CN104774881B - 一种生物催化生产L-α-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成具有高光学活性的L‑α‑氨基丁酸的新方法,综合运用了醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L‑氨基酸脱氢酶,将乙醇和甘氨酸原料“一锅法”直接合成为L‑α‑氨基丁酸。本发明基于利用简单易得的原料一锅合成L‑α‑氨基丁酸,具有操作步骤少、环境友好、生物安全性好、设备简单的优点,有利于工业大规模生产光学活性高的L‑α‑氨基丁酸及L‑α‑氨基酸一系列产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型生物催化法“一锅法”合成L-α-氨基丁酸及纯化浓缩结晶得到高纯度L-α-氨基丁酸的方法,属于生物合成领域。
背景技术
L-α-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸,具有加强葡萄糖磷酸酯酶的活性,促进脑细胞代谢的作用;L-α-氨基丁酸也是重要的医药中间体原料,已经广泛应用于药物的合成,如抗结核药物盐酸乙胺丁醇,抗癫痫药物左乙拉西坦等药物的合成。
目前,国内外L-α-氨基丁酸的生产方法分为化学法和生物法,化学法是比较经典的方法,主要有化学合成和化学拆分。化学合成主要是以正丁酸和溴为起始原料,经α卤代反应制得α-溴丁酸,在氨水中合成α-氨基丁酸,化学拆分法是用手性拆分试剂和消旋的α-氨基丁酸形成非对应异构体进行拆分得到L-α-氨基丁酸,光学纯度可达98%,但是此方法需要昂贵的手性拆分试剂,成本较高,工业生产不易采用,而且产生大量的有机费溶剂污染环境;
生物法又包括微生物发酵法和细胞外酶转化法,微生物发酵法专属性较强,条件温和,环境污染少,但存在反应产物成分复杂,分离繁琐的缺点;酶催化转化则是一种高选择性反应,不同种类的酶可作用于不同构型和不同种类的特定底物,从而达到定向转化的目的。目前酶法制备L-α-氨基丁酸主要有三种,一种是对消旋α-氨基丁酸进行酶法拆分制备,主要是用醋酐乙酰化氨基丁酸,再用氨基酰化酶进行拆分,产物收率约35%,同时通过将剩余的酰化α-氨基丁酸通过化学法消旋来利避免了使用剧毒原料,降低了生产成本,但仍然存在反应步骤多,总收率不高等问题。另一种是以α-羰基丁酸为原料,通过脱氢酶或者转氨酶来催化制备。但是反应底物浓度低,生产成本较高。还有一种方法是用苏氨酸脱氨酶将底物苏氨酸转化为中间产物α-羰基丁酸,然后再用亮氨酸脱氢酶将其转化为最终产物L-α-氨基丁酸。但是需要甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶偶联,建立辅酶再生***,才能使反应循环进行,仍然存在生产成本高,工业复杂,生产难度大等缺点。
发明内容
针对现有技术中L-α-氨基丁酸的合成方法存在过程繁琐、反应条件苛刻、收率低、分离提纯困难、环境污染严重等一系列缺陷,本发明的目的是在于提供一种以廉价的乙醇和甘氨酸为原料,以四种酶复合物为催化剂“一锅法”合成高纯度L-α-氨基丁酸的方法,申请人创造性的发现,采用特定比例和种类的酶,能够制备得到纯度和产率高的L-α-氨基丁酸,该方法以水相为反应体系,环保、廉价,设备要求低、酶可以反复使用,成本低,易大规模工业化生产。
本发明提供了一种高光学纯L-α-氨基丁酸的生物合成方法,该方法是在反应液中,乙醇和甘氨酸原料在醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶复合物的催化作用下,于pH为6.0~8.0,温度为20~40℃的条件下进行酶催化反应,反应产物经过层析分离、电渗析脱盐、活性炭脱色、浓缩结晶、真空干燥处理,得到高纯度α-氨基丁酸晶体;所述的醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶总活力比为4.5-25:3-5:6-25:4.5-20。
优选醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶的活力比为2:1:3:2;
所述的乙醇具有式1结构:
式1
所述的甘氨酸具有式2结构:
式2
所述的L-α-氨基丁酸具有式3结构:
式3
本发明的高纯L-α-氨基酸的生物合成方法还包括以下优选方案:
其中醇脱氢酶在反应液中的加入量相对于甘氨酸为4500 U/mol~25000U/mol;优选为8000U/mol。
其中氨基酸醛缩酶在反应液中的加入量相对于甘氨酸为3000U/mol~5000 U/mol;优选为4000U/mol。
其中氨基酸脱氨酶在反应液中的加入量相对于甘氨酸为6000U/mol~25000 U/mol,优选为12000U/mol。
其中氨基酸脱氢酶在反应液中的加入量相对于甘氨酸为4500U/mol~20000 U/mol,优选为8000U/mol。
醇类化合物在反应液中的质量百分比浓度为10%~30%,醇类化合物与甘氨酸的摩尔比为1:0.1~0.5。
优选的方案中醇类化合物在反应液中的质量百分比浓度为20%,醇类化合物与甘氨酸的摩尔比为1:0.3;
优选的方案中酶催化反应过程中加入不少于20ppm的NAD或NADP辅组因子,和不少于30ppm的磷酸吡哆醛辅因子。
优选的方案中特征性地使用了苏氨酸醛缩酶和苏氨酸脱氨酶来推动醇脱氢酶与L-氨基酸脱氢酶催化制备L-α-氨基丁酸的同时实现辅酶NAD/NADH或 NADP/NADPH的循环再生,使昂贵的NAD和NADP用量大大减少,降低了成本。
优选的方案中酶催化反应所得反应产物通过电渗析脱盐后,维持温度在 20~40℃范围内,加入活性炭进行吸附0.5~1.0h;其中,活性炭为木质活性炭,木质活性炭的使用量为L-α-氨基丁酸溶液体积的3.0~5.0‰。
优选的方案中电渗析脱盐过程中终止物料电导为8.0~10.0ms/cm。本发明的 L-α-氨基丁酸纯化过程中加入了电渗析脱盐降低物料的电导率,同时有效的去除了物料的杂质和色素,极大提高了结晶粉的色级。
优选的方案中酶催化反应以反应液中甘氨酸摩尔转化率大于99%为反应终点。
优选的方案中层析分离是通过离子交换树脂或吸附树脂进行分离。所述的离子交换树脂为强酸性的磺酸型树脂,所述的吸附树脂为疏水性的吸附树脂。
优选的方案中酶催化反应反应时间为3~5h。
优选的方案中酶催化反应的反应温度为20~40℃。
优选的方案中真空干燥是在真空度大于0.09MPa,温度在60~80℃范围内的条件下进行。
本发明采用的醇脱氢酶、氨基酸醛缩酶、氨基酸脱氨酶和氨基酸脱氢酶可购买于湖南福来格生物技术有限公司。
本发明的L-α-氨基丁酸合成路线如下:
本发明的L-α-氨基丁酸具体酶催化机理如下:
本发明的有益效果:1、本发明首次将醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶相结合“一锅法”催化乙醇和甘氨酸原料进行酶催化反应,再结合适当的提纯分离方法,高产率获得高纯度L-α-氨基丁酸,收率相对于化学法要高20-60%以上,相对于菌体法提纯容易,产品纯度达到99%以上。2、本发明的原料来源广,酶可以重复使用,不需要使用大量有机溶剂和有毒原料,相对现有技术中的化学方法大幅降低生产成本,提高了手性纯度,相对于发酵菌体法废水量少,有利于保护环境。3、本发明的方法步骤简单,反应条件温和,对设备要求低,只需在常温下反应,不需要现有技术中的低温设备反应(现有技术中的化学法需要在-70℃低温下反应)。4、本发明同样适用于其它醇类物质和甘氨酸来合成其它种类的氨基酸。
附图说明
【图1】为实例3制得的产品的色谱分析图。
具体实施方式
实例中的原料及仪器设备来源:醇脱氢酶、氨基酸醛缩酶、氨基酸脱氨酶和氨基酸脱氢酶(湖南福来格生物技术有限公司);甘氨酸(长沙明瑞化工有限公司);乙醇(长沙唐华化工贸易有限公司);电渗析***(江苏日泰化工有限公司);臭氧发生器(湖南湘麓环保科技有限公司);高效液相色谱LC-15C(日本岛津),本申请中收率的计算方法为:投料1mol 甘氨酸,理论得到的L-α-氨基丁酸应为1mol,即103.12g,每一步得到到的值跟它比较即为每步的收率。
以下实施例中酶的加入量是相对于甘氨酸的加入量。
实例1:
取75.0g无水甘氨酸加入适量去离子水溶解后加入120mL无水乙醇溶液并用3.0mol/L氨水溶解并用盐酸调节pH为8.0±0.05,真空抽滤除去不溶物,定容至 1000mL。投液态醇脱氢酶4500、固定化苏氨酸醛缩酶3000U、固定化苏氨酸脱氨酶6000U和固定化L-氨基酸脱氢酶4500U,NAD28.0mg,磷酸吡哆醛15.0mg,控制反应温度35℃,用3.0mol/L的氨水保持pH为8.00±0.05,当液相检测甘氨酸摩尔转化率≥99%时,滤出转化终止液。将终止液用5.0mol/L的甲酸调节pH6.0±0.05 后进行电渗析脱盐并顶水后,得到含92.04g L-α-氨基丁酸溶液1530mL,产率为 89.35%。经离子交换层析分离纯化,得到含有88.44g L-α-氨基丁酸溶液1156mL,产率85.86%。物料中投加5‰的活性炭脱色半小时,过滤后取滤液在60℃, -0.09MPa~-0.098MPa负压下蒸发浓缩,过滤、干燥,得到含量为99.56%的L-α- 氨基丁酸干粉84.67g,总产率81.84%。
实例2:
取75.0g无水甘氨酸加入适量去离子水溶解后加入120mL无水乙醇溶液并用3.0mol/L氨水溶解并用盐酸调节pH为8.0±0.05,真空抽滤除去不溶物,定容至 1000mL。投液态醇脱氢酶25000U、固定化苏氨酸醛缩酶5000、固定化苏氨酸脱氨酶25000和固定化L-氨基酸脱氢酶20000U,NAD28.0mg,磷酸吡哆醛15.0mg,控制反应温度35℃,用3.0mol/L的氨水保持pH为8.00±0.05,当液相检测甘氨酸摩尔转化率≥99%时,滤出转化终止液。将终止液用5.0mol/L的甲酸调节 pH6.0±0.05后进行电渗析脱盐并顶水后,得到含95.04g L-α-氨基丁酸溶液1530mL,产率为92.27%。经离子交换层析分离纯化,得到含有91.44g L-α-氨基丁酸溶液 1156mL,产率88.77%。物料中投加5‰的活性炭脱色半小时,过滤后取滤液在 60℃,-0.09MPa~-0.098MPa负压下蒸发浓缩,过滤、干燥,得到含量为99.44%的L-α-氨基丁酸干粉88.67g,总产率85.60%。
实例3:
取75.0g无水甘氨酸加入适量去离子水溶解后加入120mL无水乙醇溶液并用3.0mol/L氨水溶解并用盐酸调节pH为8.0±0.05,真空抽滤除去不溶物,定容至 1000mL。投液态醇脱氢酶8000U、固定化苏氨酸醛缩酶4000U、固定化苏氨酸脱氨酶12000U/mol和固定化L-氨基酸脱氢酶8000U,NAD28.0mg,磷酸吡哆醛 15.0mg,控制反应温度35℃,用3.0mol/L的氨水保持pH为8.00±0.05,当液相检测甘氨酸摩尔转化率≥99%时,滤出转化终止液。将终止液用5.0mol/L的甲酸调节 pH6.0±0.05后进行电渗析脱盐并顶水后,得到含95.44gL-α-氨基丁酸溶液1530mL,产率为92.66%。经离子交换层析分离纯化,得到含有92.44g L-α-氨基丁酸溶液 1156mL,产率89.74%。物料中投加5‰的活性炭脱色半小时,过滤后取滤液在 60℃,-0.09MPa~-0.098MPa负压下蒸发浓缩,过滤、干燥,得到含量为99.14%的L-α-氨基丁酸干粉89.67g,总产率86.30%。
Claims (8)
1.高光学纯L-α-氨基丁酸的生物合成方法,其特征在于,在反应液中,乙醇与甘氨酸原料在醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶复合物的催化作用下,于pH为6.0~8.0,温度为20~40℃的条件下进行酶催化反应,反应产物经过层析分离、电渗析脱盐、活性炭脱色、浓缩结晶、真空干燥处理,得到高光学纯度L-α-氨基丁酸晶体,其中生物催化剂为醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶的复合物,复合物为混合液态酶或固定化酶;酶复合物中醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶在反应液中加入量的活力比为4.5-25:3-5:6-25:4.5-20;酶催化反应过程中加入不少于20ppm的NAD或NADP辅因子,和不少于30ppm的磷酸吡哆醛辅因子,
所述的乙醇化合物具有式1结构:
所述的甘氨酸具有式2结构:
所述的L-α-氨基丁酸具有式3结构:
2.如权利要求1所述方法,其特征在于,其中L-氨基酸脱氢酶选自L-亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶或L-缬氨酸脱氢酶。
3.如权利要求1所述方法,其特征在于,酶复合物中醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶在反应液中加入量的活力比为2:1:3:2。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,乙醇化合物在反应液中的质量百分比浓度为10%~30%,乙醇化合物与甘氨酸的摩尔比为1:0.1~0.5。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,酶催化反应所得反应产物通过电渗析脱盐后,维持温度在20~40℃范围内,加入活性炭进行吸附0.5~1.0h;其中,活性炭为木质活性炭,木质活性炭的使用量为L-α-氨基丁酸溶液体积的3.0~5.0‰。
6.如权利要求1或5所述的方法,其特征在于,所述的电渗析脱盐过程中采用的极水为电导在5.0~10.0ms/cm之间的硫酸钠溶液,浓水为去离子水,终止物料电导为8.0~10.0ms/cm。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的酶催化反应以反应液中甘氨酸摩尔转化率大于99%为反应终点。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的层析分离是通过离子交换树脂或吸附树脂进行分离。
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