FR2658987A1 - Transformation genetique et regeneration de la betterave sucriere. - Google Patents

Abstract

Procédé de transformation de cellule végétale appartenant à l'espèce Beta vulgaris caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes: I) induction de cals blancs friables à partir d'explant; II) dispersion des cals dans un milieu de culture cellulaire végétale liquide contenant 0 à environ 3.0 mgl- 1 d'une cytokinine, ou obtention d'une suspension cellulaire à partir des cals dans un milieu de culture cellulaire végétale liquide contenant environ 0.1 à environ 3.0 mgl- 1 d'une cytokinine; III) mise en contact de la dispersion ou de la suspension cellulaire, avec Agrobacterium tumefaciens contenant un vecteur portant un gène destiné à être introduit dans les cellules végétales, suivie de coculture des cellules végétales et des bactéries; IV) lavage des cellules végétales pour éliminer les bactéries; V) sélection des cellules transformées sur un milieu sélectif; VI) culture des cellules transformées sélectionnées pour obtenir des cals friables transformés.

Description

TRANSFORMATION GENETIQUE ET REGENERATION
DE LA BETTERAVE SUCRIERE
L'invention concerne un procédé de transformation génétique de cellules végétales appartenant à l'espèce
Beta vulgaris, suivie éventuellement par une étape de régénération de cellules transformées en plante entière.

L'invention concerne également les cellules transformées, les bourgeons, les plantes et les graines transgéniques produits par ce procédé.

Les références bibliographiques apparaissant dans la description de l'invention sont répertoriées sous forme de bibliographie.

L'obtention de plantes transgéniques met en oeuvre le transfert du fragment d'ADN sélectionné dans la cellule végétale, la sélection des cellules transformées de façon stable et la régénération de plantes entières à partir des cellules sélectionnées transformées.

Le problème technique qui s'est posé lors de l'élaboration de la présente invention était de trouver une méthode de transformation de cellules de betterave présentant une fréquence de transformation élevée qui pouvait être associée avec succès à une méthode de régénération de plante transgénique. A ce jour, une telle méthode de tranformation et de régénération n'a pas été décrite.

Actuellement, il existe deux grandes voies de transfert d'ADN dans les cellules végétales
- La première voie est une voie physico-chimique (électroporation, microinjection, polycations, canon à particules).

Chez la betterave, des cellules transformées de manière stable ont été sélectionnées après électroporation d'un gène codant pour la résistance à la kanamycine dans les protoplastes (Lindsey et al, 1989).

Cependant, ce procédé n'a jamais pu conduire à la création de betteraves transgéniques puisque la régénération de plantes à partir de protoplastes n'a pu être obtenue chez cette espèce.

- La deuxième voie est une voie biologique utilisant comme vecteur une bactérie du sol : Aqrobacterium tumefaciens ou rhizogenes.

Différentes souches de ces deux espèces ont été utilisées avec succès pour la transformation de cellules de betteraves. Ces cellules transformées ont donné naissance soit à des tumeurs avec Aqrobacterium tumefaciens (Krens et al, 1988) soit à des racines avec
Aqrobacterium rhizoqenes (Yacoub et al, 1987). Ces tissus transformés (racines et tumeurs) n'ont jamais permis à ce jour la régénération de plantes chez la betterave. Ceci vient du fait que ces deux phénotypes sont les résultats de l'intégration dans le génome de la cellule non seulement du fragment d'ADN desiré mais aussi d'un fragment d'ADN de la bactérie qui perturbe l'équilibre hormonal de la cellule (Akiyoshi et al, 1983). Pour pallier ces problèmes, ces gènes ont ete délétés, donnant de nouvelles souches d'Aqrobacterium dites souches désarmées.

Les trois souches d'Aqrobacterium tumefaciens désarmées utilises dans le travail decrit ici sont LBA 4404 (Hoekema et al, 1983 ; EHA 101 (Hood et al, 1986)
C58'3 (Dale et al, 1989).

L'utilisation des souches d'Aqrobacterium desarmées implique l'association d'un système selectif pour la transformation de cellules végétales. Le succès dans l'obtention de transformants est étroitement lié à la mise au point d'un bon système sélectif. Le gène selectif le plus utilise dans ce domaine est celui provenant du transposon Tn5 d'Escherichia coli (Rothstein et al, 1981) codant pour la néomycine phosphotransférase (NPT II) qui confère la résistance à la kanamycine (An et al, 1985).

La plupart des vecteurs plasmidiques utilisés dans ces souches desarmées contiennent dans 1'ADN transférable, outre le gène désiré, le gène NPT II, sous le contrôle de signaux de transcription végetaux (Bevan, 1984 ; An, 1986). Le système de sélection comprend d'une part le gène conférant la résistance, et d'autre part, l'agent sélectif. Ceci implique de déterminer les concentrations d'agent sélectif permettant à la fois de tuer les cellules non transformées et de laisser croître les cellules transformées. Les seuls travaux publiés concernant la sélection de cellules de betterave après transformation d'explants pluricellulaires par
Aqrobacterium font appel à un autre système sélectif hygromycine B / hygromycine B phosphotransferase (Harpster et al, 1988).

La transformation par Aqrobacterium nécessite dans un premier temps le choix d'un type de cellule ou d'un type d'explant qui va faire l'objet de la transformation.

Par exemple, des explants tels que des hypocotyles, des morceaux de feuilles (Krens et al, 1988) peuvent être transformés par Aqrobacterium.

La fréquence de transformation peut varier selon le type de cellule ayant fait l'objet de la transformation, cette variabilité étant souvent d'une nature imprévisible.

Lors de la production d'une plante transgénique, la transformation est associée à un procédé de régénération.

L'efficacite d'obtention des transformants dépend de la fréquence de régénération de plantes à partir de cellules transformées d'une part, et la fréquence de transformation des cellules d'autre part.

Par exemple, la transformation de tronçons de pétioles de betterave a donné des cals transformés sélectionnés sur kanamycine. Cependant, il n'a jamais été possible de régénérer des plantes à partir de ces cals transformés issus de pétioles, bien que la régénération d'embryons somatiques et de bourgeons à partir de ce type de cal dans l'état non-transformé ait été reportée (Tetu et al, 1987). Cet échec n'est pas surprenant si on prend en compte la faible fréquence de régénération décrite.

Ceci traduit bien les problèmes de régénération de plantes non transformées à partir d'explants rencontrés depuis longtemps chez la betterave sucrière (Ritchie et al, 1989). Plusieurs auteurs ont décrit la régénération directe de bourgeons adventifs à partir de fragments de pétioles de plantes en multiplication végétative (Detrez et al, 1988 ; Freytag et al, 1988). Bien que ce phénomène se soit avéré reproductible dans des conditions appliquées par les inventeurs, la fréquence s'est révélée beaucoup trop faible pour être associée à la transformation. D'autres part, il semble que ces néoformations proviennent de massifs cellulaires non accessibles à la bactérie et apparemment peu sensibles à un agent sélectif.

La dernière technique de régénération de plantes à partir de cellules de betteraves à sucre est celle décrite par Saunders et al (1986). Elle met en jeu dans un premier temps, l'induction de cals friables indépendants d'hormones et initiés probablement à partir des cellules épidermiques du limbe, puis dans un deuxième temps, la régénération de bourgeons et d'embryons somatiques à partir de ces cals. Cette technique a été facilement reproductible sur plusieurs variétés de betteraves sucrières. Un des intérêts de ce processus est la possibilité d'obtenir aisément des suspensions cellulaires à partir de cals friables dont le potentiel organogène peut être entretenu pendant quelques mois.

Les inventeurs ont utilise ce matériel organogène, c'est-à-dire les cals friables, pour l'associer à la transformation par Aqrobacterium tumefaciens.

I1 y a encore peu de temps la transformation de suspensions cellulaires ne paraissait pas concevable selon le dogme établi que le transfert d'ADN par
Aqrobacterium dans une cellule végétale nécessitait des lésions cellulaires. Cependant, des auteurs ont reporté la transformation de cellules en suspens ion chez le tabac et la carotte (AN, 1985 ; Scott et Draper, 1987). A ce jour, la transformation de cellules en suspension chez la betterave n'a pas été décrite. Par ailleurs, il est à noter que les méthodes de transformation qui s'appliquent avec succès à une espèce végétale ne peuvent pas être étendues systématiquement à d'autres espèces. Les conditions de transformation, les matériels de départ et les milieux de culture sont des paramètres variables spécifiques à chaque espèce.

La présente invention décrit
- la transformation de suspens ions cellulaires habituées, donnant des cals et suspensions cellulaires transformes ;
- la transformation de suspens ions cellulaires regénérantes donnant des cals, des suspensions cellulaires et des plantes transformes ;
- la transformation de cals friables donnant des cals, des suspensions cellulaires et des plantes transformés.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de transformation de cellules végétales appartenant à espèce Beta vulgaris caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes
I) induction de cals blancs friables à partir d'explant ;
II) dispersion des cals dans un milieu de culture cellulaire végétale liquide contenant 0 à environ 3.0 mgl-1 d'une cytokinine, ou obtention d'une suspension cellulaire à partir des cals dans un milieu de culture cellulaire végétale liquide contenant environ 0.1 à environ 3.0 mgl-1 d'une cytokinine ;;
III) mise en contact de la dispersion, ou de la suspension, avec Aqrobacterium tumefaciens contenant un vecteur portant un gène destiné à être introduit dans les cellules végétales, suivie de coculture des cellules végétales et des bactéries
IV) lavage des cellules végétales pour eliminer les bactéries ;
V) sélection des cellules transformées sur un milieu sélectif ;
VI) culture des cellules transformées sélectionnées pour obtenir des cals friables transformés.

Les figures 1 et 2 illustrent différents aspects de l'invention.

La figure 1 montre le vecteur binair pGA-ss-3-lB, qui est utilisé dans la transformation de cellules de betteraves à titre d'example. La légende de la figure 1 est la suivante
355, promoteur 355 du Cauliflower Mosaic Virus 5'NOS, promoteur du gène de la nopaline synthase - NOS, terminateur du gène de la nopaline synthase - NPT, gène de la néomycine phosphotransférase - UID A, gène de la ss-glucuronidase d'E. coli - BR et BL, bordures droite et gauche du T-DNA de pTiT 37 - amp, gène de resistance à l'ampicilline - tet., gène de résistande à la tetracyline - Kana., gène de résistance à la kanamycine - E, EcoRI
H, Hind III - S, Sst I -, origine de replication du RK2.

La figure 2 montre une analyse par Western blot d'extraits proteiques de 3 betteraves transgéniques à l'aide de deux sérums : un sérum anti-BNYVV et un sérum anti-p-glucuronidase.

Abbreviations : L, limbe ; P, pétiole . Te, témoin
S, suspension cellulaire transformée ; 2ng, 2ng de BNYVV purifie ; 14-3, 22-1 et 68-1 réfèrent à 3 betteraves transgéniques différentes.

Le tableau 1 montre la composition des différents milieux de culture utilisés dans le procédé de l'invention.

TABLEAU 1 : MILIEU DE CULTURE
MS :
Pour 1 litre
4.4 g de milieu de Nurashige et Skoog
déshydratés de chez SIGMA réf. M6899.

Vitamines
1 mg panthoténate de calcium
0,01 mg biotine
1 mg acide nicotinique
1 mg pyridoxine HC1
10 mg thiamine HC1 30 g saccharose pH : 5.8
Milieu solide : 8 g agar-agar
MSB1 NS + 1 mg/l BAP
MSBo.l MS + 0.1 mg/l BAP MS enracinement MS + 1 mg/l ANA
Etalement des cellules
MSB1 + C = MSB + 300 mg/l cefotaxime
MSB1 + CK = MSB + 300 mg/l céfotaxime + + 200 mg/l kanamycine
LB
Pour 1 litre
10 g bactotryptone
5 g yeast extract
10 g NaCl
La photo montre des betteraves transgeniques après 4 mois d'acclimatation en serre.

La première étape de la transformation est l'induction de cals blancs friables à partir d'explants de betterave. Les explants qui peuvent servir dans cette étape peuvent être par exemple des disques de feuilles, des tronçons de pétioles, etc. De préférence, les explants sont des morceaux de jeunes feuilles prélevées d'une plante âgee de moins de trois mois.

Par exemple, après germination de graines de betterave d'environ un mois, de jeunes feuilles de 3 à 5 cm de long sont prelevées de chaque plante et sont soumises à une étape de désinfection et rinçage. Chaque feuille est ensuite decoupée en petits morceaux de 0,25 cmZ à 1.0 cm2. Les feuilles peuvent être prélevees de la plante jusqu'à deux mois environ après les premiers prélèvements. Après cette période, l'aptitude de régénération des feuilles diminue. Les disques de feuilles sont ensuite mis en culture sur un milieu de 1culture cellulaire végétale contenant de 0,1 à 5,0 mil'l cytokinine.De préférence, la cytokinine est présente à raison d'environ 1.0 mgl~ et peut être la 6benzylaminopurine (BAP), la zéatine, la kinêtine. La BAP est particulièrement préférée. Le milieu de culture cellulaire végétale est avantageusement le milieu de Murashige et Skoog (1962), dit milieu M.S. Les explants sont cultives à 30"C environ pendant 30 jours dans l'obscurité, et ensuite ils sont sortis en chambre de culture avec une photopériode de 18/24 H par exemple à environ 25"C le jour et 20"C la nuit.

De 4 à 10 semaines après la mise en culture, des cals blancs friables apparaissent autour, sur ou sous les explants foliaires.

L'étape suivante du procédé de transformation est la production d'une suspension cellulaire à partir des cals, ou d'une dispersion des cals dans un milieu de culture liquide. Cette suspension ou dispersion sera utilisée ultérieurement pour la transformation.

La suspension cellulaire est obtenue par mise en culture des cals, 4 à 6 semaines après leur apparition dans un milieu de culture liquide additionné de 0,1 à 3,0 mgl1 d'une cytokinine, par exemple de la BAP. Cette étape de culture dure 2 à 3 semaines et est effectuée sous agitation. Le milieu de culture est avantageusement le milieu M.S. Un milieu particulièrement préfére est le milieu M.S additionné de 1 mgl'l BAP. Ce milieu sera appelé le milieu MSB1 dans ce qui suit. Sa composition est indiquée dans le tableau I.

La suspension cellulaire s'établit en 2 ou 3 semaines. Chaque suspension est ensuite repiquee toutes les 3 semaines par filtration des suspens ions sur trois tamis empilés, donnant lieu à trois fractions (par exemple > 1 mm ; > 500 pm, > 100 pu). Une partie de chaque fraction est remise en suspension dans du milieu liquide, par exemple le milieu MSB1, et ces nouvelles suspensions sont agitées.L'observation des différentes suspensions permet de distinguer deux types cellulaires, notamment
- type habitue (A) : suspension fine, verte à croissance rapide, régénère ponctuellement des formations vitrifiées se développant difficilement
- type noduleux (C) : suspension d'agrégats compacts jaunâtres, à croissance plus lente, régénère plus frequemment que la première, des structures embryonnaires compactes se développant assez bien. Ce type est aussi connu sous le nom "type régénérant".

La production d'une dispersion des cals s'effectue par dispersion des cals apparus depuis 2 à 6 semaines sur les explants, dans un milieu de culture liquide contenant
O à 3,0 mgl1 cytokinine, par exemple le milieu MSB1. Les deux types cellulaires, habitue et noduleux, peuvent aussi être observés dans les dispersions. Les cals en dispersion peuvent être examinés avant la transformation dans le but de separer les deux types cellulaires, c'est-à-dire noduleux et habitué. Un examen visuel des cals permet de repérer les deux types qui sont ensuite enlevés du milieu avec une pince et redisperses. Les deux types peuvent être soumis à la transformation mais il est préférable de transformer le type noduleux si la régénération de la plante est désirée ultérieurement.

La suspension cellulaire ou la dispersion des cals est ensuite mise en contact avec la bacterie
Aqrobacterium tumefaciens.

Le protocole de transformation est le même, qu'il soit effectue sur des suspens ions cellulaires ou sur les dispersions. Un échantillon des bactéries dans du milieu frais est ajouté à la suspension ou à la dispersion des cellules de betterave. La coculture des cellules vegétales et des bacteries se fait à l'obscurité pendant trois jours environ, en chambre de culture.

L'Aqrobacterium utilise dans la transformation contient un vecteur portant un gène destiné à être introduit dans les cellules de betterave. Les souches utilises par les inventeurs contiennent des vecteurs binaires portant le gène d'intérêt. Bien évidemment, le gène d'intérêt est place sous le contrôle de signaux regulateurs appropries, par exemple un promoteur permettant son expression dans la cellule végétale et, le cas échéant, dans la plante transgénique régénérée. Comme gène, on peut citer des gènes codants pour des caractères agronomiques intéressants, par exemple la résistance aux herbicides, aux insecticides et aux virus. Un exemple d'un gène codant pour la résistance à un virus est le gène de la protéine de capside du virus des nervures jaunes et necrotiques de la betterave à sucre (BNYVV).Ce virus provoque la rhizomanie chez la betterave. Selon le procédé de l'invention, ce gène codant pour cette protéine de capside peut être introduit dans des cellules de betteraves, conférant ainsi la résistance à la rhizomanie.

Le vecteur porte également un gène codant pour une protéine permettant la sélection des transformants, par exemple la neomycine phosphotransférase (NPT II) qui confère la résistance à la kanamycine. De plus, un gène "reporteur" peut être introduit dans le vecteur afin de pouvoir confirmer le caractère transformé du tissu végétal. Un exemple d'un tel gène reporteur est le gène uid A d'E. coli codant pour l'enzyme B-glucuronidase. Le dosage de l'activité enzymatique de cette protéine se fait facilement avec des substrats chromogènes ou fluorescents.

Après la coculture des cellules de betteraves et des bactéries, une étape de lavage avec un agent bactériostatique est effectué pour éliminer les bactéries. Comme agent bacteriostatique, la cefotaxime peut être utilise. Le lavage peut être effectue en deux etapes, par exemple une première fois avec le milieu MSB1 contenant 600 mgl~1 cefotaxime, puis une deuxième fois dans du milieu NSBl contenant 300 mgll cefotaxime.

Ensuite, la sélection des cellules transformées est effectuée grâce au gène codant pour la résistance à l'agent sélectif. Les cellules lavées sont donc mises en culture pendant une quinzaine de jours sur un milieu contenant l'agent sélectif, par exemple la kanamycine et l'agent bactériostatique. Les cellules vegétales sont ensuite repiquees sur du milieu frais.

Trois à huit semaines après la coculture, des cals blancs apparaissent. Ces cals transformés présentent les deux types cellulaires, noduleux et habitue. Quand ils sont suffisamment développes, les cals sont repiques sur un milieu MSB1 avec de la cefotaxime et éventuellement de la kanamycine.

D'une manière surprenante, il a été constate qu'un mois après le clonage des cals transformés, la kanamycine et le céfotaxime peuvent être supprimés du milieu sans que la bactérie ne se développe. Ceci peut présenter un avantage pour l'étape de régénération, les cellules n'étant plus en contact avec les antibiotiques.

Après l'obtention des cals friables transformés, la régénération de la plante transgénique peut être initiée, en commençant par la régénération de bourgeons et/ou d'embryons transgeniques.

Le procédé de régénération de bourgeons et/ou d'embryons transgéniques selon l'invention est caractérise par l'obtention de cals friables transformes selon le procédé decrit ci-dessus, suivie du repiquage des cals friables transformes sur un milieu de culture, par exemple le milieu M.S, contenant 0 à 3,0 mgl1 d'une cytokinine et éventuellement un agent bactériostatique et un agent sélectif. Comme cytokinine, on peut citer la zéatine, la kinetine et la BAP, par exemple à une concentration de 1 mol~1. La BAP est particulièrement préférée.

Des bourgeons et/ou embryons régénèrent sur certains des cals après des délais variant d'une semaine à plusieurs mois.

A partir de ces bourgeons et/ou embryons transgéniques, il est possible, selon l'invention, de régénérer des plantes par repiquage des bourgeons et/ou embryons sur un milieu de culture tel que le milieu M.S contenant un cytokinine à faible concentration, par exemple entre 0,05 et 0,15 mil~1, de préférence 0,1 mil~1.

La BAP est préférée dans cette étape. Les structures régénérées commencent alors à développer des feuilles et elles sont remises en multiplication végétative en pots ou boîtes. Les bourgeons les plus développes sont alors mis sur un milieu d'enracinement tel que le milieu MS contenant de l'acide naphtalène-acétique, par exemple 1 mol~1. Les racines apparaissent 2 à 6 semaines après. Les plantes peuvent alors être acclimatées en serre.

L'invention concerne également la production de graines à partir des plantes transgéniques par vernalisation de ces plantes transgéniques et recolte des graines après floraison.

L'invention concerne egalement les cals friables transformés, les bourgeons et/ou embryons transformes, les plantes transgeniques et les graines de ces plantes produits selon les procédés decrits ci-dessus.

L'invention sera illustrée par les exemples nonlimitatifs suivants
EXEMPLE 1 : OBTENTION DE CALS FRIABLES REGENERANTS A
PARTIR DE FEUILLES
Des graines de betterave sont semées dans du terreau en serre.

Environ un mois après la germination en serre, les premières experiences d'induction de cals selon la méthode décrite par Saunders et al (1986) ont été faites
- de jeunes feuilles de 3 à 5 cm de long sont prélevées de chaque plante,
- elles sont désinfectées comme suit
detergent de la marque Domestos 15 % pendant 5 minutes
3 rinçages à l'eau stérile
séchage sur papier filtre stérile
- chaque feuille est ensuite decoupée en fragments de 0.25 cm2 environ,
- les explants ainsi obtenus sont mis en culture sur du milieu MSB1 (Tableau 1) en boîtes de Pétri,
- les boîtes après avoir été scellees avec un film plastique de la marque Scello-frais sont placées à 30"C à l'obscurité pendant 30 jours,
- puis elles sont sorties en chambre de culture L:D 18:8, 25"C:20"C.

De 4 à 10 semaines après la mise en culture, des cals blancs friables apparaissent autour, sur ou sous les explants foliaires.

De 1 à 8 semaines après l'apparition de cals des bourgeons et/ou embryons commencent à régénérer de ces cals.

EXEMPLE 2 : OBTENTION DE SUSPENSIONS CELLULAIRES A
PARTIR DES CALS INDUITS
De 4 à 6 semaines après leur apparition, les cals sont prélevés (en evitant toute structure organisee) et mis en culture dans 100 ml de milieu MSB1 liquide, dans les erlenmeyers de 250 ml fermés avec une feuille de cellophane maintenue au col par deux élastiques. Les erlenmeyers sont agités à 200 RPM environ dans la chambre de culture.

La suspension cellulaire s'établit en 2 ou 3 semaines. Chaque suspension est repiquee toutes les 3 semaines environ comme suit
- le contenu de chaque erlenmeyer après 3 semaines de culture est filtré sur une série de trois tamis empilés (dont les mailles sont de 1 mm, 500 Zm et 100 ym) ; une partie de chaque fraction ( > 1 mm, > 500Am, > 100 Am) est remise en suspension dans 100 ml de milieu MSB1 frais en erlenmeyers de 250 ml.Ces nouvelles suspensions sont à nouveau agitées à 200 RPM ; l'observation des différentes suspensions cellulaires etablies à partir de différents génotypes ont permis de distinguer deux types cellulaires
* type habitué (A) : suspension fine, verte à croissance rapide, régénère ponctuellement des formations vitrifiées se développant difficilement,
* type noduleux (C) : suspension d'agregats compacts jaunâtres, à croissance plus lente, régénère plus fréquemment que la première, des structures embryonnaires compactes se développant assez bien.

EXEMPLE 3 : TRANSFORMATION DE SUSPENSIONS
CELLULAIRES ET DE JEUNES CALS
Suspension cellulaires
La transformation est faite sur des suspensions cellulaires après 3 semaines de culture, sans repiquage.

Dans un tube plastique, sterile et gradué, on recueille une partie de la suspension de manière à avoir 5 ml de cellules tassées dans 10 ml de milieu. 10 ml milieu MSB1 frais sont rajoutes. La nouvelle suspension ainsi obtenue est distribuée dans quatre boîtes de pétri à raison de 5 ml par boîte.

Les souches d'Aqrobacterium tumefaciens testees sont
LBA 4404, EHA 101, C58'3. Chacune de ces souches contient un vecteur binaire portant un gène codant pour la protéine de capside du virus BNYW, ou une protéine dérivée de cette protéine sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les cellules à transformer (voir Fig 1).

Les souches bactériennes sont conservées à -20 C dans 15 % de glycérol. 50 p1 de chaque souche sont prélevés et mis en culture dans 2 ml de milieu LB + rifampicine + tetracycline. Les cultures sont agitées à 200 RPM à 30 C pendant 2 jours. Chaque souche est repiquée dans du milieu frais et cultivée dans les conditions decrites plus haut pendant une nuit.

Quand les bactéries sont ainsi prêtes, l'infection des cellules végétales est faite
- 50 1 de chaque souche poussee une nuit sont prélevés et ajoutes à une des boîtes de Pétri contenant les cellules de betteraves décrites plus haut
- la coculture des cellules de betterave et des bactéries se fait à l'obscurité pendant 3 jours en chambre de culture
Après ces 3 jours, des cellules végétales sont lavees pour éliminer la bactérie, une première fois avec du MSB1 + 600 mg/l de céfotaxime (bactériostatique inhibant la croissance d'Aqrobacterium), puis une deuxième fois dans du milieu MSB1 + 300 mg de céfotaxime
- les cellules ainsi lavees sont mises en culture sur un disque de papier Whatman stérile dépose sur du milieu MSB1 + CK (tableau 1), en boîtes de Pétri (la kanamycine est l'agent sélectif permettant aux seules cellules transformées de se développer). Les boîtes sont scellées avec du scello-frais et mises en chambre de culture. 15 jours après, les filtres portant les cellules végétales sont repiques sur du milieu frais MSB1 + cefotaxime + kanamycine
- 3 à 8 semaines après la coculture, des cals blancs apparaissent sur un lit de cellules mortes.

Quand ils sont suffisamment developpes, ces cals sont repiques soit sur milieu MSB1 + CK ou MSB1 + C ; la plupart des cals poussent sur les deux milieux. Un test histochimique (Jefferson, 1987) pour deceler l'activité de la protéine codee par le gène de la -glucuronidase dans les cellules de ces cals, a permis d'évaluer à environ 80 % le taux de cals positifs pour ce test. Ceci confirme donc le caractère transgénique de la plupart des cals obtenus.

Le fait de cultiver ces cals sans l'agent selectif (kanamycine) ne semble pas modifier l'expression du gène
GUS. De plus, après un mois de culture sur milieu avec céfotaxime, les cals peuvent être sevres de cet antibiotique sans que la bactérie se développe sur le milieu.

Donc, un mois après le clonage des cals, on peut se passer d'ajouter les deux antibiotiques dans le milieu de culture, sans inconvénient apparent. Ceci peut representer un atout pour la regénération.

Cals nouvellement induits
Les inventeurs ont pensé que le potentiel organogène des cals transformés serait mieux préserve si, au lieu de transformer des suspensions cellulaires induites depuis plusieurs mois (et ayant hypothétiquement perdu de leur potentiel de régénération), de jeunes cals fraîchement induits d'explants foliaires (Saunders et al, 1986) étaient transformés.

Pour tester cela, des cals juste apparus depuis 2 à 6 semaines sur feuilles de serre ont été prélevés. Ces cals ont été dispersés dans un milieu MSB1 liquide en tubes plastiques stériles, et le même protocole de transformation que pour les suspensions cellulaires a été appliqué. Des cals transformés ont ainsi été sélectionnés par cette voie.

EXEMPLE 4 : REGENERATION DE PLANTES A PARTIR DE CALS
TRANFORMES
Après un premier passage d'un mois sur M.SB1 + C ou
MSB1 + CK, les cals tranformes sont repiqués tous les mois sur MSB1. Après des délais plus ou moins longs, variant d'une semaine à plusieurs mois, des bourgeons et/ou embryons régénèrent sur certains de ces cals.

I1 a été observe qu'après transformation les cals ont le même phénotype que la suspension de départ.

C'est-à-dire que le type noduleux ou habitué se retrouve après la transformation. En outre, il semble que ce soit les cals transformés de type noduleux qui aient la plus grande aptitude à la régénération. Ils permettent la régénération de plusieurs structures se développant assez bien et vite en plante, alors que les structures obtenues sur les cals habitués transformés sont très rares, longues et très difficiles à se développer en plante.

Les structures régénérées sont très hétérogènes morphologiquement. Elles sont repiquées, après avoir été coupées à la base au scalpel, sur le milieu MSBO.1 en boîtes de Pétri.

Quand les bourgeons commencent à développer plusieurs feuilles, ils sont remis en multiplication végétative en pots ou boîtes. Les bourgeons les plus développés sont alors mis en enracinement sur MS + ANA 1 mg/l(ANA : acide naphtalène-acétique). Les racines apparaissent de 2 à 6 semaines après.

Dès que les racines sont suffisamment développées, les plantes sont acclimatees en serre dans du terreau universel. Au bout de 3 mois, les plantes sont bien développées (photo) et ont perdu la plupart des variations phenotypiques dues à la culture in vitro.

EXEMPLE 5 : EXPRESSION DE LA PROTEINE DE CAPSIDE ET
DE LA PROTEINE CHIMERIQUE DERIVEE DANS LES BETTERAVES
TRANSGENIQUES
Bien que sachant les betteraves transgéniques, grâces aux tests de détection du gène codant pour la ss- glucuronidase, il n'était pas certain que le gène intéressant, à savoir celui codant pour les protéines de capside du BNYW, etait bien exprime dans ces plantes.

Pour le savoir, il faut détecter ces protéines dans les tissus de betterave transformées. Pour detecter les proteines dans les transformants, il a été fait appel à la technique de Western blot (Ausubel et al, 1987).

Celle-ci consite à faire migrer les proteines solubles extraites de broyat de tissus des transformants, sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (Laemmli, 1970). Les protéines ainsi separees sont transférées par electrotransfert sur une membrane de nitrocellulose.

Cette membrane est ensuite hybridée avec des anticorps polyclonaux de lapins dirigés contre le BNYW. La révélation se fait par addition d'anticorps anti-lapin conjuguées à la phosphatase alcaline, qui utilise des substrats chromogènes. La figure 2 montre le type de résultats obtenus. Les extraits de betterave transgéniques contenant le gène codant pour les protéines de capside montre une bande immunoreactive migrant au même niveau que la protéine de capside du virus. Cette bande n'est pas presente dans les extraits de plantes non transformées.

EXEMPLE 6 : OBTENTION DE GRAINES DE BETTERAVES
TRANSGENIQUES
Après 2 à 3 mois d'acclimatation en serre des plantes transgeniques, il a été constaté qu'elles etaient phenotypiquement conformes à la plante mère. A ce stade les plantes possèdent de 10 à 15 feuilles très bien developpees, et sont toujours à l'état de rosette. Pour savoir si les plantes obtenues sont tout à fait normales et notamment fertiles, et si le gène introduit est transmis à la descendance, les plantes ont ete vernalisees pour induire la montée à graines. Les transformants primaires sont donc places entre 2 et 7"C à l'obscurité pendant 3 mois, puis en champs en période de jour long. Un mois à un mois et demi après la mise en champ, la hampe florale commence à monter.

La floraison a lieu trois mois environ après la sortie de vernalisation, et les fruits sont mûrs deux mois après.

Quand les glomérules sont bien secs, ils sont récoltés et nettoyés. Les graines sont ainsi prêtes à être semées.

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Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Procédé de transformation de cellule végétale appartenant à l'espèce Beta vulqaris caracterisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes

I) induction de cals blancs friables à partir d'explant ; II) dispersion des cals dans un milieu de culture cellulaire végétale liquide contenant 0 à environ 3.0 mgl-1 d'une cytokinine, ou obtention d'une suspension cellulaire à partir des cals dans un milieu de culture cellulaire végétale liquide contenant environ 0.1 à environ 3.0 mgl-1 d'une cytokinine ;

III) mise en contact de la dispersion ou de la suspension cellulaire, avec Aqrobacterium tumefaciens contenant un vecteur portant un gène destiné à être introduit dans les cellules végétales, suivie de coculture des cellules vegétales et des bacteries ;;

IV) lavage des cellules vegétales pour éliminer les bactéries ;

V) sélection des cellules transformées sur un milieu selectif ;

VI) culture des cellules transformées selectionnees pour obtenir des cals friables transformés.

2. Procedé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cals blancs friables sont induits à partir de jeunes feuilles, ayant par exemple une longueur de 3 à 5 cm, prelevees d'une plante âgee de moins de trois mois.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que la dispersion des cals s'effectue dans un milieu de culture cellulaire végétale contenant de la 6-benzylaminopurine (BAP), plus particulièrement Imgl'l BAP.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la suspension cellulaire est obtenue par mise en culture pendant 2 à 3 semaines des cals blancs friables âgés de 4 à 6 semaines dans le milieu de culture additionné de cytokinine , le milieu étant agité pendant cette période, suivie de repiquage de la suspension ainsi obtenue sur du milieu de culture frais, donnant lieu à deux types cellulaires, notamment type habitué et type noduleux.

5. Procéde selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu de culture est additionne de la 6benzylaminopurine (BAP), plus particulièrement environ 1 mgl'l BAP.

6. Procéde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu de culture cellulaire végétale est le milieu de Murashige et Skoog (1962), dit milieu M.S.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la coculture de cellules vegétales et des bacteries s'effectue pendant 3 jours dans l'obscurité sur un milieu de culture cellulaire vegetale tel que le milieu MS, éventuellement additionné de cytokinine, par exemple environ 1 mil'l

BAP.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications precedentes, caractérisé en ce que l'élimination des bacteries s'effectue par lavage des cellules végétales avec un milieu de culture cellulaire végétale contenant un agent bactériostatique inhibant la croissance d'Agrobacterium, par exemple le céfotaxime.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérise en ce que la sélection des cellules transformées s'effectue sur un milieu contenant de la kanamycine.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérise en ce que la culture des cellules transformées sélectionnées s'effectue sur un milieu de culture solide, tel que le milieu M.S solide, additionné de cytokinine, d'agent bactériostatique et d'agent sélectif.

11. Procéde de régénération de bourgeons et/ou d'embryons transgéniques appartenant à l'espèce Beta vulqaris à partir d'explants, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes

I) obtention de cals friables transformés selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; II) repiquage des cals transformés sur un milieu de culture contenant 0 à environ 3 mil'l d'une cytokinine, et eventuellement un agent bacteriostatique et un agent selectif jusqu'à l'apparition de bourgeons et/ou d'embryons transgéniques.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le milieu de culture est le milieu M.S additionné d'environ Imgl'l BAP et éventuellement environ 300 mgl-1 cétotaxime et 200 mgl'l kanamycine.

13. Procédé de régénération de plantes transgéniques appartenant à l'espèce Beta vulgaris, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes

I) régénération de bourgeons et/ou d'embryons transgeniques selon le procéde de la revendication 11 ; II) repiquage des bourgeons et/ou des embryons transgéniques sur un milieu de culture tel que le milieu

M.S additionné d'environ 0.1 mgl-1 cytokinine, par exemple de la BAP ;

III) remise des structures régenerées en multiplication végétative suivi d'enracinement sur un milieu de culture tel que le milieu M.S contenant de l'acide naphthalène acétique, par exemple environ 1 mgl1.

14. Procédé de production de graines de plantes transgéniques appartenant à 11 espèce Beta vulgaris caractérisé en ce que qu'il comprend les étapes suivantes

I) régénération de plantes transgéniques selon le procédé de la revendication 12 II) vernalisation des plantes transgéniques et récolte des graines apres floraison.

15. Cals friables transformés appartenant à l'espèce Beta vulgaris et produits selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.

16.Bourgeons et/ou embryons transgéniques appartenant à l'espèce Beta vulgaris et produits selon l'une des revendications 11 et 12.

17.Plantes transgéniques appartenant à l'espèce Beta vulqaris et produits selon le procédé de la revendication 13.

18.Graines de plantes transgeniques appartenant à l'espèce Beta vulgaris et produits selon la revendication 14.