CN1944661A - 胞磷胆碱钠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胞磷胆碱钠的制备方法，以酵母为生物催化剂，以5′－胞苷酸、磷酸胆碱、氢氧化钾、葡萄糖为原料进行生物转化的生产方式，以活性碳为吸附载体，以Cl－型离子交换树脂为分离载体进行提取和分离，以酸性pH为吸附条件，其pH在2.0～6.0之间吸附，以碱性pH为洗脱条件，以pH＝7～12为解析条件，以水和醇类复配试剂为解析试剂进行解析液的提取分离，以醇类溶剂为结晶溶剂进行成品的精制；与现有技术相比，本发明产品收率和纯度均好于现有技术最佳值。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备胞磷胆碱钠的方法，属于生物制药技术领域。
背景技术
胞磷胆碱钠，又称胞二磷胆碱，是脑代谢激活剂，可促进神经细胞膜磷酯的合成，具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力的作用，临床应用较广。所以，胞磷胆碱钠的制备方法是人们比较关心的研究课题。
目前制备胞磷胆碱钠的方法有：①化学合成，利用CMP(5′-胞苷酸)和磷酸胆碱作为反应物，对-甲苯磺酰氯作为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺存在下进行缩合制备，用717(Cl-)型阴离子交换柱和711(Cl-)型浓缩柱分离液酒精沉淀制备胞磷胆碱钠，其缺点是难与缩合剂分离，产品不适合药用；②酶促合成，抽提细胞液用胞苷三磷酸(CTP)和磷酸胆碱生物合成胞磷胆碱钠，酶和细胞抽提液合成需要底物CTP，合成价格高；③游离细胞和酵母无细胞抽提液合成胞磷胆碱钠，游离酵母合成需要大量酵母，且只能一次性使用，具有很多缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胞磷胆碱钠的制备方法，该方法以酵母中的酶系为反应载体、选择新的催化剂和反应溶剂进行生物合成，在保留现有技术优点的基础之上，克服现有技术的种种不足，使胞磷胆碱钠的制备过程更易进行、产品收率更高。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
胞磷胆碱钠的制备方法，以5′-胞苷酸和磷酸胆碱作为反应物、以酵母作为生物催化剂生物合成胞磷胆碱钠，其特征在于：包括以下步骤——
①将酵母、葡萄糖、氢氧化钾、磷酸胆碱、5′-胞苷酸和水混合后调温至25℃～40℃，进行2～14小时振荡搅拌使其充分反应；
②将反应液升温至50℃～90℃灭活，进行液固分离；
③调PH为碱性(PH7.0～12.0)，部分碱性蛋白质及核酸沉淀，进行液固分离，然后再调PH为酸性(PH2～6)，使酸性蛋白沉淀，进行液固分离、分离沉淀物；
④用活性炭吸附分离，用纯水洗涤；
⑤用乙醇碱溶试剂进行洗脱，洗脱液进行脱盐、脱色处理，收集液体；
⑥洗脱液真空浓缩；
⑦浓缩液加入醇类溶剂，结晶，液固分离得粗品；
⑧粗品溶解，微滤后超滤，加入醇类溶剂，结晶，液固分离得湿品，干燥后得成品。
前述的胞磷胆碱钠的制备方法，步骤①中酵母为速冻酵母、经低于零下20℃冷冻5天以上形成，其用量为30～100公斤/公斤产品。
前述的胞磷胆碱钠的制备方法，步骤①中的磷酸胆碱用量为3～8公斤/公斤产品，5′-胞苷酸用量为1～5公斤/公斤产品，葡萄糖用量为10～20公斤/公斤产品，氢氧化钾用量为2～5公斤/公斤产品，水用量为800～1500公斤/公斤产品。
前述的胞磷胆碱钠的制备方法，步骤①的反应体系中还添加MgSO4溶液，其用量为0.5～6公斤/公斤产品。
前述的胞磷胆碱钠的制备方法，步骤①的反应体系PH＝4～8、65～150转/分钟搅拌反应6～10小时为最佳反应条件。
前述的胞磷胆碱钠的制备方法，步骤④中PH为2～6。
前述的胞磷胆碱钠的制备方法，步骤⑤所述乙醇碱液由20％乙醇和5％碱液配制而成。
前述的胞磷胆碱钠的制备方法，步骤⑦和⑧的醇类溶剂为2倍量乙醇或甲醇或甲乙醇混合液。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要体现在：
(1)酵母反应体系是牛顿流体，粘度小，多相催化反应体系，反应主体溶液物质扩散速度快，限制一些激酶和辅酶流入反应体系，阻止氧化胞磷胆碱钠合成途径的酶，减少游离酵母对胞磷胆碱钠吸附量，固定化酵母采用KCl溶液洗涤可以反复利用三次以上，且仍能保持较高酶激活性；
(2)速冻酵母生物合成胞磷胆碱钠，只需少量酵母，减少了费用，提高了经济效益；
(3)采用最佳的反应体系促进胞磷胆碱钠的合成，实现了高峰值的合成量；
(4)得到的产品不仅纯度好，收率比现有技术最佳值更高，实际转化率可达到75％以上。
附图说明
下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：
图1：本发明胞磷胆碱钠制备方法的主反应式；
图2：本发明工艺流程图。
具体实施方式
胞磷胆碱钠别名为胞二磷胆碱、胞磷胆碱、胞二磷酰胆碱等，英文名为Citicoline sodium，化学名：胆碱胞嘧啶核苷二磷酸酯单钠盐，分子式：C14H25N4NaO11P2，分子量：510.31，呈白色晶状物，极易溶于水。胞磷胆碱钠是一种体内天然产生的内源性核苷，是细胞膜磷酯生物合成主要途径的中间物，神经细胞膜的修复需要大量的胞磷胆碱钠；注射外源性的胞磷胆碱钠可促进神经细胞膜磷酯的合成；在维持多种细胞生理过程中胞磷胆碱钠起着极其重要的作用；在多种由于缺血、失血所引起的细胞膜功能紊乱、退行性病变中，胞磷胆碱钠具有明显的临床治疗效果。
本发明胞磷胆碱钠制备方法的主反应式，如图1所示。本发明是以酵母酶为反应载体，以5′-胞苷酸、磷酸胆碱、氢氧化钾、葡萄糖为主要原料进行生物转化的生产方式，以活性碳为吸附载体，以Cl-型离子交换树脂为分离载体进行提取和分离，以酸性PH为吸附条件，其PH在2～6之间吸附，以碱性PH为洗脱条件，以PH＝7～12为解析条件，以水和醇类复配试剂为解析试剂进行解析液的提取分离，以醇类溶剂为结晶溶剂进行成品的精制。如图2所示，胞磷胆碱钠的制法包括以下步骤：①将酵母、葡萄糖、氢氧化钾、磷酸胆碱、5′-胞苷酸和水混合后调温至20℃～40℃，PH＝4～8，进行65～150转/分钟搅拌2～14小时使其充分反应；②将反应液升温至50℃～90℃灭活，进行液固分离；③调PH为碱性(PH7.0～12.0)，部分碱性蛋白质及核酸沉淀，进行液固分离，然后再调PH为酸性(PH2～6)，使酸性蛋白沉淀，再进行液固分离，分离沉淀物；④调PH为2～6，用活性炭吸附分离，用纯水洗涤；⑤用乙醇碱液(20％乙醇和5％碱液配制而成)试剂进行洗脱，洗脱液进行脱盐、脱色处理，收集液体；⑥洗脱液真空浓缩；⑦浓缩液加入2倍乙醇，结晶，进行液固分离得粗品；⑧粗品溶解，微滤后超滤，加入2倍乙醇进行结晶，再进行液固分离得湿品，进行干燥得成品。
其中，步骤①酵母为速冻酵母、经-20℃以下冷冻5天以上形成，速冻时间越长，效果越好，其用量为30～100公斤/公斤产品；磷酸胆碱用量为3～8公斤/公斤产品，5′-胞苷酸用量为1～5公斤/公斤产品，葡萄糖用量为10～20公斤/公斤产品，氢氧化钾用量为2～5公斤/公斤产品，水的用量为800～1500公斤/公斤产品；反应体系中还添加MgSO4溶液，其用量为0.5～6公斤/公斤产品；体系还生成磷酸二氢钾溶液；反应6～10小时为最佳反应时间。
图2是本发明工艺流程示意图，下面结合图2对本发明再作进一步的详细描述。
实施例1：
将30公斤速冻酵母、3公斤磷酸胆碱、1公斤5′-胞苷酸、10公斤葡萄糖、2公斤氢氧化钾，800公斤水混合后调温至25℃，PH＝6，进行65转/分钟搅拌反应6小时使其充分反应；将反应液升温至50℃灭活，进行液固分离；调PH＝8.0，部分碱性蛋白质及核酸沉淀，进行液固分离，然后再调PH＝2.5，使酸性蛋白沉淀，进行液固分离、分离沉淀物；用活性炭吸附分离，PH＝2.5，用纯水洗涤；用乙醇碱溶试剂进行洗脱，洗脱液进行脱盐、脱色处理，收集液体；洗脱液真空浓缩；浓缩液加入2倍乙醇，结晶，液固分离得粗品；粗品溶解，微滤后超滤，加入2倍乙醇，结晶，液固分离得湿品，干燥后得成品。
实施例2：
将80公斤速冻酵母、4公斤磷酸胆碱、4公斤5′-胞苷酸、16公斤葡萄糖、4公斤氢氧化钾，1100公斤水混合后调温至30℃，并添加0.5公斤MgSO4溶液，PH＝6，进行120转/分钟搅拌反应8小时使其充分反应；将反应液升温至70℃灭活，进行液固分离；调PH＝10，部分碱性蛋白质及核酸沉淀，进行液固分离，然后再调PH＝4，使酸性蛋白沉淀，进行液固分离、分离沉淀物；用活性炭吸附分离，PH＝4，用纯水洗涤；用乙醇碱溶试剂进行洗脱，洗脱液进行脱盐、脱色处理，收集液体；洗脱液真空浓缩；浓缩液加入2倍甲醇，结晶，液固分离得粗品；粗品溶解，微滤后超滤，加入2倍甲醇，结晶，液固分离得湿品，干燥后得成品。
实施例3：
将100公斤速冻酵母、8公斤磷酸胆碱、5公斤5′-胞苷酸、20公斤葡萄糖、5公斤氢氧化钾，1500公斤水混合后调温至40℃，并添加6公斤MgSO4溶液，PH＝8，进行150转/分钟搅拌反应10小时使其充分反应；将反应液升温至90℃灭活，进行液固分离；调PH＝12.0，部分碱性蛋白质及核酸沉淀，进行液固分离，然后再调PH＝5.5，使酸性蛋白沉淀，进行液固分离、分离沉淀物；用活性炭吸附分离，PH＝5.5，用纯水洗涤；用乙醇碱溶试剂进行洗脱，洗脱液进行脱盐、脱色处理，收集液体；洗脱液真空浓缩；浓缩液加入2倍甲乙醇溶液，结晶，液固分离得粗品；粗品溶解，微滤后超滤，加入2倍甲乙醇溶液，结晶，液固分离得湿品，干燥后得成品。
从以上实施例表明，本发明与现有技术相比，产品收率和纯度均明显好于现有技术最佳值。
以上具体描述了本发明技术方案的应用实例，它们仅作为例子给出，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.胞磷胆碱钠的制备方法，以5′-胞苷酸和磷酸胆碱为主反应物、以酵母作为生物催化剂生物合成胞磷胆碱钠，其特征在于：包括以下步骤——
①将酵母、葡萄糖、氢氧化钾、磷酸胆碱、5′-胞苷酸等和水混合后调温至25℃～40℃，进行2～14小时振荡搅拌使其充分反应；
②将反应液升温至50℃～90℃灭活，进行液固分离；
③调PH为碱性、PH＝7.0～12.0，部分碱性蛋白质及核酸沉淀，进行液固分离，然后再调PH为酸性、PH＝2.0～6.0，使酸性蛋白沉淀，进行液固分离、分离沉淀物；
④用活性炭吸附分离，用纯水洗涤；
⑤用乙醇碱液试剂进行洗脱，洗脱液进行脱盐、脱色处理，收集液体；
⑥洗脱液真空浓缩；
⑦浓缩液加入醇类溶剂，结晶，液固分离得粗品；
⑧粗品溶解，微滤后超滤，加入醇类溶剂，结晶，液固分离得湿品，干燥后得成品。
2.按权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制备方法，其特征在于：步骤①中酵母为速冻酵母、经-20℃以下冷冻5天以上形成，其用量为30～100公斤/公斤产品。
3.按权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制备方法，其特征在于：步骤①中的磷酸胆碱用量为3～8公斤/公斤产品，5′-胞苷酸用量为1～5公斤/公斤产品，葡萄糖用量为10～20公斤/公斤产品，氢氧化钾用量为2～5公斤/公斤产品，水用量为800～1500公斤/公斤产品。
4.按权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制备方法，其特征在于：步骤①的反应体系中还添加MgSO4溶液，其用量为0.5～6公斤/公斤产品。
5.按权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制备方法，其特征在于：步骤①的反应体系PH＝4～8、进行65～150转/分钟搅拌反应6～10小时为最佳反应条件。
6.按权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制备方法，其特征在于：步骤④中PH为2.0～6.0。
7.按权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制备方法，其特征在于：步骤⑤所述乙醇碱液为20％乙醇和5％碱液配制而成。
8.按权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制备方法，其特征在于：步骤⑦和⑧的醇类溶剂为乙醇或甲醇或甲乙醇混合液。
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