CN1197618C - 突变霍乱全毒素佐剂 - Google Patents

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Abstract

一种突变霍乱全毒素可以作为佐剂用在抗原性组合物中，从而增强脊椎动物宿主对来自病原性细菌、病毒、真菌或寄生虫的选定抗原的免疫应答，该突变毒素的特征在于其A亚基的第29位氨基酸发生点突变，该处的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代。在具体实施例中，氨基酸29是组氨酸。该突变霍乱全毒素还可以在A亚基内氨基酸29以外位置具有至少一处其他突变。所述抗原性组合物可以另含除突变霍乱全毒素之外的第二佐剂。

Description

突变霍乱全毒素佐剂
                            发明领域
本发明涉及免疫原性突变霍乱全毒素作为佐剂增强脊椎动物宿主对选定抗原的免疫应答的用途，该突变毒素的毒性比野生型霍乱毒素降低，且霍乱全毒素A亚基的第29位谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代。
                            发明背景
免疫***运用多种机制来攻击病原体。然而，免疫后，并非所有这些机制都被激活。免疫诱导的保护性免疫力取决于疫苗激发适当免疫应答抵抗或消灭病原的能力。根据不同的病原，这可能需要细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答。
与免疫原或病原一起给予时能增强免疫应答的物质称为佐剂。
革兰氏阴性菌霍乱弧菌(V.cholerae)会引起胃肠道疾病霍乱。霍乱毒素(CT)的分泌会引起霍乱弧菌性腹泻。
CT含有一个毒素酶活性所在的A亚基(CT-A)，和与毒素结合肠上皮细胞等表面具有神经节苷脂GM1的细胞有关的五个相同的B亚基(CT-B)。CT-A与CT-B共同构成一个全毒素。CT序列是已知的(目录1)。
CT是一个六异聚复合物，由一条A多肽和5条相同的B多肽构成(2)。五聚体B是与细胞表面受体神经节苷脂GM1结合所必需的(3)。A亚基经蛋白酶消化切开其内部C187与C199之间的二硫环可产生具有酶活性的A1多肽(4)和连接片段A1与五聚体B的较小的多肽A2(5)。进入肠细胞后，CT-A1将调节性G蛋白(Gsα)ADP-核糖基化，导致腺苷酸环化酶组成性活化，提高细胞内cAMP浓度，液体及电解质分泌进入小肠腔(6)。在体外，辅助蛋白ARFs(7)，一种GTP结合性小蛋白(已知在真核细胞内参与囊泡转运)的存在激发CT的ADP-核糖基转移酶活性。
对于通过胃肠道、肺、鼻咽或泌尿生殖道表面进入体内而引起急性感染的感染性生物所需要的的有效免疫方法是主动免疫学方法。这些表面被粘液所覆盖，其中含有免疫球蛋白，主要是分泌性IgA(8，9，10)。该抗体由许多渗透上述粘膜下固有层的产IgA浆细胞产生(11，12)。IgA通过分泌性组分的作用被特异性地运输到内腔表面(13)。
然而，肠胃外免疫方法一般不能有效诱导分泌性IgA应答。分泌性免疫力主要是通过对粘膜相关淋巴组织直接免疫而获得的。诱导产生于一个粘膜位置后，产IgA浆细胞前体渗出分散到多种粘膜组织，最终分化导致IgA的高速合成(14，15，16)。大量研究证明了粘膜免疫诱导该普遍粘膜免疫***的可行性(17)，但大多需要大量抗原来获得有效的免疫，因而使得该方法不适合纯化的疫苗抗原。为了克服这一问题而研究的方案之一是采用粘膜佐剂。已知CT是最有效的佐剂之一，而且，当CT与一种无关抗原共给予时会同时诱导对该抗原的循环性和粘膜性抗体。因此，CT可以作为佐剂。
较好的是，采用减毒形式的CT全毒素作为佐剂，从而减少因野型生CT所致的腹泻症状。因此，需要鉴定一种能够增强免疫应答，同时降低CT全毒素毒性的突变CT全毒素。
发明概述
因此，本发明目的是用毒性比野生型CT降低的突变CT全毒素作为抗原性组合物中的佐剂，从而增强脊椎动物宿主对来自病原性细菌、病毒、真菌或寄生虫的选定抗原的免疫应答。
本发明的以上目的是用一种突变霍乱全毒素达到的，该突变全毒素的特征在于其A亚基的第29位氨基酸发生了点突变，即该处的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸所取代。具体实施例之一中，第29位的氨基酸是组氨酸。该突变CT(又称CT-CRM)可用作抗原性组合物中的佐剂，增强脊椎动物宿主对来自病原性细菌、病毒、真菌或寄生虫的选定抗原的免疫应答。该突变CT是用常规技术对编码野生型CT的DNA进行定点诱变产生的。所述抗原性组合物还可以含有稀释剂或载体。
本发明还涉及一种提高含来自病原性细菌、病毒、真菌或寄生虫的选定抗原的抗原性组合物激发脊椎动物宿主免疫应答的能力的方法，即在组合物中包含有效佐剂量的突变霍乱全毒素，其中全毒素的毒性比野生型CT降低，且A亚基的第29位氨基酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸特别是组氨酸取代。
本发明还涉及一种含分离并纯化的DNA序列的质粒，该DNA序列含编码免疫原性突变霍乱全毒素的DNA序列，所述突变霍乱全毒素A亚基的第29位谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，而且，该DNA序列与阿糖诱导型启动子操作性连接，还涉及以该质粒转化、转导或转染的合适的宿主细胞。免疫原性突变霍乱全毒素的产生是通过；用上述质粒转化、转导或转染宿主细胞，并在允许宿主细胞表达重组免疫原性脱毒蛋白质的条件下培养宿主细胞。
                         附图简述
图1显示各种CT-CRM结合神经节苷脂GM1的能力。每种CT-CRM都稀释3倍，初始浓度为3μg/ml，重复实验2次。以各稀释度的410nm平均吸光度表示结合能力。
图2显示用脑膜炎球菌重组菌毛蛋白(rpilin)单独或与CT-CRME29H佐剂一起鼻内免疫的小鼠(每组10只)或原初(未免疫)小鼠鼻内菌落的减少，以log10CFU/鼻表示，各组在免疫后都接受相同脑膜炎球菌菌株的激发。
图3显示用脑膜炎球菌重组菌毛蛋白单独或与CT-CRME29H佐剂一起、脑膜炎球菌1类外膜蛋白(ProA)与CT-CRME29H佐剂一起、KLH与CT-CRME29H佐剂一起鼻内免疫的小鼠(每组5只)或原初小鼠鼻内菌落的减少，以log10CFU/鼻表示，各组在免疫后都接受相同脑膜炎球菌菌株的攻击。
图4显示以CT-CRME29H为佐剂用脑膜炎球菌重组菌毛蛋白、脑膜炎球菌H355的ProA、脑膜炎球菌870277的ProA、热灭活脑膜炎球菌870277全细胞或KLH鼻内免疫的小鼠(每组10只)鼻内菌落的减少，以log10CFU/鼻表示，各组在免疫后都接受相同脑膜炎球菌菌株(870277)的攻击。
图5显示用脑膜炎球菌H355的ProA和CT-CRME29H或MPLTM佐剂、KLH和MPLTM佐剂或热灭活脑膜炎球菌870277全细胞和MPLTM佐剂皮下免疫的小鼠(每组10只)鼻内脑膜炎球菌870277菌落的减少，以log10CFU/鼻表示，各组在免疫后都接受相同脑膜炎球菌菌株(870277)的攻击。
图6显示对呼吸道合胞病毒(RSV)所感染靶细胞的抗原依赖性溶胞活性第一次试验，表示为细胞裂解百分比与效应物：靶细胞之比的关系。
图7显示F蛋白加佐剂免疫赋予小鼠肺抗RSV攻击保护作用的第一次试验，肺内病毒的效价测定表示为Log10PFU/g。
图8显示对呼吸道合胞病毒(RSV)所感染靶细胞的抗原依赖性溶胞活性第二次试验，表示为细胞裂解百分比与效应物：靶细胞之比的关系。
图9显示F蛋白加佐剂免疫赋予小鼠肺抗RSV攻击保护作用的第二次试验，肺内病毒的效价测定表示为Log10PFU/g。
图10显示用2/6-VLP单独或与CT-CRME29H佐剂一起鼻内免疫后，BALB/c小鼠体内的轮状病毒特异性血清抗体应答。用2/6-VLP单独(n＝5)或与CT-CRME29H佐剂一起(n＝4)鼻内免疫BALB/c小鼠，测定轮状病毒特异性IgG(图10A)、IgM(图10B)和IgA(图10C)的水平。显示了标准方差。
图11显示BALB/c近交小鼠接受2/6-VLP免疫后的轮状病毒特异性血清抗体应答。各组BALB/c小鼠在第0和第2周接受2/6-VLP加CT-CRME29H的口服(方块，n＝4)、鼻内(菱形，n＝5)或鼻内和口服(圆圈，n＝4)联合免疫。在所示周收集各组各小鼠的血清样品，用ELISA测定血清IgG(图11A)、IgM(图11B)和IgA(图11C)的水平。计算各组的几何平均效价(GMT)，对免疫后周数做图。
图12显示BALB/c小鼠的IgG1和IgG2抗体亚类。用轮状病毒2/6-病毒样颗粒(VLP)加CT-CRME29H口服或鼻内免疫的BALB/c小鼠的攻击前血清来测定IgG亚类。显示标准方差。
图13显示2/6 VLP免疫的近交BALB/c小鼠的轮状病毒特异性小肠抗体应答反应。如图11所述用2/6 VLP加CT-CRME29H免疫各组BALB/c小鼠，测定轮状病毒特异性小肠IgA(图13A)和IgG(图13B)。所有小鼠中都没有测到轮状病毒特异性小肠IgM。
图14显示以鼠轮状病毒攻击后2/6 VLP免疫的BALB/c和CD-1小鼠的保护作用。图14A显示以2/6 VLP单独(n＝4)或与CT-CRME29H一起(n＝5)免疫的小鼠之间抗原排出减少百分比(PRAS)的比较。计算各小鼠(·)的PRAS和各组(-)的平均PRAS。图14B显示经不同途径用2/6 VLP加CT-CRME29H免疫的各组BALB/c小鼠，保护作用水平测定如前所述。图14C显示如前所述以2/6 VLP加CT-CRME29H口服或鼻内免疫的远交CD-1小鼠。在第26周，攻击免疫和对照小鼠，如前所述测定PRAS。口服组(n＝4)中，一只小鼠在攻击前死亡(测定保护作用的n＝3)。
                         本发明的详细描述
本发明描述的是突变CT作为抗原性组合物的佐剂的用途。本发明在大肠杆菌内产生了一组突变CT克隆(CT-CRM)。数据显示，辅佐性能特别优良的CT-CRM是A亚基内第29位具有非保守性氨基酸取代(谷氨酸被组氨酸取代)的突变体(CT-CRME29H)。累积数据表明，CT-CRME29H是全毒素，但毒性低于野生型CT。重要的是，胃内(IG)或鼻内(IN)给予不同疫苗抗原时，CT-CRME29H都能够增强粘膜和***免疫应答反应。这些疫苗抗原来自细菌或病毒病原。幽门螺杆菌、轮状病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)感染鼠模型中的结果显示，以CT-CRME29H制备的疫苗胃内或鼻内免疫促进的免疫应答是保护性的。这些数据表明，CT-CRME29H作为佐剂的活性至少相当于野生型CT。即使在已有抗CT免疫应答存在下，CT-CRME29H仍能起到粘膜佐剂的作用。
突变CT-A保留了与CT-B组装形成全毒素的能力，从而使辅佐性接近野生型CT，而毒性则比野生型CT降低。B亚基可能保留其天然序列，或自身发生突变。
毒性的降低提供了一种可用作佐剂的CT。本发明的免疫原性突变CT平衡了毒性的降低和辅佐性的保留，因此，该蛋白质在起佐剂作用的同时能够被接受抗原性组合物免疫的脊椎动物安全地耐受。
本发明的抗原性组合物在给予该组合物后增强脊椎动物宿主的抗体应答和细胞介导的免疫，从而调节免疫应答，所述的抗原性组合物含有来自细菌、病毒、真菌或寄生虫的选定抗原和有效佐剂量的突变CT，其中CT的毒性比野生型CT降低，其A亚基内第29位的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代。在实施例之一中，第29位是组氨酸。
本发明中，“全毒素的毒性降低”表示与野生型CT相比，突变CT-CRM，例如CT-CRME29H突变体表现出的每单位纯化毒素蛋白质毒性大大降低，这使得突变体能够用作抗原性组合物中的佐剂而不会引起明显的副作用。
本发明中，“有效佐剂量”表示CT-CRM突变体，例如CT-CRME29H突变体的剂量适合在脊椎动物宿主内引发增强的免疫应答。具体剂量将取决于宿主的年龄、体重和医学情况，以及给药的方法。本领域技术人员不难确定所述的合适剂量。
如后文实施例所述，产生了5种CT-CRM，其A亚基内具有如下突变：
氨基酸           天然           突变体           缩写
7                 精氨酸          赖氨酸            CT-CRMR7K
11                精氨酸          赖氨酸            CT-CRMR11K
29                谷氨酸          组氨酸            CT-CRME29H
110               谷氨酸          天冬氨酸          CT-CRME110D
112               谷氨酸          天冬氨酸          CT-CRME112D
本发明就这些突变对CT结构和功能的表型作用进行了评价。
根据神经节苷脂GM1结合试验测定(图1)，变异CT-A的R7K、E29H、E110D和E112D能够组装入免疫反应性的全毒素。然而，在实施例2中以多克隆抗体测试时，纯化的R11K部分似乎不是全毒素。
各种全毒素变异体都在Y-1肾上腺肿瘤细胞试验(19)中测定了其与野生型CT全毒素相比的残留毒性。表2结果表明，CT-CRME29H和市售的CT-B(Sigma)具有1.2％的残留毒性。市售CT-B的1.2％残留毒性很可能来自污染性A亚基(约0.5％)。其余第7、11、110或112位氨基酸突变的CT-CRM的残留毒性等于或低于0.4％。
对CT-CRME29H进行专利(patent)小鼠肠重试验(20)，以估计体内肠液累积作为毒性指标。表3的结果表明，与野生型CT相比，CT-CRME29H刺激进入小肠的肠液累积增加的活性低得多。
还在ADP-核糖基转移酶活性试验中将各种CT-CRM与CT进行了比较。结果与Y-1肾上腺细胞试验的结果大致相符，说明与野生型CT相比，A1亚基内的突变降低了各种CT-CRM的ADP-核糖基转移酶活性。酶活性最高的突变体是CT-CRME29H。其活性约为野生型CT的10％。
根据Western印迹分析，37℃胰蛋白酶消化CT-CRME29H将CT-A剪切成了片段A1和A2，其方式与对野生型CT处理时的基本相同。这还证明CT-CRME29H的结构与野生型CT的相似。
CT-CRME29H活性在Y-1肾上腺肿瘤细胞和ADP-核糖基转移酶活性试验中的明显差异是因为在后一试验中突变全毒素被胰蛋白酶活化。因此，CT-A因为大肠杆菌内蛋白酶活性降低没有剪切成A1和A2，所以造成大肠杆菌表达的CT-CRME29H减毒。总之，数据显示，CT-CRME29H是结合神经节苷脂GM1的全毒素，但其毒性比野生型CT低得多。
进行一系列研究评价了CT-CRME29H作为粘膜佐剂用于含以下作为候选疫苗的细菌或病毒抗原的组合物的效力，这些抗原是：(1)不可归类流感嗜血杆菌重组P4蛋白，又称蛋白质“e”(rP4)(21)，重组NTHi P6蛋白(rP6)(22)和纯化天然流感嗜血杆菌粘附与穿透(Haps)蛋白(23)；(2)幽门螺杆菌重组脲酶蛋白(重组脲酶)(24)；(3)脑膜炎奈瑟氏球菌B群重组1类菌毛蛋白(25)和脑膜炎奈瑟氏球菌B群重组1类外膜蛋白(26)；(4)呼吸道合胞病毒纯化天然融合蛋白(RSV F)(27)和(5)轮状病毒的2/6-病毒样颗粒(28)。
CT-CRME29H作为NTHi rP4和rP6的佐剂与其他4种突变CT和野生型CT进行了比较。结果表明，5种不同的CT-CRM都增强了rP4和rP6蛋白激发全身性体液免疫应答的能力(表5和6)。例如，在三次IN免疫后2周，以CT-CRME29H或CT-CRME110D配制的rP4和rP6蛋白免疫的小鼠其抗rP4 IgG抗体的效价比单用上述重组蛋白的PBS溶液免疫的小鼠高40倍(表5)。以重组蛋白加野生型CT全毒素免疫的小鼠的抗体效价提高了20倍。用CT-CRMR11K免疫的小鼠抗rP4抗体效价提高10倍。
当检测血清的抗天然P6抗体效价时观察到了更明显的差异(表6)。二次IN免疫后2周，接受以CT-CRME29H或CT-CRME110D配制的疫苗免疫的小鼠其血清抗天然P6抗体效价比用rP6加PBS制备的疫苗免疫的小鼠高30倍。比较中，以野生型CT制备的疫苗激发的抗天然P6抗体效价比疫苗PBS制剂产生的高90倍。以CT-CRME112D、CT-CRMR7K或CT-CRMR11K制剂免疫的小鼠其抗天然P6抗体的效价只比以rP4加rP6的PBS制剂所产生的高2-4倍。
三次免疫后2周对粘膜分泌中蛋白质特异性抗体的检测进一步表明，CT-CRM促进抗rP4蛋白质的局部免疫应答的产生。而且，抗rP4抗体的效价与野生型CT所诱导的相当(表7)。没有测定抗天然P6蛋白的局部抗体效价(未给出数据)。因此，综合以上数据表明，同时产生抗rP4和rP6蛋白全身性和局部抗体应答的最好的突变CT是在第29位或110位突变的CT-CRM。
还研究确认了CT-CRME29H作为佐剂的潜力，并测定了IN免疫的合适剂量(表8)。结果表明，1μg CT-CRME29H可促进得到最强的抗rP4蛋白全身性和局部体液免疫应答。当CT-CRME29H的剂量从1升高到10或30μg时，数据显示，全身和体液免疫应答都减弱。例如，10μg CT-CRME29H免疫小鼠第48天的血清抗P4 IgG抗体效价是1μg CT-CRME29H免疫小鼠的1/7(表8)。而且，前一组小鼠第49天支气管和***洗液内的局部抗P4 IgA抗体效价是后一组小鼠的1/34和1/16。数据表明，rP4加rP6/CT-CRME29H免疫小鼠的局部和全身性体液免疫应答与以野生型CT为佐剂的疫苗免疫所得的基本相同(表8)。
检测了添加CT-CRME29H对Haps蛋白激发的血清抗体应答的作用。CT-CRME29H的加入协助诱导对Haps蛋白的血清抗体应答(表9)。免疫应答出现于第7周的血清；此前的血清中没有测得抗体效价。表9列出了免疫小鼠血清的抗HapsELISA效价。应答以剂量依赖性方式增强，加入0.1μg CT-CRME29H使应答增强了约3倍。在两个剂量水平都出现这种增强作用。
用小鼠模型研究了5种不同CT-CRM增强幽门螺杆菌重组脲酶胃内免疫后的全身性和局部体液免疫应答的潜力(29)。结果与用NTHi鼻内给予后所得的相似。数据表明，CT-CRME29H是增强IG免疫后全身和局部体液免疫远大效力最强的突变体。在研究的第28天，CT-CRME29H配制的疫苗激发的抗重组脲酶IgG(表10)和IgA(表11)抗体血清效价几何平均值比CT-CRME110D诱导所得的分别高6倍和3倍。而且，T-CRME29H配制的疫苗激发的血清IgG和IgA抗体效价与含野生型CT的疫苗所产生的相当。
最重要的是，以CT-CRME29H配制的重组脲酶疫苗IG免疫似乎产生了最强的局部体液免疫应答(表12)。这在检测支气管洗液后最明显。支气管洗液中的抗重组脲酶IgA抗体效价比以CT-CRME110D配制疫苗所激发高5倍。在与野生型CT制剂的比较中，抗重组脲酶IgA抗体效价的水平是其1/5。然而，CT-CRME29H配制的疫苗免疫组的***洗液中的蛋白质特异性IgA抗体效价与野生型CT制备的疫苗所激发的相当(表12)。
值得注意的是，数据暗示，与CT-CRME29H配制的疫苗IG免疫在小鼠中激发的相比，胃肠外免疫没有在支气管洗液中激发显著的重组脲酶特异性IgA抗体(表12)。
所以，第二次研究测试了以CT-CRME29H配制的重组脲酶产生免疫应答的效力。数据显示，CT-CRME29H支持诱导的抗幽门螺杆菌保护性免疫应答与野生型CT一样强(表13)。前一组在研究第28天的血清抗重组脲酶IgA抗体效价与后一组的相当。重组脲酶加StimulonTM QS-21胃肠外免疫小鼠的蛋白质特异性血清IgA抗体效价比CT-CRME29H制备的疫苗IG免疫小鼠的强12倍。然而，CT-CRME29H免疫小鼠支气管洗液内的蛋白质特异性IgA抗体效价比胃肠外免疫小鼠强10倍以上(表13)。
结果显示IG免疫与小鼠从胃组织中清除幽门螺杆菌的能力有关。最后一次攻击后10天，以CT或CT-CRME29H配制的疫苗IG免疫的小鼠中80％能够清除胃组织内的含脲酶细菌。相反，原初对照小鼠(10％)，以重组脲酶加PBS IG免疫的小鼠(20％)或以重组脲酶混合StimulonTM QS-21皮下免疫的小鼠(30％)清除幽门螺杆菌的能力似乎较弱(表13)。值得注意的是，以上数据没有显示效力与支气管洗液中蛋白质特异性IgA抗体效价之间的关联。重组脲酶加野生型CT免疫小鼠的支气管洗液内蛋白质特异性IgA抗体效价是CT-CRME29H免疫小鼠的1/10(表13)。但是，两种疫苗都获得了80％的保护作用。因此，对肺组织内局部体液免疫应答的监测与胃内的保护性免疫应答关联性极小。
Jani O′Rourke博士(新南威尔士大学)曾提出：与BALB/c小鼠不同，在被幽门螺杆菌感染后，C57B1/6小鼠的发病过程与人相似。为了测试CT-CRME29H促进清除胃组织内幽门螺杆菌的抗重组脲酶免疫应答的效力，用C57B1/6小鼠进行了另一系列的研究。结果显示，以CT-CRME29H配制的重组脲酶IG免疫产生的全身性和局部体液免疫应答与以野生型CT配制的重组脲酶所攻击的相似(表14)。研究第28天，野生型CT或CT-CRME29H制备的疫苗免疫的小鼠的血清和支气管及***洗液抗重组脲酶IgA抗体效价几乎相同。唯一的区别是CT-CRME29H制备的疫苗免疫的小鼠其粪便提取物中测得的IgA抗体效价高3倍(表14)。值得注意的是，重组脲酶加明矾肠胃外免疫小鼠粪便中的蛋白质特异性IgA抗体效价比野生型CT或CT-CRME29H制剂IG免疫小鼠低得多(分别是后者的1/38和1/14)。因此，C57B1/6小鼠模型能够评价CT-CRME29H辅佐IG免疫后产生的免疫应答的效力。而且，数据表明，该模型能用来确定局部和全身性免疫应答在保护粘膜表面抵抗幽门螺杆菌中的作用。
据报道，CT不适合作为粘膜免疫应答的佐剂(30，31)。其假设是：CT易使疫苗激发过高的IgE抗体效价，这是不期望的。IgE与超敏和变应性反应有关。还暗示，热不稳定性大肠杆菌毒素(LT)或LT-CRM激发过高IgE抗体效价的能力较弱。因此，LT或LT-CRM更适合作为产生粘膜免疫应答的疫苗佐剂。为了验证这一假设，用CT、LT或CT-CRME29H配制含重组脲酶的疫苗，并测定它们在IG免疫后激发IgE抗体的能力(表15)。数据显示，以CT-CRME29H或野生型CT制备的疫苗产生总的IgE或重组脲酶特异性IgE循环抗体的可能性低于野生型LT。实际上，以上结果的含义在于，以CT-CRME29H配制的疫苗不大可能产生高效价的IgE抗体。总IgE和重组脲酶特异性IgE抗体效价的终点都是以野生型LT制备的疫苗免疫的小鼠的1/4(表15)。因此，以上数据表明，至少在一种重组脲酶制剂中，CT-CRME29H作为佐剂优于LT。
在理论之外，最近van den Akker等最近提出的LT活性机制(32)更能够解释E29或其周围改变所得CT变异体的毒性降低。在切开连接结构域A1和A2的二硫环并还原二硫键后，A1结构域内由30-33个残基构成的环因为结构域A2长螺旋的移动而改变了位置。E29的取代可能改变环30-33的性能，结果减弱CT-A1的活化作用。CT-Y30WAH和CT-G34GGP的毒性降低也可以用对30-33环的作用削弱了CT-A1活化作用来解释。所提出的活化路径中的下一步是整个25-36环的移动，因此破坏了R25与Y55之间的相互作用。CT-R25G的毒性降低程度比CT-R25W更大，可能是因为R25和Y55的侧链参与疏水性相互作用，CT-R25W可能保留这种相互作用，而CT-R25G则未保留。我们的变异体的表型与van denAkker等提出的热不稳定性肠毒素活化模型相一致(32)。
以一系列实验评价了CT-CRME29H作为两种脑膜炎奈瑟氏球菌B群候选疫苗的粘膜和胃肠外佐剂的效力。第一种候选疫苗是重组1类菌毛蛋白(rpilin)(25)。第二种候选疫苗是1类外膜蛋白(PorA)，由不表达2/3类蛋白的突变脑膜炎球菌菌株表达。
第一个实验证明了粘膜佐剂作用，其中，加CT-CRME29H组的重组菌毛蛋白特异性血清IgG抗体增多，比接受重组菌毛蛋白盐水溶液小鼠的效价高3-19倍(表16)。重组菌毛蛋白CT-CRME29H(0.1和1.0μg)制剂免疫小鼠的特异性血清IgA也增加了2-5倍。值得注意的是，CT-CRME29H(1μg)使鼻、***和支气管洗液内的重组菌毛蛋白特异性IgA增加了3-10倍。而且，重组菌毛蛋白加CT-CRME29H鼻内免疫显著降低脑膜炎奈瑟氏球菌B群菌株在鼻内的定居，降低至Swiss-Webster小鼠内测得的水平(图2)。
第二个实验表明CT-CRME29H增强抗同源脑膜炎球菌菌株的保护作用。如表17所示，重组菌毛蛋白加CT-CRME29H组内，脑膜炎球菌B群全细胞ELISA中对同源菌株以及异源菌株FAM18和M982的血清IgG效价比只接受重组菌毛蛋白的小鼠效价高至少4倍。作为对照，在全细胞ELISA中，KLH加CT-CRME29H免疫的小鼠没有诱导对任何菌株的血清IgG。表18中，与无佐剂组相比，重组菌毛蛋白加CT-CRME29H组的重组菌毛蛋白特异性IgG和IgA抗体显著增加。而且，CT-CRME29H作为重组菌毛蛋白的粘膜佐剂，保护小鼠抵抗同源B群脑膜炎球菌菌株在鼻内的定居(图3)。
接着证明了PorA加CT-CRME29H在鼻内免疫中的免疫原性。接受PorA加CT-CRME29H佐剂的组对脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76全细胞的血清IgG抗体增高，并产生比无佐剂PorA组高7和14倍的PorA特异性抗体(表19)。然而，没有测得抗PorA H44/76的血清IgA。而且，在收集的所有粘膜分泌物样品中都没有测到PorA特异性抗体。
第四个实验表明CT-CRME29H增强重组菌毛蛋白或PorA的抗异源脑膜炎球菌保护作用。数据特别是表20的数据显示用CT-CRME29H鼻内给予的1类重组菌毛蛋白或PorA不仅激发抗抗原和脑膜炎球菌全细胞的高血清抗体效价，而且还保护Swiss-Webster小鼠抵抗异源B群脑膜炎奈瑟氏球菌在鼻内的聚集。具体地说，与不用佐剂的组相比，CT-CRME29H增强对1类重组菌毛蛋白的血清抗体应答。同样，用佐剂的1类重组菌毛蛋白增强鼻内细菌清除。
接着，测定了CT-CRME29H作为佐剂用于脑膜炎球菌胃肠外免疫的能力。如图5所示，以MPLTM或CT-CRME29H为佐剂的PorA H355显著减少B群脑膜炎球菌异源菌株870227在鼻内的聚集。具体地说，在攻击后24小时，PorA H355加CT-CRME29H皮下免疫小鼠鼻内的菌落显著少于PorA H355加MPLTM免疫的小鼠。然而，只有PorA和热灭活全细胞加佐剂MPLTM免疫组的血清中检测到灭菌活性(表22)，PorA加CT-CRME29H免疫的组则没有。虽然PorA以CT-CRME29H为佐剂不能引发和MPLTM类似的同源灭菌活性，但减少异源B群脑膜炎球菌菌株的聚集则更有效。
用纯化天然融合(F)蛋白测定了增强抗呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白的全身性和粘膜免疫应答的能力。此外还研究了已有抗CT抗体对CT-CRME29H佐剂效力的影响。结果显示，F蛋白以CT或CT-CRME29H为佐剂鼻内免疫的BALB/c小鼠产生了全身性和局部的抗CT IgG和IgA抗体效价(表23)。而且，数据还表明，CT-CRME29H制剂产生的抗体效价相当于野生型CT制剂。例如，F蛋白/CT-CRME29H二次免疫(1μg/次)后10天，血清抗CT IgA和IgG抗体效价只略低于F蛋白/CT(1μg/次)免疫的小鼠。检测F蛋白/1μg或10μg CT-CRME29H免疫小鼠***洗液所得的结果相似(表23)。所以，以上数据说明CT-CRME29H和野生型CT具有同样的免疫原性。
第二个实验解答了抗CT免疫应答是否会危害F抗原的免疫原性这一问题，该实验中，首先通过两次单用野生型CT或CT-CRME29H的PBS溶液鼻内免疫引发Balb/c小鼠(表24)。然后，通过两次F蛋白混合CT或CT-CRME29H免疫合适的小鼠。对最后一次免疫后2周收集的血清检测显示，已有抗CT抗体不影响局部或全身性抗F蛋白IgA和IgG抗体水平。实际上，数据显示，已有抗CT抗体对增强抗F蛋白抗体应答有利。在比较粘膜表面激发产生的抗F蛋白抗体效价时，这一点尤其明显(表24)。二次免疫后2周，以CT-CRME29H初次免疫然后以F蛋白/CT-CRME29H免疫小鼠支气管和***洗液中的抗F蛋白IgA抗体效价分别比只用F蛋白/CT-CRME29H免疫的小鼠高7倍和17倍。
第三个实验中，评价了RSV F蛋白加CT-CRME29H、CT-B或明矾鼻内免疫BALB/c小鼠的全身性和粘膜免疫应答。表25列出了三次免疫后9天时集得血清的体液免疫应答。F蛋白加1或10μg CT-CRME29H免疫的小鼠(分别为777和778组)与F/PBS、F/AlOH或RSV免疫小鼠(分别为784、785和907组)相比，表现出显著提高的IgG、IgG1和IgG2a效价。此外，以含F/CT-CRME29H的疫苗免疫的小鼠(777和778组)产生的效价至少与F蛋白和CTB(779和780)所激发的相当。
在最后一次免疫后1周，收集免疫小鼠的支气管、***和鼻液，用于进行IgG和IgA抗体的ELISA。表26的数据显示了5鼠汇总的效价。CT-CRME29H免疫小鼠在***和鼻洗液中都激发可测水平的的IgA(777和778组)。CT-CRME29H免疫小鼠的BAL中没有测到IgA，这与RSV免疫小鼠(907组)和F/CTB免疫小鼠(780)的BAL中情况相反。IgG可见于所有粘膜洗液，包括BAL。CT-CRME29H免疫小鼠洗液中的IgG水平与CTB(779和780组)和活RSV免疫小鼠的相当。
第四个实验中，测定了免疫小鼠的刺激脾细胞体外诱导的溶胞(CTL)活性。数据见图6。虽然RSV免疫小鼠表现出约60％的抗原特异性溶胞活性，但其余各小鼠的CTL活性仍低于20％。因此，虽然CT-CRME29H能够诱导抗RSV F蛋白的全身性和粘膜体液免疫应答(表25和26)，但没有检测到对RSV感染靶细胞的细胞介导免疫应答。
第五个实验中，为了研究鼻内给予F/CT-CRME29H是否增强抗活RSV攻击的保护作用而进行了抗病毒保护试验。数据见图7。
对图7结果的ANOVA统计学分析如下：
p＜0.05：F/PBS与F/CT-CRME29H(1μg和10μg CT-CRME29H)，F/CTB(1μg和10μg)，F/AlOH相比。
p＞0.05：PBS/CT-CRME29H与F/PBS相比
p＞0.05：F/CT-CRME29H(1μg和10μg CT-CRME29H)与F/CTB(1μg和10μg)与F/AlOH相比。
含F/CT-CRME29H或F/CTB的疫苗鼻内免疫小鼠肺内的病毒效价与F/AlOH肌内免疫小鼠的相当(p＞0.05)。而且，F/CT-CRME29H鼻内免疫被发现，与F/PBS或PBS/CT-CRME29H鼻内免疫相比，能使肺内病毒效价降低log101.6和log101.4。F/CT-CRME29H与F/PBS或PBS/CT-CRME29H之间的差异具有统计学上的显著性。
第六个实验测定了RSV F蛋白加CT-CRME29H或明矾鼻内免疫BALB/c小鼠的全身性和粘膜免疫应答。表27列出了三次免疫后2周集得血清的体液免疫应答。接受F蛋白加1μg CT-CRME29H免疫的小鼠(256组)表现出比F/PBS或PBS/CT-CRME29H免疫小鼠(分别为组250和257)显著提高的IgG、IgG1和IgG2a效价。F/CT-CRME29H(256)与F/AlOH(258)免疫小鼠的IgG1效价之间没有显著差异。然而，F/CT-CRME29H鼻内免疫(256)激发的IgG2a效价比F/AlOH免疫(258)高得多。总之，以上结果与表25一致。虽然在F/CT-CRME29H免疫小鼠中检测到了血清IgA，但效价比先前观察到的(777组的16,202±2,031和256组的444±1,458)低得多。这一明显差异的原因尚不清楚。但是，鼻内给予诱导血清IgA的能力在两项研究中是一致的，而且，所幸这方面与F/AlOH的能力相反。
最后一次免疫后2周收集支气管洗液、***洗液和鼻洗液进行IgG和IgA抗体的ELISA。表28的数据显示5鼠汇总的效价。与表26的结果相似，CT-CRME29H免疫小鼠在***和鼻洗液中都激发了可测水平的IgA(256组)。同样，与表26的数据相似，在CT-CRME29H免疫小鼠的BAL中没有测得IgA。F/CT-CRME29H免疫小鼠洗液中测得的IgG水平至少与活RSV免疫小鼠相当(表28，256组对259组)。
第七个实验测定了免疫小鼠体外刺激的脾细胞引发的溶胞(CTL)活性。数据见图8。虽然RSV免疫小鼠表现出约45％的抗原特异性细胞裂解，其余小鼠的CTL活性仍低于10％。以上数据证明F/CT-CRME29H鼻内免疫不能在脾淋巴细胞群中诱导细胞介导的免疫防御机制抵抗RSV感染靶细胞。这证实了先前的观察(表8)。第八个实验中，为了研究鼻内给予F/CT-CRME29H是否增强抗活性RSV攻击的保护作用而进行抗病毒保护试验。对图9结果的ANOVA统计学分析如下：
p＜0.05：F/PB S与F/CT-CRME29H，F/AlOH，RSV相比。
p＜0.05：原初与F/CT-CRME29H，F/AlOH，RSV相比。
p＞0.05：F/CT-CRME29H与F/AlOH，RSV相比。
与图7结果相似，接受含F/CT-CRME29H疫苗鼻内免疫的小鼠能控制肺内病毒的复制，其程度在统计学上相当于F/AlOH肌内免疫或活RSV鼻内免疫(log101.87对log101.99和log101.94)(p＞0.05)。F/PBS鼻内免疫(第一柱)或原初小鼠表现出的肺内病毒效价分别为log104.5和log104.3。而且，这些组的肺内病毒效价比F/CT-CRME29H、F/AlOH或活RSV免疫小鼠所得的病毒效价有统计学上的提高(p＜0.05)。所以，以上数据支持这样的结论：F/CT-CRME29H鼻内滴注可提供抗感染性RSV攻击的保护作用。
第九个实验测定抗F血清抗体应答。结果显示，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)免疫小鼠的抗F蛋白IgG比给予F蛋白加PBS的小鼠有显著提高(表29)。此外，F蛋白以0.1或1.0μg CT-CRME29H为佐剂和F/AlOH9肌内)或实验性RSV感染在激发抗F蛋白IgG应答方面至少同样有效。抗F蛋白抗体效价取决于制剂中CT-CRME29H的剂量，因此，接受1.0μg CT-CRME29H的小鼠体内的效价显著高于接受0.01μg的小鼠。与F/PBS相比，抗F蛋白的IgG1和IgG2a的效价都被0.1或1.0μg CT-CRME29H增强。CT-CRME29H既激发1型免疫腔室(immune compartment)也激发2型免疫腔室。F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)鼻内免疫小鼠激发的血清抗F蛋白IgA应答显著高于实验性RSV感染。相反，没有观察到F/PBS(IN)或胃肠外给予F/AlOH引起血清IgA抗F蛋白抗体(表29)。
抗CT效价和抗F蛋白效价一样呈现剂量依赖性(表29)。CT-CRME29H(1.0μg)或F/CT-CRME29H(1.0μg)免疫小鼠血清中的抗CT效价统计学上相当。然而，以上效价显著高于F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)。此外，F/CT-CRME29H(0.1μg)免疫小鼠血清中的抗CT效价显著高于F/CT-CRME29H(0.01μg)免疫小鼠。所以，CT-CRME29H对抗F蛋白抗体应答的佐剂效应与对突变霍乱全毒素的抗体应答相关(r＝0.97)。
第九个实验检测粘膜免疫力。只在F/CT-CRME29H(1.0μg)或F/CT-CRME29H(0.1μg)免疫小鼠的合并鼻洗液(NW)中发现了粘膜IgA。此外，接受纯化F蛋白加F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)鼻内免疫的小鼠其***洗液(VW)中也有抗F蛋白IgA。接受F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)或F/AlOH小鼠的支气管洗液(BAL)、VW和/或NW发现有F蛋白特异性IgG。相反，F/AlOH肌内免疫的小鼠中则没有测到抗F蛋白IgA。
第十个实验测定F蛋白CT-CRME29H制剂免疫小鼠的功能性免疫力。在补体存在下，在接受F蛋白加0.1或1.0μg CT-CRME29H、F/AlOH或RSV A2免疫小鼠的血清内测得统计学上高于接受F/PBS或CT-CRME29H单独免疫小鼠的抗RSV中和抗体效价。没有补体存在时，各组均没有测得中和抗体效价(log10＜1.3)。和血清及粘膜抗体数据一致(表29和30)，F/0.01μg CT-CRME29H免疫不足以产生抗RSV中和抗体。
第十一个实验中，在三次免疫后两周攻击小鼠以测定F/CT-CRME29H抗再次感染的保护能力。结果显示，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)免疫的小鼠得到保护(表32)。与原初小鼠或F/PBS或CT-CRME29H单独免疫小鼠相比，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)免疫小鼠肺内的病毒水平显著降低。此外，与原初小鼠或F/PBS单独免疫小鼠相比，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)免疫小鼠的鼻组织内病毒水平也显著降低。相比之下，F/AlOH胃肠外免疫小鼠与F/PBS免疫小鼠相比，肺组织内的病毒效价降低，但鼻组织内没有显著降低。总而言之，F/CT-CRME29H(0.1或1.0μg)鼻内免疫足以产生局部和全身性体液免疫应答，从而保护呼吸道组织抵御活RSV再次感染。
实施例10的数据说明了一种获得RSV F蛋白鼻内疫苗的可行方法。数据表明，鼻内给予F/CT-CRME29H同时产生体液和粘膜IgG和IgA。有两点证明观察到的抗体效价具有显著性：首先，在数量上，F/CT-CRME29H免疫小鼠体液和粘膜的抗体效价相当，而且都比F/PBS免疫小鼠提高。其次，这种效价提高转而引起生物学相关的免疫应答，如图7和9所示的保护水平。F/CT-CRME29H免疫与F/PBS或PBS/F/CT-CRME29H相比，显著增强抗活性RSV攻击的保护作用。
总之，以上数据提示了一种通过F/CT-CRME29H鼻内免疫激发产生粘膜或体液免疫球蛋白，从而中和感染性病毒的机制。
用另一种病毒抗原(轮状病毒)，即重组表达的VP2和VP6蛋白，免疫小鼠。按已知方法构建表达Sall轮状病毒VP2和VP6的重组杆状病毒载体；已知，重组表达的轮状病毒结构蛋白会自身组装成形态与病毒粒子极其相似的颗粒。所表达的蛋白共同组装成2/6病毒样颗粒(VLP)。
采用基因背景相同的近交BALB/c小鼠，它们可能都对免疫有应答，从而阐明应答VLP单独或与CT-CRME29H佐剂联合时的全身及粘膜免疫球蛋白情况。另用遗传相异的远交CD-1小鼠来测定遗传差异对诱导免疫力和保护作用中诸因素的作用。
除两只没有应答的口服免疫CD-1小鼠之外，免疫BALB/c小鼠和CD-1小鼠的血清都含抗VP2和VP6的两种抗体。预免疫血清和非免疫小鼠血清没有在模拟或VP2-6杆状病毒感染细胞内检测到病毒抗原。2/6-VLP免疫的血清或VP6和VP2的特异性mAbs接触未感染细胞也没有显示反应性(未给出数据)。用各小鼠抗2/6-VLP和轮状病毒Sall的攻击前免疫血清进行的Western印迹分析也证实了2/6-VLP的免疫原性(数据未显示)。
2/6-VLP单独免疫组的轮状病毒特异性血清IgG、IgM和IgA模式与2/6-VLP加CT-CRME29H免疫组的相似(图10)。然而，第13周时，接受2/6-VLP加CT-CRME29H免疫小鼠中这三种同型血清抗体的效价明显较高(图10)(IgG、IgM和IgA的p分别为0，0.004和0.02)。这说明，CT-CRME29H显著增强对2/6-VLP的体液应答。选择第13周体现两次免疫之后攻击前产生的抗体水平。
如图11A所示，接受VLP的BALB/c小鼠产生的轮状病毒特异性全身IgG应答强于口服免疫的小鼠。在第13周可看到这两组血清IgG效价之间有统计学显著差异(p＝0)。同样，攻击前分析时(第13周)，鼻内组的血清IgM水平高于口服组(图11B)。鼻内和混合组的血清IgM水平在第二周达到峰值，第四周下降，而口服组的血清IgM水平在实验全过程中始终较低，但相对恒定。口服免疫和鼻内免疫动物的血清IgA最高水平出现在第四周。第13周时，三个实验组的血清IgA之间水平没有显著差异(图11C)。总之，鼻内免疫产生的全身性IgG和IgM应答高于口服免疫。鼻内免疫诱导明显较高的IgG和IgM效价支持这一观点：鼻内免疫可作为将来候选疫苗的优选给药途径(33)。因此，引发全身性强中和应答的鼻内免疫可能能够有效抵抗穿过粘膜屏障的病毒性病原。
鼻内和口服免疫BALB/c小鼠的血清内都发现了IgG1和IgG2(图12)。鼻内组这两种IgG亚类的水平显著高于口服组(IgG1的p＝0.005，IgG2的p＝0.05)。然而，同组内亚类之间则没有显著差异。以上数据证明鼻内免疫对诱导两种T辅助细胞路径(TH-1和TH-2)都有效。
三实验组的粪便IgA最高水平都出现在初次免疫后4周(图13A)，这与口服和鼻内免疫动物血清IgA最高水平的出现时间(图11C)相同。检测攻击前粪便IgA水平时，这3种免疫方法之间没有统计学显著差异(图13A)。第4周粪便IgG也最高(图13B)；然而，鼻内组第13周的IgG显著多于口服组和混合组(p分别为0和0.002)。总之，2/6-VLP免疫小鼠都产生血清IgG、IgM和IgA，以及粪便IgG和IgA。在所有这些动物中都没有测得粪便IgM。
所有接受2/6-VLP鼻内免疫的CD-1小鼠和4只口服免疫小鼠中的2只都产生轮状病毒特异性抗体应答(数据未显示)。为了更精确地测定抗体应答情况，在26周内每周分析血清和粪便样品。CD-1小鼠血清和粪便抗体的诱导方式与BALB/c小鼠(图11和13)的相似。
在BALB/c小鼠中，与2/6-VLP单独鼻内免疫(PRAS＝39％)相比，用2/6-VLP加CT-CRME29H两次鼻内免疫提供了保护(PRAS＝98.7％)(图14A)。混合免疫，即鼻内免疫后再口服免疫，提供小鼠的保护作用程度与口服组和鼻内组相近，这说明混合免疫在BALB/c小鼠内同样有效。这证明CT-CRME29H显著增强保护性免疫应答。三个实验组的BALB/c小鼠都表现出近乎完全的抗攻击保护作用。口服、鼻内和混合组的PRAS分别为99.6％、98.8％和98.8％(图14B)。未免疫对照组的病毒抗原显著多于三个免疫组(P＝0)。3个免疫组的PRAS值之间没有显著差异。
鼻内免疫接种在所有免疫CD-1小鼠中同时诱导全身性和粘膜应答，并提供保护作用(PRAS＝97.9％)(图14C)。4只口服免疫CD-1小鼠中只有2只表现出全身性和粘膜抗体应答和保护作用(3只中有2只，PRAS65.8％)(图14C)；相比之下，口服免疫的BALB/c小鼠都表现出粘膜和全身性应答，并被保护。值得注意的是，没有产生免疫应答的CD-1小鼠未获得抗攻击保护，而有免疫应答的小鼠则获得保护(图14C)。口服组中1只免疫后没有抗体应答的小鼠在攻击前死亡。将两只CD-1小鼠作为对照，以减少抗体应答分析中的样品数量。然而，统计学分析清楚地显示，保护作用结果具有显著性(P＝0，置信水平为95％)。在相同条件下用CD-1重复口服免疫实验，但在第26周而不是第13周攻击。用4只小鼠组成免疫组，5只作为对照，观察到了相似的保护水平(PRAS＝71.2％)(数据为显示)。综合起来，以上结果支持最近公开的O Neal等(34，35)的观点：在CD-1小鼠中，鼻内免疫比口服免疫更有效。
因为已证实CT-CRME29H可用作疫苗佐剂，所以最好能适量生产这种物质。用pIIB29H(实施例1)在大肠杆菌内进行了数次表达CT-CRME29H的尝试。纯化CT-CRME29H全毒素的得率约为50μ/L培养基。最初试图通过对起始质粒pIIB29H进行修饰形成质粒pPX2492(实施例1)来提高CT-CRME29H的得率，但几乎没有效果。用霍乱弧菌DsbA和大肠杆菌RpoH通过pIIB29H和衍生物的共表达获得了得率的中等程度提高。共表达和纯化改进将CT-CRME29H的得率提高到约2mg/L。
为了提高CT-CRME29H的表达，用阿糖诱导型启动子代替乳糖诱导型启动子(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，将其与编码CT-CRME29H的DNA序列操作性连接。克隆时证明pIIB29H质粒含有霍乱弧菌569B的ctxA基因，它与霍乱弧菌2125的ctxB基因连接。这些基因的交叉排列对比表明，两个ctxB基因之间有7处碱基取代，ctxA基因之间有1个碱基改变。以上碱基取代中有些引起成熟亚基内的氨基酸改变。特别值得注意的是ctxA基因之间的取代，它造成A亚基内A-2部分或全毒素组装结构域内的氨基酸改变。尚不知道这些基因之间的异质性是否对毒素的表达或全毒素的组装不利；然而，但从进化观点考虑，两个毒素亚基的基因具有相同来源。因此，用于构建阿糖诱导型***的ctxA基因和ctxB基因都源自霍乱弧菌569B。实施例12描述了质粒pPX7490的构建。pPX7490的纯CT-CRME29H产量约为30mg/L培养物。
本发明还涉及含分离纯化DNA序列的质粒，该DNA序列包含编码免疫原性突变霍乱全毒素的DNA序列，所述突变霍乱全毒素A亚基第29位的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，而且，该编码DNA序列与阿糖诱导型启动子操作性连接，本发明还涉及用常规方法以上述质粒转化、转导或转染的合适宿主细胞。
本发明用了许多宿主细胞-质粒载体***来表达免疫原性突变霍乱全毒素。载体***，最好含有阿糖诱导型启动子，应与所用宿主细胞相容。合适的宿主细胞包括用质粒DNA、粘粒DNA或噬菌体DNA转化的宿主细胞；病毒，例如痘病毒和腺病毒；酵母，例如Pichia细胞；昆虫细胞，例如Sf9或Sf21细胞；或哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢细胞；以及其他常用微生物。所述宿主细胞-载体***中可采用多种常用转录和翻译元件。将编码CT-CRM的DNA***表达***，在载体的特定位点连入启动子(以阿糖诱导型启动子为佳)及其他调控元件，这样，当质粒载体进入宿主细胞(根据所用宿主细胞-载体***采用转化、转导或转染)，宿主细胞表达编码CT-CRM的DNA。
用前述质粒转化、转导或转染宿主细胞，然后在允许所述重组免疫原性脱毒蛋白表达的条件下培养该宿主细胞，由此生产出免疫原性突变霍乱全毒素。
虽然本发明以第29位为组氨酸的CT-CRM为例，但范围包括对野生型内谷氨酸的其他非保守性取代。谷氨酸是一种酸性(负电)分子。所以，非保守性取代不包括同是酸性分子的天冬氨酸取代。合适的其他氨基酸包括与组氨酸一样是碱性(正电)分子的赖氨酸和精氨酸。合适的其他氨基酸还包括没有极性官能团的氨基酸，例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸，以及具有不带电极性官能团的氨基酸，例如天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
将有效量突变霍乱全毒素与来自病原性细菌、病毒、真菌或寄生虫的选定抗原混合，用来制备抗原性组合物，其中的突变全毒素与野生型相比毒性降低，且A亚基第29位的谷氨酸被天冬氨酸以外的其他氨基酸取代，可增强脊椎动物对选定抗原的免疫应答。
本发明的抗原性组合物还可包含除第29位氨基酸残基以外至少有一处其他突变的CT-CRM。国际专利申请WO93/13202描述了可降低霍乱全毒素毒性的一系列A亚基内突变。这些突变发生在第7位的精氨酸，第9位天冬氨酸，第11位精氨酸，第44位组氨酸，第53位的缬氨酸，第54位的精氨酸，第61位的丝氨酸，第63位的丝氨酸，第70位的组氨酸，第97位的缬氨酸，第104位的酪氨酸，第106位的脯氨酸，第107位的组氨酸，第110位的谷氨酸，第112位的谷氨酸，第114位的丝氨酸，第127位的色氨酸，第146位的精氨酸和第192位的精氨酸。国际专利申请WO93/13202列出了霍乱全毒素A亚基的核苷酸序列。国际专利申请WO98/42375(37)描述了可降低霍乱全毒素毒性的A亚基第109位丝氨酸取代。所以，可用常规技术产生一处或多处这些其他位置上的突变。
可通过各种途径将本发明抗原性组合物给予人或非人脊椎动物，途径包括但不限于：鼻内、口服、***、直肠、胃肠外、皮内、透皮(参见国际专利申请WO98/20734(38))、肌内、腹膜内、皮下、静脉内和动脉内。抗原成分或抗原性组合物中各组分的含量根据抗原特性，宿主年龄、体重及医学情况，以及给予方法而不同。同样，本领域技术人员不难确定合适的剂量。虽然不要求，但较好的是抗原与突变CT同时给予。本领域技术人员能够确定抗原性组合物的剂次和给药程序。保护作用可能只需单剂的抗原性组合物，也可能需要多次给予，并在后几次进行加强免疫以维持保护作用。有时，突变CT的佐剂特性可减少所需的剂次或给药时间。
本发明的抗原性组合物可另含CT-CRME29H以外的其他佐剂。这样的佐剂例如但不限于：StimulonTM QS-21(Aqila Biopharmaceutical，Inc.，Framingham，MA)，MPLTM(3-O-脱酰基—磷酰基脂质A；RIMI ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)，磷酸铝，氢氧化铝和IL-12(Genetics Institute，Cambridge，MA)。抗原性组合物还可以与免疫学上认可的稀释剂或载体以常规方式混合。
本发明的免疫原性突变霍乱全毒素适合用作含各种抗原的抗原性组合物的佐剂，所述抗原可来自多种感染人和非人动物的病原性微生物，例如但不限于细菌、病毒、真菌或寄生性微生物。抗原可以是完整的细胞或病毒，或是一种或多种多糖、蛋白质、蛋白质亚基或片段、聚或寡聚核苷酸或其他分子组分。如有必要，抗原性组合物可包含一种或多种来自相同或不同病原性微生物的抗原。
以CT-CRM突变株为佐剂的较好细菌疫苗可预防和/或治疗以下(不限于)病原引起的疾病：流感嗜血杆菌(包括已确定类型的和无法确定类型的)，睡眠嗜血杆菌，粘膜炎莫拉氏菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌，无乳链球菌，粪链球菌，幽门螺杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，砂眼衣原体，肺炎衣原体，鹦鹉热衣原体，百日咳博德特氏菌，伤寒沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，猪霍乱沙门氏菌，大肠杆菌，志贺氏菌，霍乱弧菌，白喉棒杆菌，结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌复合体，奇异变形菌，普通变形菌，金黄色葡萄球菌，破伤风梭菌，问号钩端螺旋体，布氏疏螺旋体，溶血巴斯德氏菌，多杀巴斯德氏菌，大叶性肺炎放线杆菌和雉枝原体。
以CT-CRM突变株为佐剂的较好病毒疫苗可预防和/或治疗以下(不限于)病原引起的疾病：呼吸道合胞病毒，1-3型副流感病毒，单纯性疱疹病毒，人巨细胞病毒，人免疫缺陷病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，人***瘤病毒，脊髓灰质炎病毒，轮状病毒，萼状病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，腺病毒，狂犬病病毒，犬热病病毒，冠状病毒，细小病毒，传染性鼻气管炎病毒，猫白血病毒，猫传染性腹膜炎病毒，禽传染性囊疾病病毒，新城疫病毒，Marek病病毒，猪呼吸和生殖综合征病毒，马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
以CT-CRM突变株为佐剂的较好抗病原性真菌疫苗可预防和/或治疗以下(不限于)病原引起的疾病：曲霉属，裂球菌(Blasomyces)，念珠菌，球孢子菌和组织胞质菌。
以CT-CRM突变株为佐剂的较好抗寄生虫疫苗可预防和/或治疗以下(不限于)病原引起的疾病：利什曼原虫属，蛔虫属，鞭虫属，贾第鞭毛虫属，裂体吸虫属，cryptosporidium，毛滴虫属，兔弓形虫属和卡氏肺囊虫。
CT-CRM突变株还适合用作聚核苷酸疫苗(又称DNA疫苗)中的佐剂。此类疫苗可另含布比卡因之类增效剂(参见美国专利5,593,972)。
比较了CT-CRME29H与野生型CT作为佐剂用于给予编码全长2型单纯性疱疹病毒(HSV)糖蛋白D(gD2)加布比卡因制剂(40)的作用。结果显示，接受CT-CRME29H加HSV-2 pDNA疫苗皮内免疫的Balb/c小鼠产生的平均细胞应答高于接受皮内给予pDNA HSV gD2疫苗的小鼠(表34)。此外，接受CT-CRME29H加pDNAHSV gD2疫苗小鼠的平均血清抗体应答与接受无佐剂pDNA HSV gD2疫苗的小鼠相当(表35)。
类似的，pDNA HSV gD2疫苗产生的***洗液内gD-2特异性抗体应答水平与皮内或肌内给予无佐剂疫苗时相当(表36)。
pDNA HSV gD2疫苗加CT-CRME29H或CT为佐剂皮内免疫小鼠产生的γ干扰素水平显著高于接受无佐剂pDNA HSV gD2疫苗的小鼠(表37)。接受CT-CRME29H的小鼠还产生IL-5。
因此，在与抗HSV质粒pDNA疫苗一同给予时，CT-CRME29H增强增殖应答和γ干扰素应答。
为了更好地理解本发明，提供以下实施例。以下实施例仅以说明为目的，不限定本发明的范围。
                             实施例
                             实施例1
                          突变CT的表达
菌株、质粒和培养条件
克隆重组质粒和表达突变蛋白质所用的宿主是大肠杆菌TG1(Amersham-Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和TX1，后者是TG1的一种抗萘啶酸衍生株，带有XL1 blue(Stratagene，LaJolla，CA；(41))和CJ236(FTc，lacIq)(Bio-Rad，Hercules，CA)的FTc，lacIq。将含质粒菌株维持在含有所需抗生素(氨苄青霉素50μg/ml；卡那霉素25μg/ml；四环素10μg/ml)的LB琼脂培养板上。将霍乱弧菌0395的完整CT操纵子亚克隆到噬菌粒载体pSKII-中，受lac启动子的调控，形成IPTG诱导型质粒pMGJ67(42)。
ctxA基因的诱变
用Kunkel(43)法选择质粒pMGJ67内产生的寡核苷酸衍生突变体。表1显示了用来产生5种突变CT-CRM的寡核苷酸。
                   表1
         引入ctxA的寡核苷酸序列
取代             寡核苷酸序列a
R7KR11KE29HE110DE112D AAGTTATAT AAGGCAGATTC(SEQ NI NO：1)CAGATTCTA AACCTCCTG(SEQ NI NO：2)GACAGAGT NA GTACTTTGAC CG(SEQ NI NO：3)CAGATGA KCAAGA KGTTTCT GC(SEQ NI NO：4)CAGATGA KCAAGA KGTTTCT GC(SEQ NI NO：5)
a：加下划线的是被改变的碱基；N＝任意碱基；K＝T或G。
简而言之，将各单链寡核苷酸磷酸化，用来在自大肠杆菌 dut  unq菌株CJ236(F′Tc，pMGJ67)获取的一段含尿嘧啶单链DNA模板上引导第二链的合成。连接并转化unq+菌株TX1后，抽提AmpR转化子的单链DNA，用双脱氧链终止法测序(44)。
编码CT-CRME29H的质粒的构建
编码CT-CRME29H的质粒称为pIIB29H。该质粒含有霍乱弧菌编码CT的ctxA和ctxB基因的多顺反子。该质粒内的ctxA基因经上述诱变而在CT-A的第29位氨基酸处编码组氨酸。去除天然ToxR诱导型启动子而代之以乳糖诱导型启动子，对野生型多顺反子进行了改变。此外，编码ctxA和ctxB信号序列的区域代之以大肠杆菌LT的信号序列编码编码区(LTIIb-B前导序列)，以促进CT-CRME29H的分泌。然后，对质粒pIIB29H进行旨在提高CT-CRME29H表达的修饰。所得质粒称为pPX2492，在ctxA和ctxB的上游各含有合成的SD序列。这两个基因在pPX2492中是遗传上分开的基因，而在霍乱弧菌中则是重叠的。这两个基因还具有位于各自上游的LTIIb-B前导序列。
突变ctxA等位基因的表达
在125ml Erlenmeyer瓶内，5ml TB培养基(45)培养物37℃振荡培养(200rpm)，如此测试各种突变全毒素的产生。加入IPTG至0.4mM诱导对数期细胞(A600＝0.8-1.0)，然后培养过夜。加入多粘菌素B至1mg/ml，然后37℃培养10分钟。离心去除细胞，取上清液如下所述测定全毒素和五聚体B的浓度。
具体地说，大肠杆菌内CT-CRME29H的产生包括大肠杆菌rpoH基因和霍乱弧菌dsbA基因的共表达。这些基因产物参与CT A亚基和B亚基的构相成熟。
                             实施例2
                     完整全毒素的GM1结合试验
在神经节苷脂GM1-依赖性固相放射性免疫试验(42)中测试CT-CRM，确定纯化后是否存在完整的全毒素。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，其中ELISA板的微孔以神经节苷脂GM1(10μg/ml)4℃包被过夜。然后，依次加入以下试剂，间隔以1小时的室温培养：CT-CRM(浓度为3-0.00137μg/ml)，100μl兔抗CT-A血清(1∶1000)和碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔抗体(1∶2000)。为了显示反应，加入1μg/ml磷酸对硝基苯酯的二乙醇胺溶液100μl，培养30分钟。加入100μl 2N NaOH终止反应，立即用Microelisa自动读数仪读数。在与野生型CT比较时，数据显示在第7、29、110或112位发生氨基酸取代的CT-CRM是完整全毒素(图1)。然而，结果暗示，一部分纯化CT-CRMR11K似乎不是全毒素。
                           实施例3
              CT-CRM残留毒性的Y-1肾上腺细胞试验
多次以小鼠Y-1肾上腺细胞试验比较突变CT-CRM与野生型全毒素的毒性。将Y-1肾上腺细胞(ATCC CCL-79)以104个细胞/孔的浓度接种在96孔平底板上。然后，向肿瘤细胞加入CT-CRM的3倍系列稀释液，37℃培养18小时。然后用光学显微镜检查细胞的毒性表现(细胞变圆)。终点滴定量即使50％以上细胞变圆所需的最低毒素浓度。用野生型CT的终点滴度除以CT-CRM的终点滴度然后乘以100，算得残留毒性百分比。表2显示了以Y-1肾上腺细胞试验测定的几种纯化突变全毒素的残留毒性。
                           表2
                     对Y-1肾上腺细胞的毒性
                        Y-1肾上腺细胞试验
CT-CRM                  ％残留毒性
E112D                      0.13
E112D                      0.13
R11K                       0.04
R7K                        0.04
E110D                      0.13
E110D                      0.40
E29H                       1.20
CT-B                       1.20
CT                         100.0
                            实施例4
                         专利小鼠肠重试验
本试验中，将10μg野生型CT或CT-CRME29H胃内给予各组BALB/c小鼠(3个/组)。3小时后，小心地取出小肠并称重。表3显示了结果。给出的数据是每组的平均肠重/体重比。
                                   表3
                              CT-CRME29H的毒性
    试验     CT     CT-CRME29H     PBS
    小鼠肠重(肠/身体重量比)     0.13±0.01     0.09±0.01a     0.08±0.007
a：与野生型CT对照比较的p＜0.05，与PBS比较的p＞0.05。
                             实施例5
                      ADP-核糖基转移酶试验
测定放射性标记的NAD+释放的[羰基-14C]烟酸酰胺，作为NAD+：胍基丁胺ADP-核糖基转移酶活性。简而言之，用胰蛋白酶活化CT和CT-CRM，与50mM甘氨酸/20mM二硫苏糖醇在TEAN缓冲液(TrisTM/EDTA/叠氮钠/氯化钠)(pH8.0)中30℃培养30分钟。然后，在反应中加入以下物质：0.1mg大豆胰蛋白酶抑制剂，50mM磷酸钾，10mM胍基丁胺，20mM二硫苏糖醇，10mM氯化镁，100μMGTP，3mM双肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱，0.2％胆盐，0.03mg卵白蛋白，100μM[腺嘌呤-U-14C]NAD(DuPont NENTM，Boston，MA)，加水至300μl终体积。30℃培养90分钟后，取100μl样品加到AG1-X2柱(0.64×5cm)(Bio-Rad)上，用1.0ml去离子/蒸馏水洗柱5次。收集含[14C]ADP-核糖基胍基丁胺的洗脱液进行放射试验。洗脱液中[14C]的平均回收率表示为与上样量的百分比。结果见表4。
                          表4
佐剂 形成的ADP-核糖基胍基丁胺 ％ADP-核糖基化活性
CT，10μgE29H，10μgE110D，10μgE112D，10μgR7K，10μgR11K，10μg  57.16.70.40.90.40.4  10011.70.71.60.70.7
                             实施例6
         以重组(r)不可归类流感嗜血杆菌(NTHi)P4和P6外膜蛋白
                  免疫的BALB/c小鼠的免疫应答反应
第一个实验中，每组5只BALB/c小鼠在第0、21和35天，接受含5μg rP4或10μg rP6加1μg表5和6所示佐剂(有一组不用佐剂)的10μl剂量鼻内免疫。以第0、21、35和48天收集的样品，用ELISA测定抗rP4的IgG抗体的效价，结果见表5。另外以第0、21、35和48天收集的样品，用ELISA测定抗rP6的IgG抗体的效价，结果见表6。还在最后一次免疫后第2周(第49天)，测定了对rP4的粘膜抗体应答。表7显示鼻、支气管和***洗液中的IgA和IgG效价。
第二个实验中，每组5只BALB/c小鼠在第0、21和35天，接受含5μg rP4或10μg rP6加表8所示递减剂量CT-CRME29H的30μl剂量鼻内免疫(其他组分别接受CT或CT-B；有一组不用佐剂)。以第21、35和48天收集的样品通过ELISA测定抗rP4的IgA和IgG抗体的效价，结果见表8。还测定了第49天支气管和***洗液中的IgA和IgG效价，结果见表8。
                       表5
    突变霍乱全毒素配制的重组P4和P6蛋白b免
    疫a的BALB/c小鼠的全身性体液免疫应答反应
                            血清抗重组P4 IgG抗体效价c
佐剂d  第0天  第21天  第35天  第48天
无CTCT-BE29HE110DE112DR7KR11K  1157751111110521243140025461289  12771657111815391313152017711391  1893175896917119176886928033113428  196845885705789562283058414854093623631
a：小鼠在第0、21和35天接受鼻内免疫(IN，10μl体积)。
b：重组P4和P6的给予剂量分别是每剂5μg和10μg。
c：抗重组P4 IgG抗体效价是用ELISA对在所示时间收集的样品测得的。每组5只小鼠。
d：CT和CT突变体的给予剂量是每剂1μg。
                                              表6
                              以突变霍乱全毒素配制的重组P4和P6蛋白b
                            免疫a的BALB/c小鼠的全身性体液免疫应答反应
                                       血清抗天然P6 IgG抗体效价c
佐剂d 第0天 第21天  第35天  第48天
无CTCT-BE29HE110DE112DR7KR11K ＜100＜100＜100＜100＜100＜100＜100＜100 ＜100＜100＜100＜100＜100＜100＜100＜100  ＜100964487534723666426529248  ＜1005482173991963822415953839043763
a：小鼠在第0、21和35天接受鼻内免疫(IN，10μl体积)。
b：重组P4和P6的给予剂量分别是每剂5μg和10μg。
c：抗重组P4 IgG抗体效价是用ELISA对在所示时间收集的样品测得的。每组5只小鼠。
d：CT和CT突变体的给予剂量是每剂1μg。
                                            表7
                           以突变霍乱全毒素配制的重组P4和P6蛋白b
                           免疫a的BALB/c小鼠的粘膜抗体应答反应
                                           抗重组P4抗体的效价c
                 NWd                 BAWd                 VWd
佐剂e IgA IgG IgA  IgG  IgA IgG
无CTCT-BE29HE110DE112DR7KR11K ＜5＜5＜5＜5＜511＜56 ＜5＜5＜5＜5＜5＜5＜5＜5 ＜5＜5＜5＜5＜5＜5＜5＜5  ＜55699176144485634  ＜5054＜5063＜50564＜50223 ＜50＜50＜50＜509858＜50＜50
a：小鼠在第0、21和35天接受鼻内免疫(IN，10μl体积)。
b：重组P4和P6的给予剂量分别是每剂5μg和10μg。
c：抗重组P4的IgG和IgA抗体的效价是用ELISA对最后依次免疫后第2周时(第49天)收集的样品测得的。每组5只小鼠。
d：NW，BAW和VW表示鼻、支气管和***洗液。
e：CT和CT突变体的给予剂量是每剂1μg。
                                                        表8
                                    CT-CRME29H递减剂量对于抗重组流感嗜血杆菌
                                    P4和P6蛋白的局部和全身性免疫应答反应的影响
                                                抗重组P4抗体效价a
                               血清                    粘膜洗液b
        第21天         第35天         第48天           BAW           VW
佐剂  IgA  IgG  IgA  IgG  IgA  IgG  IgA  IgG  IgA  IgG
无  189  219  204  3833  334  17269  27  26  493  146
1μg CT  145  741  1803  67470  5855  495735  864  2279  1446  1934
10μg CT-B  206  2531  650  34047  5838  989806  622  3674  1397  884
1μg CT-CRME29H  171  2640  1021  59031  8643  588586  845  3180  1898  1479
10μg CT-CRME29H  ＜100  498  ＜100  6427  397  84176  25  175  122  31
30μg CT-CRME29H  119  622  801  14151  2194  161178  67  568  215  116
a：小鼠在第0、21和35天接受重组P4(5μg)和P6(10μg)蛋白的鼻内免疫。抗重组P4 IgG和IgA抗体的效价是用ELISA对所示时间收集的样品测得的。每组5只小鼠。
b：BAW和VW分别表示支气管和***洗液。
                            实施例7
        以天然NTHi Haps蛋白免疫的BALB/c小鼠的免疫应答反应
NTHi菌株P860295(46)由Pittsburgh大学的Charles Brinton博士提供。它获自一名NTHi诱导的中耳炎患儿的鼻咽。NTHi菌株TN106(47)由Dallas的Texas大学西南医学中心的Eric Hansen博士提供的。在含有100μg/ml链霉素(Sigma，St.Louis，MO)的BHI-XV培养板上选择得到TN106的一种抗链霉素突变株。该突变株在Balb/c小鼠的鼻咽内传代2次，冷冻保存，称为菌株TN106.P2。
如下纯化NTHi菌株P860295的Haps蛋白。NTHi菌株P860295在BHI-XV培养基中35℃通气培养18小时。4℃10k×g离心沉淀细菌细胞，将其丢弃。上清液中加入固体(NH4)2SO4至60％饱和度，室温下保持2-3小时，离心收集沉淀。将沉淀溶于缓冲液1(50mM磷酸钠缓冲液pH5.8，1mM EDTA，50mM NaCl)中，在4℃用以上缓冲液透析。用缓冲液1平衡床体积为10ml的CMSepharoseTM柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)，以1ml/min的流速将以上溶解物质30ml上柱。用缓冲液1洗柱，直至OD280降至基线。弃去未能结合的物质。以3步从树脂上梯度洗脱结合的蛋白质：1)磷酸钠缓冲液，pH7.0，1mM EDTA，50mM NaCl；2)磷酸钠缓冲液，pH8.0，1mM EDTA，50mM NaCl；和3)磷酸钠缓冲液，pH8.0，1mMEDTA，0.5M NaCl。
收集各梯度洗脱的蛋白质，保存以待分析。对样品的SDS-PAGE(48)分析显示，Haps蛋白在梯度2和3洗脱。将含有高纯度Haps的这些洗脱液合并。
用纯化自NTHi菌株P860295的Haps鼻内免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠(每组10只)。Haps蛋白以D-PBS稀释至5-15μg/40μl，其中含或不含CT-CRME29H。使用时，CT-CRME29H的用量是0.1μg/小鼠。同时，给予小鼠40μl的以下对照制剂：溶于D-PBS的CT-CRME29H，单独的D-PBS和***固定的TN106.P2(NTHi攻击株)。
鼻内(IN)免疫之前，将小鼠麻醉，然后用吸量管按20μl/鼻孔鼻内接种进行免疫。握住吸量管，使得管嘴碰到鼻口，制剂随呼吸自动流入鼻孔。保持小鼠仰卧，不让鼻孔在给予制剂或攻击后接触任何东西。在第0、1、3和5周免疫小鼠。在第7周抽取血清。结果见表9。
                                               表9
                              以Haps单独或与CT-CRME29H混合鼻内免疫后
                                  Balb/c小鼠的全身性体液免疫应答
  免疫原 剂量(μg) 佐剂   抗Haps IgG ELISA
  Hap   5 -   1604
  Hap   15 -   5204
  Hap   5 CT-E29H   4653
  Hap   15 CT-E29H   15111
  -   15 CT-E29H   ＜500
  I×PBS   - -   ＜500
  ***固定的TN106.P2   - -   ＜500
                           实施例8
   用重组幽门螺杆菌脲酶蛋白免疫的BALB/c和C57B1/6小鼠的免疫应答
第一个实验中，如下免疫5只一组的小鼠：表10-12所示，7组小鼠在第0、2、14和16天用100μg重组脲酶加10μg表10-12所示的佐剂胃内免疫。在第0和16天，一组小鼠用10μg重组脲酶臀部皮下免疫；另一组用10μg重组脲酶颈部皮下免疫；两组都接受20μg StimulonTM QS-21作为佐剂。用第28天收集的样品通过ELISA测定抗重组脲酶抗体效价。IgG结果见表10，IgA见表11。而且在第29天测定了对重组脲酶的粘膜抗体应答反应。表12分别列出了支气管洗液和***洗液中的IgA和IgG效价。
第二个实验评价重组脲酶加佐剂保护小鼠抵抗幽门螺杆菌攻击的能力。如下免疫10只一组的BALB/c小鼠：2组在第0、2、14和16天用100μg重组脲酶加10μg表13所示的佐剂胃内免疫；1个对照组以PBS代替重组脲酶加上10μg佐剂。1组在第0天和第16天接受10μg重组脲酶加20μg StimulonTM QS-2 1皮下免疫。在第28天收集样品，通过ELISA测定抗重组脲酶抗体效价。在第29、31和34天3次用108幽门螺杆菌攻击小鼠，在第44天测定保护作用。以快速脲酶试验评价保护作用。在快速脲酶试验中，半个胃在0.5ml脲酶试验培养基(2％尿素和酚红，7μg/ml pH指示剂)中37℃培养5小时。脲酶活性由尿素产生氨气和碳酸氢盐，由此提高pH值，并诱导溶液变色，提高550nm的吸光度。通过分光光度法测定脲酶活性水平。如果平均吸光度比非感染小鼠胃组织所得高出2倍标准方差，则认为幽门螺杆菌阳性。接见表13。
第三个实验中，2组C57BL/6小鼠(每组5只)在第0、2、14和16天接受100μg重组脲酶加10μg表14所示佐剂胃内免疫。第三组在第0和16天接受10μg重组脲酶加100μg明矾皮下免疫。第四组在第0、2、14和16天接受不加佐剂的100μg重组脲酶胃内免疫。在第28天收集样品，用ELISA测定抗重组脲酶抗体效价。表14分别列出了血清、支气管洗液、粪便提取物和***洗液中的IgA和IgG效价。
第四个实验中，如下免疫6只一组的C57BL/6小鼠：3组第0、2、14和16天接受100μg重组脲酶加10μg表15所示佐剂的胃内免疫。第四组不用佐剂。用第29天的样品ELISA测定抗重组脲酶抗体效价。IgA和IgG结果见表15。表15还列出IgE(PCA)和总IgE效价。PCA表示通过被动皮肤过敏性反应测得的IgE抗体效价。对雌性Sprague-Dawley大鼠进行PCA。用开他敏/甲苯噻嗪镇静大鼠，脱毛，皮内注射0.1ml以重组脲酶的CT、LT或CT-CRME29H制剂免疫的C57B1/6小鼠的血清(连续稀释4倍)。48-60小时后，镇静大鼠，尾部静脉内注射0.1ml 2μg重组脲酶以含1％Evan′s蓝染料PBS配制的溶液。
                            表10
   CT-CRM对BALB/c小鼠产生全身性抗脲酶IgG抗体效价的作用
                                              抗重组脲酶IgG抗体效价a
    佐剂b     途径b     平均值     SE
    CTE29HR7KR11KE110DE112DCT-BQS-21QS-21     IGIGIGIGIGIGIGSC-RSC-N     234,010131,03217,69225,50222,2998,78447,0604,038,4305,609,764     43,61364,1839,27111,4138,57152,0838,9911,702,556353,824
a：第28天收集的血清样品经ELISA测定的抗重组脲酶抗体几何平均效价。每组5只小鼠。
b：小鼠在第0和16天接受10μg重组脲酶臀部(R)或颈部(N)皮下(SC)免疫。
小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重组脲酶胃内免疫。佐剂是StimulonTMQS-21(20μg)，CT(10μg)或突变CT(10μg)。
                     表11
CT-CRM对BALB/c小鼠产生全身性抗脲酶IgA抗体效价的作用
                                                         抗重组脲酶IgG抗体效价a
    佐剂b     途径b     平均值     SE
    CTE29HR7KR11KE110DE112DCT-BQS-21QS-21     IGIGIGIGIGIGIGSC-RSC-N     2,5291,013821533512324555,6754,793     584426153913793208562528
a：第28天收集的血清样品经ELISA测定的抗重组脲酶抗体几何平均效价。每组5只小鼠。
b：小鼠在第0和16天接受10μg重组脲酶臀部(R)或颈部(N)皮下(SC)免疫。小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重组脲酶胃内免疫。佐剂是StimulonTMQS-21(20μg)，CT(10μg)或突变CT(10μg)。
                                 表12
       CT-CRM对BALB/c小鼠粘膜分泌物中产生的抗脲酶IgA抗体效价的作用
                               抗重组脲酶抗体效价a
                    BAWb                      VWb
    佐剂c     途径c     IgA     IgG     IgA     IgG
    CTE29HR7KR11KE110DE112DCT-BQS-21QS-21     IGIGIGIGIGIGIGSC-RSC-N     38763＜5713＜565611     1,005317276298173129,81610,545     3,4712,0957929217991140809235     4642654221841086010,2726,237
a：第29天收集的血清样品经ELISA测定的抗重组脲酶IgG和IgA抗体效价。每组5只小鼠。
b：BAW和VW分别表示支气管洗液和***洗液。
c：小鼠在第0和16天接受10μg重组脲酶臀部(R)或颈部(N)皮下(SC)免疫。小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重组脲酶胃内免疫。佐剂是StimulonTMQS-21(20μg)，CT(10μg)或突变CT(10μg)。
                                     表13
         重组脲酶的CT或CT-CRME29H制剂在BALB/c小鼠内产生的保护性免疫应答
                IgA效价a
  抗原b   佐剂c     途径     血清     BAWd     受保护数/总数(％)e
  PBS   CT     IG     ＜100     ND     2/10(20)
  重组脲酶   CT     IG     2,730     11     8/10(20)
  重组脲酶   E29H     IG     1,225     124     8/10(20)
  重组脲酶   QS-21     SC     14,917     7     3/10(20)
  无   无     ND     ＜100     ND     1/10(20)
a：第28天收集的样品经ELISA测定的抗重组脲酶IgA抗体效价。每组10只小鼠。
b：小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重组脲酶/剂胃内(IG)免疫。对照小鼠在第0和16天皮下(SC)注射10μg重组脲酶/剂。
c：重组脲酶以10μg/剂CT或CT-CRM配制，或与20μg/剂StimulonTM QS-21混合。
d：BAW表示支气管洗液。
e：小鼠在第29、31和34天3次用108幽门螺杆菌攻击，在第44天测定保护作用。保护作用用快速脲酶实验测定。
                                        表14
                    CT-CRME29H对C57BL/6小鼠抗重组脲酶免疫应答的作用
                                           抗重组脲酶抗体效价a
           血清            BAWb            FPb             VWb
  佐剂c   途径c   IgA   IgG     IgA     IgG     IgA     IgG     IgA     IgG
  E29HCT明矾无   IGIGSCIG   135811172658110   25228992182101279010938     14123＜5     42633179514     265977＜5     97＜5＜5     404549＜50     14030917329
a：用第28天收集的血清样品用ELISA测定抗重组脲酶抗体的终点效价。每组5只小鼠。
b：BAW、FP和VW分别表示支气管洗液、粪便提取物和***洗液。
c：小鼠在第0和16天用10μg重组脲酶皮下(SC)免疫。小鼠在第0、2、14和16天接受100μg重组脲酶胃内(IG)免疫。佐剂是明矾(100μg)，CT(10μg)或CT-CRME29H(10μg)。
                                             表15
                           以重组脲酶的CT、LT或CT-CRME29H制剂
                     免疫C57BL/6小鼠循环***内脲酶特异性IgE抗体的产生
                                       抗重组脲酶抗体效价a
    佐剂b     IgA     IgG     IgE(PCA)c     总IgEd
    无CTCT-CRME29HLT     732250440395251     30,591496,373477,098670,807     ＜4321664     ND15918883589
a：用ELISA测定第29天收集的血清样品的IgA和IgG抗体终点效价。每组5只小鼠。
b：小鼠在第0、2、14和16天以100μg重组脲酶胃内(IG)免疫。佐剂是10μgCT、CT-CRME29H或LT。
c：PCA表示通过被动皮肤过敏性反应测得的IgE抗体效价。对雌性Sprague-Dawley大鼠进行PCA。用开他敏/甲苯噻嗪镇静大鼠，脱毛，皮内注射0.1ml以重组脲酶的CT、LT或CT-CRME29H制剂免疫的C57B1/6小鼠的血清(连续稀释4倍)。48-60小时后，镇静大鼠，尾部静脉内注射0.1ml 2μg重组脲酶以含1％Evan′s蓝染料PBS配制的溶液。
d：数值单位是ng/ml。ND表示没有测定。
                              实施例9
            重组脑膜炎奈瑟氏球菌1类菌毛蛋白和1类外膜蛋白
                   免疫Swiss-Webster小鼠的免疫应答
第一个实验中，6-8周龄Swiss-Webster小鼠(一组15只)在第0、2和3周以5μg纯化重组1类菌毛蛋白的CT-CRME29H(0.1-1μg/鼠)制剂(10μl)鼻内免疫。第4周，收集各组中5只小鼠的血清样品、支气管洗液(BAW)、鼻洗液(NW)和***洗液(VW)，用ELISA法测定脑膜炎奈瑟氏球菌菌毛蛋白特异性血清和粘膜IgA和IgG抗体。结果见表16。各组同等免疫的其余10只小鼠在第4周接受同源脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H355P+.p2IR(由乳鼠传代2次)2×107CFU的鼻内攻击。攻击后第24小时，通过定量培养测定鼻组织中B群脑膜炎奈瑟氏球菌的回收率，见图2。
第二个实验中，比较重组菌毛蛋白CT-CRME29H制剂和CT-CRME29H与无关蛋白KLH混合物的抗同源脑膜炎球菌保护作用。5只一组的Swiss-Webster小鼠(6周龄)在第0、2和3周，接受5μg重组菌毛蛋白单独或加CT-CRME29H(0.1μg)，或PorA H355加CT-CRME29H(0.1μg)鼻内免疫(10μl)。对照组不免疫(不变异组)或以KLH(5μg)加CT-CRME29H(0.1μg)鼻内免疫。用全细胞和抗原特异性ELISA测定第四周攻击前收集的血清样品得到抗体终点效价，然后用1×107CFU脑膜炎球菌H355P+攻击。结果见表17和18。
第三个实验评价脑膜炎球菌PorA的CT-CRME29H制剂鼻内免疫的免疫原性。5只一组的Swiss-Webster小鼠在第0、2和3周接受20μg/次脑膜炎球菌H44/76的PorA单独或加CT-CRME29H(0.1μg/次)鼻内免疫，见表19。用实验第4周收集的血清和粘膜样品测定抗PorA H44/76抗体效价和IgG的全细胞ELISA。结果见表19
第四个实验评价重组菌毛蛋白和PorA的CT-CRME29H制剂保护小鼠抵抗异源脑膜炎球菌攻击的能力。10只一组的Swiss-Webster小鼠在第0、2和3周接受5μg重组菌毛蛋白、菌株H355的PorA或菌株870227的PorA的CT-CRME29H(0.1μg)制剂鼻内免疫(10μl)。对照组接受热灭活脑膜炎球菌870227全细胞或KLH(5μg)加CT-CRME29H(0.1μg)免疫。在用870227菌株攻击前的第四周收集血清样品，通过全细胞和抗原特异性ELISA测定IgG和IgA终点效价。结果见表20和21。通过定量培养测定870227菌株攻击后第24小时鼻组织内的细菌回收率，表示为Log10CFU±标准方差。本实验结果见表22和图4。
第五个试验检验CT-CRME29H作为胃肠外免疫佐剂的潜力。用CT-CRME29H(10μg)或MPLTM(100μg)配制的PorA H355 5μg于第0和4周皮下免疫每组10只5-6周龄的Swiss-Webster雌鼠。对照组用热灭活的脑膜炎球菌870227全细胞或KLH(5μg)加MPLTM(100μg)皮下免疫。第6周，用1.2×107CFO的脑膜炎球菌870227攻击小鼠。攻击后24小时，杀死小鼠，鼻组织制成匀浆，接种在选择培养基上。37℃培养过夜，清点菌落数，表示为Log10CFU±标准方差。结果见表22和图5。
                                        表16
                   CT-CRME29H对Swiss-Webster小鼠抗脑膜炎奈瑟氏球菌
                重组菌毛蛋白(I类H44/76)全身性和粘膜免疫应答的佐剂效应
  免疫原                              样品的抗重组菌毛蛋白抗体ELISA效价
  血清(第0周)     血清(第4周)       BW     NW     VW
  IgA   IgG   IgA   IgG   IgA  IgG   IgA   IgG   IgA   IgG
  重组菌毛蛋白   ＜50      ＜50   878          69013   4         41   23         2   37      17
  重组菌毛蛋白+CT-CRME29H(0.1μg)   ＜50      ＜50   2209         209228   ＜2       19   34         40   61      51
  重组菌毛蛋白+CT-CRME29H(1μg)   ＜50      ＜50   4089         1344776   41        540   75         45   135     216
                                    表17
                         CT-CRME29H对Swiss-Webster小鼠
                         抗脑膜炎球菌抗原免疫应答的作用
                        B群脑膜炎球菌全细胞ELISA总血清IgG
  组     H335P+菌株     FAM 18菌株     M982菌株
  第0周    第4周   第0周    第4周   第0周    第4周
  5μg重组菌毛蛋白   175*    2,371   294*    639   137*    2,375
  5μg重组菌毛蛋白+0.1μg CT-CRME29H   175*    24,965   294*    2702   137*    21,862
  5μg PorA+0.1μg CT-CRME29H   175*    10,156   294*    9136   137*    5,733
  5μgKLH+0.1μg CT-CRME29H   175*    192   294*    230   137*    100
*：代表第0周所有组的合并样品。
                                               表18
                                CT-CRME29H对Swiss-Webster小鼠
                                抗脑膜炎球菌抗原免疫应答的作用
                        汇总样品的抗重组菌毛蛋白和抗PorA抗体ELISA效价
组       重组菌毛蛋白血清IgG   血清IgA第4周     第4周         I类OMPH355血清IgG    血清IgA第4周      第4周
  5μg重组菌毛蛋白     8840      ＜50     ＜50       ＜50
  5μg重组菌毛蛋白+0.1μg CT-CRME29H     149221    860     120        ＜50
  5μg PorA H355+0.1μg CT-CRME29H     ＜50      ＜50     13795      60
  5μg KLH+0.1μg CT-CRME29H     ＜50      ＜50     ＜50       ＜50
                                              表19
                  脑膜炎球菌PorA加CT-CRME29H鼻内免疫Swiss-Webster小鼠的免疫应答
组        血清IgG     IgA            BW             NW             VW
    IgG     IgA     IgG     IgA     IgG     IgA
  20μg PorA  WCE   3530    NDPorA  1220    ＜50     ND＜2     ND＜2     ND＜2     ND＜2     ND＜7     ND＜7
  20μg PorA+1μg CT-CRME29H  WGE   26660   NDPorA  17673   ＜50     ND5     ND＜2     ND＜2     ND＜2     ND＜7     ND＜7
ND＝无数据
WCE＝对H44/76菌株的全细胞ELISA
PorA＝PorA H44/76特异性ELISA
                                       表20
                   异源和同源脑膜炎球菌PorA和重组菌毛蛋白加CT-CRME29H
                            鼻内免疫Swiss-Webster小鼠的免疫应答
试验抗原 血清周                                       免疫小鼠的ELISA IgG效价#
  5μg KLH+0.1μgCT-CRME29H     5μg重组菌毛蛋白+0.1μgCT-CRME29H     5μg PorA+0.1μgCT-CRME29H   5μg PorA870227+0.1μgCT-CRME29H   25μg HIWC870227+0.1μg CT-CRME29H
  WC870227     04   ＜100350     ＜10013,376     ＜1007088   ＜10024815   ＜10074930
  WCH355P     04   257310     2573687     2575140   2573930   2575933
  重组菌毛蛋白     04   146585     1461,999,530     146＜100   146＜100   146＜100
  PorAH44/76     04   ＜100＜100     ＜100673     ＜10029770   ＜10019009   ＜100463
  PorA870227     04   ＜100＜100     ＜100＜100     ＜10010020   ＜10023045   ＜1005935
#：所有组合并样品的第0周效价
WC＝全细胞
HI＝热灭活的
                                        表21
                 异源和同源脑膜炎球菌PorA和重组菌毛蛋白加CT-CRME29H
                           鼻内免疫Swiss-Webster小鼠的免疫应答
试验抗原 血清周                                        免疫小鼠的ELISA IgA效价#
  5μg KLH+0.1μgCT-CRME29H     5μg重组菌毛蛋白+0.1μgCT-CRME29H     5μg PorA+0.1μgCT-CRME29H     5μg PorA870227+0.1μgCT-CRME29H     25μg HIWC870227+0.1μg CT-CRME29H
    WC870227     04   ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25ND
    WCH355P     04   ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25
    重组菌毛蛋白     04   ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25
    PorAH44/76     04   ＜25＜25     ＜255097     ＜25233     ＜25200     ＜25＜25
    PorA870227     04   ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25     ＜25＜25
#：所有组的合并样品的第0周效价
WC＝全细胞
HI＝热灭活的
ND＝无数据
                                                      表22
                                       PorA加CT-CRME29H或MPLTM皮下免疫
                                        小鼠血清的抗脑膜炎奈瑟氏球菌活性
    小鼠血清     H355P+     870227
    第5周，第6天KLH(5μg)，MPLTM(100μg)     ＜25     ＜25
    第5周，第6天H355 1类OMP(5μg)，MPLTM(100μg)     200     ＜25
    第5周，第6天870227 1类OMP(5μg)，MPLTM(100μg)     ＜25     100
    第5周，第6天热灭活870227WC(25μg)，MPLTM(100μg)     25     200
    第5周，第6天H355 1类OMP(5μg)，CT-CRME29H(10μg)     ＜25     ＜25
    第0周合并样品阴性对照     ＜10     ＜10
    第6周阳性对照1     200     nd
    第6周阳性对照2     nd*     400
*nd＝未试验
所用补体：人UR4-97
                           实施例10
          以纯化天然呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)糖蛋白免疫的
                      BALB/c小鼠的免疫应答
第一个实验中，6-8周龄BALB/c小鼠(5只一组)在第0和14周接受3μg纯化天然蛋白质与CT-CRME29H(1或10μg/鼠)、野生型CT(1μg/鼠)、CT-B(1或10μg/鼠)或无佐剂制剂鼻内免疫(10μl)。在实验第24天，用ELISA法测定IgG和IgA抗体终点效价。测定血清、支气管洗液和***洗液的效价。结果见表23。
第二个实验中，6-8周龄BALB/c小鼠(5只一组)在第0和14周接受野生型CT(1μg/鼠)或CT-CRME29H(1μg/鼠)鼻内预免疫(50μl)。对照组不进行预免疫。然后，在第28和42天，所有小鼠都接受3μg融合蛋白等量CT或CT-CRME29H制剂鼻内免疫。用ELISA法测定第56天(血清)收集的样品和第57天(支气管和***洗液)收集的样品的抗体终点效价。结果见表24。
第三个实验中，未免疫过的雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，5只一组)在第0、1和2周接受纯化天然RSV A2融合蛋白鼻内免疫。免疫使用融合蛋白(3μg/鼠)的CT-CRME29H(1或10μg/鼠)，CT-B(1或10μg/鼠)或明矾(100μg/鼠)制剂。将小鼠麻醉，使其吸入放在鼻孔口的疫苗，如此鼻内给予疫苗。第0、1、2周每次的总体积是10μl/鼠(表25)。对照小鼠接受含F/ALOH的首次肌内免疫，或者接受首次和二次活RSV A2鼻内免疫。三次免疫后第9天(表25和26)，用ELISA分析全身性体液免疫应答。并且收集支气管、***和鼻洗液，用于测定粘膜抗体应答。用免疫小鼠的脾脏测定对MHC-相容性RSV感染的靶细胞的抗原依赖性杀伤细胞活性。接受同样免疫的第二组小鼠用活性RSV攻击。然后，在攻击后第4天，通过测定肺组织匀浆中的病毒空斑，分析该组小鼠内的肺腔室保护作用。用ANOVA进行统计学分析。结果见表25和26。
第四个实验中，Balb/c小鼠在第0、1和2周接受纯化RSV F蛋白(3μg/鼠)加CT-CRME29H(1或10μg/鼠)，CT-B(1或10μg/鼠)或PBS的鼻内免疫。对照小鼠接受RSV鼻内免疫或F/ALOH肌内免疫。最后一次免疫后第9天，分离出脾细胞，在体外用同源RSV感染的刺激细胞攻击。培养6天后，通过测定RSV感染的靶细胞释放的51铬量来确定抗原依赖性杀伤细胞活性。结果见图6。
第五个实验是一个抗病毒保护试验，在用活性RSV攻击后第4天分离出免疫小鼠的肺腔室，匀浆化，测定感染性病毒的量。用含纯化RSV F蛋白和CT-CRME29H、CTB或PBS的疫苗鼻内免疫Balb/c小鼠。对照组用F/ALOH肌内免疫。最后一次免疫后8天(F/ALOH免疫后3周)，用活性RSV攻击小鼠。4天后，获取肺组织，用来测定感染性病毒的量。结果见图7。
第六个实验中，未免疫过的雌性Balb/c小鼠(6-8周龄，5只一组)在第0、1和2周接受纯化天然RSV A2融合蛋白鼻内免疫。免疫使用融合蛋白(3μg/鼠)的CT-CRME29H(1μg/鼠)或明矾(100μg/鼠)制剂。将小鼠麻醉，使其吸入放在鼻孔口的疫苗，如此鼻内给予疫苗。第0、1和2周每次的总量是5μl/鼠(表27)。对照小鼠接受含F/ALOH的首次肌内免疫，或者接受首次和二次活RSV A2鼻内免疫。三次免疫后2周(表27和28)，用ELISA分析全身性体液免疫应答。收集支气管、***和鼻洗液，用于测定粘膜抗体应答。用免疫小鼠的脾脏研究对MHC-相容性RSV感染的靶细胞的抗原依赖性杀伤细胞活性。接受同样免疫的第二组小鼠用活性RSV攻击。然后，在攻击后第4天，通过测定肺组织匀浆中的病毒空斑，分析该组小鼠内的肺腔室保护作用。用ANOVA进行统计学分析。结果见表27和28。
第七个实验中，使用第四个实验中的方法来测定对RSV感染的靶细胞的抗原依赖性CTL活性。结果见图8。
第八个实验是另一个抗病毒保护试验，Balb/c小鼠(5只一组)接受纯化RSV F蛋白单独或加CT-CRME29H的鼻内免疫。对照组接受F/ALOH肌内免疫或不免疫(原初)。最后一次免疫后2周(给予F/ALOH后4周)，用活性RSV攻击各组小鼠。4天后，获取肺组织，用来测定感染性病毒的量。结果见图9。
第九个实验中，用3次免疫方案更详细地研究CT-CRME29H的佐剂应答。5只一组的BALB/c小鼠在第0、1和2周接受融合蛋白(3μg)混合0.01、0.1或1.0μgCT-CRME29H的鼻内免疫(5μl)。对照鼠在第0天用F/ALOH(肌内)或RSV A2(鼻内)初次免疫。三次免疫后2周，测定血清抗体效价。结果见表29。数据显示为log10抗体效价几何平均值(±SD)。在另两次实验中得到相近的结果。
F/CT-CRME29H鼻内免疫后，还测定实验9中小鼠的抗F蛋白局部抗体应答。最后一次免疫后2周，杀死小鼠，获取粘膜洗液样品，用ELISA分析抗F蛋白特异性IgG和IgA。结果见表30。数据显示为log10(令OD410为0.03)终点效价几何平均值(±SD)。在另两次实验中得到相近的结果。
第十个实验中，为了研究F/CT-CRME29H免疫诱导体液免疫应答的功能，用空斑减少试验测定血清抗RSV A2中和抗体效价。结果见表31。以5％豚鼠血清为补体来源，在其存在(+C′)和不存在(-C′)下，测定各小鼠(5只一组)血清的中和抗体效价几何平均值(log10)。在另两次实验中得到相近的结果。
第十一个实验中，小鼠(5只一组)在第0、7和14天接受F蛋白加0.01、0.1或1μg CT-CRME29H制剂鼻内免疫。对照鼠用F/ALOH(肌内)或RSV A2(鼻内)免疫。为了测定F/CT-CRME29H抗再次感染的保护能力，三次免疫后2周攻击小鼠。感染后4天，测定各小鼠肺组织匀浆和鼻组织匀浆中的病毒水平。结果见表32。数据显示为病毒效价/g组织的几何平均值(±SD)。
                                                      表23
                                        用CT、CT-B或CT-CRME29H鼻内免疫后
                                           BALB/c小鼠抗霍乱毒素抗体的产生
                                               抗霍乱毒素抗体效价a
                 血清                 BAW                 VW
 佐剂b   IgG     IgA     IgG     IgA     IgG     IgA
 无   ＜100     ＜100     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25
 CT(1μg)   434,180     3,944     70     ＜25     214     1,431
 CT-B(1μg)   781,628     4,665     280     ＜25     127     709
 CT-B(10μg)   156,239     2,544     241     ＜25     163     1,243
 E29H(1μg)   118,541     2,207     94     ＜25     227     1,578
 E29H(10μg)   514,233     4,881     410     NDc     214     980
a：用第24天收集的合并样品测定抗体终点效价。BAW和VW分别表示支气管洗液和***洗液。每组5只小鼠。
b：小鼠在第0和14天接受F蛋白混合所示量野生型CT、市售CT-B或CT-CRME29H的鼻内免疫(10μl)。
c：ND＝无数据。
                                              表24
                              已有抗霍乱毒素抗体对呼吸道合胞病毒融合蛋白
                                 加CT或CT-CRME29H制剂的免疫原性的作用
                                       抗融合蛋白抗体效价a
               血清                 BAW                 VW
  已有Vaxb   佐剂   IgG     IgA     IgG     IgA     IgG     IgA
  无   无   ＜1000     ＜100     ＜25     ＜25     ＜25     25
无 CT 887,136 11,337 16,219 8,709 274 1,447
  +   CT   ＞10,000,000     22,344     253,641     24,331     36,415     4,391
  无   E29H   1,430,836     10,786     2,232     1,680     333     378
  +   E29H   6,346,730     17,890     131,217     12,367     2,750     6,359
a：用第56天(血清)和第57天(支气管洗液(BAW)和***洗液(VW))收集的样品以ELSIA法测定的抗体终点效价。每组5只小鼠。
b：小鼠在第0和14天接受野生型CT(1μg)或CT-CRME29H(1μg)鼻内预免疫(50μl)。然后在第28天和第42天，所有小鼠都接受3μg融合蛋白的同样量(1μg)野生型CT或CT-CRME29H制剂鼻内免疫(50μl)。野生型CT或CT-CRME29H预免疫后再用F蛋白免疫的小鼠其第42天时的抗CT抗体终点效价超过1,000,000。
                                             表25
                      RSV融合蛋白加CT-CRME29H鼻内免疫BALB/c小鼠的全身性免疫应答
                                          抗融合蛋白抗体效价
 组 免疫原  IgG  IgG1  IgG2a  IgA
 776 10μg E29H  ＜100  ＜100  ＜100  ＜100
 777 3μg F+1μg E29H  126,463±32,646  62,344±27,002  4,899±1,027  16,202±2,031
 778 3μg F+10μg E29H  209,123±75,688  75,711±29,659  19,425±13,508  15,706±10,909
 779 3μg F+1μg CTB  46,742±32,987  26,902±14,985  4,239±3,658  4,076±614
 780 3μg F+10μg CTB  285,116±110,154  116,245±34,596  10,512±11,016  11,679±7,246
 784 3μg F+PBS  2,171±1,921  521±743  ＜100  ＜100
 785 3μg F+100μg AlOH  23,303±16,994  5,519±2,348  ＜1000  ＜100
 907 RSV A2  52,749±23,557  6,252±4,286  8,718±2,826  4,284±2,350
总IgG：
p＜0.05：777-780与784相比；780与779相比；777-780与785相比；777，780与907相比(779与907相比p＝0.7)
p＞0.05：778与777相比(p＝0.125)
IgG1：
p＜0.05：777-780与784相比；777-780与907相比；777-780与785相比
p＞0.05：781-780与907相比
IgG2a：
p＜0.05：777-780与784相比
                                                   表26
                              RSV融合蛋白(F)加CT-CRME29H鼻内免疫BALB/c小鼠的粘膜免疫应答
                                                   抗融合蛋白抗体效价
             合并BAL             合并VW             合并NW
 组  免疫原  IgG IgA IgG  IgA IgG  IgA
 776  10μg E29H ＜254633701371109＜25＜252870 ＜25＜25＜25＜25226＜25＜251126 ＜25253239298903＜25＜25167 ＜252855848426357478＜25738 ＜25＜2549177512＜25＜25172 ＜25237242272372＜25＜25170
 777  3μg F+1μg E29H
 778  3μg F+10μg E29H
 779  3μg F+1μg CTB
 780  3μg F+10μg CTB
 784  3μg F+PBS
 785  3μg F+100μg AlOH
 907  RSVA2
                                                    表27
                             RSV融合蛋白加CT-CRME29H鼻内免疫BALB/c小鼠的全身性免疫应答
                                               抗融合蛋白抗体效价
 组  免疫原 IgG IgG1 IgG2a IgA
 250  3μg F+PBS ＜100 ＜100 ＜100 ＜100
 256  3μg F+1μg E29H 315,878±131,746 78,380±40,870 10,718±16,475 444±1,458
 257  1μg E29H ＜100 ＜100 ＜100 ＜100
 258  3μg F+100μg AlOH 121,551±52,023 63,595±27,491 428±4,205 ＜100
 259  RSV A2 112,451±50,247 8,871±5,206 9,953±4,924 224±344
总IgG：
p＜0.05：256与250和257相比
p＞0.05：256与258和259相比
IgG1：
p＜0.05：256与250和257相比
p＞0.05：256与258相比
IgG2a：
p＜0.05：256与250相比，257与258相比
                                   表28
           RSV F蛋白加CT-CRME29H鼻内免疫BALB/c小鼠的粘膜免疫应答
                                             抗F抗体效价
           免疫原          合并BAL           合并VW             合并NW
组
                          IgG    IgA        IgG    IgA         IgG    IgA
           3μg F
250
                          ＜25   ＜25       ＜25   ＜25        ＜25   ＜25
           PBS
           3μg F
256
                          826    ＜25       1,195  3,730       554    875
           1μg E29H
257        1μg E29H      ＜25   ＜25       ＜25   ＜25        ＜25   ＜25
           3μg F
258
                          706    ＜25       577    108         148    ＜25
           100μg AlOH
259        RSV A2         347    ＜25       172    1,449       305    ＜25
                                                                    表29
                                               F蛋白加CT-CRME29H免疫诱导的抗F血清抗体应答
                                              抗体效价几何平均值(log10)
    免疫原                                          抗F蛋白              抗CT
  IgG   IgG1   IgG2a   IgG2b   IgA   IgG     IgA
    F/PBS   3.0±1.0   2.9±0.9   2.2±0.4   2.4±0.6   ＜2.0   ＜3.7     ＜2.0
    CT-CRME29H(1.0μg)   ＜2.0   ＜2.0   ＜2.0   ＜2.0   ＜2.0   6.4±0.3     4.4±0.1
    F/CT-CRME29H(1.0μg)   5.6±0.3a，b   5.2±0.3a，b   4.5±0.3a，b   5.0±0.3a，b   3.0±.06a，b   6.4±0.2c     3.4±0.2c
    F/CT-CRME29H(0.1μg)   5.4±0.2a   5.1±0.2a   3.9±0.7a   4.6±0.5a   3.1±0.2a   5.5±0.2d     3.8±0.2d
    F/CT-CRME29H(0.01μg)   3.8±0.8e   3.5±0.9e   2.3±0.7e   3.0±0.7e   2.1±0.2e   ＜3.7     ＜2.0
    F/AlOH   49±0.8   4.7±0.7   3.5±0.9   3.7±1.0   ＜2.0   NDg     ND
    RSVA2   4.9±0.1   4.0±0.2   4.4±0.2   4.1±0.3   2.3±0.3t   ND     ND
ap＜0.05：与F/PBS或F/CT-E29H(0.01μg)相比，
bp＞0.05：与F/CT-E29H(0.1μg)或F/AlOH相比
cp＜0.05：与F/CT-E29H(0.1和0.01μg)和F/PBS相比；p＞0.05：与CT-E29H相比(1.0μg)
dp＜0.05：与F/PBS和F/CT-E29H(0.01μg)相比
ep＞0.05：与F/PBS相比
fp＜0.05：与F/CT-E29H(0.1和1.0μg)相比
gND：未进行。
                                                               表30
                                         F蛋白CT-CRME29H制剂免疫小鼠粘膜液中的抗F蛋白抗体
免疫原                BAL                  VW                  NW
    IgG     IgA     IgG     IgA     IgG     IgA
  F/PBS     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4
  CT-CRME29H(1μg)     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4
  F/CT-CRME29H(1μg)     3.1     ＜1.4     2.8     3.5     2.0     2.2
  CT-CRME29H(0.1μg)     2.5     ＜1.4     2.5     2.9     ＜1.4     2.3
  CT-CRME29H(0.01μg)     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     2.2     ＜1.4     ＜1.4
  F/AlOH     2.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4     ＜1.4
                                                              表31
                                     F蛋白CT-CRME29H制剂鼻内免疫后全身性抗RSV中和抗体的产生
    免疫原     中和抗体效价(+C′)     中和抗体效价(-C′)
    F/PBS     ＜1.3     ＜1.3
    CT-CRME29H(1μg)     ＜1.3     ＜1.3
    F/CT-CRME29H(1μg)     2.3±0.7a     ＜1.3
    F/CT-CRME29H(0.1μg)     2.2±0.4b     ＜1.3
    F/CT-CRME29H(0.01μg)     ＜1.3     ＜1.3
    F/AlOH     2.0±0.3     ＜1.3
    RSVA2     2.3±0.3     ＜1.3
ap＜0.05：与F/PBS或F/CT-CRME29H(0.01μg)相比
p＞0.05：与F/CT-CRME29H(0.1μg)，F/AlOH或RSV A2相比
bp＜0.05：与F/PBS或F/CT-CRME29H(0.01μg)相比p＞0.05：与F/CT-CRME29H(1μg)，F/AlOH或RSV A2相比
                                                        表32
                                 F蛋白加CT-CRME29H鼻内免疫后肺和鼻组织内的病毒感染度
    免疫原     肺内病毒滴度(log10平均值±SD)     鼻内病毒滴度(log10平均值±SD)
    F/PBS     4.6±0.5     2.7±0.2
    CT-CRME29H(1μg)     4.6±0.5     3.5±0.2
    F/CT-CRME29H(1μg)     ＜2.0±0.1a，b     ＜1.9±0.1c
    F/CT-CRME29H(0.1μg)     ＜1.9±0.1a     ＜1.8±0.1d
    F/CT-CRME29H(0.01μg)     3.9±0.7     2.9±0.4
    F/AlOH     2.6±0.7     2.3±0.4
    RSV     ＜2.0±0.03     ＜1.8±0.1
    原初     4.6±0.1     3.4±0.5
ap＜0.05：与F/PBS，F/CT-CRME29H(0.01μg)，CT-CRME29H或原初鼠相比，p＞0.05：与F/AlOH或RSV A2相比
bp＞0.05：与F/CT-CRME29H(0.1μg)。
cp＜0.05：与F/CT-CRME29H(0.01μg)，F/PBS，CT-CRME29H或原初鼠相比，p＞0.05：与F/CT-CRME29H(0.1μg)，F/AlOH或RSV A2相比
相比
dp＜0.05：与F/PBS，F/CT-CRME29H(0.01μg)，CT-CRME29H或原初鼠相比，p＞0.05：与F/CT-CRME29H(1μg)，F/AlOH或RSV A2相比
                                实施例11
                轮状病毒重组病毒样颗粒免疫小鼠的免疫应答
草地夜蛾(sf-9)细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)维持在SF-900II无血清培养基(GibGo-BRL，Grand Island，NY)中。用表达猿轮状病毒Sall株(32)的VP2和VP6基因的重组杆状病毒构建物共转染sf-9细胞。
如下从被感染Sf9细胞的生长培养基中纯化释放出的2/6VLP：室温下830×g离心细胞30分钟进行澄清。进一步8000×g离心30分钟澄清上清液。用35％的蔗糖TNC缓冲液(10mM Tris，140mM NaCl，10mM CaCl2，pH8.0)溶液96500×g离心2小时，共2次，如此从上清液中纯化得到VLP，然后悬浮在TNC缓冲液中，4℃保存。用SDS-PAGE分析纯化的VLP，然后通过银和考马斯亮蓝染色来确定纯度，用Western印迹法分析蛋白质组成，用电子显微镜检查颗粒的完整性，用BSC蛋白试验测定总蛋白浓度。
对纯化2/6-VLP的考马斯亮蓝、银染色和Western印迹证明有VP2和VP6蛋白存在，以及它们的纯度和与特异性单克隆抗体的免疫反应活性。
根据凝胶上的条带强度估计，VLP的纯度约为95％。此外，对纯化2/6-VLP的电子显微镜分析证实它们形态完整(数据未显示)。
如下免疫小鼠。本试验所用BALB/c和CD-1小鼠购自Charles RiverLaboratoreis(Storeridge，NY)，培养在无轮状病毒的环境中。在第0和2周，分别用100和10μg 2/6-VLP对4周龄的BALB/c小鼠进行口服(n＝4)或鼻内(n＝5，n＝4)免疫；每次都用10μg CT-CRME29H制剂。第三组BALB/c小鼠(n＝4)接受2/6-VLP加CT-CRME29H鼻内免疫，然后以口服免疫增强(即，混合组)。该实验中的对照小鼠接受CT-CRME29H(n＝10)，1×TNC缓冲液(n＝5)或2/6-VLP加1×TNC缓冲液(n＝5)免疫。各小鼠用20μl接种物鼻内免疫，每次2μl，每隔1分钟轮换滴入另一鼻孔。在第0、1、2、4、6、8、10、13周收集各鼠的血清和粪便样品，通过ELISA测定产生的轮状病毒特异性血清IgG、IgM和IgA抗体水平，以及粪便IgG和IgA水平。血清抗体的结果见图10和11；粪便抗体的结果见图13。用第13周的血清来测定IgG1和IgG2a亚类。抗体亚类结果见图12。
免疫前血清的1∶100稀释液和1∶2稀释的粪便样品在ELISA中显示没有反应活性。平行分析只接受TNC缓冲液或CT-CRME29H的对照小鼠的血清和粪便。对照组在实验中显示血清无轮状病毒特异性，粪便内也没有抗体。
在第0、2和13周以CT-CRME29H为佐剂口服(n＝4)或鼻内(n＝4)免疫4周龄的CD-1小鼠。对照组(n＝2)只接受CT-CRME29H。收集0-9，11-14，26-28周的血清和粪便样品，测定血清和粪便内轮状病毒特异性抗体的水平。
为了检测和定量粪便和血清样品中的IgG、IgM和IgA，在96孔聚氯乙烯微滴板(Dynex Technologies，Chantilly，VA)上涂以超免疫豚鼠抗Sall轮状病毒血清的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，37℃培养4小时，或室温培养过夜。微滴板然后用5％BLOTTO(5％脱脂奶粉的PBS溶液)37℃封闭2小时。粪便样品的悬浮液用1％BLOTTO按1∶1稀释，加到板上。微滴板然后在4℃培养过夜，然后用加有0.05％TweenTM20(TNC-T)的TNC缓冲液洗板3次。用加有2.5％普通豚鼠血清(NGPS)的1％BLOTTO稀释兔抗猕猴轮状病毒超免疫血清，加到板上，37℃培养1小时。然后用TNC-T洗板3次。用加有2.5％NGPS的1％BLOTTO稀释辣根过4氧化物偶联的山羊抗兔IgG、IgM和IgA(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)，加到板上，37℃培养1小时。然后用TNC-T洗板4次。加入TMB底物(Kirkegaard and Perry Laboratories)，室温下进行7分钟的显色反应。加入1M磷酸终止反应。用微滴板读数仪(BIO-TEK Instrument，Winooski，VT)测定450nm的OD。如果比空白高出0.1，则认为是显著。用1％BLOTTO稀释Sall病毒原液，加到板上，4℃培养过夜。用TNC-T洗板3次；然后将1％BLOTTO 1∶1稀释的粪便样品或1％BLOTTO连续稀释的血清样品加到板上。将一式两份的粪便样品加到没有抗Sall抗体包被的孔中作为阴性对照。微滴板在37℃培养2小时，然后用TNC-T洗涤3次，以1％BLOTTO加2.5％NGPS稀释过氧化物酶偶联的羊抗小鼠IgG、IgM和IgA加入孔中。以相同方式稀释过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgA+IgG+IgM(H+L)抗体，加到孔中，测定免疫前抗体。微滴板在37℃培养1小时，然后用TNC-T洗涤4次。如前所述进行显色进行ELISA抗原检测。用于测定IgG亚类的ELISA法对使用HRP标记的大鼠抗(单克隆)抗小鼠IgG1和IgG2a作为第二抗体(Biosource International，Camarillo，CA)的方法进行了修改。
对Ishida等所述的免疫组织化学实验(49)进行修改，用于检测2/6-VLP免疫小鼠血清中的抗轮状病毒VP2和VP6抗体。简而言之，将振荡烧瓶中的对数早期的Sf9细胞接种到96孔组织培养板上，接种密度为2.5×104细胞/孔，然后室温(RT)培养1小时。接着，用编码VP2和VP6基因的重组杆状病毒感染细胞，感染复数为10，感染在28℃持续3天。然后将培养基丢弃，培养板室温下真空干燥1小时，用10％***(37％甲醛溶液，含10-15％甲醇，Sigma)PBS溶液室温下固定30分钟。然后，细胞在1％Triton X-100(Sigma)的TNC缓冲液溶液中室温下透化5分钟。
使表达指定轮状病毒蛋白的各组感染细胞接触每只BALB/c或CD-1小鼠攻击前或免疫后血清，然后免疫染色。用含5％FCS的PBS连续稀释小鼠血清样品。将样品加到孔中，培养板在37℃培养2小时。然后以PBS洗板4次。加入含5％FCS的PBS配制的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG、IgM或IgA抗体，37℃培养1小时。用PBS洗孔2次，用3-氨基-9-乙基-咔唑底物(AEC)(Sigma)检测着色细胞。用非感染Sf9细胞，非免疫小鼠血清和免疫小鼠的免疫前血清作为阴性对照。用抗VP6的单克隆抗体(7D9，5E6)和抗VP2单克隆抗体(BP2)作为阳性对照(50)。
在第26周(CD-1小鼠)或第13周(BALB/c小鼠)管饲以10SD50的野生型鼠EDIM轮状病毒(51)攻击非免疫小鼠和2/6-VLP免疫小鼠。测定排出剂量50作为EDIM菌株滴度，即诱导50％成年鼠在粪便中排除病毒所需的剂量。先口服给予100μl 4％碳酸氢钠溶液中和胃酸，然后给予胰蛋白酶活化的攻击病毒(100μl)。将病毒以M199培养基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)稀释，每ml病毒储备液中加10μl胰蛋白酶储备液(1mg/ml)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)以活化病毒。攻击后，收集9天时所有动物的粪便样品。
通过ELISA测定粪便样品中的轮状病毒抗原排出，以净光密度值(OD)表示，即攻击后粪便样品的OD减去同一小鼠攻击前样品的OD。测定各动物排出曲线下的面积，将各动物曲线下的面积与对照组的平均面积比较，由此计算出各动物的抗原排出减少百分比(PRAS)。然后计算各免疫组的平均PRAS。只有PRAS超过50％时才认为受到保护。结果见图14。
用SPSS Windows 8.0版(SPSS，Inc.，Chicago，IL)进行统计学分析。用独立的T检验比较各组之间的攻击前效价几何平均值和PRAS。在计算P值时，保留到小数点之后3位(0.000＝0)。
                             实施例12
             用阿糖诱导型启动子提高CT-CRME29H的表达
如下构建阿糖诱导***：合成PCR引物用于扩增pIIB29H中编码毒素的双顺反子。引物1：CT29正向NheI：5′-TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATGAGC-3′(SEQ ID NO：6)；引物2：CT29反向HindIII：5′-GCAGGTCGAAGCTTGCATGT TTGGGC-3′(SEQ ID NO：7)。用内切核酸酶NheI和HindIII位点将CT-CRME29H ctxA和ctxB编码PCR片段克隆到pBAD18-Cm中，形成pCT18。用ClaI和HindIII去除pCT18的ctxB基因(霍乱弧菌2125)，用pMGJ142的相同片段取代，后者编码霍乱弧菌569B的ctxB基因。所得的pPX7490编码CT-CRME29HctxA和霍乱弧菌569B的ctxB，它们处于阿糖启动子的控制下，并具有LTIIb-B前导序列。
CT-CRME29H的大规模表达及纯化方法如下：用3L的槽纹费氏烧瓶，内有1L的Hy-Soy生长培养基(每升中：Hy-Soy 10g；酵母提取物12.5g；氯化钠5g；磷酸二氢钠3.3g；磷酸氢钠13.1g)。为了制备起始物储备液，在一烧瓶中加入20μg/ml氯霉素和20ml无菌的50％葡萄糖溶液(葡萄糖的最终浓度为1％)。然后在烧瓶内接种以300μl pPX7490转化的DH5α-70℃冷冻储备液。烧瓶在37℃以200rpm振荡培养过夜。第二天使用的所有生长培养基在37℃以200rpm振荡预热。第二天，将通宵培养物的1∶40稀释液加入Hy-Soy生长培养基，补充以20μg/ml氯霉素和10ml作为碳源的无菌甘油(甘油的终浓度为1％)。37℃培养过夜，直至费氏烧瓶内的OD600达到4.5-5.5(在生物反应器中则更高)。然后，用20ml L-阿糖(终浓度为0.5％)诱导培养物，继续培养3小时。3小时诱导期后，大多数毒素都与细胞结合着。离心收获细胞，将沉淀重悬于10mM NaPO4、1mM EDTA(pH7.0)缓冲液中，体积为最初培养物体积的9％。用显微流化仪机械搅拌细胞悬液，以8500×g离心10分钟，去除细胞碎片。在一45Ti转头，160,000×gAV离心机中42,000rpm离心1小时，进一步澄清细胞裂解液(上清液)。将澄清后的细胞裂解液上样到经10mM NaPO4(pH7.0)平衡的羧甲基(CM)-SepharoseTM柱(Pharmacia)上。每10L培养物用约300ml CM-SepharoseTM。以0.102cm/min(2ml/min)的速度将细胞裂解液上柱。用10-25倍柱体积的10mM NaPO4(pH7.0)以0.255cm/min(5ml/min)的速度彻底洗柱，以去除污染物。用4倍柱体积的10mM NaPO4(pH7.0)以0.255cm/min的速度洗脱CT-CRME29H全毒素。通过过滤或用PBS透析对CT-CRME29H的洗脱液进行缓冲液交换，然后保存于4℃。
                          实施例13
         编码2型单纯性疱疹病毒全长糖蛋白D的质粒DNA
                   免疫BALB/c小鼠的免疫应答
编码2型单纯性疱疹病毒全长糖蛋白D的质粒DNA(pDNA)以0.25％布比卡因配制，以野生型CT、CT-CRME29H为佐剂，或不含佐剂，用它免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(含gD2基因的质粒参见Pachuk等的(40))。3周后，进行第二次免疫，末次注射2周后，杀死动物。免疫方案如下。
                                                       表33
    组     给予途径     质粒浓度   佐剂浓度     注射体积
    小鼠1     ID     50μg 024   50μg CT-CRME29H     10μl
    小鼠2     ID     50μg 024   50μg CT     10μl
    小鼠3     ID     50μg 024   -     10μl
    小鼠4     IM     50μg 024   -     100μl
    小鼠5     ID     50μg 023   -     10μl
024-含gD2基因的pDNA；023＝未***gD2基因的pDNA骨架。
ID＝真皮内；IM＝肌内
第四组为阳性对照；第5组为阴性对照。
如下进行增殖试验：将1×105个脾细胞培养在不含或含200ng/ml gD2蛋白的含10％FCS完全RPMI培养基中。37℃，5％CO2存在下培养4天后，用3[H]脉冲处理培养物过夜。在β计数仪上测定3[H]的掺入量。计数报告为SI(刺激指数＝有抗原刺激时的数值除以没有抗原刺激时的数值)。结果见表34。
进行ELISA，测定血清和***洗液中的抗原特异性体液应答。简而言之，96孔圆底板(Maxisorb，Nunc)涂以0.4μg/ml纯化gD2蛋白，4℃过夜。用PBS洗板3次，然后用4％BSA室温下封闭1小时。将50μl(1∶100稀释的)血清样品或50μl***洗液加到板上。血清培养1小时，***洗液4℃培养过夜后，用PBS洗板5次，加入过氧化物酶偶联的抗小鼠Ig(Sigma，St.Louis，MO)1∶3000稀释液，培养1小时。用PBS洗板，然后加入底物3，3′，5，5′-四甲基二氨基联苯(TMB)-H2O2(Biotecx，Houston，TX)。显色30分钟后，在Emax微滴板读数仪(Molecular Device，Sunnyvale，CA)上在450nm处读数。结果见表35(血清)和表36(***洗液)。
用前文所述的标准ELISA检测细胞因子。适当包被微滴板以捕捉gD2刺激24小时或72小时的培养物上清液中的IL5-或γ干扰素。结果见表37。
                                                            表34
                                              给予HSV gD2的pDNA加CT或CT-CRME29H后的
                                                   gD2特异性细胞增殖应答(SI)
    组     ID CT    ID CT-CRME29H     ID     IM
    小鼠1     6521     28826     24696     30949
    小鼠2     9641     15760     20249     26159
    小鼠3     32078     25558     12472     35366
    小鼠4     28792     19023     7092     5151
    小鼠5     12486     22510     14702     30790
    平均值     17904     22335     15842     25683
                                                            表35
                                               给予HSV gD2的pDNA加CT或CT-CRME29H后
                                               ***洗液内的gD2-特异性体液应答(ng/ml)
    组     ID CT    ID CT-CRME29H     ID     IM
    小鼠1     -27     606     516     932
    小鼠2     -15     1378     1547     1315
    小鼠3     333     33     113     430
    小鼠4     582     755     688     108
    小鼠5     3     208     13     234
    平均值     175     598     575     604
                                                        表36
                                           给予HSV gD2的pDNA加CT或CT-CRME29H后
                                            血清内的gD2-特异性体液应答(ng/ml)
    组     ID CT   ID CT-CRME29H     ID     IM
    小鼠1     0     0     69     374
    小鼠2     0     224     0     198
    小鼠3     0     145     0     83
    小鼠4     0     0     347     0
    小鼠5     0     -49     0     0
    平均值     0     70     54     112
                                                            表37
                                               gD2特异性细胞因子ELISA结果(gp/ml)
    024+CT ID     024+CT-CRME29H ID     024ID     024IM     023对照
γ干扰素     1597     1751     136     716     505
IL5-     63     209     9     388     16
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                             序列表
<110>美国氰胺公司
<120>突变霍乱全毒素佐剂
<130>33383-00 PCT
<140>60/102,430
<141>1998-09-30
<160>7
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>霍乱弧菌
<400>1
aagttatata aggcagattc                                                  20
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>霍乱弧菌
<400>2
cagattctaa acctcctg                                                    18
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>霍乱弧菌
<400>3
gacagagtna gtactttgac cg                                               22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>霍乱弧菌
<400>4
cagatgakca agakgtttct gc                                               22
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>霍乱弧菌
<400>5
cagatgakca agakgtttct gc                                               22
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>霍乱弧菌
<400>6
ttttttgggc tagcatggag gaaaagatga gc                                    32
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>霍乱弧菌
<400>7
gcaggtcgaa gcttgcatgt ttgggc                                           26

Claims (9)

1.一种抗原性组合物，含有来自病原性细菌、病毒、真菌或寄生虫的选定抗原和有效佐剂量的突变霍乱全毒素，其中所述突变霍乱全毒素与野生型霍乱全毒素相比毒性降低，且所述突变霍乱全毒素A亚基的第29位谷氨酸被组氨酸取代，所述突变霍乱全毒素增强脊椎动物宿主对所述抗原的免疫应答。
2.根据权利要求1所述的抗原性组合物，所述的选定抗原是不可归类流感嗜血杆菌重组P4外膜蛋白，不可归类流感嗜血杆菌重组P6外膜蛋白，纯化天然流感嗜血杆菌粘附与穿透蛋白，幽门螺杆菌重组脲酶蛋白，脑膜炎奈瑟氏球菌B群1类重组菌毛蛋白，脑膜炎奈瑟氏球菌B群1类外膜蛋白，呼吸道合胞病毒纯化天然融合蛋白，轮状病毒病2/6-毒样颗粒或2型单纯性疱疹病毒全长糖蛋白D。
3.根据权利要求1所述的抗原性组合物，还含有稀释剂或载体。
4.根据权利要求1所述的抗原性组合物，对霍乱全毒素A亚基在氨基酸29之外进行了至少一处其他突变，所述其它突变选自A亚基的精氨酸7，天冬氨酸9，精氨酸11，组氨酸44，缬氨酸53，精氨酸54，丝氨酸61，丝氨酸63，组氨酸70，缬氨酸97，酪氨酸104，脯氨酸106，组氨酸107，丝氨酸109，谷氨酸110，谷氨酸112，丝氨酸114，色氨酸127，精氨酸146和精氨酸192。
5.一种质粒，含有分离的纯化DNA序列，该序列包含编码免疫原性突变霍乱全毒素的DNA序列，所述突变霍乱全毒素A亚基内第29位的谷氨酸被组氨酸取代，所述编码DNA序列与阿糖诱导型启动子操作性连接。
6.如权利要求5所述的质粒，所述启动子是***糖诱导型启动子。
7.一种宿主细胞，被权利要求5所述的质粒转化、转导或转染。
8.一种制备免疫原性突变霍乱全毒素的方法，其中所述突变霍乱全毒素与野生型霍乱全毒素相比毒性降低，且所述突变霍乱全毒素A亚基的第29位谷氨酸被组氨酸取代，该方法包括：用权利要求5所述的质粒转化、转导或转染宿主细胞，并在允许宿主细胞表达所述免疫原性突变霍乱全毒素的条件下培养该宿主细胞。
9.有效佐剂量突变霍乱全毒素在与来自病原性细菌、病毒、真菌或寄生虫的选定抗原组合制备抗原性组合物中的用途，其中所述突变霍乱全毒素与野生型霍乱全毒素相比毒性降低，且所述突变霍乱全毒素A亚基的第29位谷氨酸被组氨酸取代，所述突变霍乱全毒素增强脊椎动物对所述抗原的免疫应答。
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