CN102268057B - 一种3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种3’，5’-环腺苷单磷酸的结晶方法。本发明所提供的方法包括：1)将3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，生成3’，5’-环腺苷单磷酸盐；2)将步骤1)中反应生成的3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，生成3’，5’-环腺苷单磷酸；3)于0～15℃下，保存步骤2)中得到的3’，5’-环腺苷单磷酸，即得。本发明所提供的方法可以明显改善最终产品质量，结晶收率高，操作简单，重复性好，适合3’，5’-环腺苷单磷酸的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于结晶技术领域，具体涉及一种3’，5’-环腺苷单磷酸的结晶方法。
背景技术
3′，5’-环磷酸腺苷(3′，5′-cyclic adenosine monophosphate)是蛋白激酶致活剂，是核苷酸的衍生物。3′，5’-环磷酸腺苷是在人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，能调节细胞的多种功能活动。作为激素的第二信使，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢作用，能改变细胞膜的功能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，从而增强心肌收缩，并可促进呼吸链氧化酶的活性，改善心肌缺氧，缓解冠心病症状及改善心电图。此外，对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。
目前有关3’，5’-环腺苷单磷酸结晶的研究鲜有文献报道。在2000年出的版的《最新生化药物制备技术》中报道，在化学合成的3’，5’-环腺苷单磷酸结晶工艺，加等体积的95％乙醇，用2mol/L盐酸调pH1～2，即析出白色结晶，过滤，取结晶干燥，得成品cAMP，母液回收，收率62.48％。由于化学合成过程中添加了如吡啶、三氯氧磷等毒性较大的试剂，且反应不完全，副产物多，最终导致后续分离结晶收率很低。另外，在中国专利CN1702076A中公开了直接用冷冻干燥法对3’，5’-环腺苷单磷酸浓缩液进行结晶，但由于冷冻干燥法仅能除去溶液中的水分，虽然收率为100％，但产品的纯度并没有进一步提升，且真空冷冻干燥设备投资大，能源消耗成本较高，限制了该技术的工业化应用。
发明内容
3’，5’-环腺苷单磷酸上的磷酸基的解离平衡常数的pK值为3.3～3.9，调节溶液的pH即可改变它的存在形式，如下式，当pH＞pK时，3’，5’-环腺 苷单磷酸上的磷酸基将与碱反应生成对应的3’，5’-环腺苷单磷酸盐，当pH＜pK时，3’，5’-环腺苷单磷酸盐将与酸反应生成3’，5’-环腺苷单磷酸。
cAMP·H++NaOH＝cAMP·Na++H2O
cAMP·Na++HCl＝cAMP·H++NaCl
因此，本发明的目的是提供一种新的高收率的3’，5’-环腺苷单磷酸的结晶方法，采用反应-低温相结合的结晶技术取代溶剂强析方法和冷冻干燥方法，以克服现有3’，5’-环腺苷单磷酸结晶技术中产品质量差，收率低的缺点。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。本发明提供一种3’，5’-环腺苷单磷酸的结晶方法，所述方法包括以下步骤：1)将3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，生成3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液；2)将步骤1)中反应生成的3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，生成3’，5’-环腺苷单磷酸；3)于0～15℃，优选为0～10℃，更优选为5～10℃下保存步骤2)中反应生成的3’，5’-环腺苷单磷酸，即得。
优选地，所述步骤1)中3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，直至溶液pH值为pH 6.0～10.0，优选为pH 6.0～9.0，更优选为pH 6.5～8.0。
优选地，所述碱选自氨水和氢氧化钠溶液中的一种或几种，其浓度为2～10M，优选为3～6M，更优选为3～5M。
优选地，所述步骤1)中的3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液的浓度为15～350g/L，优选为150～200g/L。
优选地，所述步骤2)中的反应温度为10～40℃，优选为15～35℃，更优选为30～35℃。
优选地，所述步骤2)中3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，直至溶液pH值为pH 1.0～3.5，优选为pH 1.5～3.0，更优选为pH 2.0～2.5。
优选地，所述酸选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种，其浓度为0.01～10M，优选为0.05～8M，更优选为2～4M；
优选地，所述步骤2)中的酸以按3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液体积的0.01～0.5％/min的流速，优选为0.04～0.4％/min，更优选为0.1～0.4％/min的流速缓慢加入至3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液中。
优选地，所述步骤2)中加入酸的过程中还包括以20～250rpm的搅拌速度，优选为90～200rpm，更优选为100～150rpm的搅拌速度进行搅拌。
优选地，所述步骤3)中的保存时间为5～25小时，优选为5～20小时， 更优选为18～20小时。
优选地，所述方法还包括抽滤、乙醇洗涤和真空干燥步骤3)所得产品的步骤。
优选地，所述方法包括以下步骤：1)用3～5M氨水或氢氧化钠与浓度为150～200g/L的3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应，生成3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，溶液pH值为pH 6.5～8.0；2)将步骤1)中生成的3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液于30～35℃下与浓度为2～4M的酸进行反应，直至溶液pH值为pH 2.0～2.5；3)在5～10℃下保存步骤2)中得到的产物18～20小时，抽滤、乙醇洗涤和真空干燥后，即得。优选地，所述步骤2)中的酸以0.1～0.4ml/min的流速缓慢加入至3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液中；优选地，所述加入酸的过程中还包括以100～150rpm的搅拌速度进行搅拌的步骤。
此外，本发明还提供了一种3’，5’-环腺苷单磷酸的制备方法，所述方法包括采用上述的方法使3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液结晶的步骤。
本发明还可采用以下技术方案来实现。一种3’，5’-环腺苷单磷酸的结晶方法，用2～10M氨水或氢氧化钠与浓度为15～350g/L 3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成pH在6～10之间的3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，然后置于结晶罐中，温度保持在10～40℃，搅拌转速控制在20～250rpm，按水溶液体积的0.01～0.5％/min的流速加入浓度为0.01M～10.0M的酸进行反应结晶，直到水溶液的pH值为1.0～3.5为止，停止搅拌，在0～15℃下保存5～25h，再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥即得纯度高于99％的3’，5’-环腺苷单磷酸晶体。其中，优选的氨水或氢氧化钠浓度为3～6M。其中，3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液pH控制在6～9之间。其中，优选的是温度保持在15～35℃，搅拌转速控制在90～200rpm。其中，优选的是按3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液体积的0.1～0.4％/min的流速加入浓度为0.05M～8.0M的酸。上述酸为硫酸、盐酸或磷酸溶液。其中，优选的是直到3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液的pH值为1.5～3.0为止，停止搅拌。其中，优选的是在0～10℃下保存5～20h。
最优选的技术方案如下：用3～5M氨水或氢氧化钠与浓度为150～200g/L 3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成pH为6.5～8.0之间的3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，然后置于结晶罐中，温度保持在30～35℃，搅拌转速控制在100～150rpm，按初始3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液体积的 0.1～0.4％/min的流速加入浓度为2～4M的酸，直到3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液的pH值为2.0～2.5为止，停止搅拌，在5～10℃下保存18～20h，再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥，即得3’，5’-环腺苷单磷酸晶体。
由此可见，本发明所提供的3’，5’-环腺苷单磷酸的结晶方法，在结晶产品收率和质量方面比常规结晶方法具有明显的提高，结晶产品收率稳定在92％以上，产品纯度达到99％以上。另外，本发明所提供的结晶体系和制备方法操作时间短，减少了结晶过程中3’，5’-环腺苷单磷酸的生物降解和色素杂质增加，而且生产过程在常温下进行，无需要特殊的加热和冷却装置，节约投资成本，操作过程更加易于控制，重复性好。可见，采用本发明提供的结晶方法，可以明显改善最终产品质量，结晶收率高，操作简单，重复性好，适合3’，5’-环腺苷单磷酸的工业化生产。
本发明所提供的3’，5’-环腺苷单磷酸的结晶方法，尤其适用于发酵法合成的3’，5’-环腺苷单磷酸，即利用微生物核苷酸代谢途径，以次黄嘌呤为底物，通过一系列生物酶催化反应，最终合成3’，5’-环腺苷单磷酸，将合成的3’，5’-环腺苷单磷酸发酵液先经过预处理和离子交换柱层析后，然后经纳滤膜浓缩脱盐，最后进入结晶罐进行结晶。微生物合成法具有成本低，污染性小，杂质少，分离纯化工艺简单等特点，再加上本发明所提供的结晶方法，使其更加适合于该技术的工业化应用。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
在以下各实施例和对比例中，原料3’，5’-环腺苷单磷酸可以通过以下描述的方法制备，但是不应理解为对本发明的限制，任何通过商购途径获得的3’，5’-环腺苷单磷酸都可以使用本发明提供的方法进行结晶。
1)发酵：将节杆菌A302(分类命名Arthrobacter sp.，于2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3584)接入种子培养基(基于培养基的重量百分比计，包含葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，牛肉膏1％，NaCl 0.3％)中，初始pH为7.0，在30℃、240rpm下培养18 小时。以10％的接种量接入5L发酵罐中的发酵培养基(基于培养基的重量百分比计，包含葡萄糖5％，K2HPO4 1％，KH2PO4 1％，MgSO4 1％，尿素0.5％，蛋白胨0.5％)的基础上每升培养基添加0.1g NaF、0.1g VB1和5g次黄嘌呤)中，以NaOH控制pH为7.0，溶氧控制为30％，400rpm、30℃下发酵72小时。放罐时，环磷酸腺苷的产量是5.0～10.0g/L。然后将发酵液通过离心机离心去除菌体，再将离心清液透过截留分子量为6000道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质，可得到浓度范围在5.0～10.0g/L的3’，5’-环腺苷单磷酸清液。
2)分离纯化：用500g阴离子交换树脂(Amberlite IRA900RF Cl类)填充固定床，平衡后将浓度为5.31g/L的3’，5’-环腺苷单磷酸清液上柱，8.098L后吸附饱和，然后用0.25mol/L的氨水进行洗杂，洗杂完毕后，再用0.3mol/L的HCl进行洗脱16h，洗脱液的体积为14.048L，浓度为2.96g/L，得到的3’，5’-环腺苷单磷酸纯度为95.0％，收率为96.7％。
3)粗结晶：洗脱液再经过浓缩后，采用3～5M氨水或氢氧化钠与浓度为150～200g/L 3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应，生成pH为6.5～8.0之间的3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，然后置于结晶罐中，温度保持在30～35℃，搅拌转速控制在100～150rpm，按初始3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液体积的0.1～0.4％/min的流速加入浓度为2～4M的酸，直到3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液的pH值为2.0～2.5为止，停止搅拌，在5～10℃下保存18～20h，再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥，即得3’，5’-环腺苷单磷酸粗结晶，其纯度为97～98％。
检测3’，5’-环腺苷单磷酸的高效液相色谱的最佳条件如下：
色谱柱：汉邦Lichrospher-5-C18色谱柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相：甲醇-6‰(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为25∶75)；流速0.8mL/min；检测波长255nm；柱温为室温；进样体积20μL。采用外标一点法定量。
在以下各实施例中，结晶收率是通过最终结晶得到的3’，5’-环腺苷单磷酸质量除以进入结晶罐即投料的3’，5’-环腺苷单磷酸质量，再乘以100％计算得到；纯度是通过高效液相色谱检测到的3’，5’-环腺苷单磷酸峰面积除以所有峰的总面积，再乘以100％计算得到。
实施例1
用5M氨水与3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L3’，5’- 环腺苷单磷酸铵盐溶液0.95L，控制pH 8.0，置于结晶罐中，在30℃下控制搅拌速度150rpm，以初始3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0.2％/min(即1.9mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的磷酸溶液，直至pH值为2.0时停止加酸，降温至5℃，保存20h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’-环腺苷单磷酸晶体166.1g，结晶收率为93.5％，纯度99.4％。
实施例2
用3M氨水与3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为105g/L 3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液1L，控制pH 7.0，置于结晶罐中，在35℃下控制搅拌速度200rpm，以初始3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0.4％/min(即4mL/min)的流速缓慢加入浓度为3M的硫酸溶液，直至pH值为2.5时停止加酸，降温至5℃，保存18h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’-环腺苷单磷酸晶体96.71g，结晶收率为92.10％，纯度99.4％。
实施例3
用3M氢氧化钠与3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为185g/L 3’，5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液1.5L，控制pH 8.0，置于结晶罐中，在30℃下控制搅拌速度200rpm，以初始3’，5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液体积的0.4％/min(即6mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的硫酸溶液，直至pH值为2.0时停止加酸，降温至5℃，保存20h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’-环腺苷单磷酸晶体256.97g，结晶收率为92.6％，纯度99.3％。
对比例1
用5M氨水与3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L 3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液0.95L，控制pH 8.0，置于结晶罐中，在30℃下控制搅拌速度150rpm，以初始3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0.2％/min(即1.9mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的磷酸溶液，直至pH值为2.0时停止加酸，在25℃下保存20h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’-环腺苷单磷酸晶体153.8g，结晶收率 为86.6％，纯度99.2％。
对比例2
用3M氢氧化钠与3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L 3’，5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液2L，控制pH 8.0，置于结晶罐中，在40℃下控制搅拌速度100rpm，以初始3’，5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液体积的0.1％/min(即2mL/min)的流速缓慢加入浓度为3M的盐酸，直至pH值为3.0时停止加酸，降温至5℃，保存20h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’-环腺苷单磷酸晶体319.32g，结晶收率为85.38％，纯度98.3％。
Claims (14)
1.一种3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）将3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，直至溶液pH值为pH6～10，生成3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液；
其中，所述3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液的浓度为105-187g/L；
其中，所述碱选自氨水和氢氧化钠溶液中的一种或几种，其浓度为2～10M；
2）将步骤1）中反应生成的3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，直至溶液pH值为pH2.0-2.5，生成3’,5’-环腺苷单磷酸；
其中，所述步骤2）中的反应温度为10～40℃；
其中，所述酸选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种，其浓度为0.01～10M；
其中，所述步骤2）中的酸以按3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液体积的0.2～0.5%/min的流速缓慢加入至3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液中；
其中，所述加入酸的过程中还包括以150-200rpm的搅拌速度进行搅拌；
3）于0～15℃下保存步骤2）中得到的3’,5’-环腺苷单磷酸，保存时间为18～25小时，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）为于0～10℃下保存步骤2）中得到的3’,5’-环腺苷单磷酸，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3）为于5～10℃下保存步骤2）中得到的3’,5’-环腺苷单磷酸，即得。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，直至溶液pH值为pH6～9。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，直至溶液pH值为pH6.5～8.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱浓度为3～6M。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碱浓度为3～5M。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸浓度为0.05～8M。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酸浓度为2～4M。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中的反应温度为15～35℃。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中的反应温度为30～35℃。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括抽滤、乙醇洗涤和真空干燥步骤3）所得产品的步骤。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）用3～5M氨水或氢氧化钠与浓度为105-187g/L的3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应，生成3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，溶液pH值为pH7.5～8.5；
2）将步骤1）中生成的3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液于30～35℃下与浓度为2～4M的酸进行反应，直至溶液pH值为pH2.0～2.5；
3）在5～10℃下保存步骤2）中得到的产物18～20小时，抽滤、乙醇洗涤和真空干燥后，即得。
14.一种3’,5’-环腺苷单磷酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1至13中任一项所述的方法使3’,5’-环腺苷单磷酸结晶的步骤。
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