ES2372971T3

ES2372971T3 - Procedimiento de transformación que usa un gen de una acetolactato-sintasa mutante.

Info

Publication number: ES2372971T3
Application number: ES06746369T
Authority: ES
Inventors: Kinya Toriyama; Ayako Okuzaki; Koichiro Kaku; Kiyoshi Kawai; Tsutomu Shimizu
Original assignee: Tohoku University NUC; Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Tohoku University NUC; Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2012-01-30
Anticipated expiration: 2026-05-09
Also published as: EP1889902B1; WO2006121178A1; EP1889902A4; US20090217420A1; JPWO2006121178A1; CN101175849A; PT1889902E; KR101323617B1; CA2607645C; US8017400B2; JP4968685B2; CA2607645A1; KR20080033165A; EP1889902A1; CN101175849B

Abstract

Un procedimiento de transformación que comprende las etapas de: transformación de una célula hospedadora con un vector de recombinación que contiene un gen de interés y un gen que codifica una acetolactato-sintasa vegetal mutante con una mutación de glicina a alanina en un resto de glicina correspondiente a la posición 95 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; cultivo de la célula transformada obtenida en la primera etapa en presencia de un herbicida de carboxipirimidinilo, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante se usa como marcador de selección.

Description

Procedimiento de transformación que usa un gen de una acetolactato-sintasa mutante

Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a un procedimiento de transformación y a un procedimiento para el cultivo de una planta que usa una acetolactato-sintasa mutante en la que se introduce una mutación en una posición predeterminada de una acetolactato-sintasa natural.

Antecedentes

[0002] La acetolactato-sintasa (denominada en adelante “ALS”) es una enzima limitante de la velocidad en la ruta biosintética de los aminoácidos de cadena ramificada, como leucina, valina e isoleucina y es conocida como una enzima esencial para el crecimiento de las plantas. También se sabe que la ALS está presente en una amplia diversidad de plantas superiores. Además, la ALS se ha descubierto en diversos microorganismos, como levaduras (Saccharomyces cerevisiae), Escherichia coli y Salmonella typhimurium.

[0003] Se conocen tres tipos de isoenzimas de la ALS presentes en Escherichia coli y Salmonella typhimurium. Cada una de estas isoenzimas es un heterooligómero que consta de subunidades catalíticas de alto peso molecular que rigen la actividad catalítica de la enzima y subunidades reguladoras de bajo peso molecular que funcionan como inhibidores de retroalimentación a través de la unión de aminoácidos de cadena ramificada (Chipman y col., Biochim. Biophys. Acta 1385, 401-419, 1998 [documento no correspondiente a patente 1]). Las subunidades catalíticas se localizan en los operones iIvIH, iIvGM y e iIvBN, respectivamente. Además, la ALS en levaduras es una enzima única que consta de una subunidad catalítica y una subunidad reguladora, como en el caso der las bacterias (Pang y col., Biochemistry 38, 5222-5231, 1999 [documento no correspondiente a patente 2]). La subunidad catalítica de la proteína se localiza en el locus ILV2.

[0004] En las plantas, se sabe que la ALS consta de subunidades catalíticas y subunidades reguladoras, como en el caso de los microorganismos anteriores (Hershey y col., Plant Molecular Biology 40, 795-806, 1999 [documento no correspondiente a patente 3]). Por ejemplo, las subunidades catalíticas de la ALS en tabaco (dicotiledónea) están codificadas por dos loci génicos, SuRA y SuRB (Lee y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988 [documento no correspondiente a patente 4]), y las de maíz están codificadas por dos loci génicos, als1 y als2 (Burr y col., Trends in Genetics 7, 55-61, 1991 [documento no correspondiente a patente 5]; Lawrence y col., Plant Mol. Biol. 18, 1185-1187, 1992 [documento no correspondiente a patente 6]). Las secuencias nucleotídicas de los genes que codifican las subunidades catalíticas han sido determinadas en su totalidad para plantas dicotiledóneas, como tabaco, Arabidopsis, colza, algodón, Xanthium, Amaranthus y Kochia (véanse Chipman y col., Biochim. Biophys. Acta 1385, 401-419, 1998 [documento no correspondiente a patente 1] y la publicación internacional WO97/08327 [documento de patente 1]). Sin embargo, el maíz y el arroz son las únicas plantas monocotiledóneas para las que se han determinado las secuencias nucleotídicas en su totalidad.

[0005] Mientras tanto, se sabe que herbicidas como los herbicidas de sulfonilurea, los herbicidas de imidazolinona, los herbicidas de triazolopirimidina y los herbicidas de carboxipirimidinilo (denominados de ahora en adelante, “herbicidas de PC”) suprimen el crecimiento de las plantas por inhibición de la ALS (Ray, Plant Physiol. 75, 827-831, 1984 [documento no correspondiente a patente 7]; Shaner y col., Plant Physiol. 76, 545-546, 1984 [documento no correspondiente a patente 8]; Subramanian y col., Plant Physiol. 96, 310-313, 1991 [documento no correspondiente a patente 9]; Shimizu y col., J. Pestic. Sci. 19, 59-67, 1994 [documento no correspondiente a patente 10].

[0006] Se sabe que plantas con una o dos sustituciones de nucleótidos en un gen que codifica la ALS, que inducen una o dos sustituciones de aminoácidos en una región conservada entre diferentes especies, presentan resistencia a estos herbicidas. Algunos ejemplos de un gen semejante incluyen un gen que codifica una ALS con una fuerte resistencia a los herbicidas de sulfonilurea (véanse Kathleen y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988 [documento no correspondiente a patente 11]; Mourad y col., Planta 188, 491-497, 1992 [documento no correspondiente a patente 12]; Guttieri y col., Weed Sci. 43, 175-178, 1995 [documento no correspondiente a patente 13]; Bernasconi y col., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385, 1995 [documento no correspondiente a patente 14], y la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 63-71184 A (1988) [documento de patente 2]; un gen que codifica una ALS con una fuerte resistencia a los herbicidas de imidazolinona (véanse Mourad y col., Panta 188, 491-497, 1992 [documento no correspondiente a patente 12]; Lee y col., FEBS Lett. 452, 341-345, 1999 [documento no correspondiente a patente 15], y la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 5-227964 A (1993) [documento de patente 3]); un gen que codifica una ALS con una fuerte resistencia a los herbicidas de PC (véanse los documentos WO02/44385A1 [documento de patente 4] y WO03/083118A1 [documento de patente 5]), y un gen que codifica una ALS con resistencia a herbicidas de sulfonilurea, imidazolinona y PC (véanse Kathleen y col., EMBO J. 7, 12411248, 1988 [documento no correspondiente a patente 11]; Bernasconi y col., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385 [documento no correspondiente a patente 14]; Hattori y col., Mol. Gen. Genet. 246, 419-425, 1995 [documento no correspondiente a patente 16]; Alison y col., Plant Physiol. 111, 1353, 1996 [documento no correspondiente a patente 17]; Rajasekarau y col., Plant Sci. 119, 115-124, 1996 [documento no correspondiente a patente 18]; la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 63-71184 A (1988) [documento de patente 2]; la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 4-311392 A (1992) [documento de patente 6]; Bernasconi y col., patente de los EE. UU. 5633437, 1997 [documento de patente 7] y los documentos WO02/44385A1 [documento de patente 4] y WO03/083118A1 [documento de patente 5]).

[0007] Los documentos siguientes discuten también la mutación de la acetolactato-sintasa con el fin de conferir resistencia a herbicidas: Shimizu y col. (2005) Environmental Fate and Safety Management of Agrochemicals, vol. 899, páginas 255-271; Mazur y Falco (1989) Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology, vol. 40, páginas 441-470, y Okuzaki y col. (2004) Plant Cell Reports, vol. 22, páginas 509-512.

[0008] Se ha intentado la producción de una planta que muestre resistencia tanto a los herbicidas de sulfonilurea y como de imidazolinona mediante el cruzamiento de una planta con una ALS que muestra resistencia específicamente a los herbicidas de sulfonilurea con una planta con una ALS que muestra resistencia específicamente a los herbicidas de imidazolinona (Mourad y col., Mol. Gen. Genet. 243, 178-184, 1994 [documento no correspondiente a patente 19]). Además se ha intentado la alteración artificial de un gen que codifica una ALS para obtener un gen de resistencia a herbicidas (Véanse Ott y col., J. Mol. Biol. 263, 359-368, 1996 [documento no correspondiente a patente 20]; la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 63-71184 A (1988) [documento de patente 2]; la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 5-227964 A (1993) [documento de patente 3], y la publicación de patente japonesa (Kohyo) n° 11-504213 A (1999) [documento de patente 8]). De este modo, se ha puesto de manifiesto que la deleción de un solo aminoácido hace que la ALS muestre resistencia a los herbicidas tanto de sulfonilurea como de imidazolinona (véase la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 5-227964 A (1993) [documento de patente 3]).

[0009] Tal como se describe anteriormente, las ALS con resistencia a herbicidas y los genes codificantes de ALS se han estudiado intensamente. Sin embargo, hasta ahora no se han descrito casos relativos a un gen de una ALS mutante que presente resistencia específicamente a los herbicidas de PC solamente con el uso de la resistencia a herbicidas de PC como indicador. En caso de obtener un gen de una ALS mutante con resistencia específica a un herbicida específico, dicho gen de ALS mutante puede usarse para diversas aplicaciones. Hasta el momento no se han descrito casos relativos a un gen de una ALS mutante semejante que sea útil en cuanto a su especificidad para herbicidas de PC.

Documento no correspondiente a patente 1: Chipman y col., Biochim. Biophys. Acta 1385, 401-419, 1998

Documento no correspondiente a patente 2: Pang y col., Biochemistry 38, 5222-5231, 1999

Documento no correspondiente a patente 3: Hershey y col., Plant Molecular Biology 40, 795-806, 1999

Documento no correspondiente a patente 4: Lee y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988

Documento no correspondiente a patente 5: Burr y col., Trends in Genetics 7, 55-61, 1991

Documento no correspondiente a patente 6: Lawrence y col., Plant Mol. Biol. 18, 1185-1187, 1992

Documento no correspondiente a patente 7: Ray, Plant Physiol. 75, 827-831, 1984

Documento no correspondiente a patente 8: Shaner y col., Plant Physiol. 76, 545-546, 1984

Documento no correspondiente a patente 9: Subramanian y col., Plant Physiol. 96, 310-313, 1991

Documento no correspondiente a patente 10: Shimizu y col., J. Pestic. Sci. 19, 59-67, 1994

Documento no correspondiente a patente 11: Kathleen y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988

Documento no correspondiente a patente 12: Mourad y col., Planta 188, 491-497, 1992

Documento no correspondiente a patente 13: Guttieri y col., Weed Sci. 43, 175-178, 1995

Documento no correspondiente a patente 14: Bernasconi y col., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385, 1995

Documento no correspondiente a patente 15: Lee y col., FEBS Lett. 452, 341-345, 1999

Documento no correspondiente a patente 16: Hattori y col., Mol. Gen. Genet. 246, 419-425, 1995

Documento no correspondiente a patente 17: Alison y col., Plant Physiol. 111, 1353, 1996

Documento no correspondiente a patente 18: Rajasekarau y col., Plant Sci. 119, 115-124, 1996

Documento no correspondiente a patente 19: Mourad y col., Mol. Gen. Genet. 243, 178-184, 1994

Documento no correspondiente a patente 20: Ott y col., J. Mol. Biol. 263, 359-368, 1996

Documento de patente 1: publicación internacional WO97/08327

Documento de patente 2: publicación de patente japonesa (Kokai) n° 63-71184 A (1988)

Documento de patente 3: publicación de patente japonesa (Kokai) n° 5-227964 A (1993)

Documento de patente 4: publicación internacional WO02/44385

Documento de patente 5: publicación internacional WO03/083118

Documento de patente 6: publicación de patente japonesa (Kokai) n° 4-311392 A (1992)

Documento de patente 7: Bernasconi y col., patente de los EE. UU. n° USP 5.633.437

Documento de patente 8: publicación de patente japonesa (Kohyo) n° 11-504213 A (1999)

Descripción de la invención

[0010] En las circunstancias descritas anteriormente, un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para seleccionar eficazmente una célula transformada con el uso de un gen de una ALS mutante con alta especificidad para herbicidas de PC.

[0011] Como resultado de estudios intensivos para alcanzar el objetivo anterior, hemos puesto de manifiesto que una ALS con una mutación específica muestra una resistencia extremadamente alta a herbicidas de PC. También hemos descubierto que un gen que codifica una ALS con dicha mutación puede usarse como marcador de selección. Por lo tanto, hemos llevado a término la presente invención.

[0012] La presente invención abarca lo siguiente.

(1): Un procedimiento de transformación que comprende las etapas de:

transformación de una célula hospedadora con un vector de recombinación que contiene un gen de interés y un gen que codifica una acetolactato-sintasa vegetal mutante con una mutación de glicina a alanina en un resto de glicina correspondiente a la posición 95 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; cultivo de la célula transformada obtenida en la primera etapa en presencia de un herbicida de carboxipirimidinilo, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante se usa como marcador de selección.

(2): El procedimiento de transformación según (1), en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante es un gen que codifica la proteína (a) o (b) siguiente:

(a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2;

(b): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO:3 a

14.

(3): El procedimiento de transformación según (1), en que la célula hospedadora es una célula vegetal.

(4): Un procedimiento para el cultivo de una planta que comprende las etapas de:

transformación de una célula vegetal con un vector de recombinación que contiene un gen de interés y un gen que codifica una acetolactato-sintasa vegetal mutante con una mutación de glicina a alanina en un resto de glicina correspondiente a la posición 95 de SEQ ID NO:2; cultivo de la planta transformada obtenida en la primera etapa en presencia de un herbicida de carboxipirimidinilo, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante se usa como marcador de selección.

(5): El procedimiento para el cultivo de una planta según (4), en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante es un gen que codifica la proteína (a) o (b) siguiente:

14.

Breve descripción de los dibujos

[0013]

La figura 1 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos entre una proteína ALS mutante derivada de arroz y una proteína ALS natural derivada de arroz. La figura 2-1 muestra una comparación de secuencias de nucleótidos entre un gen de una ALS mutante derivada de arroz y un gen que codifica una proteína ALS natural derivada de arroz. La figura 2-2 muestra una comparación de secuencias de nucleótidos entre un gen de una ALS mutante derivada de arroz y un gen que codifica una proteína ALS natural derivada de arroz. La figura 2-3 muestra una comparación de secuencias de nucleótidos entre un gen de una ALS mutante derivada de arroz y un gen que codifica una proteína ALS natural derivada de arroz. La figura 3 muestra fotografías que muestran el enraizamiento de clones derivados de la línea G95A-1 y la línea G95A-2 en un medio de enraizamiento que contiene bispiribaco de sodio tal como se observa. La figura 4 es un diagrama esquemático para explicar el procedimiento de construcción de un vector de expresión de la ALS mutante G95A. La figura 5 es una figura característica que muestra la razón de resistencia del herbicida (razón RS) entre la ALS mutante G95A y la ALS natural, basada en la concentración inhibitoria del 50%.

Mejor modo de realización de la invención [0014] A continuación se proporcionará una explicación más detallada de la presente invención.

[0015] La proteína acetolactato-sintasa de la presente invención (denominada de ahora en adelante “proteína ALS mutante”) puede obtenerse por mutación de un sitio predeterminado en una proteína ALS natural. En una proteína ALS natural derivada de arroz, el aminoácido n° 95 desde la metionina N-terminal es glicina. En la proteína ALS mutante de la presente invención, la glicina 95 se ha sustituido con alanina. Específicamente dicha proteína ALS mutante derivada de arroz según la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos en la que la glicina 95 ha sido sustituida con alanina (denotada como G95A). La secuencia de nucleótidos de un gen (denominado de ahora en adelante “gen de la ALS mutante”) que codifica dicha proteína ALS mutante derivada de arroz y la secuencia de aminoácidos de dicha proteína ALS mutante se muestran en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente.

[0016] La figura 1 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos entre la proteína ALS mutante derivada de arroz y la proteína ALS natural derivada de arroz. Además, en la figura 1, la secuencia de aminoácidos en la primera línea representa la proteína ALS natural y la secuencia de aminoácidos en la segunda línea representa la proteína ALS mutante.

[0017] A diferencia del gen que codifica la proteína ALS natural derivada de arroz, el gen de la ALS mutante (SEQ ID NO:1) derivada de arroz se obtiene por sustitución de los codones que codifican la glicina 95 en la proteína ALS natural con codones que codifican alanina. Las figuras 2-1 a 2-3 muestran una comparación de la secuencia de nucleótidos entre el gen de la ALS mutante derivada de arroz y el gen que codifica la proteína ALS natural derivada de arroz. Además, en las figuras 2-1 a 2-3, la secuencia de nucleótidos en la primera línea representa el gen de la ALS natural y la secuencia en la segunda línea representa el gen que codifica la proteína ALS mutante.

[0018] Dicho gen de la ALS mutante puede obtenerse mediante la introducción de la mutación descrita anteriormente en un gen que codifica una proteína ALS natural presente en el ADN genómico de la variedad Taichung 65 (variedad de arroz del tipo japónica). Como técnica para introducir mutaciones puede emplearse cualquiera de las técnicas conocidas convencionalmente. Por ejemplo, puede emplearse la mutación dirigida. La mutación dirigida puede realizarse con un kit comercial, p. ej. Mutan-K (Takara Shuzo), Gene Editor (Promega) o ExSite (Stratagene). Además, un gen que codifique la proteína ALS mutante puede obtenerse por cultivo de células naturales sensibles a un herbicida de PC en presencia del herbicida de PC y obtención posterior del gen a partir de las células mutantes que aparecen y muestran resistencia al herbicida de PC.

[0019] El gen de la ALS mutante según la presente invención puede obtenerse no solo a partir del gen derivado de arroz mostrado en SEQ ID NO:1, sino también a partir de los genes de ALS derivados de una amplia diversidad de plantas. Por ejemplo, el gen de la ALS mutante según la presente invención puede obtenerse mediante la introducción de una mutación similar en un gen de ALS derivado de maíz, trigo, cebada, soja, algodón, colza, remolacha, raigrás italiano, tabaco, Arabidopsis thaliana o similares. En este caso, “mutación similar” significa una mutación a alanina de la glicina correspondiente a la glicina de la posición 95 (este número puede diferir dependiendo de las plantas en cuestión) en una proteína ALS natural derivada de arroz.

[0020] Las secuencias de aminoácidos de dos tipos de proteínas ALS mutantes derivadas de maíz se muestran en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos parciales de dos tipos de proteínas ALS mutantes derivadas de trigo se muestran en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de dos tipos de proteínas ALS mutantes derivadas de algodón se muestran en SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de dos tipos de proteínas ALS mutantes derivadas de colza se muestran en SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de dos tipos de proteínas ALS mutantes derivadas de tabaco se muestran en SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de una proteína ALS mutante derivada de raigrás italiano se muestra en SEQ ID NO:13. La secuencia de aminoácidos de una proteína ALS mutante derivada de Arabidopsis thaliana se muestra en SEQ ID NO:14.

[0021] La proteína ALS mutante según la presente invención muestra resistencia específicamente a herbicidas de PC, independientemente de su origen, siempre que la glicina correspondiente a la glicina 95 de una proteína ALS natural derivada de arroz se haya sustituido con alanina.

[0022] En comparación con las proteínas ALS naturales, la proteína ALS mutante muestra gran resistencia a herbicidas de PC. Esto puede confirmarse mediante la incorporación de un gen que codifica la proteína ALS mutante en un vector de expresión en Escherichia coli, por ejemplo, y el examen posterior de la sensibilidad de la ALS mutante (obtenida a partir de Escherichia coli así transformada mediante el vector de expresión) a herbicidas de PC.

[0023] En este documento, los ejemplos de herbicidas de PC incluyen bispiribaco de sodio, piritiobaco de sodio y piriminobaco, tal como se representan por las siguientes fórmulas químicas 1.

[0024] La expresión “…muestra resistencia específicamente a herbicidas de PC” significa que la resistencia a herbicidas de sulfonilurea o a herbicidas de imidazolinona distintos de los herbicidas de PC es significativamente 5 menor que la resistencia a herbicidas de PC. Algunos ejemplos de dichos herbicidas de sulfonilurea incluyen, tal como se representan por las fórmulas químicas 2, clorsulfurón, metilbensulfurón, etilpirazosulfurón e imazosulfurón.

10 [0025] Algunos ejemplos de herbicidas de imidazolinona incluyen imazaquina e imazapir, tal como se representan por las fórmulas químicas 3.

[0026] Según la presente invención, puede establecerse un procedimiento de transformación que permita la transformación eficiente con un gen de interés mediante el uso de un gen de una ALS mutante. Específicamente, dicho gen de una ALS mutante puede usarse como marcador de selección en un experimento de transformación de plantas. Por ejemplo, para transformar una célula vegetal con un gen de interés, se introduce un vector de recombinación con el gen de la ALS mutante y un gen de interés en la célula vegetal y después la célula vegetal se cultiva en presencia de un herbicida de PC. Si las células vegetales así obtenidas sobreviven en presencia del herbicida de PC, se confirma que son células vegetales en las que el gen de interés se ha introducido junto con el gen de la ALS mutante. Además, puede confirmarse si el gen de interés y el gen que codifica la proteína ALS mutante se han incorporado en los cromosomas de las células vegetales mediante observación del fenotipo de las plantas y examen posterior de la presencia de estos genes en el genoma por hibridación genómica de Southern o por PCR.

[0027] Como técnicas para la transformación de plantas pueden usarse las técnicas conocidas convencionalmente. Un ejemplo de una de estas técnicas es una técnica que supone la introducción de un gen foráneo en una célula vegetal diana por medio de Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens).

[0028] Más específicamente, el gen de la ALS mutante y un gen de interés se insertan en un vector binario que contiene la secuencia de ADN-T de un plásmido Ti de Agrobacterium. El plásmido Ti se transforma en Escherichia coli o similar. Después, los vectores binarios que retienen el gen de la ALS mutante y el gen de interés replicados, p. ej., en Escherichia coli, se transforman en una bacteria Agrobacterium sp. que contiene plásmidos auxiliares. Las plantas diana se infectan con la bacteria Agrobacterium sp. y después se identifican las plantas transformadas. Cuando las plantas transformadas identificadas están en forma de cultivos celulares, las células vegetales pueden regenerarse para obtener plantas completas por una técnica conocida convencionalmente.

[0029] Para transformar una planta diana con dicho vector de recombinación que contiene el gen de la ALS mutante y un gen de interés, el vector puede introducirse directamente en la planta mediante una técnica conocida convencionalmente. Además, algunos ejemplos de procedimientos de transformación con dicho vector de recombinación que contiene el gen de la ALS mutante y un gen de interés incluyen el procedimiento del polietilenglicol, el procedimiento de electroporación, el procedimiento de la pistola de genes y similares.

[0030] Mientras tanto, el gen de la ALS mutante y un gen de interés pueden transformarse en cualquier tipo de plantas, como plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Algunos ejemplos de cultivos diana para transformar con un gen semejante que codifica la proteína ALS mutante incluyen arroz, maíz, cebada, soja, algodón, colza, remolacha, tabaco y similares. Además, césped, arboles y similares también pueden transformarse mediante la introducción de dicho gen mutante y un gen de interés.

[0031] En cualquiera de los casos anteriores, la transformación de una planta mediante un gen de una ALS mutante puede conferir a la planta resistencia específicamente a herbicidas de PC. En particular, los herbicidas de PC son solubles en agua, a diferencia de los herbicidas de sulfonilurea o los herbicidas de imidazolinona, de modo que son fáciles de manejar. Además, el uso de un herbicida de PC semejante hace posible eliminar los efectos de un disolvente orgánico en las células del hospedador. Por lo tanto, un herbicida de PC semejante se usa preferentemente como herbicida en la transformación. Además, un herbicida de PC semejante muestra una actividad inhibidora de la ALS que es aproximadamente 100 veces superior a la de un herbicida de imidazolinona. Por lo tanto, los transformantes pueden seleccionarse con el uso de una cantidad extremadamente baja del herbicida de PC.

[0032] La presente invención se describirá a continuación por los ejemplos siguientes, pero el alcance técnico de la invención no se limita por estos ejemplos.

[Ejemplo 1] Inducción de callo (derivado de un cultivo de anteras)

[0033] Se recogieron panículas jóvenes, con una longitud de aurícula a aurícula de 6 cm a 8 cm, de la variedad “Taichung 65” (un cultivar de arroz del tipo japónica) en la etapa de embuchamiento, de modo que pudiera

5 obtenerse el número máximo de anteras en la fase mononucleada. En dicho momento se cortaron en agua porciones de los tallos por debajo de los nudos de los profilos o los cotiledones. Se eliminaron las hojas distintas de estos dos tipos de hoja (un cotiledón y un profilo) que envuelven directamente cada panícula joven.

[0034] Las porciones de la base de los tallos se envolvieron con toallas de papel empapadas con agua y

10 después se cubrieron con bolsas de vinilo, de modo que se realizó un tratamiento a baja temperatura durante 5 a 10 días en condiciones de oscuridad y a 10°C. Posteriormente, las panículas se separaron en una cámara de flujo laminar, se esterilizaron con etanol al 70% durante 10 minutos y después se secaron en toallas Kimtowel esterilizadas (Crecia, Tokio). Las flores glumáceas semitransparentes que contenían anteras en la fase mononucleada se abrieron mediante pinzas esterilizadas. Se extirparon solamente las anteras, que se colocaron en

15 medio de inducción de callo (medio N6CI, tabla 1). Las anteras se cultivaron en condiciones de luz continua a 30°C. Se subcultivaron en medio nuevo cada tres semanas.

Tabla 1

Medio de inducción de callo (N6CI), pH 5,8

Sales inorgánicas N6

Vitaminas N6

Sacarosa 30 g/l

2,4-D 2 mg/l

L(-)-prolina 2,878 g/l

Gelrita 3 g/l

Casaminoácidos 0,3 g/l

20 [Ejemplo 2] Selección de callo (derivado del cultivo de anteras) mediante bispiribaco de sodio

[0035] A las cinco semanas después de la inducción de callo, los callos (derivados del cultivo de anteras) se cultivaron en medio de inducción de callo con bispiribaco de sodio 0,25 μM durante cuatro semanas. A continuación, los callos crecidos se cultivaron en medio de rediferenciación (tabla 2) con bispiribaco de sodio 0,5 μM durante

25 cuatro semanas. De este modo se obtuvieron plantas rediferenciadas albinas. En todos los casos se realizó un subcultivo cada dos semanas.

Tabla 2

Medio de rediferenciación (pH 5,8) Sales inorgánicas MS Vitaminas N6 Sacarosa 30 g/l Sorbitol 50 g/l 2,4-D 2 mg/l NAA 1 mg/l BAP 2 mg/l Casaminoácidos 2 g/l L(-)-prolina 2,878 g/l Gelrita 4 g/l

30 El medio se ajustó a un volumen total de 1 litro, se autoclavó y después se le añadió bispiribaco de sodio.

[Ejemplo 3] Prueba de resistencia a bispiribaco de sodio

[0036] Las dos líneas de plantas seleccionadas por el procedimiento anterior se designaron línea G95A-1 y

35 línea G95A-2. Dado que eran plantas albinas se cultivaron en el medio MS y después se multiplicaron por división. Para evaluar el grado de resistencia a bispiribaco de sodio, los clones de las plantas obtenidas por división de la línea G95A-1 se trasplantaron a un medio de enraizamiento (tabla 3) que contenía bispiribaco de sodio 0 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM o 20 μM (figura 3A: a la izquierda en cada placa de Petri, de color blanco por ser albinos). Los clones de las plantas de la línea G95A-2 (estos clones son pocos en número) se evaluaron solo con bispiribaco de sodio 5

40 μM. Se usaron plantas de la variedad Taichung 65 de tipo natural a las dos semanas después de la siembra como miembros de un grupo de control (figura 3, a la derecha en cada placa de Petri). Las plantas se observaron una semana después del trasplante (figura 3B) y dos semanas después del trasplante (figura 3C). Como resultado, las plantas de las dos líneas G95A-1 y G95A-2 mostraron resistencia, observándose nuevo enraizamiento en las plantas de las dos líneas para todas las concentraciones de bispiribaco de sodio en el medio. Sin embargo, todas las plantas

45 de tipo natural del grupo de control se marchitaron en el medio con bispiribaco de sodio.

Tabla 3

Medio de la prueba de enraizamiento (pH 5,8)

Sales inorgánicas MS

Vitaminas N6

Sacarosa 30 g/l

Agar 8 g/l

El medio se ajustó a un volumen total de 1 litro, se autoclavó y después se le añadió bispiribaco de sodio.

[Ejemplo 4] Análisis de las secuencias de los genes de ALS de líneas albinas resistentes a bispiribaco de sodio.

[0037] Se colocaron hojas (aproximadamente 0,5 x 1 cm) de las dos líneas anteriores en tubos de 1,5 ml y luego se secaron a 50°C durante dos o más horas. Dentro de cada tubo se colocaron cuatro perlas de vidrio BZ-3 (Iuchiseieido), cada una con un diámetro de 3 mm. Las hojas se pulverizaron mediante un molino mezclador MM300 (Retsch). Después de la pulverización, se añadieron 300 μl de un tampón de extracción (Tris-HCl 200 mM (pH 7,5), NaCl 250 mM, EDTA 25 mM y SDS al 0,5%) para suspender el producto pulverizado. La suspensión se centrifugó a

14.000 rpm durante 5 minutos. Un volumen de 200 μl del sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y después se añadieron 200 μl de isopropanol. El producto resultante se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y, después, el precipitado así obtenido se secó al vació durante 3 minutos. Se añadieron 50 μl de 1/5 x TE al precipitado. El producto resultante se centrifugó a 14.000 rpm durante 1 minuto y de este modo se preparó una disolución de ADN genómico.

[0038] Las secuencias de todas las regiones de los genes de ALS se analizaron por secuenciación directa por PCR, usando el ADN genómico así preparado como molde y los cebadores siguientes. Para la PCR se usó ExTaq (TAKARA BIO INC.). Después de una desnaturalización inicial a 94°C durante 1 minuto, se realizaron 40 ciclos de reacción, cada uno de ellos compuesto de 94°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 segundos y 72°C durante 40 segundos. Con la combinación de los cebadores ALSF2 y ALS2R, se añadió la disolución potenciadora PCRx (Invitrogen), la desnaturalización inicial se realizó a 94°C durante 1 minuto y después se realizaron 40 ciclos de reacción, cada uno de ellos compuesto de 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto. Todos los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y después se purificaron mediante un kit de extracción en gel Mini Elute (QUIAGEN).

[0039] Las reacciones de secuenciación se realizaron con los productos de PCR como moldes, un kit de secuenciación ABI y los cebadores siguientes. Cuando se usaron los cebadores ALSF2 y ALS2R se añadió la disolución potenciadora Sequence Rx A (Invitrogen). Se llevaron a cabo 35 ciclos de reacción de secuenciación en las condiciones siguientes, 96°C durante 10 segundos, 50°C durante 5 segundos y 60°C durante 4 minutos. Después de la reacción de secuenciación, se determinaron las secuencias de nucleótidos mediante el analizador genético ABI PRISM 310 (Applied Biosystems, EE. UU.).

ALSF2 (5’-CCACCACCCACCATGGCTACG -3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos -12 a 9 del gen de ALS y SEQ ID NO:15) ALS2R (5’-GAAGAGGTGGTTGGTGATGA-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 326 a 345 del gen de ALS y SEQ ID NO:16) ALS12 (5’-GCAACCAACCTCGTGTCCGC-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 436 a 455 del gen de ALS y SEQ ID NO:17) ALS22 (5’-GAAGGCTTCCTGTATGACGC-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 620 a 639 del gen de ALS y SEQ ID NO:18) ALS13 (5’-GAATTGCGCTGGTTTGTTGA-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 868 a 887 del gen de ALS y SEQ ID NO:19) ALS23 (5’- CTCAATTTTCCCTGTCACACG-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 1051 a 1071 del gen de ALS y SEQ ID NO:20) ALS24F (5’-GGTAGCTTCCTCATGAACAT-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 1537 a 1556 del gen de ALS y SEQ ID NO:21) ALS24R (5’-AATGTTCATGAGGAAGCTAC-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 1538 a 1557 del gen de ALS y SEQ ID NO:22) ALS25 (5’-CATTCAGGTCAAACATAGGCC-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 1919 a 1989 del gen de ALS y SEQ ID NO:23)

[0040] Las secuencias de los genes de ALS de las dos líneas anteriores se examinaron tan como se describe anteriormente. En ambas líneas, el aminoácido 95 (glicina (GGC)) de la ALS había sido sustituido por alanina (GCC) mediante la sustitución de un solo nucleótido.

[Ejemplo 5] Construcción de un vector para la expresión de la ALS mutante G95A fusionada a GST

[0041] Se realizó una amplificación con un mutante de la ALS con dos mutaciones puntuales W548L/S627I

(véase el documento WO02/44385A1) derivado de arroz, incorporado en un vector pUC18, como molde, un cebador de sentido directo ALS-M5 (5’-TACCCGGGCNNNGCGTCCATGGAGATCCA-3’: correspondiente a los aminoácidos 92 a 101 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24), preparado por degeneración de los codones correspondientes a la glicina 95 y un cebador antisentido ALS-RspA (5’-TGTGCTTGGTGATGGA-3’; SEQ ID NO:25) correspondiente a los aminoácidos 191 a 196 de la secuencia de aminoácidos. El producto de PCR así amplificado se clonó en un vector pT7Blue-T. Con el vector se transformó Escherichia coli (cepa HB-101) según un procedimiento convencional.

[0042] Con el mismo juego de cebadores se realizó PCR de colonias y análisis de secuencias. De este modo, se obtuvieron colonias en las que la glicina (GGC) 95 había mutado a serina (AGC), cisteína (TGC), tirosina (TAT), alanina (GCA), valina (GTG), leucina (CTG), isoleucina (ATA), metionina (ATG), triptófano (TGG), fenilalanina (TTT), ácido aspártico (GAT), ácido glutámico (GAG) o arginina (CGG). En el caso del mutante de alanina, se extrajo el plásmido de un cultivo líquido de Escherichia coli y se digirió con SmaI. Después de la electroforesis, se purificó un fragmento del gen de la ALS mutante a partir del gel de agarosa. El fragmento del gen se ligó a un vector pUC18 en el que se había incorporado el gen de la ALS mutante con dos mutaciones puntuales W548L/S627I derivado de arroz (que había sido digerido con SmaI y tratado después con BAP para su purificación). Un fragmento NcoI que contenía la porción de G95A se escindió del vector pUC18 así obtenido que contenía el gen de la ALS mutante con tres mutaciones puntuales G95A/W548L/S627I. El fragmento NcoI escindido se ligó a un vector de expresión de proteínas (pGEX-2T) para Escherichia coli en el que se había incorporado un gen de la ALS natural (que había sido tratado con NcoI y después con BAP). Por lo tanto, se obtuvo un vector de expresión pGEX-2T que contenía un gen de una ALS mutante con una única mutación puntual G95A (figura 4).

[Ejemplo 6] Confirmación de la secuencia de nucleótidos del vector pGEX-2T en el que se había incorporado el gen de la ALS mutante G95A

[0043] Las células de Escherichia coli (cepa JM109) transformadas con el vector se cultivaron en diez tubos (2 ml, respectivamente) a 37°C durante 12 horas. El plásmido (500 μl) se extrajo mediante un aparato de extracción de plásmidos (TOMY DP-480) y se concentró por centrifugación a aproximadamente 200 μl. El producto se desaló mediante un kit GFX para la purificación de ADN de PCR y de bandas de gel (Amersham Bioscience) y finalmente se eluyó con 200 μl de agua esterilizada. El plásmido se sometió a una reacción de secuenciación con un kit de secuenciación en ciclos BigDye Terminator, versión 1.1. [Volumen total: 20 μl (ADN molde 13 μl, cebador (3,2 μmol/μl) 1 μl, mezcla previa 4 μl y tampón de dilución 2 μl), condiciones de reacción: desnaturalización inicial a 96°C (5 minutos) y 40 ciclos, cada uno de ellos compuesto de una desnaturalización a 96°C (5 segundos), un alineamiento a 50°C (5 segundos) y una elongación a 60°C (4 minutos), seguida de una elongación en el ciclo final a 60°C (9 minutos)] Después de la reacción de secuenciación, los nucleótidos fluorescentes en la disolución de reacción se eliminaron por filtración en gel con una columna AutoSeq G-50 (Amersham Bioscience). La muestra de reacción se midió con un analizador genético ABI PRIZM 310 y después se confirmó la secuencia. Como cebadores para la secuenciación se usaron las siguientes secuencias. PGEX-5 (5’-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’, cebador de sentido directo en el lado 5’ del gen de ALS y SEQ ID NO:26) ALS-RspC (5’-CAGCGACGTGTTCGCCTA-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 258 a 275 del gen de ALS y SEQ ID NO:27) ALS-M1 (5’-CCCCAGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTT-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 510 a 539 del gen de ALS y SEQ ID NO:28) ALS-Rsp3 (5’-CTGGGACACCTCGATGAAT-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 720 a 738 del gen de ALS y SEQ ID NO:29) ALS-Rsp7 (5’-AACTGGGATACCAGTCAGCTC-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 886 a 906 del gen de ALS y SEQ ID NO:30) ALS-Rsp1 (5’-GCTCTGCTACAACAGAGCACA-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 1192 a 1212 del gen de ALS y SEQ ID NO:31) 3-1-3 (5’-GATTGCCTCACCTTTCG-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 1346 a 1362 del gen de ALS y SEQ ID NO:32) 4-83-10 (5’-CAGCCCAAATCCCATTG-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 1457 a 1473 del gen de ALS y SEQ ID NO:33) 3-1-4 (5’-AGGTGTCACAGTTGTTG-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 1506 a 1522 del gen de ALS y SEQ ID NO:34) ALS-RspB (5’-TCAAGGACATGATCCTGGATGG-3’, cebador de sentido directo correspondiente a los nucleótidos 1892 a 1913 del gen de ALS y SEQ ID NO:35) ALS-Rsp2 (5’-AGTCCTGCCATCACCATCCAG-3’, cebador antisentido correspondiente a los nucleótidos 1906 a 1926 del gen de ALS y SEQ ID NO:36) PGEX-3 (5’-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3’, cebador antisentido en el lado 3’ del gen de ALS y SEQ ID NO:37)

[Ejemplo 7] Expresión del gen de la ALS mutante G95A y preparación de la ALS [0044] Las células de Escherichia coli transformadas con pGEX-2T con un gen de una ALS mutante G95A preparadas en el ejemplo 6 y las mismas transformadas con pGEX-2T (véase el documento WO02/44385A1) con un gen de una ALS natural se cultivaron respectivamente con agitación (precultivo) a 27°C en 2 ml de medio LB líquido

5 que contenía ampicilina. Después se cultivaron respectivamente en 250 ml de medio LB líquido que contenía ampicilina usando 1 ml del precultivo. Después del cultivo durante la noche se añadió IPTG 1 mM y se cultivaron durante 3 a 4 horas más. De este modo se indujo la expresión de la proteína de fusión con GST. Además, las células microbianas se lavaron con un tampón de extracción de ALS (tampón de fosfato de potasio (pH 7,5) con glicerol al 30% y MgCl2 0,5 mM) y después se almacenaron a -80°C.

10 [0045] La preparación y la purificación de la ALS a partir de Escherichia coli se llevaron a cabo por el procedimiento siguiente: primeramente, un precipitado de Escherichia coli almacenado a -80°C se suspendió en el tampón de extracción de ALS (2,5 ml del tampón de extracción de ALS se añadieron al precipitado obtenido de 50 ml de cultivo). La suspensión se sometió a ultrasonidos (sonicador W-225R, Heat Systems-Ultrasonics, microchip,

15 control de salida de 8, intervalos de aproximadamente 1 segundo y dos veces cada 40 segundos) y después se centrifugó a 15.000 x g y 4°C durante 20 minutos, de modo que se obtuvo el sobrenadante como una disolución enzimática cruda. Por lo tanto, se prepararon una disolución enzimática cruda de la proteína ALS mutante G95A fusionada a GST y una disolución enzimática cruda de la proteína ALS natural fusionada a GST.

20 [Ejemplo 8] Determinación de la actividad de la ALS expresada

[0046] Se preparó una disolución de reacción para usarla en la reacción para la determinación de la actividad mediante la mezcla de la proteína de fusión GST-ALS que había de someterse a la determinación de actividad con una disolución que comprendía piruvato de sodio 20 mM, pirofosfato de tiamina 0,5 mM, MgCl2 0,5 mM, 25 flavinadenindinucleótido 10 μM, valina (añadida para la inhibición de la actividad de la ALS derivada de Escherichia coli) 10 mM y tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,5) Se usaron 0,5 ml de la disolución de reacción. La reacción se llevó a cabo a 37°C durante 30 minutos después de la adición de la proteína de fusión GST-ALS que había de someterse a la determinación de actividad. La reacción se detuvo por adición de 0,05 ml de ácido sulfúrico 6 N. Después de finalizar la reacción, la disolución de reacción se sometió a una incubación a 37°C durante 60 30 minutos, de modo que el ácido acetoláctico presente en la disolución de reacción se transformó en acetoína. Posteriormente, para cuantificar la acetoína presente en la disolución de reacción se añadieron 0,05 ml de creatina al 0,5% (p/v) y 0,05 ml de a-naftol al 5% (p/v) disueltos en hidróxido de sodio 2,5 N, a lo que siguió una incubación a 37°C durante 10 minutos. La acetoína se cuantificó después por comparación de color de la absorbancia a 525 nm de la disolución de reacción, evaluando así la actividad de la ALS. El valor en el momento 0 (horas) de la reacción se

35 usó como valor de control. Para examinar la actividad inhibitoria del herbicida, se prepararon disoluciones acuosas de bispiribaco de sodio y de piritiobaco de sodio, cada una 100 veces concentrada, y después se añadieron a la disolución de reacción. En el caso de piriminobaco, clorsulfurón, metilbensulfurón, imazaquina e imazapir, que presentan baja solubilidad en agua, se preparó una disolución 100 veces concentrada de cada uno en acetona, que después se añadió a la disolución de reacción.

40 [Ejemplo 9] Sensibilidad de la ALS mutante G95A frente a herbicidas

[0047] Se examinó la actividad inhibitoria de diversos inhibidores de la ALS frente a la ALS mutante G95A así expresada. De este modo se puso de manifiesto que la actividad inhibitoria de bispiribaco de sodio, de piritiobaco de

45 sodio y de priminobaco fueron extremadamente débiles (actividad inhibitoria del 50% o inferior a 100 μM), pero la inhibición por clorsulfurón fue intensa, y metilbensulfurón, imazaquina e imazapir también mostraron actividad inhibitoria (tabla 4).

Tabla 4

Sensibilidad de la ALS mutante G95A frente a herbicidas

BS: PS PM CS BM IQ IP

Primero: 17,9% 12,1% 22,9% 0,0023 0,268 1,653 46,041

Segundo: 16,8% 12,8% 23,3% 0,0030 0,294 1,886 44,612

Tercero: 18,4% 18,1% 29,2% 0,0027 0,271 1,848 49,705

Cuarto: - - - 0,0028 - - -

Quinto: - - - 0,0021 - - -

Sexto: - - - 0,0019 - - -

Media: 17,7% 14,3% 25,1% 0,0025 0,278 1,80 46,8

EE: 0,47% 1,9% 2,0% 0,0002 0,008 0,07 1,52

BS: bispiribaco de sodio, PS: piritiobaco de sodio, PM: piriminobaco, CS: clorsulfurón, BM: metilbensulfurón, IQ: imazaquina, IP: imazapir

[0048] Además, en la tabla 4, la unidad de todas las cifras numéricas en las que no se indica unidad es μM (concentración inhibitoria del 50%). Las cifras numéricas indicadas con % denotan el porcentaje de inhibición a 100 μM. EE denota el error estándar.

[0049] La concentración inhibitoria del 50% de cada herbicida para la ALS mutante G95A se comparó con la

concentración inhibitoria del 50% del herbicida para la ALS natural (ALS natural fusionada a GST), de modo que se

calculó la razón de resistencia (razón RS) de la concentración inhibitoria del 50% para la ALS mutante G95A frente a

5 aquella para la ALS natural. Las razones RS en los casos de piribaco de sodio, piritiobaco de sodio y piriminobaco

fueron de 16.000:1 o más, 9.100:1 o más y 13.000:1 o más, respectivamente. En contraste, las razones RS en los

casos de clorsulfurón, metilbensulfurón, imazaquina e imazapir fueron de 0,19:1, 40:1, 0,82:1 y 4,9:1,

respectivamente. Por consiguiente, se demostró que la ALS mutante G95A muestra específicamente una fuerte

resistencia a los herbicidas de PC (tabla 5 y figura 5). Además, en la figura 5, BS denota bispiribaco de sodio, PS 10 denota piritiobaco de sodio, PM denota piriminobaco, CS denota clorsulfurón, BM denota metilbensulfurón, IQ

denota imazaquina e IP denota imazapir.

Tabla 5

Razón de la resistencia contra herbicidas: ALS mutante G95A frente al tipo natural

Herbicida: Concentración inhibitoria del 50% (μM) Razón de resistencia (razón RS)

Tipo natural: Mutante G95A

Bispiribaco de sodio: 0,0063 > 100 > 16.000

Piritiobaco de sodio: 0,011 > 100 > 9.100

Piriminobaco: 0,0080 > 100 > 13.000

Clorsufurón: 0,013 0,0025 0,19

Metilbensulfurón: 0,0070 0,28 40

Imazaquina: 2,2 1,8 0,82

Imazapir: 9,6 47 4,9

15 [Conclusión]

[0050] Según los ejemplos anteriores, se puso de manifiesto que la proteína ALS mutante preparada mediante la introducción de una mutación G95A en la proteína natural derivada de arroz muestra resistencia específicamente a herbicidas de carboxipirimidinilo. Por lo tanto, se demostró que mediante el uso de las

20 propiedades de la proteína ALS mutante que muestra una especificidad tan excelente, las células que expresan la proteína ALS mutante pueden seleccionarse eficazmente con certeza de las células que no expresan dicha proteína en presencia de herbicidas de PC.

[0051] Además, en los ejemplos anteriores se usó un gen de ALS derivado de arroz. Sin embargo, el alcance

25 técnico de la presente invención no se limita al procedimiento de transformación con el gen de la ALS mutante derivado de arroz. En general, se sabe que los genes de ALS presentan gran homología entre diferentes plantas. Además, se sabe también que una mutación específica en un gen de ALS tiene efectos similares en varias especies de plantas. Por lo tanto, según los ejemplos, se puso de manifiesto que las proteínas ALS mutantes derivadas de maíz, trigo, cebada, soja, algodón, colza, remolacha, tabaco y similares que contenían una mutación igual a la

30 mutación G95A mostraban de manera similar resistencia específica a herbicidas de carboxipirimidinilo.

Aplicabilidad industrial

[0052] Tal como se describe en detalle anteriormente, según la presente invención, puede proporcionarse un

35 procedimiento de transformación de una eficiencia excelente mediante el uso de una acetolactato-sintasa mutante que muestra una resistencia extremadamente alta a los herbicidas de PC como marcador de selección.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0053]

5 <110> KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD, UNIVERSIDAD DE TOHOKU

<120> Procedimiento de transformación que usa un gen de una acetolactato-sintasa mutante

<130> PH-2806-PCT

<150> JP 2005-136186 10 <151>

<160> 37

<170> PatentIn, versión 2.1

<210> 1 15 <211> 1935

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> Secuencia codificante 20 <222> (1)..(1935)

<400> 1

<210> 2

<211> 644

<212>: Proteína 5 <213> Oryza sativa

<400> 2

<210> 3

<211> 638

<212>: Proteína 5 <213> Zea mays

<400> 3

<210> 4

<211> 638

<212>: Proteína 5 <213> Zea mays

<400> 4

<210> 5

<211> 598

<212> Proteína

<213> Triticum aestivum 5 <400> 5

<210> 6

<211> 598

<212>: Proteína 5 <213> Triticum aestivum

<400> 6

<210> 7

<211> 659

<212>: Proteína 5 <213> Gossypium hirsutum

<400> 7

<210> 8

<211> 659

<212>: Proteína 5 <213> Gossypium hirsutum

<400> 8

<210> 9

<211> 637

<212>: Proteína 5 <213> Brassica napus

<400> 9

<210> 10

<211> 599

<212>: Proteína 5 <213> Brassica napus

<400> 10

<210> 11

<211> 667

<212>: Proteína 5 <213> Nicotiana tabacum

<400> 11

<210> 12

<211> 664

<212>: Proteína 5 <213> Nicotiana tabacum

<400> 12

<210> 13

<211> 640

<212>: Proteína 5 <213> Lolium multiflorum

<400> 13

<210> 14

<211> 670

<212>: Proteína 5 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 14

<210> 15

<211> 21

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 15 ccaccaccca ccatggctac g 21

<210> 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 16 gaagaggtgg ttggtgatga 20

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 17 gcaaccaacc tcgtgtccgc 20

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 18 gaaggcttcc tgtatgacgc 20

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 19 gaattgcgct ggtttgttga 20

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 20 ctcaattttc cctgtcacac g 21

<210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 21 ggtagcttcc tcatgaacat 20

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 22 aatgttcatg aggaagctac 20

<210> 23

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 23 cattcaggtc aaacataggc c 21

<210> 24

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<220>

<221> Elemento mixto

<222> 10

<223> n es a, g, c o t

<220>

<221> Elemento mixto

<222> 11

<223> n es a, g, c o t

<220>

<221> Elemento mixto

<222> 12

<223> n es a, g, c o t

<400> 24 tacccgggcn nngcgtccat ggagatcca 29

<210> 25

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 25 tgtgcttggt gatgga 16

<210> 26

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 26 gggctggcaa gccacgtttg gtg 23

<210> 27

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 27 cagcgacgtg ttcgccta 18

<210> 28

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 28 ccccagccgc atgatcggca ccgacgcctt 30

<210> 29

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 29 ctgggacacc tcgatgaat 19

<210> 30

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 30 aactgggata ccagtcagct c 21

<210> 31

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 31 gctctgctac aacagagcac a 21

<210> 32

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 32 gattgcctca cctttcg 17

<210> 33

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 33 cagcccaaat cccattg 17

<210> 34

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 34 aggtgtcaca gttgttg 17

<210> 35

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 35 tcaaggacat gatcctggat gg 22

<210> 36

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 36 agtcctgcca tcaccatcca g 21

<210> 37

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

5 <400> 37 ccgggagctg catgtgtcag agg 23

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de transformación que comprende las etapas de:

transformación de una célula hospedadora con un vector de recombinación que contiene un gen de interés y un gen que codifica una acetolactato-sintasa vegetal mutante con una mutación de glicina a alanina en un resto de glicina correspondiente a la posición 95 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2;

cultivo de la célula transformada obtenida en la primera etapa en presencia de un herbicida de carboxipirimidinilo, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante se usa como marcador de selección.
2. El procedimiento de transformación según la reivindicación 1, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante es un gen que codifica la proteína (a) o (b) siguiente:

(a)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2;

(b)

una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO:3 a 14.
3.

El procedimiento de transformación según las reivindicaciones 1 ó 2, en que la célula hospedadora es una célula vegetal.
4.

El procedimiento de transformación según la reivindicación 3, en el que dicha célula hospedadora es una célula de arroz, maíz, trigo, cebada, soja, algodón, colza, remolacha, raigrás italiano, tabaco o Arabidopsis thaliana.
5.

Un procedimiento para el cultivo de una planta, que comprende las etapas de:

transformación de una célula vegetal con un vector de recombinación que contiene un gen de interés y un gen que codifica una acetolactato-sintasa vegetal mutante con una mutación de glicina a alanina en un resto de glicina correspondiente a la posición 95 de SEQ ID NO:2;

cultivo de la planta transformada obtenida en la etapa anterior en presencia de un herbicida de carboxipirimidinilo, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante se usa como marcador de selección.
6. El procedimiento para el cultivo de una planta según la reivindicación 5, en que el gen que codifica la acetolactatosintasa mutante es un gen que codifica la proteína (a) o (b) siguiente:

(a)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2;

(b)

una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO:3 a 14.
7. El procedimiento según las reivindicaciones 5 ó 6, en que dicha planta es arroz, maíz, trigo, cebada, soja, algodón, colza, remolacha, raigrás italiano, tabaco o Arabidopsis thaliana.