CN101671716A - 生物酶不对称转化生产d-苯丙氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

D－苯丙氨酸微生物制造方法属于生物工程领域中的酶工程技术。其所要解决的技术问题是：提供一种生产过程简单，能够降低生产成本的D－苯丙氨酸生物酶不对称转化的制造方法。其技术要点：以DL－苯丙氨酸为生产原料，在酶催化反应中作为底物参加反应；以L－苯丙氨酸解氨酶作为催化剂，催化转化底物DL－苯丙氨酸中的L－苯丙氨酸生成反式肉桂酸和氨，而D－苯丙氨酸完全不参加反应，作为目标产物被提取出来；通过不断流加底物，目标产物D－苯丙氨酸的浓度增高，在酶反应液中形成结晶，直接分离；溶解于酶反应液中的D－苯丙氨酸，通过调节pH至1－5，利用肉桂酸酸性环境不溶于水的性质分离除去肉桂酸，然后浓缩结晶得到；D－苯丙氨酸粗品经过膜过滤脱色，重结晶就可以达到精制提纯的目的。产品化学纯度和光学纯度高，制造成本低。

Description

生物酶不对称转化生产D-苯丙氨酸的方法

技术领域：

本发明属于生物工程领域中的酶工程技术，本发明涉及一种以DL-苯丙氨酸为原料，利用L-苯丙氨酸解氨酶作为催化剂，不对称转化其中的L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸和氨，而D-苯丙氨酸完全不参与反应，作为产物提取出来。

技术背景：

氨基酸类生化产品是关系到人类生命健康的主要物质，用途广泛。近年来D-苯丙氨酸在食品医药方面的用途被充分的开发，尤其在医药领域，国际上许多公司用D-苯丙氨酸为原料开发了一系列抗肿瘤药(百士欣，奥曲肽等)，2型糖尿病治疗药物(那格列奈)，抗艾滋病药物(茚地那韦)等等。D-苯丙氨酸在世界范围内需求量也急剧上涨。

已知制取D-苯丙氨酸的方法主要有“氨基酰化酶法”，“不对称化学转换法”，“海因酶法”。其中，“氨基酰化酶法”是目前生产D型氨基酸常规方法，在生产其他D型氨基酸上也应用广泛，但因为氨基酰化酶价格昂贵，只能用于小规模的生产。“不对称化学转化”反应机制太复杂，工艺流程长，且需要昂贵的纯手性试剂作为拆分剂，生产成本高。目前国内外工业化生产D-苯丙氨酸普遍采用“海因酶法”，该法需要两种酶催化剂的参与，底物浓度低，转化时间长，转化率低，产品纯度不高，而且成本很高。目前国内外企业工业化生产D-苯丙氨酸的方法均有，规模小，产率低，成本高等缺点。无法应对世界范围对D-苯丙氨酸日益增长的需求。

世界各国在手性药物的研发的投入，对D-苯丙氨酸的需求量的增加，迫切需要研究开发一种适合大规模工业化生产的，能显著降低生产成本的技术。依据生物酶的不对称降解或转化原理，研究生产手性氨基酸的方法，是一个重要的方向，本项目的技术创新就是基于该原理。

发明内容：

本发明要解决的问题是：提供一种原料易得，生产过程简单，条件温和，能够大幅度降低生产成本的D-苯丙氨酸生物酶不对称转化生产的方法。

其技术方案是：一种D-苯丙氨酸生物酶不对称转化生产方法，具体步骤和特征如下：

1.含酶细胞悬液的制作：

采用摇瓶或发酵罐通风培养。摇瓶旋转速度为40-200转/分钟，1000毫升三角烧瓶装液量100-400毫升，培养时间12～48小时，培养温度25℃-40℃。发酵培养通风比1∶0.05V-1∶0.4V(液体体积：每分钟通入空气体积)。

培养基可以使用通常的碳水化合物作为碳源，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、麦芽汁、糖蜜等；作为氮源可以单独或混合使用各种动物植物蛋白胨、豆饼水解液、硫酸铵、酵母提取物、玉米浆等；无机盐可以单独或混合使用氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等多种无机盐；诱导物为单独或者混合使用的L-苯丙氨酸，DL-苯丙氨酸，L-酪氨酸；酶稳定剂为单独或者混合使用的聚乙二醇、山梨醇、戊二醛、甘油、谷氨酸。此外培养基中加入大豆油、各种消泡剂，避免灭菌或培养过程中的起泡现象。培养基配制后用酸或碱调节PH值到4.0-7.5。然后用蒸汽110-121℃灭菌10-30分钟。

其中碳源浓度为0-100g/L；氮源浓度为0.5-50g/L，无机盐的浓度为0.1-10.0g/L。诱导物浓度为0-1.0g/L，酶稳定剂的浓度为0-1.0g/L。

本发明使用的是产L-苯丙氨酸解氨酶微生物，主要是红酵母属，如深红酵母，粘红酵母等，也包括链霉菌属，枝孢霉属，曲霉属等。通过培养这些微生物得到含酶的微生物的细胞悬液，可以直接加入底物反应，也可以将微生物细胞或者L-苯丙氨酸解氨酶单独分离提取出来使用。也可以将分离得到微生物细胞用聚合胶包埋等方式固定化使用。

2.酶不对称转化反应

将培养好的细胞悬液(发酵液)维持一定的温度25℃-55℃，向液体中加入底物DL-苯丙氨酸，加入的DL-苯丙氨酸两种异构体的比例任意。反应体系中的L-苯丙氨酸解氨酶特异性的催化转化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸和氨。其中的D-苯丙氨酸完全不参加反应。反应过程检测反式肉桂酸浓度，检测反应体系pH值，随着反应的进行反应液pH值会增加，可以通过加入硫酸控制反应体系的pH值，维持最适宜的pH值在4.0～10.0.

3.产物提取分离

反应过程D-苯丙氨酸浓度增加，积累到一定程度，D-苯丙氨酸从反应体系中结晶出来，通过离心分离就可以得到粗品。

分离溶解在反应体系的D-苯丙氨酸，可以通过向酶液中加酸调节酶液pH在1.0到5.0，利用肉桂酸在酸性环境下不溶于水的特性，沉淀除去反式肉桂酸，然后浓缩结晶提取。

4.D-苯丙氨酸的精制

将粗品溶解于蒸馏水中，用膜过滤的方法脱色，重结晶的方法精制。脱色液用真空浓缩的方法减少水分，从而使D-苯丙氨酸结晶出来。离心或者抽滤得到成品。

其技术效果是：利用L-苯丙氨酸解氨酶，不对称地催化转化DL-苯丙氨酸中的L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸和氨，而D-苯丙氨酸完全不参加反应。作为目标产物被提取出来。产品光学纯度高达99.8％、化学纯度高达99.7％，生产过程简单，条件温和，生产成本低。

实施例：

以下，用实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例中使用的原料是旋光度为零的DL-苯丙氨酸

实施例1：

配制各组分质量分数如下培养基1000ml。

葡萄糖0.5％，蛋白胨1％，酵母膏1％，NaCl0.5％，K₂HPO₄0.1％，L-酪氨酸0.1％，泡敌0.01％，DL-苯丙氨酸0.1％，谷氨酸0.1％。

用硫酸调节pH值到5.5。

将此1000ml培养基分装入1000ml三角烧瓶中，每瓶装液量250ml。将上述培养基121℃高压灭菌15分钟。冷却至30℃，将保存在斜面上粘红酵母用ф1mm接种环挑取一环接入上述培养基中。使用旋转振荡器，在30℃、110rpm下培养24小时。

合并上述细胞培养液1升，调节pH至8.5，加入DL-苯丙氨酸30g，控制温度45℃，反应5～10小时后开始流加DL-苯丙氨酸，反应连续进行40小时，累计加入DL-苯丙氨酸250g，停止加料，继续反应1小时，冷却至15℃，用抽滤的方法分离结晶出的D-苯丙氨酸粗品90g。抽滤液中加入硫酸，调节其pH至2，肉桂酸沉淀析出，再次抽滤除去肉桂酸沉淀，得到的抽滤液真空浓缩得到D-苯丙氨酸25g，合并粗品115g粗品溶解于4L蒸馏水中，膜过滤脱色，抽滤。用旋转薄膜蒸发器真空浓缩结晶，得D-苯丙氨酸精制品100g。产品光学纯度99.5％，化学纯度99.6％。

实施例2：

配制各组分质量分数如下培养基1000ml。

葡萄糖0.5％，蛋白胨1％，酵母膏1％，NaCl0.5％，K₂HPO₄0.1％，L-酪氨酸0.1％，泡敌0.01％，DL-苯丙氨酸0.1％，谷氨酸0.1％。

用硫酸调节pH值到5.5。

将此1000ml培养基分装入1000ml三角烧瓶中，每瓶装液量250ml。将上述培养基121℃高压灭菌15分钟。冷却至30℃，将保存在斜面上粘红酵母用ф1mm接种环挑取一环接入上述培养基中。使用旋转震荡器，在30℃、110rpm下培养24小时。

离心上述细胞培养液，取6g离心所得菌体加入预先配制好的DL-苯丙氨酸溶液200ml(浓度3％)，45℃，110rpm，持续反应10小时。向此反应液中加入硫酸调节pH到2，肉桂酸析出，抽滤除去肉桂酸，所得抽滤液真空浓缩得到D-苯丙氨酸粗品2.5g。将2.5g粗品溶解于100ml蒸馏水中，用膜过滤，结晶的方法精制得到D-苯丙氨酸精制品2.0g。产品光学纯度99.8％，化学纯度99.7％。

实施例3：

配制含蛋白胨20g/L，酵母膏20g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，玉米浆干粉18g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L的一级培养基150毫升，用氨水或者硫酸调整pH值到5.5，分装入500ml的三角烧瓶中，每瓶装液量150ml。将上述培养基121℃高压灭菌15分钟。冷却到30℃，将保存在斜面上的粘红酵母用ф1mm接种环挑去一环接入上述培养基中。使用恒温摇床，在30℃，110rpm下培养18小时，得到一级种子细胞悬液400毫升。

配制含豆饼水解液20g/L(折干)，麦芽粉20g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，玉米浆干粉5g/L，硫酸镁02g/L，磷酸二氢钾1g/L、L-苯丙氨酸5g/L的发酵液10升，调节PH值到5.5。将上述培养基加到有效容积10升的发酵罐中，115℃高压灭菌15-20分钟。冷却至30℃，接入上述一级种子细胞悬液400毫升。每分钟通入无菌空气2升，培养24小时。离心分离菌体备用。

(1)用游离细胞反应的实施例：取湿菌体3kg，加入酶反应罐，酶反应罐中预先配制浓度3％，pH9.5的DL-苯丙氨酸的底物溶液100L。45℃持续反应10小时。加入硫酸，调节反应液pH到2.0，过滤除去肉桂酸。膜过滤脱色，真空浓缩酶反应液得到D-苯丙氨酸1150g，母液20L。产品光学纯度998％，化学纯度99.7％。

(2)固定化菌体的细胞反应的实施例：取湿菌体3kg，用卡拉胶0.5kg，在温度45℃混合，冷却制备固定化细胞。将固定化细胞装入有机玻璃固定化细胞反应柱。配制浓度3％，pH9.5的DL-苯丙氨酸溶液100L，控制温度40℃，将DL-苯丙氨酸溶液从底部循环通入反应柱，控制流速，使L-苯丙氨酸转化率转化率不低于98.5％。收集流出液95L，反应结束用10L蒸馏水分3次洗涤反应柱。合并得到反应液105L。用硫酸调节pH值到2.0，过滤除去肉桂酸，通过膜过滤脱色，真空浓缩结晶，得到D-苯丙氨酸1200g，母液20L。产品光学纯度99.8％，化学纯度99.7％。

Claims (6)

1.一种D-苯丙氨酸的生物酶不对称转化生产的方法，其特征在于：

1)本发明涉及的D-苯丙氨酸生产方法是以DL苯丙氨酸为原料，利用L-苯丙氨酸解氨酶作为催化剂，不对称转化其中的L-苯丙氨酸，使其脱氨生成反式肉桂酸和氨，而D-苯丙氨酸完全不参与反应，作为产物提取出来。

2)生物酶不对称转化反应所用的酶反应液的制作

将碳源、氮源、无机盐、水和诱导物以及酶稳定剂按比例配制培养基，用酸或者碱将其pH值调节到4.0-8.0；然后接入产L-苯丙氨酸解氨酶的微生物，用旋转振荡器或者发酵罐通风培养12-48小时，培养温度为25℃-40℃。

3)生物酶催化不对称转化反应。

向培养好的细胞悬液液体中不断流加底物DL-苯丙氨酸，使反应体系中的L-苯丙氨酸解氨酶特异性的催化转化L-苯丙氨酸，脱氨生成反式肉桂酸和氨，通过加大通风量或者加入酸等手段降低溶液的pH值，使溶液的pH值维持在4.0-10.0，反应温度25℃-55℃。

4)产物提取分离

利用苯丙氨酸在水中溶解度低的特性，通过向转化体系中不断地加入DL-苯丙氨酸，增加D-苯丙氨酸的浓度，是D-苯丙氨酸从反应体系中结晶出来，通过离心分离得到粗品

反应结束溶解于酶液中的D-苯丙氨酸，通过向酶液中加酸调节酶液pH在1.0到5.0，利用肉桂酸在酸性环境下不溶于水的特性，沉淀除去反式肉桂酸，然后浓缩结晶提取。

5)D-苯丙氨酸的精制

粗品溶解于蒸馏水中，用膜过滤的方法脱色，然后浓缩结晶即得到D-苯丙氨酸成品。

2.根据权利要求1所述的一种D-苯丙氨酸的生物酶不对称转化生产的方法，其特征在于所述培养基中的碳源为单独或者混合使用的碳水化合物中的葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、麦芽汁和糖蜜；氮源为单独或者混合使用的各种动植物蛋白胨、豆饼水解液、硫酸铵、酵母提取液和玉米浆；无机盐为单独或混合使用的氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾；所述的诱导物为单独或者混合使用的L-苯丙氨酸，DL-苯丙氨酸，L-酪氨酸；酶稳定剂为单独或者混合使用的聚乙二醇、山梨醇、戊二醛、甘油、谷氨酸。

3.根据权利要求1和2所述的一种D-苯丙氨酸生物酶不对称转化生产方法，其特征在于：所述碳源浓度为0-100g/L；氮源的浓度为0.5-50g/L；无机盐的浓度为0.1-10.0g/L，诱导物浓度为0-10.0g/L，酶稳定剂浓度为0-10.0g/L。

4.根据权利要求1所述的一种D-苯丙氨酸的生物酶不对称转化生产的方法其特征在于：产L-苯丙氨酸解氨酶的微生物为红酵母属，如深红酵母，粘红酵母等，也包括链霉菌属，枝孢霉属，曲霉属等。

5.根据权利要求1所述的一种D-苯丙氨酸的生物酶不对称转化生产的方法，其特征在于：做为生产原料DL-苯丙氨酸中的两种旋光异构体的比例可以是任意的。

6.根据权利要求1所述的一种D-苯丙氨酸的生物酶不对称转化生产的方法，其特征在于：可以将底物DL-苯丙氨酸直接加入培养好的微生物细胞悬液中，也可以通过离心手段分离出细胞培养液中的微生物细胞，与底物溶液混合制作反应体系进行反应。同样也可以从微生物细胞中提取L-苯丙氨酸解氨酶，以游离酶的形式参加反应。也可以将分离得到的微生物细胞用聚合胶包埋等方法固定化使用。