CN102268057B - 一种3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法。本发明所提供的方法包括:1)将3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应,生成3’,5’-环腺苷单磷酸盐;2)将步骤1)中反应生成的3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应,生成3’,5’-环腺苷单磷酸;3)于0~15℃下,保存步骤2)中得到的3’,5’-环腺苷单磷酸,即得。本发明所提供的方法可以明显改善最终产品质量,结晶收率高,操作简单,重复性好,适合3’,5’-环腺苷单磷酸的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于结晶技术领域,具体涉及一种3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法。
背景技术
3′,5’-环磷酸腺苷(3′,5′-cyclic adenosine monophosphate)是蛋白激酶致活剂,是核苷酸的衍生物。3′,5’-环磷酸腺苷是在人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质,由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成,能调节细胞的多种功能活动。作为激素的第二信使,在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢作用,能改变细胞膜的功能,促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维,从而增强心肌收缩,并可促进呼吸链氧化酶的活性,改善心肌缺氧,缓解冠心病症状及改善心电图。此外,对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。
目前有关3’,5’-环腺苷单磷酸结晶的研究鲜有文献报道。在2000年出的版的《最新生化药物制备技术》中报道,在化学合成的3’,5’-环腺苷单磷酸结晶工艺,加等体积的95%乙醇,用2mol/L盐酸调pH1~2,即析出白色结晶,过滤,取结晶干燥,得成品cAMP,母液回收,收率62.48%。由于化学合成过程中添加了如吡啶、三氯氧磷等毒性较大的试剂,且反应不完全,副产物多,最终导致后续分离结晶收率很低。另外,在中国专利CN1702076A中公开了直接用冷冻干燥法对3’,5’-环腺苷单磷酸浓缩液进行结晶,但由于冷冻干燥法仅能除去溶液中的水分,虽然收率为100%,但产品的纯度并没有进一步提升,且真空冷冻干燥设备投资大,能源消耗成本较高,限制了该技术的工业化应用。
发明内容
3’,5’-环腺苷单磷酸上的磷酸基的解离平衡常数的pK值为3.3~3.9,调节溶液的pH即可改变它的存在形式,如下式,当pH>pK时,3’,5’-环腺 苷单磷酸上的磷酸基将与碱反应生成对应的3’,5’-环腺苷单磷酸盐,当pH<pK时,3’,5’-环腺苷单磷酸盐将与酸反应生成3’,5’-环腺苷单磷酸。
cAMP·H++NaOH=cAMP·Na++H2O
cAMP·Na++HCl=cAMP·H++NaCl
因此,本发明的目的是提供一种新的高收率的3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法,采用反应-低温相结合的结晶技术取代溶剂强析方法和冷冻干燥方法,以克服现有3’,5’-环腺苷单磷酸结晶技术中产品质量差,收率低的缺点。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。本发明提供一种3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法,所述方法包括以下步骤:1)将3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应,生成3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液;2)将步骤1)中反应生成的3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应,生成3’,5’-环腺苷单磷酸;3)于0~15℃,优选为0~10℃,更优选为5~10℃下保存步骤2)中反应生成的3’,5’-环腺苷单磷酸,即得。
优选地,所述步骤1)中3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应,直至溶液pH值为pH 6.0~10.0,优选为pH 6.0~9.0,更优选为pH 6.5~8.0。
优选地,所述碱选自氨水和氢氧化钠溶液中的一种或几种,其浓度为2~10M,优选为3~6M,更优选为3~5M。
优选地,所述步骤1)中的3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液的浓度为15~350g/L,优选为150~200g/L。
优选地,所述步骤2)中的反应温度为10~40℃,优选为15~35℃,更优选为30~35℃。
优选地,所述步骤2)中3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应,直至溶液pH值为pH 1.0~3.5,优选为pH 1.5~3.0,更优选为pH 2.0~2.5。
优选地,所述酸选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种,其浓度为0.01~10M,优选为0.05~8M,更优选为2~4M;
优选地,所述步骤2)中的酸以按3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液体积的0.01~0.5%/min的流速,优选为0.04~0.4%/min,更优选为0.1~0.4%/min的流速缓慢加入至3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液中。
优选地,所述步骤2)中加入酸的过程中还包括以20~250rpm的搅拌速度,优选为90~200rpm,更优选为100~150rpm的搅拌速度进行搅拌。
优选地,所述步骤3)中的保存时间为5~25小时,优选为5~20小时, 更优选为18~20小时。
优选地,所述方法还包括抽滤、乙醇洗涤和真空干燥步骤3)所得产品的步骤。
优选地,所述方法包括以下步骤:1)用3~5M氨水或氢氧化钠与浓度为150~200g/L的3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应,生成3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液,溶液pH值为pH 6.5~8.0;2)将步骤1)中生成的3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液于30~35℃下与浓度为2~4M的酸进行反应,直至溶液pH值为pH 2.0~2.5;3)在5~10℃下保存步骤2)中得到的产物18~20小时,抽滤、乙醇洗涤和真空干燥后,即得。优选地,所述步骤2)中的酸以0.1~0.4ml/min的流速缓慢加入至3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液中;优选地,所述加入酸的过程中还包括以100~150rpm的搅拌速度进行搅拌的步骤。
此外,本发明还提供了一种3’,5’-环腺苷单磷酸的制备方法,所述方法包括采用上述的方法使3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液结晶的步骤。
本发明还可采用以下技术方案来实现。一种3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法,用2~10M氨水或氢氧化钠与浓度为15~350g/L 3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成pH在6~10之间的3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液,然后置于结晶罐中,温度保持在10~40℃,搅拌转速控制在20~250rpm,按水溶液体积的0.01~0.5%/min的流速加入浓度为0.01M~10.0M的酸进行反应结晶,直到水溶液的pH值为1.0~3.5为止,停止搅拌,在0~15℃下保存5~25h,再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥即得纯度高于99%的3’,5’-环腺苷单磷酸晶体。其中,优选的氨水或氢氧化钠浓度为3~6M。其中,3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液pH控制在6~9之间。其中,优选的是温度保持在15~35℃,搅拌转速控制在90~200rpm。其中,优选的是按3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液体积的0.1~0.4%/min的流速加入浓度为0.05M~8.0M的酸。上述酸为硫酸、盐酸或磷酸溶液。其中,优选的是直到3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液的pH值为1.5~3.0为止,停止搅拌。其中,优选的是在0~10℃下保存5~20h。
最优选的技术方案如下:用3~5M氨水或氢氧化钠与浓度为150~200g/L 3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成pH为6.5~8.0之间的3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液,然后置于结晶罐中,温度保持在30~35℃,搅拌转速控制在100~150rpm,按初始3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液体积的 0.1~0.4%/min的流速加入浓度为2~4M的酸,直到3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液的pH值为2.0~2.5为止,停止搅拌,在5~10℃下保存18~20h,再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥,即得3’,5’-环腺苷单磷酸晶体。
由此可见,本发明所提供的3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法,在结晶产品收率和质量方面比常规结晶方法具有明显的提高,结晶产品收率稳定在92%以上,产品纯度达到99%以上。另外,本发明所提供的结晶体系和制备方法操作时间短,减少了结晶过程中3’,5’-环腺苷单磷酸的生物降解和色素杂质增加,而且生产过程在常温下进行,无需要特殊的加热和冷却装置,节约投资成本,操作过程更加易于控制,重复性好。可见,采用本发明提供的结晶方法,可以明显改善最终产品质量,结晶收率高,操作简单,重复性好,适合3’,5’-环腺苷单磷酸的工业化生产。
本发明所提供的3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法,尤其适用于发酵法合成的3’,5’-环腺苷单磷酸,即利用微生物核苷酸代谢途径,以次黄嘌呤为底物,通过一系列生物酶催化反应,最终合成3’,5’-环腺苷单磷酸,将合成的3’,5’-环腺苷单磷酸发酵液先经过预处理和离子交换柱层析后,然后经纳滤膜浓缩脱盐,最后进入结晶罐进行结晶。微生物合成法具有成本低,污染性小,杂质少,分离纯化工艺简单等特点,再加上本发明所提供的结晶方法,使其更加适合于该技术的工业化应用。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
在以下各实施例和对比例中,原料3’,5’-环腺苷单磷酸可以通过以下描述的方法制备,但是不应理解为对本发明的限制,任何通过商购途径获得的3’,5’-环腺苷单磷酸都可以使用本发明提供的方法进行结晶。
1)发酵:将节杆菌A302(分类命名Arthrobacter sp.,于2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.3584)接入种子培养基(基于培养基的重量百分比计,包含葡萄糖1%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%,牛肉膏1%,NaCl 0.3%)中,初始pH为7.0,在30℃、240rpm下培养18 小时。以10%的接种量接入5L发酵罐中的发酵培养基(基于培养基的重量百分比计,包含葡萄糖5%,K2HPO4 1%,KH2PO4 1%,MgSO4 1%,尿素0.5%,蛋白胨0.5%)的基础上每升培养基添加0.1g NaF、0.1g VB1和5g次黄嘌呤)中,以NaOH控制pH为7.0,溶氧控制为30%,400rpm、30℃下发酵72小时。放罐时,环磷酸腺苷的产量是5.0~10.0g/L。然后将发酵液通过离心机离心去除菌体,再将离心清液透过截留分子量为6000道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质,可得到浓度范围在5.0~10.0g/L的3’,5’-环腺苷单磷酸清液。
2)分离纯化:用500g阴离子交换树脂(Amberlite IRA900RF Cl类)填充固定床,平衡后将浓度为5.31g/L的3’,5’-环腺苷单磷酸清液上柱,8.098L后吸附饱和,然后用0.25mol/L的氨水进行洗杂,洗杂完毕后,再用0.3mol/L的HCl进行洗脱16h,洗脱液的体积为14.048L,浓度为2.96g/L,得到的3’,5’-环腺苷单磷酸纯度为95.0%,收率为96.7%。
3)粗结晶:洗脱液再经过浓缩后,采用3~5M氨水或氢氧化钠与浓度为150~200g/L 3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应,生成pH为6.5~8.0之间的3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液,然后置于结晶罐中,温度保持在30~35℃,搅拌转速控制在100~150rpm,按初始3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液体积的0.1~0.4%/min的流速加入浓度为2~4M的酸,直到3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液的pH值为2.0~2.5为止,停止搅拌,在5~10℃下保存18~20h,再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥,即得3’,5’-环腺苷单磷酸粗结晶,其纯度为97~98%。
检测3’,5’-环腺苷单磷酸的高效液相色谱的最佳条件如下:
色谱柱:汉邦Lichrospher-5-C18色谱柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm);流动相:甲醇-6‰(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为25∶75);流速0.8mL/min;检测波长255nm;柱温为室温;进样体积20μL。采用外标一点法定量。
在以下各实施例中,结晶收率是通过最终结晶得到的3’,5’-环腺苷单磷酸质量除以进入结晶罐即投料的3’,5’-环腺苷单磷酸质量,再乘以100%计算得到;纯度是通过高效液相色谱检测到的3’,5’-环腺苷单磷酸峰面积除以所有峰的总面积,再乘以100%计算得到。
实施例1
用5M氨水与3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L3’,5’- 环腺苷单磷酸铵盐溶液0.95L,控制pH 8.0,置于结晶罐中,在30℃下控制搅拌速度150rpm,以初始3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0.2%/min(即1.9mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的磷酸溶液,直至pH值为2.0时停止加酸,降温至5℃,保存20h,结晶完全后将悬浊液抽滤,用乙醇洗涤所得的白色晶体,真空干燥,可以得到3’,5’-环腺苷单磷酸晶体166.1g,结晶收率为93.5%,纯度99.4%。
实施例2
用3M氨水与3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为105g/L 3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液1L,控制pH 7.0,置于结晶罐中,在35℃下控制搅拌速度200rpm,以初始3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0.4%/min(即4mL/min)的流速缓慢加入浓度为3M的硫酸溶液,直至pH值为2.5时停止加酸,降温至5℃,保存18h,结晶完全后将悬浊液抽滤,用乙醇洗涤所得的白色晶体,真空干燥,可以得到3’,5’-环腺苷单磷酸晶体96.71g,结晶收率为92.10%,纯度99.4%。
实施例3
用3M氢氧化钠与3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为185g/L 3’,5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液1.5L,控制pH 8.0,置于结晶罐中,在30℃下控制搅拌速度200rpm,以初始3’,5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液体积的0.4%/min(即6mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的硫酸溶液,直至pH值为2.0时停止加酸,降温至5℃,保存20h,结晶完全后将悬浊液抽滤,用乙醇洗涤所得的白色晶体,真空干燥,可以得到3’,5’-环腺苷单磷酸晶体256.97g,结晶收率为92.6%,纯度99.3%。
对比例1
用5M氨水与3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L 3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液0.95L,控制pH 8.0,置于结晶罐中,在30℃下控制搅拌速度150rpm,以初始3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0.2%/min(即1.9mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的磷酸溶液,直至pH值为2.0时停止加酸,在25℃下保存20h,结晶完全后将悬浊液抽滤,用乙醇洗涤所得的白色晶体,真空干燥,可以得到3’,5’-环腺苷单磷酸晶体153.8g,结晶收率 为86.6%,纯度99.2%。
对比例2
用3M氢氧化钠与3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L 3’,5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液2L,控制pH 8.0,置于结晶罐中,在40℃下控制搅拌速度100rpm,以初始3’,5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液体积的0.1%/min(即2mL/min)的流速缓慢加入浓度为3M的盐酸,直至pH值为3.0时停止加酸,降温至5℃,保存20h,结晶完全后将悬浊液抽滤,用乙醇洗涤所得的白色晶体,真空干燥,可以得到3’,5’-环腺苷单磷酸晶体319.32g,结晶收率为85.38%,纯度98.3%。
Claims (14)
1.一种3’,5’-环腺苷单磷酸的结晶方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
1)将3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应,直至溶液pH值为pH6~10,生成3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液;
其中,所述3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液的浓度为105-187g/L;
其中,所述碱选自氨水和氢氧化钠溶液中的一种或几种,其浓度为2~10M;
2)将步骤1)中反应生成的3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应,直至溶液pH值为pH2.0-2.5,生成3’,5’-环腺苷单磷酸;
其中,所述步骤2)中的反应温度为10~40℃;
其中,所述酸选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种,其浓度为0.01~10M;
其中,所述步骤2)中的酸以按3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液体积的0.2~0.5%/min的流速缓慢加入至3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液中;
其中,所述加入酸的过程中还包括以150-200rpm的搅拌速度进行搅拌;
3)于0~15℃下保存步骤2)中得到的3’,5’-环腺苷单磷酸,保存时间为18~25小时,即得。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤3)为于0~10℃下保存步骤2)中得到的3’,5’-环腺苷单磷酸,即得。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤3)为于5~10℃下保存步骤2)中得到的3’,5’-环腺苷单磷酸,即得。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应,直至溶液pH值为pH6~9。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应,直至溶液pH值为pH6.5~8.0。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述碱浓度为3~6M。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述碱浓度为3~5M。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述酸浓度为0.05~8M。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述酸浓度为2~4M。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2)中的反应温度为15~35℃。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述步骤2)中的反应温度为30~35℃。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括抽滤、乙醇洗涤和真空干燥步骤3)所得产品的步骤。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
1)用3~5M氨水或氢氧化钠与浓度为105-187g/L的3’,5’-环腺苷单磷酸水溶液反应,生成3’,5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液,溶液pH值为pH7.5~8.5;
2)将步骤1)中生成的3’,5’-环腺苷单磷酸盐溶液于30~35℃下与浓度为2~4M的酸进行反应,直至溶液pH值为pH2.0~2.5;
3)在5~10℃下保存步骤2)中得到的产物18~20小时,抽滤、乙醇洗涤和真空干燥后,即得。
14.一种3’,5’-环腺苷单磷酸的制备方法,其特征在于,所述方法包括采用权利要求1至13中任一项所述的方法使3’,5’-环腺苷单磷酸结晶的步骤。
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李良铸,等.环磷腺苷.《最新生化药物制备技术》.中国医药科技出版社,2001,244-246. * |
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