CN104928342A - 一种制备s-腺苷蛋氨酸和d-蛋氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸的方法,该方法包括:以D/L-蛋氨酸为原料,通过发酵制得S-腺苷蛋氨酸,从菌体细胞中分离得到S-腺苷蛋氨酸,从发酵液中分离得到D-蛋氨酸。本发明方法以价格低廉的D/L-蛋氨酸为原料,采用包含S-腺苷甲硫氨酸合成酶的菌株进行发酵,使L-蛋氨酸在菌体细胞内与ATP反应生成S-腺苷蛋氨酸,通过细胞膜将S-腺苷蛋氨酸与D-蛋氨酸分隔开来,再通过离心分离及离子交换等分离方式,将S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸分别分离出来,该方法不仅实现了S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸的同步生产,还使D-蛋氨酸得到回收。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种制备S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸的方法。
背景技术
S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine,简写为SAM)是一种重要的生理活性物质,作为甲基供体和生理性巯基化合物的前体,它参与人体内与甲基转移和巯基转移相关的多种生化反应,对于维持肝细胞膜的正常流动相和肝脏的解毒功能具有不可或缺的作用。
研究发现,SAM对于病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等肝病导致的肝内胆汁淤积、肝硬化、抑郁症和骨关节炎等多种疾病具有积极的治疗效果,已在意大利、德国、西班牙等国家被批准为处方药进入临床应用。
在我国,SAM已进入2009版国家医保目录,用于胆汁淤积性肝病的治疗。此外,SAM还具有止痛、抗抑郁等保健效果,已被美国FDA批准为一种新型膳食补充剂进入市场,年销售量已超过10亿美元,并以每年10%以上的速度递增。近年来,SAM还被用来生产去屑、止痒、减皱、抗衰老的美容化妆品,应用范围越来越广。随着SAM应用范围的日渐拓展,市场对SAM的需求量也与日俱增。
SAM的主要制备方法有三种:包括化学合成、酶合成和发酵制备。
化学合成的SAM是由(+)-SAM和(-)-SAM两种光学异构体组成的消旋体,而其中仅有(-)-SAM才具有生理活性。由于难以分离(+)-SAM和(-)-SAM,而且生产成本较高,因此,化学合成在SAM的大规模生产中应用较少。
酶合成和发酵制备是目前大规模生产SAM的主流方法。这两种方法都是利用具有S-腺苷甲流氨酸合成酶(简称SAM合成酶)活性的生物催化剂(生产SAM合成酶的菌株细胞或SAM合成酶本身)催化L-蛋氨酸(也被称为L-甲硫氨酸)与三磷酸腺苷(ATP)的合成反应而产生S-腺苷蛋氨酸,反应方程式如下:
申请号为200810020215.4的中国发明专利申请文献公开了一种以多羟基有机试剂保护酶的活性,以腺苷三磷酸前体、L-蛋氨酸和磷酸根离子为底物,以葡萄糖或/和麦芽糖为能量供体,加入金属离子的组合物,利用有透性的生产菌株全细胞催化生产S-腺苷蛋氨酸的方法;申请号为200510119015.0的中国发明专利申请文献公开了一种利用重组S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化L-蛋氨酸与ATP反应产生S-腺苷蛋氨酸的方法。
这两个专利之所以采用L-蛋氨酸作为反应底物,其原因在于生物体中的SAM合成酶只能催化L-蛋氨酸,不能催化D-蛋氨酸。所以,如果以D-蛋氨酸作为底物,ATP无法在生物体中天然SAM合成酶的催化下转化为SAM。但是,由于光学纯L-蛋氨酸的价格远高于消旋体D/L-蛋氨酸混合物,在实际生产中,特别是在SAM的发酵制备过程中,有时也以D/L-蛋氨酸作为反应的底物替代L-蛋氨酸,以降低生产成本。
在这种情况下,D/L-蛋氨酸中的L-蛋氨酸被转化为SAM,而未反应的D-蛋氨酸则残留于发酵液中。虽然,残留在发酵液中的D-蛋氨酸造成了蛋氨酸的浪费,但由于生产的目的是获得SAM,而且D/L-蛋氨酸的成本较低,所以,在本发明之前,没有任何人关注如何利用残留在发酵液中的D-蛋氨酸,即它们被视为生产过程的废物而被排放;这不仅导致D-蛋氨酸的浪费,而且还造成了重大的经济损失,因为D-蛋氨酸本身也存在经济价值。
D-蛋氨酸在化工和医药领域具有广泛的用途。作为一种重要的含硫有机手性源,D-蛋氨酸在制药行业作为手性合成的手性源用于合成手性药物、手性添加剂、手性助剂等高附加值物质;作为一种具光学活性的有机酸,D-蛋氨酸还可以作为精细化工品合成的重要前体或模块用于手性化合物的不对称合成过程。此外,医学研究还发现D-蛋氨酸还能抑制某些肿瘤细胞的生长、防治氨基糖苷类抗生素的耳毒性,减轻抗肿瘤化疗药物顺铂的耳毒性。然而,D-蛋氨酸是一种非天然氨基酸,无法直接从自然界获取,目前制备D-蛋氨酸的主要方法是先通过化学合成方法获得D/L-蛋氨酸,然后,通过手性拆分从D/L-蛋氨酸混合物中分离纯化出D-蛋氨酸。虽然,化学合成D/L-蛋氨酸的成本较低,但手性拆分的成本较高,所以,D-蛋氨酸的价格不仅远高于D/L-蛋氨酸,而且也高于L-蛋氨酸,D-蛋氨酸的市价是L-蛋氨酸价格的10倍左右。
发明内容
本发明提供了一种制备S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸的方法,该方法能够同时生产S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸,且生产成本低、工艺简单,消除了传统S-腺苷蛋氨酸生产方法中D-蛋氨酸的浪费问题。
一种制备S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸的方法,包括:以D/L-蛋氨酸为原料,通过发酵制得S-腺苷蛋氨酸,从菌体细胞中分离得到S-腺苷蛋氨酸,从发酵液中分离得到D-蛋氨酸。
在上述发酵过程中,发酵液中的菌体通过体内的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(简称SAM合成酶)催化L-蛋氨酸和ATP反应生成S-腺苷蛋氨酸,并使S-腺苷蛋氨酸始终在细胞内积累,而D-蛋氨酸由于未参加上述反应,存在于菌体细胞外的发酵液中。通过发酵液上清和菌体的分离,可将S-腺苷蛋氨酸与D-蛋氨酸分离。所述D/L-蛋氨酸是指由D-蛋氨酸和L-蛋氨酸组成的外消旋体混合溶液。
作为优选,所述发酵的温度为25~35℃,以确保发酵液中菌株处于最佳生长环境,更优选,发酵的温度为28~30℃。
发酵液中pH值对菌株的生长也有影响,偏酸偏碱均会降低菌株内S-腺苷甲硫氨酸合成酶的产量和活力,进而降低S-腺苷蛋氨酸的得率。作为优选,所述发酵液的pH值为4.5~5.5, 更优选,pH值为5.0±0.2。
本发明所述发酵液中的菌体可以为产S-腺苷甲硫氨酸合成酶的野生菌,也可以通过分子克隆技术制备含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的重组工程菌。
作为优选,所述野生菌为酿酒酵母或清酒酵母,该类菌株能够高效表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶且酶活力高,利于S-腺苷蛋氨酸的生产。
Mg2+和K+是SAM合成酶的辅因子,其浓度高低会对SAM合成酶的催化活力产生影响。作为优选,发酵液中,Mg2+的浓度为10~90mmol/L,K+的浓度为100~500mmol/L。更优选,Mg2+的浓度为45~65mmol/L,K+的浓度为300~400mmol/L。
分次投加原料D/L-蛋氨酸可提高S-腺苷蛋氨酸的得率,作为优选,所述D/L-蛋氨酸分次投加入发酵液中,投加量为10~20g/L,投加间隔时间为2~5h,投加次数为4次。
所述S-腺苷蛋氨酸的分离方法,包括:将所述菌体进行硫酸水溶液重悬后,28~30℃孵育9~10h,离心,收集上清液,通过离子交换柱分离获得S-腺苷蛋氨酸。
所述D-蛋氨酸的分离方法,包括:将离心或过滤后的发酵液上清通入离子交换树脂,洗脱后,获得D-蛋氨酸。所述的离子交换树脂为NH4 +型。
过柱前,先将树脂浸泡于氢氧化钠中,再浸泡于盐酸中,重复上述步骤1~2次后,将树脂填装于色谱柱中,并先后用盐酸、氨水淋洗,获得NH4 +型离子交换树脂。
所述洗脱的过程,包括:用去离子水清洗色谱柱至洗出液pH达中性,再用氨水进行洗脱,收集洗脱液。作为优选,所述氨水的浓度为0.5~0.6mol/L。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明方法以价格低廉的外消旋体D/L-蛋氨酸为原料,采用包含S-腺苷甲硫氨酸合成酶的菌株进行发酵,使L-蛋氨酸在菌体细胞内与ATP反应生成S-腺苷蛋氨酸,通过细胞膜将S-腺苷蛋氨酸与D-蛋氨酸分隔开来,再通过离心分离方式,将S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸逐一分离出来,该方法不仅实现了S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸的同步生产,还消除了传统生产方法中D-蛋氨酸的浪费问题,使D-蛋氨酸得到回收;
(2)本发明方法不仅生产成本低,而且工艺简单;
(3)本发明方法打破了S-腺苷蛋氨酸制备工艺中的传统思路,在不额外增加复杂工艺步骤的情况下,实现了D-蛋氨酸的有效回收,为未来S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸的制备提供了新的工艺思路。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的阐述和说明。
本发明所需的各类培养基具体如下:
固体活化培养基:葡萄糖1%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.5%,琼脂1.8%;
液体种子培养基:葡萄糖1%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.5%;
液体发酵培养基:葡萄糖3%,蛋白胨1.5%,酵母粉1%,K2HPO40.5%,KH2PO41%, MgCl20.01%,pH为5.1。
实施例1
取4℃低温保藏的产SAM合成酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)划线接种于固体活化培养基中,在30℃培养过夜后,转接液体种子培养基中,再在温度为30℃、转速为250rpm的摇床上培养过夜后,将新鲜种子按体积比6%的接种量接种至发酵罐中,发酵罐中放置有体积为2L的液体发酵培养基,28℃下培养。该发酵罐的搅拌桨转速为150rpm,通气量为250m3/h,发酵液pH值保持在5.0。
待菌株生长至对数生长中期OD600=25后,逐次向发酵液中投加4g D/L-蛋氨酸,共投加6次,待发酵结束时发酵液中的L-蛋氨酸消耗完全后停止,4℃、5000rpm离心发酵液5min,以分离发酵液中的菌体细胞和发酵液上清,并分别收集菌体细胞和发酵液上清,从菌体中分离纯化S-腺苷蛋氨酸,从发酵液上清中分离纯化D-蛋氨酸。
实施例2
取从实施例1中收集到的菌体细胞,生理盐水洗涤菌体细胞两次后,用质量分数3%的硫酸溶液重悬菌体细胞至200mL,在30℃下孵育10h,以充***解菌体细胞,使其释放出胞内的S-腺苷蛋氨酸,再在4000rpm下离心15min后,弃去菌体碎片沉淀,收集破胞后的上清液,并调节pH值至5.0±0.5。
取HZD-2树脂,用自来水反复冲洗5次,除去机械杂质,用2倍树脂体积的质量分数为10%的NaOH溶液浸泡树脂。2小时后,用去离子水水洗至中性,再用质量分数为10%的盐酸浸泡树脂2小时,使树脂转型,去离子水水洗至中性后填装色谱柱;然后,以1.5倍柱体积/小时的流速将离心收集破胞后的上清液(pH值:5.0±0.5)泵入装填好的色谱柱,待离子交换完毕后,用去离子水以2倍柱体积/小时的流速清洗交换柱,直至水洗液的电导率不再下降为止;用0.1mol/L的乙酸溶液以1.5倍柱体积/小时的流速对色谱柱进行淌洗,在流出液的pH值接近4.5后停止淌洗,再次用去离子水清洗色谱柱直至水洗液的电导率保持恒定;最后,用0.2mol/L的硫酸溶液洗脱色谱柱中的SAM,收集洗脱液,经活性炭脱色后即可得到3.0g SAM,纯度为90%。
实施例3
取D018树脂,用自来水反复冲洗5次,除去机械杂质,用2倍树脂体积的质量分数10%的氢氧化钠浸泡树脂,2小时后,用去离子水水洗至中性,再用质量分数为10%的盐酸浸泡2小时左右,用去离子水水洗至中性。重复上述步骤一次后,将树脂装填色谱柱,用4倍树脂体积的质量分数为10%的盐酸淋洗,用去离子水水洗至流出液pH值为中性;再用4倍柱体积的2mol/L的氨水淋洗,用同样浓度的氨水浸泡树脂使树脂转化为NH4 +型,用去离子水水洗色谱柱,直至流出液的pH值为中性。然后,以1倍柱体积/小时的流速将实施例1中收集 的发酵液上清泵入处理好的D018树脂色谱柱,待离子交换达到平衡后用去离子水以2倍柱体积/小时的流速清洗交换柱,直至水洗液的pH值达到中性,再用0.5mol/L的氨水进行洗脱,收集洗脱液,经浓缩、低温结晶、抽滤,即可获得D-蛋氨酸晶体8.4g,纯度为91%。
实施例4
取4℃低温保藏的产SAM合成酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)划线接种于固体活化培养基中,在30℃培养过夜后,转接液体种子培养基中,再在温度为30℃、转速为250rpm的摇床上培养过夜后,将新鲜种子按体积比6%的接种量接种至发酵罐中,发酵罐中放置有体积为2L的液体发酵培养基,28℃下培养。该发酵罐的搅拌桨转速为150rpm,通气量为250m3/h,发酵液pH值保持在4.5。
待菌株生长至对数生长期OD600=30后,向发酵液中添加1.5g D/L-蛋氨酸,促进SAM合成酶的表达,带菌体生长至稳定期后,离心收集菌体,经生理盐水洗涤两次后,用1/5体积的磷酸缓冲液(pH8.0)重悬菌体细胞;再投加24g D/L-蛋氨酸,35℃下反应,待L-蛋氨酸彻底转化后,离心分离菌体细胞和反应液上清,分别从菌体细胞中分离SAM、从反应液上清中分离D-蛋氨酸。
按照实施例3和实施例4所述的纯化方法分别进行SAM和D-蛋氨酸的纯化,分别获得纯度为90%的SAM 4.1g和纯度为91%的D-蛋氨酸8.2g。可见,当采用静息细胞进行催化时,由于被菌体用于自身生长代谢而消耗的L-蛋氨酸的量减少,从而使最终产生的SAM增多,SAM的得率从9%提高到了13%。
Claims (10)
1.一种制备S-腺苷蛋氨酸和D-蛋氨酸的方法,包括:以D/L-蛋氨酸为原料,通过发酵制得S-腺苷蛋氨酸,其特征在于,从菌体细胞中分离得到S-腺苷蛋氨酸,从发酵液中分离得到D-蛋氨酸。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发酵的温度为25~35℃。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发酵液的pH值为4.5~5.5。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,发酵采用的菌株为产S-腺苷甲硫氨酸合成酶的野生菌或工程菌。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述野生菌为酿酒酵母或清酒酵母。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述D-蛋氨酸的分离方法,包括:将离心或过滤后的发酵液上清通入离子交换树脂,洗脱后,获得D-蛋氨酸。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的离子交换树脂为NH4 +型。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,过柱前,先将树脂浸泡于氢氧化钠中,再浸泡于盐酸中,重复上述步骤1~2次后,将树脂填装于色谱柱中,并先后用盐酸、氨水淋洗,获得NH4 +型离子交换树脂。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述洗脱的过程,包括:用去离子水清洗色谱柱至洗出液pH达中性,再用氨水进行洗脱,收集洗脱液。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述氨水的浓度为0.5~0.6mol/L。
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