₁是OSO₂R₁₂或苯基，则Y不是OCF₂H;

d）如果J是J-2，则Y不是OCF₂H或OCH₂CF₃;

e）如果J是J-3，R₄是S（O）mR₁₂，则Y不是

OCH₂CF₃。

137、权利要求136的方法，其中

J是J-1;

R₁是Cl，CH₃，C₁-C₄烷氧基，C₁-C₂卤代烷氧基，

烯丙氧基，炔丙氧基，CO₂R₉，CONR₁₀R₁₁，

SO₂N（OCH₃）CH₃，SO₂NR₁₀R₁₁，S（O）mR₁₂，

OSO₂R₁₂，苯基或

138、权利要求136的方法，其中

J是J-2;

R是H;

R₃是SO₂N（CH₃）₂，CO₂CH₃或CO₂C₂H₅。

139、权利要求136的方法，其中

J是J-3;

R是H;

R₄是CO₂CH₃或CO₂C₂H₅。

140、权利要求136的方法，其中

J是J-4;

R是H;

R₅是Cl，Br，CO₂CH₃，CO₂C₂H₅或

;

R₆是CH₃;

R₇是H，Cl或OCH₃。

141、权利要求136的方法，其中

J是J-5;

R是H;

R₅是CO₂CH₃或CO₂C₂H₅;

R₇是H或CH₃。

142、权利要求136的方法，其中

J是J-6;

Q是CHCH₃或NR₁₅;

R是H;

R₈是H，F，Cl，CH₃，OCH₃，CF₃或SCH₃。

143、权利要求136的方法，其中

J是J-7;

R是H;

P是O;

R₈是H，F，Cl，CH₃，OCH₃，CF₃或SCH₃。

144、权利要求136的方法，其中

J是J-8;

R是H;

R₁₆是CH₃;

R₈是H，F，Cl，CH₃，OCH₃，CF₃或SCH₃。

145、权利要求136的方法，其中

J是J-9;

R是H;

R₁₇是C（O）N（CH₃）₂。

146、权利要求136的方法，其中

R是H;

R₁是Cl，C₁-C₄烷氧基，OCF₂H，OCH₂CH₂Cl，

CO₂R₉，CON（CH₃）₂，SO₂N（CH₃）₂，

SO₂R₁₂或OSO₂R₁₂;

R₂是H，Cl，CH₃或OCH₃。

147、根据权利要求134的方法，其中的除莠剂是由

构成的一组化合物中选出的一种化合物。其中

Ra是C₁-C₄烷基，F，Cl，Br，I，NO₂，

S（O）pRd，COOR_e或CF₃;

R_b是H，F，Cl，Br，I，C₁-C₄烷基或COOR_e;

R_c是H，C₁-C₄烷基，F，Cl，Br，I，CH₂OR_d，

苯基，NO₂或COOR_e;

R_d是C₁-C₄烷基;

R_e是C₁-C₄烷基，C₁-C₄烯烃基，C₁-C₄炔烃基，或

2-乙氧乙基;

V是H，C₁-C₃烷基，烯丙基，炔丙基，苄基或C₁-C₃烷羰基;

X₁，Y₁和Z₁分别是H，F，Cl，Br，I，C₁-C₄烷基，C₁-C₂烷硫基或C₁-C₄烷氧基;

P是0，1或2。

148、权利要求147的方法，其中V是H。

149、权利要求148的方法，其中

X₁是H或CH₃;

Y₁是H;

Z₁是CH₃;

R_a和R_c不同时是H。

150、根据权利要求134的方法，其中的除莠剂是以

Ⅲ

构成的一组化合物中选出的一种化合物。其中

R_f是C₁-C₄烷基;

R_g是C₁-C₄烷基或C₃-C₆环烷基;

A₁是COORi，CH₂OH或CHO;

Ri是H;由C₁-C₃烷基、C₃-C₆环烷基或苯基任意取代的

C₁-C₁₂烷基;由苯基或1-2个C₁-C₃烷基、F、Cl、

Br或I任意取代的C₃-C₅烯烃基;或由苯基或1-2个

C₁-C₃烷基、F、Cl、Br或I任意取代的C₃-C₅炔基;

B是H;由Cl、NO₂或OCH₃任意取代的C（O）

C₁-C₆烷基或C（O）苯基;

X₂是H，F，Cl，Br，I，OH或CH₃;

Y₂和Z₂分别是H，C₁-C₆烷基，C₁-C₆烷氧基，F、

Cl、Br、I、苯基，NO₂，CN，CF₃或SO₂CH₃;

X₃是H，C₁-C₃烷基，F，Cl，Br，I或NO₂;

L、M、Q和Rh分别是H，F，Cl，Br，I，CH₃，

OCH₃，NO₂，CF₃，CN，N（CH₃）₂，NH₂，SCH₃

或SO₂CH₃，规定M或Q中只有一个可以是不是H，F，

Cl，Br，I，CH₃或OCH₃的取代基。

151、权利要求150的方法，其中

B是H;

A₁是COORi。

152、权利要求151的方法，其中

R_f是CH₃;

R_g是CH（CH₃）₂;

X₂是H;

Y₂是H或C₁-C₃烷基或OCH₃;

Z₂是H;

X₃是H，CH₃，Cl或NO₂;

L、M、Q和Rh是H。

153、一种包括两个连锁的核酸片段的核酸片段，其中一个编码赋予除莠剂抗性的乙酰乳酸合酶，第二个核酸片段赋予第二种特性，所述核酸片段用于转化植物，在施用磺酰脲化合物以后，除莠剂抗性在所述植物中的表达被用来检测所述植物中是否存在所述的第二个核酸片段。

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