TW201925222A - 免疫原性組成物 - Google Patents

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朵納 安柏西諾
泰瑞莎 Ｊ 布勒林
艾倫 克洛斯
理查 麥利
法蘭西斯 米瓊
喬治 雷納 西博
拉斐爾 西蒙
雪倫 坦南特
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美商醫院疫苗公司
美國馬里蘭大學巴爾的摩分校
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Abstract

用於預防及/或治療院內感染的技術。

Description

免疫原性組成物
院內感染（亦稱為醫院內獲得性感染）為今日病人面臨的主要問題。在美國183家醫院進行的調查(Magill等人, 2014)中顯示，在11,282位患者中有452位患有一或多種醫療照護相關的感染（4.0%; 信賴區間為95%, 3.7至4.4）。在504種這類的感染中，最常見的類型為肺炎(21.8%)、手術部位感染(21.8%)及胃腸感染(17.1%)。困難梭狀芽孢桿菌是最常被報告出來的病原體（引起12.1%的醫療照護相關感染）。在這類感染中佔25.6%的裝置相關感染（即中心靜脈導管相關的血流感染、導管相關泌尿道感染及呼吸器相關肺炎）在傳統上一直是預防醫療照護相關感染的計劃重點。作者估計，於2011年在美國急症照護醫院中共有648,000位患者，其中有721,800例醫療照護相關感染(HAI)。
隨著多重抗藥性(MDR)細菌的劇增，已變得難以治療院內感染。臨床醫師不得不求助於毒性更強而效果較差的抗生素。儘管如此，疾病控制與預防中心(CDC)估計每年因MDR細菌引起的感染導致約23,000人死亡。
因此，仍然有預防及/或治療這類感染的有效技術之需求。
本發明解決了缺乏用於預防及/或治療院內感染的適宜技術問題。此外，本發明解決了提供具有足夠免疫原性的疫苗的挑戰以實現免疫性及預防拓殖。
此外，本發明提供了用於在有需要的患者群體中預防及/或治療院內感染之組成物及方法。
此外，本發明提供了免疫原性組成物，其包括（例如）(i)一主鏈聚合物，其包括一聚合物及與該聚合物共軛的一或多種抗原性多醣；以及(ii)與該聚合物或抗原性多醣非共價錯合之一或多種多肽抗原。
於一些實施例中，免疫原性組成物可包括一或多種以連接子與聚合物共軛之抗原性多醣。於一些實施例中，免疫原性組成物可包括一或多種未以連接子與聚合物共軛之抗原性多醣。於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣係衍生自革蘭氏陰性細菌及/或革蘭氏陽性細菌。於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣係衍生自克雷白氏菌(Klebsiella )、假單胞菌(Pseudomonas )及/或大腸桿菌抗原性多醣。
於一些實施例中，一或多種助噬作用潛勢，或該一或多種抗原性多醣之免疫原性，於以ELISA及/或以抗體功能測定法測量時係相對於一預定程度增加。於一些實施例中，一或多種助噬作用潛勢，或該一或多種抗原性多醣之免疫原性，於以ELISA及/或以抗體功能測定法測量時係相對於一對照組成物增加。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該免疫原性組成物中之抗原性多醣且不包括存在於該免疫原性組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該免疫原性組成物中之抗原性多肽且不包括存在於該免疫原性組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該免疫原性組成物中之抗原性多肽及/或存在於該免疫原性組成物中之抗原性多醣，且不包括存在於該免疫原性組成物中之聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該疫苗組成物中之抗原性多醣且不包括存在於該疫苗組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該疫苗組成物中之抗原性多肽且不包括存在於該疫苗組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該疫苗組成物中之抗原性多肽及/或存在於該疫苗組成物中之抗原性多醣，且不包括存在於該疫苗組成物中之聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該醫藥組成物中之抗原性多醣且不包括存在於該醫藥組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該醫藥組成物中之抗原性多肽且不包括存在於該醫藥組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括存在於該醫藥組成物中之抗原性多肽及/或存在於該醫藥組成物中之抗原性多醣，且不包括存在於該醫藥組成物中之聚合物。
於一些實施例中，一或多種助噬作用潛勢，或該一或多種抗原性多醣之免疫原性，於以ELISA及/或以抗體功能測定法測量時係相對於一預定程度增加至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。於一些實施例中，該預定程度為免疫前程度。於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣之表位配價係高於天然多醣至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
於一些實施例中，該一或多種多肽抗原可為用於一或多種抗原性多醣之攜載蛋白。於一些實施例中，當施與個體時，免疫原性組成物以ELISA測量係以大於一包括有抗原性多醣而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的抗體產生。於一些實施例中，當施與個體時，免疫原性組成物以ELISA測量係以大於一包括有多肽抗原而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的抗體產生。於一些實施例中，該一或多種病原體係選自克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌。於一些實施例中，當施與個體時，免疫原性組成物係引發對抗克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者的免疫反應。
於一些實施例中，多肽抗原係為或包括細菌多肽、真菌多肽、及/或病毒多肽、或其組合。於一些實施例中，多肽抗原係為或包括來自克雷白氏菌、假單胞菌及/或大腸桿菌之多肽或其免疫原性片段。於一些實施例中，多肽抗原係為或包括衍生自克雷白氏菌、假單胞菌及/或大腸桿菌多肽之多肽。
於一些實施例中，聚合物係為或包括多醣、多肽或合成樹枝狀聚合物。 於一些實施例中，聚合物大小為約50 kDa至約2000 kDa。於一些實施例中，聚合物係為或包括衍生自革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌之莢膜多醣。於一些實施例中，莢膜多醣係為或包括克雷白氏菌莢膜多醣、假單胞菌胞外多醣及/或大腸桿菌莢膜多醣。於一些實施例中，聚合物係為或包括克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，聚合物係為或包括線性聚L-離胺酸，或L-離胺酸之樹枝狀聚合物。於一些實施例中，聚合物係為或包括合成單醣或寡醣之樹枝狀聚合物。
於一些實施例中，一或多種多肽抗原係藉由形成至少一互補親和分子對而與聚合物及/或一或多種抗原性多醣非共價錯合，所述互補親和分子對包括：(i)第一親和分子，其係與該聚合物或該一或多種抗原性多醣結合；及(ii)互補親和分子，其係與一或多種多肽抗原結合。於一些實施例中，該互補親和分子對係選自由以下組成之群組：生物素/生物素結合蛋白、抗體/抗原、酶/基質、受體/配體、金屬/金屬結合蛋白、碳水化合物/碳水化合物結合蛋白、脂質/脂質結合蛋白、及His標籤/His標籤結合分子。於一些實施例中，該第一親和分子為生物素或其衍生物。於一些實施例中，該互補親和分子為生物素結合蛋白或其生物素結合域。於一些實施例中，該生物素結合蛋白為利查維啶(rhizavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)、巴達維啶(bradavidin)、塔馬維啶(tamavidin)、倫蒂維啶(lentiavidin)、西勃維啶(zebavidin)、中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)、生物素連接蛋白(CaptAvidin™)、或其組合。
於一些實施例中，第一親和分子係交聯或共價鍵合至該聚合物或該一或多種抗原性多醣上。於一些實施例中，該第一親和分子係交聯或共價鍵合至該主鏈聚合物之聚合物上。於一些實施例中，該第一親和分子係交聯或共價鍵合至該一或多種抗原性多醣上。於一些實施例中，該第一親和分子係交聯或共價鍵合至該主鏈聚合物之聚合物上及該一或多種抗原性多醣上。於一些實施例中，該聚合物係為或包括聚L-離胺酸。於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣係為或包括克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多種的多醣。
於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣係為或包括O1、O2、O3、O5型或其組合之克雷白氏肺炎菌OPS。於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣係為或包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11、O12型或其組合之綠膿桿菌OPS。於一些實施例中，該抗原性多醣中之至少一者係為或包括綠膿桿菌外多醣PsL。於一些實施例中，該PsL係為或包括至少一表位與一單株抗體結合，該單株抗體包括一與SEQ ID NO:4序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列及/或一與SEQ ID NO:5序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中，至少一多肽抗原係為或包括一與SEQ ID NO:1序列（克雷白氏肺炎菌第I型纖毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列，或其免疫原性片段。於一些實施例中，至少一多肽抗原係為或包括一與SEQ ID NO:2序列（克雷白氏肺炎菌保留第III型纖毛蛋白MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列及/或一與SEQ ID NO:3序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。於一些實施例中，至少一多肽抗原係為或包括綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A、綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B、或其免疫原性片段。於一些實施例中，至少一多肽抗原係為或包括一與SEQ ID NO:6序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A1）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列、一與SEQ ID NO:9序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A2）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列、或一與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。於一些實施例中，至少一多肽抗原係為或包括一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列，或其免疫原性片段。
於一些實施例中，本發明之免疫原性組成物係為或包括：(a)一主鏈聚合物，包括：(i)一聚合物，其包括克雷白氏菌屬K19莢膜多醣；及(ii)一或多種抗原性多醣，其包括與克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的克雷白氏菌或假單胞菌的多醣；以及(b)一或多種多肽抗原，其藉由形成至少一互補親和分子對而與該聚合物非共價錯合，所述互補親和分子對包括：(i)第一親和分子，其係與該聚合物結合；及(ii)互補親和分子，其係與該一或多種多肽抗原結合。於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣係為或包括O1、O2、O3、O5型或其組合之克雷白氏肺炎菌OPS。於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣係為或包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型或其組合之綠膿桿菌OPS。於一些實施例中，該第一親和分子為生物素或其衍生物且該互補親和分子係為或包括生物素結合蛋白或其生物素結合域。於一些實施例中，該生物素結合蛋白係為或包括利查維啶(rhizavidin)或其生物素結合域。於一些實施例中，該一或多種多肽抗原係為或包括綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B之缺少TLR5結合模體的D2結構域、綠膿桿菌PcrV、克雷白氏肺炎菌MrkA、其抗原性片段、或其組合。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之FlaB鞭毛蛋白D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。於一些實施例中，該融合蛋白係為或包括一包括有與SEQ ID NO:24序列（Rhavi-FlaB-結構域2-MrkA-His）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。於一些實施例中，融合蛋白係為或包括一包括有與SEQ ID NO:26序列（Rhavi-FlaB-結構域2-PcrV-His）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。
此外，本發明提供了疫苗組成物。於一些實施例中，疫苗組成物可包括一或多種免疫原性組成物。於一些實施例中，疫苗組成物可包括醫藥學上可接受的載體。
於一些實施例中，疫苗組成物可包括以下之一或多者：(a)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(c) 一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(d)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物可包括以下之一或多者：(a)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(c)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(d)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物可包括以下之一或多者：(a)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(c)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(d)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(e)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(f)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(g)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(h)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物可包括以下之一或多者：(a)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(b)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(c)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(d)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(e)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(f)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(g)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(h)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物可包括以下之一或多者：(a)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(c)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(d)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(e)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(f)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(g)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(h)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(i)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(j)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(k)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(l)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物可包括以下之一或多者：(a)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(b)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(c)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(d)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(e)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(f)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(g)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(h)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白；(i)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(j)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；(k)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及(l)一包括主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括有一聚合物，該聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。於一些實施例中，該Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白係為或包括一包括有與SEQ ID NO:24序列（Rhavi-FlaB-結構域2-MrkA-His）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。於一些實施例中，該Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白係為或包括一包括有與SEQ ID NO:26序列（Rhavi-FlaB-結構域2-PcrV-His）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。
於一些實施例中，各免疫原性組成物之OPS係以約1:1的w/w比例存在。於一些實施例中，各免疫原性組成物之主鏈聚合物係以約1:1的w/w比例存在。於一些實施例中，各免疫原性組成物之合併的OPS與CPS係以約1:1的w/w比例存在。於一些實施例中，各免疫原性組成物之OPS係以約1 μg存在。於一些實施例中，各免疫原性組成物之主鏈聚合物係以約1 μg存在。於一些實施例中，各免疫原性組成物之合併的OPS與CPS係以約1 μg存在。於一些實施例中，各免疫原性組成物之OPS係以約5 μg存在。於一些實施例中，各免疫原性組成物之主鏈聚合物係以約5 μg存在。於一些實施例中，各免疫原性組成物之合併的OPS與CPS係以約5 μg存在。於一些實施例中，該主鏈聚合物係為或包括BP-1主鏈。於一些實施例中，該主鏈聚合物係為或包括BP-1.2主鏈。於一些實施例中，該主鏈聚合物係為或包括BP-2a主鏈。於一些實施例中，該主鏈聚合物係為或包括BP-2b主鏈。該主鏈聚合物係為或包括BP-3主鏈。
於一些實施例中，一或多種多肽抗原係為或包括一或多種綠膿桿菌蛋白或變異體，且其中該互補親和分子係為或包括生物素結合蛋白或其生物素結合域。於一些實施例中，該等多肽抗原中之至少一者係為或包括一與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FlaB鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。於一些實施例中，該等多肽抗原中之至少一者係為或包括一與SEQ ID NO:6序列（綠膿桿菌FlaA1鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:9序列（FlaA2鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之FlaB鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽、或一包括有一與SEQ ID NO:11序列（缺少TLR5結合模體之FlaA1鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽、或一包括有一與SEQ ID NO:12序列（缺少TLR5結合模體之FlaA2鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之FlaB鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:11序列（缺少TLR5結合模體之FlaA1鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:12序列（缺少TLR5結合模體之FlaA2鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌第III型分泌系統(TTSS) PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FliC亞型B鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之綠膿桿菌FliC亞型B鞭毛蛋白D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，至少一互補親和分子對係為或包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
於一些實施例中，當施與個體時，免疫原性組成物係引發會辨識表現MrkA的克雷白氏肺炎菌上之天然MrkA的抗體。於一些實施例中，當施與個體時，疫苗組成物係引發會辨識表現MrkA的克雷白氏肺炎菌上之天然MrkA的抗體。
於一些實施例中，醫藥組成物係包括一或多種本文中所述之免疫原性組成物或疫苗組成物中。於一些實施例中，醫藥組成物係包括一醫藥學上可接受的載體。於一些實施例中，醫藥組成物係包括一或多種佐劑。於一些實施例中，所述佐劑係選自由以下組成之群組：磷酸鋁、氫氧化鋁、磷酸化氫氧化鋁、諸如TLR2皂素(QS21)或孔蛋白之TLR促效劑及諸如(例如)單磷醯脂A (MPL)之TLR4促效劑及諸如鞭毛蛋白之TLR5等。
於一些實施例中，醫藥組成物係經配製用於肌肉內、腹膜內、皮內及/或皮下施用。於一些實施例中，醫藥組成物係經配製用於注射。於一些實施例中，當施與個體時，醫藥組成物係引發Th1反應及/或Th17反應。於一些實施例中，當施與個體時，醫藥組成物係引發對抗克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者的助噬反應/殺菌反應。於一些實施例中，其中當施與個體時，醫藥組成物係降低克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者於黏膜表面的穿透率及/或拓殖率。於一些實施例中，當施與個體時，醫藥組成物係降低克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者於GI的穿透率及/或拓殖率。
一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗克雷白氏菌感染之方法，其包括將有效量之本發明免疫原性組成物組成物施與該個體。一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗克雷白氏菌感染之方法，其包括將有效量之本發明疫苗組成物施與該個體。一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗克雷白氏菌感染之方法，其包括將有效量之本發明醫藥組成物施與該個體。
一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗綠膿桿菌感染之方法，其包括將有效量之本發明免疫原性組成物組成物施與該個體。一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗綠膿桿菌感染之方法，其包括將有效量之本發明疫苗組成物施與該個體。一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗綠膿桿菌感染之方法，其包括將有效量之本發明醫藥組成物施與該個體。
一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗大腸桿菌感染之方法，其包括將有效量之本發明免疫原性組成物組成物施與該個體。一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗大腸桿菌感染之方法，其包括將有效量之本發明疫苗組成物施與該個體。一些實施例係提供對個體進行預防接種以抗大腸桿菌感染之方法，其包括將有效量之本發明醫藥組成物施與該個體。
於一些實施例中，當施與個體時，免疫原性組成物係引發對抗革蘭氏陰性及/或革蘭氏陽性細菌之免疫反應。於一些實施例中，當施與個體時，疫苗組成物係引發對抗革蘭氏陰性及/或革蘭氏陽性細菌之免疫反應。於一些實施例中，當施與個體時，醫藥組成物係引發對抗革蘭氏陰性及/或革蘭氏陽性細菌之免疫反應。於一些實施例中，革蘭氏陰性細菌係選自克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌及其組合。於一些實施例中，該免疫反應為抗體或B細胞反應。於一些實施例中，該免疫反應為CD4+ T細胞反應，包含Th1、Th2或Th17反應，或為CD8+ T細胞反應，或CD4+/CD8+ T細胞反應。於一些實施例中，該免疫反應為抗體或B細胞反應；以及T細胞反應。
一些實施例係提供包括有以本發明之免疫原性組成物進行預防接種的哺乳動物中所養出的抗體之抗體組成物。一些實施例係提供包括有以本發明之疫苗組成物進行預防接種的哺乳動物中所養出的抗體之抗體組成物。一些實施例係提供包括有以本發明之醫藥組成物進行預防接種的哺乳動物中所養出的抗體之抗體組成物。於一些實施例中，該抗體組成物係包括至少一選自由單抗抗體及抗個體遺傳型抗體組成之群組的抗體。於一些實施例中，該抗體組成物係包括分離的γ球蛋白部分。
於一些實施例中，本發明係提供從克雷白氏菌的一或多種細胞組分純化O-抗原多醣之方法，其中該等細胞組分包含蛋白質及/或核酸，該方法包括以下步驟：使一或多種細胞組分與氧化劑接觸以得到一混合物，其中該混合物的pH為約3及5之間；從所述細胞組分中分離出O-抗原多醣；以及提取OPS，其中該OPS基本上不含有其他細胞組分且於其還原末端含有游離醛。於一些實施例中，所述氧化劑為亞硝酸鈉，所述酸為乙酸，且其中所述OPS的還原末端為含有游離醛之2,5-脫水甘露糖殘基。
於一些實施例中，本發明係提供從革蘭氏陰性細菌的一或多種細胞組分純化O-抗原多醣之方法，其中該等細胞組分包含蛋白質及/或核酸，該方法包括：使一或多種細胞組分與酸性試劑接觸以得到一混合物，其中該混合物的pH為約3及5之間；將該混合物加熱至約80°C至約100°C之間；從所述細胞組分中分離出O-抗原多醣；以及提取OPS，其中該OPS基本上不含有其他細胞組分且於其還原末端含有酮。
於一些實施例中，本發明係提供製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣包括一級胺基，及至少一生物素化多醣，該方法包括：藉由將O-抗原多醣與一含有醛基之部分氧化的多醣以及一含有一級胺之生物素混合而使該O-抗原多醣一級胺基化學鍵聯以得到一混合物；且以還原劑還原胺化該混合物而產生BP-1聚合物主鏈，其中該多醣為經生物素化的，而所述化學鍵聯的O-抗原多醣為非經生物素化的。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的BP-1聚合物主鏈。
於一些實施例中，本發明係提供製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣包括一級胺基，及至少一生物素化多醣，該方法包括：由將O-抗原多醣與一經生物素化及氧化的多醣混合而使該O-抗原多醣一級胺基化學鍵聯，所述經生物素化及氧化的多醣係先以1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及生物素醯肼處理多醣的羧酸鹽基團，並接著以氧化劑處理多醣而獲得；且以還原劑還原胺化該混合物而產生BP-1.2聚合物主鏈，其中該多醣為經生物素化的，而所述化學鍵聯的O-抗原多醣為非經生物素化的。於一些實施例中，該O-抗原多醣上的一級胺基為綠膿桿菌OPS外核的L-丙胺酸α-胺基群，或是藉由用還原劑還原胺化使得在每個末端含有一級胺基的短間隔分子化學鍵聯而已引入到O-抗原多醣之還原端的胺基群。於一些實施例中，用於氧化多醣的氧化劑為過碘酸鈉，含有二胺的短間隔體為己二酸二醯肼，而還原胺化的還原劑為氰基硼氫化鈉。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的BP-1.2聚合物主鏈。
於一些實施例中，製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣包括一級胺基，及至少一生物素化多醣，該方法包括：由將O-抗原多醣與一經生物素化及CDAP活化的多醣混合而使該O-抗原多醣一級胺基化學鍵聯，所述經生物素化及CDAP活化的多醣係先以1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及生物素醯肼處理多醣的羧酸鹽基團，並接著以CDAP活化該生物素化的多醣而獲得，藉以產生BP-1.3聚合物主鏈，其中該多醣為經生物素化的，而所述化學鍵聯的O-抗原多醣為非經生物素化的。於一些實施例中，該O-抗原多醣上的一級胺基為綠膿桿菌OPS外核的L-丙胺酸α-胺基群，或是藉由用還原劑還原胺化使得在每個末端含有一級胺基的短間隔分子化學鍵聯而已引入到O-抗原多醣之還原端的胺基群。於一些實施例中，含有二胺的短間隔體為己二酸二醯肼，而還原胺化的還原劑為氰基硼氫化鈉。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的BP-1.3聚合物主鏈。
於一些實施例中，本發明係提供製造包括有至少一生物素化O-抗原多醣及至少一生物素化多醣之主鏈聚合物的方法，該方法包括：使在核部含有一級胺之O-抗原多醣化學鍵聯，其係藉由還原胺化作用將在各末端含有一級胺的短間隔體與O-抗原多醣鍵聯以得到O-抗原多醣-間隔分子，或使用含有L-丙胺酸α-胺基群之未衍生化的OPS；將含有一級胺之O-抗原多醣與部分氧化的多醣混合以得到一混合物；還原胺化該混合物以形成OPS主鏈；以及以CDAP及含有一級胺的生物素將該混合物衍生化；藉此形成一主鏈聚合物，其中該多醣及化學鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的主鏈聚合物。
於一些實施例中，本發明係提供製造包括有至少一生物素化O-抗原多醣及至少一非生物素化多醣之主鏈聚合物的方法，該方法包括：以CDAP及含有一級胺之生物素將包括有一或多個核心KDO及/或庚醣部分之O-抗原多醣生物素化，以得到經生物素化的OPS混合物；以過碘酸鈉將經生物素化的OPS混合物部分氧化，以將醛引入到所述核心KDO及/或庚醣部分；用己二酸二醯肼將該生物素化混合物還原胺化；將經生物素化及胺化的OPS與部分氧化的多醣混合，以形成一混合物；以及還原胺化該混合物；藉此形成一主鏈聚合物，其中該多醣係未經生物素化而該化學鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的主鏈聚合物。
於一些實施例中，本發明係提供製造包括有至少一生物素化O-抗原多醣及PLL聚合物之主鏈聚合物的方法，該方法包括：以PLL聚合物的ε-NH2基團將含有末端醛或α KDO之O-抗原多醣還原胺化，以產生OPS PLL聚合物；以CDAP將OPS衍生化，以形成一衍生混合物；使該衍生混合物與含有一級胺的生物素反應；以及以醯化劑處理或不處理該混合物，以覆蓋PLL聚合物之未反應的ε-NH2基團；藉此製造一主鏈聚合物，其中經覆蓋的N-醯化PLL主鏈或未經覆蓋的PLL係未經生物素化，而該化學鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。於一些實施例中，該醯化劑為醋酸酐或乙醯氯。於一些實施例中，該還原劑為氰基硼氫化鈉。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的主鏈聚合物。
於一些實施例中，本發明係提供製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣於其還原末端包括疊氮基團，以及至少一含有炔基團的生物素化多醣，該方法包括：於催化劑的存在下使在還原端含有疊氮基團的O-抗原多醣與一含有炔的生物素化多醣化學點擊鍵聯；藉此形成一OPS主鏈聚合物，其中該多醣係經生物素化，但化學點擊鍵聯的O-抗原多醣係未經生物素化。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的主鏈聚合物。
於一些實施例中，本發明係提供製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣於其還原末端包括醛或酮基團，以及於催化劑的存在下使含有炔基團之生物素化多醣與一小分子量化合物點擊鍵聯而得到之至少一含有一級胺基的生物素化多醣，所述小分子量化合物於一端含有疊氮且於另一端含有游離胺基團，該方法包括：藉由將O-抗原多醣與一含有一級胺基之生物素化多醣混合並以還原劑還原胺化該混合物而化學鍵聯所述含有醛或酮基團之O-抗原多醣；藉此形成一主鏈聚合物，其中該多醣係經生物素化，但化學鍵聯的O-抗原多醣係未經生物素化。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的主鏈聚合物。
於一些實施例中，本發明係提供製造包括有至少一生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該生物素化O-抗原多醣於其還原末端包括疊氮基團，以及至少一含有炔的非生物素化多醣，該方法包括：於催化劑的存在下使在還原端含有疊氮基團的生物素化O-抗原多醣與一含有炔的非生物素化多醣化學點擊鍵聯；藉此形成一主鏈聚合物，其中該多醣係非經生物素化，但化學點擊鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。於一些實施例中，用於經由炔-疊氮化物環加成使該O-抗原多醣與該多醣點擊鍵聯的催化劑為硫酸銅。於一些實施例中，用以使該多醣衍生化之炔基團係選自由以下組成之群：1-胺基-3-丁炔、1-胺基-4-戊炔、DBCO-胺及炔-PEG4-胺。於一些實施例中，用以使多醣衍生化之疊氮基團係選自由以下組成之群：疊氮基-PEG3-胺、疊氮基-丙胺及疊氮基-丁胺。一些實施例係提供由本文所揭露方法製造的主鏈聚合物。
於一些實施例中，融合蛋白係為或包括一生物素結合域及一多肽，該多肽係為或包括一與SEQ ID NO:16至26中之任一者序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。於一些實施例中，融合蛋白係為或包括一生物素結合域及一多肽，該多肽係為或包括一與SEQ ID NO:1至3或6至26中之任一者序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中，一種製造變異型MAPS係包括將本文中所描述之至少一主鏈聚合物與本文中所描述之融合蛋白中之至少一者錯合。於一些實施例中，該變異型MAPS為BP-1 MAPS、BP-1.2 MAPS、BP-1.3 MAPS、BP-2a MAPS、BP-2b MAPS或BP-3 MAPS。
於一些實施例中，一種評估本文中所描述之免疫原性組成物之免疫原性的方法，包括評估、測量、及/或使用包含B細胞及T細胞反應之一或多種活體外生物測定法來比較免疫反應，諸如通過ELISA之抗體程度、通過FC之功能性抗體程度、OPK及其他如凝集作用、移動性、細胞毒性之功能性測試、Th1/Th17細胞及細胞介素程度、及院內疾病（肺炎、敗血症、燒燙傷、GI及手術部位感染）之活體內測定法，諸如細菌清除、被動及主動保護之接下來對於所述免疫原性組成物之靶標院內病原體的挑戰。於一些實施例中，該免疫反應係與一對照組成物比較。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該免疫原性組成物中之抗原性多醣且不包括一存在於該免疫原性組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該免疫原性組成物中之抗原性多肽且不包括一存在於該免疫原性組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該免疫原性組成物中之抗原性多肽其/或一存在於該免疫原性組成物中之抗原性多醣，且不包括一存在於該免疫原性組成物中之聚合物。
於一些實施例中，一種評估本文中所描述之免疫原性組成物之效價的方法，包括評估、測量、及/或使用包含B細胞及T細胞反應之一或多種活體外生物測定法來比較免疫反應，諸如通過ELISA之抗體程度、通過FC之功能性抗體程度、OPK及其他如凝集作用、移動性、細胞毒性之功能性測試、Th1/Th17細胞及細胞介素程度、及院內疾病（肺炎、敗血症、燒燙傷、GI及手術部位感染）之活體內測定法，諸如細菌清除、被動及主動保護之接下來對於所述免疫原性組成物之靶標院內病原體的挑戰。於一些實施例中，該免疫反應係與一對照組成物比較。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該免疫原性組成物中之抗原性多醣且不包括一存在於該免疫原性組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該免疫原性組成物中之抗原性多肽且不包括一存在於該免疫原性組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該免疫原性組成物中之抗原性多肽其/或一存在於該免疫原性組成物中之抗原性多醣，且不包括一存在於該免疫原性組成物中之聚合物。
於一些實施例中，一種評估本文中所描述之疫苗組成物之免疫原性的方法，包括評估、測量、及/或使用包含B細胞及T細胞反應之一或多種活體外生物測定法來比較免疫反應，諸如通過ELISA之抗體程度、通過FC之功能性抗體程度、OPK及其他如凝集作用、移動性、細胞毒性之功能性測試、Th1/Th17細胞及細胞介素程度、及院內疾病（肺炎、敗血症、燒燙傷、GI及手術部位感染）之活體內測定法，諸如細菌清除、被動及主動保護之接下來對於所述疫苗組成物之靶標院內病原體的挑戰。於一些實施例中，該免疫反應係與一對照組成物比較。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該疫苗組成物中之抗原性多醣且不包括一存在於該疫苗組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該疫苗組成物中之抗原性多肽且不包括一存在於該疫苗組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該疫苗組成物中之抗原性多肽其/或一存在於該疫苗組成物中之抗原性多醣，且不包括一存在於該疫苗組成物中之聚合物。
於一些實施例中，一種評估本文中所描述之疫苗組成物之效價的方法，包括評估、測量、及/或使用包含B細胞及T細胞反應之一或多種活體外生物測定法來比較免疫反應，諸如通過ELISA之抗體程度、通過FC之功能性抗體程度、OPK及其他如凝集作用、移動性、細胞毒性之功能性測試、Th1/Th17細胞及細胞介素程度、及院內疾病（肺炎、敗血症、燒燙傷、GI及手術部位感染）之活體內測定法，諸如細菌清除、被動及主動保護之接下來對於所述疫苗組成物之靶標院內病原體的挑戰。於一些實施例中，該免疫反應係與一對照組成物比較。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該疫苗組成物中之抗原性多醣且不包括一存在於該疫苗組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該疫苗組成物中之抗原性多肽且不包括一存在於該疫苗組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該疫苗組成物中之抗原性多肽其/或一存在於該疫苗組成物中之抗原性多醣，且不包括一存在於該疫苗組成物中之聚合物。
於一些實施例中，一種評估本文中所描述之醫藥組成物之免疫原性的方法，包括評估、測量、及/或使用包含B細胞及T細胞反應之一或多種活體外生物測定法來比較免疫反應，諸如通過ELISA之抗體程度、通過FC之功能性抗體程度、OPK及其他如凝集作用、移動性、細胞毒性之功能性測試、Th1/Th17細胞及細胞介素程度、及院內疾病（肺炎、敗血症、燒燙傷、GI及手術部位感染）之活體內測定法，諸如細菌清除、被動及主動保護之接下來對於所述醫藥組成物之靶標院內病原體的挑戰。於一些實施例中，該免疫反應係與一對照組成物比較。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該醫藥組成物中之抗原性多醣且不包括一存在於該醫藥組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該醫藥組成物中之抗原性多肽且不包括一存在於該醫藥組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該醫藥組成物中之抗原性多肽其/或一存在於該醫藥組成物中之抗原性多醣，且不包括一存在於該醫藥組成物中之聚合物。
於一些實施例中，一種評估本文中所描述之醫藥組成物之效價的方法，包括評估、測量、及/或使用包含B細胞及T細胞反應之一或多種活體外生物測定法來比較免疫反應，諸如通過ELISA之抗體程度、通過FC之功能性抗體程度、OPK及其他如凝集作用、移動性、細胞毒性之功能性測試、Th1/Th17細胞及細胞介素程度、及院內疾病（肺炎、敗血症、燒燙傷、GI及手術部位感染）之活體內測定法，諸如細菌清除、被動及主動保護之接下來對於所述醫藥組成物之靶標院內病原體的挑戰。於一些實施例中，該免疫反應係與一對照組成物比較。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該醫藥組成物中之抗原性多醣且不包括一存在於該醫藥組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該醫藥組成物中之抗原性多肽且不包括一存在於該醫藥組成物中之主鏈聚合物。於一些實施例中，對照組成物可包括一存在於該醫藥組成物中之抗原性多肽其/或一存在於該醫藥組成物中之抗原性多醣，且不包括一存在於該醫藥組成物中之聚合物。常用縮寫清單
ADH：己二酸二醯肼；AMR：抗微生物劑抗藥性；AU：任意單位；BB：主鏈；BP：主鏈聚合物；CDAP：1-氰基-4-二甲基胺基吡啶四氟硼酸鹽；CDC：疾病控制與預防中心；CDM：化學成分確定培養基；CF：囊腫性纖維化；CP：共用部分；CPS：莢膜多醣；CFU：菌落形成單位；COPS：O多醣核心；CT：霍亂毒素；DNA：去氧核糖核酸；DTT：二硫蘇糖醇；EC：大腸桿菌；EDC：1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺；ELISA：酵素連結免疫吸附分析法；ELISpot：酵素連結免疫斑點分析法；ETEC：腸毒性大腸桿菌；FC：流式細胞儀分析法；FT；流出物；GI：腸胃；GNB：革蘭氏陰性細菌；GNR：革蘭氏陰性桿菌；H-NMR：質子核磁共振儀；HA：血球凝集反應；HK：熱滅菌；HL-60細胞：人類早幼骨髓性白血病細胞；HPLC：高效能液相層析法；IATS：國際抗原分型計劃；ICU：重症加護病房；IEC：離子交換色層分析法；IFN：干擾素；IL：介白素；IM：肌內；IN：鼻內；IP：腹膜內；IV：靜脈內；IVIG：靜脈注射免疫球蛋白；Ig：免疫球蛋白；KDO：酮酸基團；KP：克雷白氏肺炎菌；KO：產酸克雷白氏菌；LAL：鱟變形細胞溶胞產物：LPS：脂多醣；mAb：單株抗體；MALLS：多角度雷射光散射；MAPS：多重抗原呈現系統；MDR：多重抗藥性；MHC：主要組織相容性複合體；MW：分子量；NAPLL：N-乙醯基聚-L-離胺酸；NaBH3 CN：氰基硼氫化鈉；NaIO4 ：偏過碘酸鈉；NHS：N-羥基琥珀醯亞胺；NHS：正常人類血清；NMR：核磁共振；OD：光密度；OMP：外膜蛋白；OPA：吞噬細胞助噬測定法；OPK：吞噬細胞助噬滅殺；OPS：O多醣；PA：綠膿桿菌；PCR：聚合酶鏈鎖反應；PBS：磷酸鹽緩衝溶液；PEG：聚乙二醇；PMN：多形核白血球；PLL：聚-L-離胺酸；PO：經口；PPG：聚丙二醇；PRO-CN：載體蛋白對照組；PT：百日咳毒素；RCB：研究細胞庫；RI：折射率；RIA：放射免疫測定法；RNA：核糖核酸；RPM：每分鐘轉速；SBA：血清殺菌測定法；SC：皮下；SDS：十二基硫酸鈉；SDS-PAGE：十二基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠電泳；SEC：尺寸篩除層析術；TFF：切向流過濾；TLR：類鐸受體；TNF：腫瘤壞死因子；TTSS：第III型分泌系統；UF：超微過濾；US：美國；WFI：注射用水。
[ 相關申請案之交叉參考 ]
本申請案係請求2017年6月23日提交之美國臨時申請案第62/524,315號及2018年2月22日提交之美國臨時申請案第62/633,807號的優先權與權益，其內容以全文引用方式併入於本文中。定義
本申請中，除非上下文另有明確指示，否則(i)術語“一個”可以被理解為是指“至少一個”；(ii)術語“或”可被理解為是指“及/或”；(iii)術語“包含”和“包括”可以被理解為包括所列出的逐項成分或步驟，無論是其獨自存在還是與一種或多種附加成分或步驟一起存在；和(iv)術語“約”和“大約”可以被理解為本領域技術人員允許的標準差；和(v)當提供的是範圍時，包括該範圍的端點。
約： 於本文中參考一數值而使用術語「約」時，其係指一個在所述參考值的上下文中之類似的數值。一般而言，熟悉上下文之熟習此項技術者將瞭解「約」在上下文中所涵蓋之相關差異度。例如，在一些實施例中，術語「約」可涵蓋在25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的所述數值之內的數值範圍。
投與 ： 如本文所用術語「投與」通常係指向個體或系統投與組成物。熟習此項技術者將意識到在適當情形中可用於投與個體(例如人類)之各種途徑，以實現該組成物或包含於該組成物之試劑的遞送。舉例而言，在一些實施例中，投與可為經眼、經口、非經腸、經局部等。在一些特定實施例中，投與可為經支氣管(例如，藉由支氣管滴注)、經頰、經真皮(其可為或包含(例如)局部投與至真皮、真皮內(intradermal)、真皮內(interdermal)、經皮等中之一或多者)、經腸、動脈內、真皮內、胃內、髓內、肌內、鼻內、腹膜內、鞘內、靜脈內、室內、在特定器官內(例如肝內)、經黏膜、經鼻、經口、直腸、皮下、舌下、局部、經氣管(例如，藉由氣管內滴注)、經***、經玻璃體等。在一些實施例中，投與可涉及為單一劑量。在一些實施例中，投與可涉及為施用固定數目的劑量。在一些實施例中，投與可涉及為間歇性(例如，適時隔開之複數個劑量)及/或週期性(例如，間隔相同時間段之個別劑量)投藥之投藥。在一些實施例中，投與可涉及連續投藥(例如，灌注)達至少所選時間段。
試劑 ：一般而言，如本文所使用，術語「試劑」可指任何化學類別的化合物或實體，包括例如多肽、核酸、糖、脂質、小分子、金屬或其組合或複合物。在適當情形下，熟習此項技術者將從上下文可知，該術語可用以指一個係為或包括細胞或生物體、或其部分、提取物或組分的實體。替代性地或另外地，可由上下文明確瞭解到，該術語可用以指一個在自然中發現及/或從自然中獲得的天然產物。在一些實例中，也可由上下文明確瞭解到，該術語可用以指通過人手的動作所設計、工程化及/或產生，且/或並非在自然中發現之一或多種人造實體。在一些實施例中，可以分離或純形式使用試劑；在一些實施例中，可以粗產物形式使用試劑。在一些實施例中，提供潛在試劑作為集合或文庫，例如可對其進行篩選以識別或定性其中的活性劑。在一些情況中，該術語可用以指一個可以是或包括一聚合物之化合物或實體；在一些情況中，術語「試劑」可用以指一個係為或包括一聚合部分之化合物或實體。在一些實施例中，術語「試劑」係可指一個不是聚合物及/或實質上不含任何聚合物及/或不含一或多個特定聚合部分之化合物或實體。在一些實施例中，該術語可指一個缺少或實質上不含任何聚合部分之化合物或實體。
胺基酸 ： 本文使用的術語「胺基酸」在廣義上是指，例如，可通過形成一個或多個肽鍵而併入多肽鏈中的任何化合物及/或物質。在一些實施例中，胺基酸具有H2 N–C(H)(R)–COOH的一般結構。在一些實施例中，胺基酸是天然存在的胺基酸。在一些實施例中，胺基酸是非天然胺基酸；在一些實施例中，胺基酸是D-胺基酸；在一些實施例中，胺基酸是L-胺基酸。「標準胺基酸」是指天然存在的肽中常見的20種標準L-胺基酸中的任何一種。「非標準胺基酸」是指除標準胺基酸外的任何胺基酸，不管它是合成製備的，還是從天然來源獲得的。在一些實施例中，胺基酸，包括多肽中的羧基及/或胺基末端胺基酸，與上面提到的一般結構相比可以含有結構修飾。例如，在一些實施例中，與一般結構相比，胺基酸可以發生甲基化、醯胺化、乙醯化、聚乙二醇化、醣基化、磷酸化及/或取代修飾（例如，胺基團、羧酸基團、一或多個質子、及/或羥基團的修飾）。在一些實施例中，與含有其它相同未修飾的胺基酸相比，這樣的修飾可以，例如，改變含有修飾胺基酸的多肽的迴圈半衰期。在一些實施例中，與含有其它相同未修飾的胺基酸相比，這樣的修飾並不顯著改變包含修飾胺基酸的多肽的相關活性。從上下文中清楚可見，在一些實施例中，術語「胺基酸」是指游離胺基酸；在一些實施例中，是指多肽的胺基酸殘基。
抗體 ： 如本文中所使用，術語「抗體」指一種多肽，其包括足以提供與具體目標抗原的特異性結合的標準免疫球蛋白序列元件。如所屬領域中已知，如在自然界中產生的完整抗體是約150 kDa四聚體試劑，其包含兩個一致重鏈多肽(每個是約50 kDa)和兩個一致輕鏈多肽(每個是約25 kDa)，所述多肽彼此結合成通常被稱為「Y形」結構的物質。每條重鏈包含至少四個結構域(每條長度是約110個胺基酸)-胺基端可變(VH)域(位於Y結構的頂端)，接著是三個恒定域：CH1、CH2和羧基端CH3 (位於Y的主幹的基底)。短區域，稱為「開關」，連接重鏈可變區與恒定區。「鉸鏈」連接CH2和CH3結構域與抗體的其餘部分。這一鉸鏈區中的兩個二硫鍵使完整抗體中的兩個重鏈多肽彼此連接。每條輕鏈包含兩個結構域-胺基端可變(VL)域，接著是羧基端恒定(CL)域，其彼此由另一個「開關」分離。完整抗體四聚體包含兩個重鏈-輕鏈二聚體，其中重鏈和輕鏈通過單個雙硫鍵彼此連接；另外兩個二硫鍵使重鏈鉸鏈區彼此連接，使得二聚體彼此連接並且形成四聚體。天然產生的抗體也糖基化，通常在CH2結構域上。天然抗體中的每個結構域具有由「免疫球蛋白折疊」表徵的結構，所述免疫球蛋白折疊由在壓縮反平行β桶中針對彼此封裝的兩個β片(例如3-、4-或5-多股片)形成。每個可變域含有三個稱為“互補決定區”的高變環(CDR1、CDR2和CDR3)以及四個在某種程度上恒定的「構架」區(FR1、FR2、FR3和FR4)。當天然抗體折疊時，FR區形成β片，其提供結構域的結構構架，並且來自重鏈和輕鏈的CDR環區域在三維空間中結合在一起，使得其產生位於Y結構的頂端的單個高變抗原結合位點。天然存在的抗體的Fc區結合於補體系統的元件，並且還結合於效應細胞上的受體，包括例如介導細胞毒性的效應細胞。如所屬領域中已知，可通過糖基化或其它修飾來調節Fc區對Fc受體的親和力及/或其它結合屬性。在一些實施例中，根據本發明產生及/或使用的抗體包括糖基化Fc結構域，包括具有這類糖基化修飾或工程改造的Fc結構域。出於本發明的目的，在一些實施例中，任何包括足夠的如在天然抗體中發現的免疫球蛋白域序列的多肽或多肽複合物可稱為及/或用作「抗體」，無論這類多肽是天然產生(例如通過生物體對抗原的反應產生)，或通過重組型工程改造、化學合成或其它人工系統或方法產生。在一些實施例中，抗體是多株的；在一些實施例中，抗體是單株的。在一些實施例中，抗體具有恒定區序列，其具有小鼠、兔、靈長類動物或人類抗體的特性。在一些實施例中，如所屬領域中已知，抗體序列元件是人類化、靈長類化、嵌合等。此外，在適合的實施例中(除非另有說明或從上下文可知)，如本文中所使用的術語「抗體」指以替代性呈現方式用於利用抗體結構和功能性特徵的所屬領域中已知的或研發構築體或型式中的任一種。例如，在實施例中，根據本發明而利用之抗體係呈選自(但不限於)以下之型式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗體；雙重或多重特性抗體(例如，Zybodies® 等)；抗體片段，諸如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段、及分離的CDR或其組合；單鏈Fvs；多肽-Fc融合體；單域抗體(例如，鯊魚單域抗體，諸如IgNAR或其片段)； 駱駝抗體；隱蔽態抗體(例如Probodies® )；小模組免疫藥物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals, “SMIPsTM ”)；單鏈或串聯雙功能抗體(TandAb® )；VHHs；Anticalins® ；Nanobodies® 微型抗體；BiTE® s； 錨定重複序列蛋白或DARPINs® ；Avimers® ；DARTs；TCR樣抗體；Adnectins® ；Affilins® ；Trans-bodies® ；Affibodies® ；TrimerX® ；微蛋白；Fynomers® 、Centyrins® ；及KALBITOR® 。在一些實施例中，抗體可不具有可能天然產生的共價修飾(例如聚糖的連接)。在一些實施例中，抗體可含有共價修飾(例如聚糖、有效負載[例如可檢測部分、治療性部分、催化部分等]的連接)或其它側基(例如聚乙二醇等)。
抗原 ：本文使用的術語“抗原”是指(i) 引發免疫反應的物質；及/或(ii)與T細胞受體(例如，當由MHC分子呈遞時)或抗體結合的物質。在一些實施例中，抗原引發體液反應(例如，包括產生抗原特異性的抗體)；在一些實施例中，引發細胞反應(例如，涉及受體特異性地與所述抗原相互作用的T細胞)。在一些實施例中，抗原引發體液反應及細胞反應。在一些實施例中，抗原結合至抗體且可或不會在生物體中誘導特定的生理反應。一般而言，抗原可以是任何化學實體或包括任何化學實體，例如，小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂質及聚合物（在一些實施例中除了生物聚合物外(例如，除了核酸或胺基酸聚合物之外)）等。在一些實施例中，抗原係為或包括多肽。在一些實施例中，抗原係為或包括多醣。本領域技術人員可以理解，在一般情況下，抗原可以以分離或純化的形式提供，或者以粗品形式來提供(例如，在提取物中與其它物質一起提供，例如，細胞提取物或其他含抗原源的相對粗製品)。在一些實施例中，本發明使用的抗原以粗製品形式提供。在一些實施例中，抗原是重組抗原。
相關 ： 如本文使用的，如果一個實體的存在、水準及/或形式與另一個實體有關，那麼就認為它們彼此「相關」。在一些實施例中，如果兩個或更多個彼此之間直接或間接地相互作用，以使它們彼此之間保持物理位置接近，則認為它們彼此之間「相關」。在一些實施例中，以物理方式彼此相關聯的兩個或更多個實體彼此共價連接；在一些實施例中，以物理方式彼此相關聯的兩個或更多個實體不彼此共價連接，而是以非共價形式相關聯，例如借助於親和相互作用、氫鍵、凡得瓦爾力相互相用、疏水性相互作用、磁性和其組合。
主鏈聚合物 ：如本文中所用，術語「主鏈聚合物」係指與或可以與一或多種多醣（例如抗原性多醣）共軛之聚合物。於一些實施例中，主鏈聚合物為一聚合物及與該聚合物共軛之一或多種多醣（例如抗原性多醣）。
結合 ：應理解，如本文中所使用，術語「結合」通常是指兩個或更多個實體之間或之中的非共價締合。「直接」結合涉及實體或部分之間的物理接觸；間接結合涉及借助於與一或多個中間實體物理接觸進行的物理相互作用。兩個或更多個實體之間的結合可在多種情形中的任一種中加以評估，包括其中相互作用的實體或部分在分離或更複雜系統的情形中進行研究(例如同時共價或以其它方式與載劑實體締合及/或在生物學系統或細胞中)。
載體蛋白 ：如本文中所用，術語「載體蛋白」係指引發或增進對於耦接或錯合之半抗原之免疫反應的蛋白或多肽。在一些實施例中，由載體蛋白所引發或增進之免疫反應為對於半抗原的反應。在某一實施例中，對於載體蛋白本身沒有顯著的反應；在一些實施例中，可偵測到對於載體蛋白本身的反應。在某一實施例中，載體蛋白係與一或多種其他分子錯合。
點擊化學 ：如本文中所用，術語「點擊化學」係指一個快速且高產率的反應，例如由K. B. Sharpless於2001年所述。在一些實施例中，點擊化學反應產生了可以在不用層析的情況下除去的副產物。在一些實施例中，點擊化學反應只產生可以在不用層析的情況下除去的副產物。在一些實施例中，點擊化學反應具有立體特異性。在一些實施例中，點擊化學反應可使用一或多種容易移除的溶劑來進行。在一些實施例中，點擊化學反應可使用一或多種良性溶劑來進行。在一些實施例中，點擊化學反應係利用銅催化的疊氮化物-炔環加成反應以連接一或多個分子實體。在一些實施例中，所述一或多個分子實體係不受分子大小的限制。在一些實施例中，點擊化學反應係可為生物正交的；例如，反應物及其產物的官能基都不會與官能化的生物分子交互作用且/或在溫和無毒的條件下容易進行反應，諸如在室溫下且較佳地於水中。在一些實施例中，點擊化學反應係可為銅催化的Huisgen環加成反應、疊氮化物-炔[3 + 2]偶極環加成反應、Staudinger接合反應、或疊氮化物-三氫化磷接合反應。在一些實施例中，點擊化學反應係可用以將兩個生物聚合物（例如兩個核酸，或一個核酸與一個蛋白質或肽，或兩個糖聚合物等）連接一起。
拓殖（例如黏膜的或胃腸道的）： 如本文中所用，術語「拓殖」係指微生物在解剖部位（例如黏膜、損傷部位、器官等）建立生態棲位的能力。
組合療法 ： 如本文中所用，術語「組合療法」係指個體同時暴露於二或多種治療方案（例如二或多種治療試劑）的情況。在一些實施例中，所述二或多種治療方案係可同時給藥；在一些實施例中，這類方案係可依序給藥（例如，在施與第二方案的任何劑量之前施與第一方案的全部劑量）；在一些實施例中，這些試劑按重疊給藥方案施與。在一些實施例中，「組合療法」的施與係涉及對一接受該組合中之其它試劑或治療方案的個體施與一或多種試劑或治療方案。為清楚說明，組合療法不需要個別的試劑在單一組成物中一起施用（或甚至需要在同一時間），儘管在一些實施例中可在一結合組成物中一起施用二或多種試劑或其活性部分（例如，做為單一化學複合物或共價實體的一部分）。
組成物 ： 熟習此項技術者將瞭解，如本文中所用的術語「組成物」係可用以指包括一或多個特定成分的分散物理實體。一般而言，除非另有說明，組成物係可呈任何形式–例如氣體、凝膠、液體、固體等。
衍生物 ： 如本文中所用，術語「衍生物」係指一參考物質的結構類似物。亦即，「衍生物」為一個顯示出與參考物質有顯著結構相似度的物質，例如共有核心或共同結構，但也在某些個別方面不同。在一些實施例中，衍生物為可通過化學操作由參考物質產生的物質。在一些實施例中，衍生物為可通過進行與用於產生參考物質的過程大體上類似(例如共有多個步驟)的合成過程而產生的物質。
結構域： 術語「結構域」於本文中係用以指實體的節段或部分。在一些實施例中，「結構域」與實體的特定結構及/或功能特徵相關聯，使得當結構域與其母實體的其餘部分物理分離時，其基本上或完全保留特定結構及/或功能特點。替代性地或另外地，結構域可以是或包括當與該(母)實體分離並與不同(接受者)實體連接時基本上保留及/或賦予接受者實體一個或多個結構及/或功能特點的實體部分，所述結構及/或功能特點在母實體中以結構域為特徵。在一些實施例中，結構域是分子(例如，小分子、碳水化合物、脂質、核酸或多肽)的區段或部分。在一些實施例中，結構域是多肽的區段；在一些這樣的實施例中，結構域的特徵在於特定的結構元件(例如，特定的胺基酸序列或序列基序、α-螺旋特徵、β-折疊特徵、捲曲螺旋特徵、無規捲曲特徵等)，以及/或特定的功能特點(例如結合活性、酶活性、折疊活性、信號傳導活性等)。
劑型 或單位劑型 ： 熟習此項技術者將瞭解，術語「劑型」可用以指用於投與個體的活性劑(例如治療劑或診斷劑)的物理離散單元。一般而言，每個單元含有預定量的活性劑。在一些實施例中，這類量是適合於根據已確定在投與相關群體時與所需或有利結果相關的給藥方案(即，用治療性給藥方案)投藥的單位劑量的量(或其完全部分)。所屬領域的技術人員將理解，投與具體個體的治療性組成物或試劑的總量是由一或多位主治醫生測定並且可涉及多種劑型的投藥。
給藥方案： 熟習此項技術者將瞭解，術語「給藥方案」係指個別地投與個體的通常由時間段間隔的一組單位劑量(通常超過一個)。在一些實施例中，既定治療劑具有推薦的給藥方案，其可能涉及一或多個劑量。在一些實施例中，給藥方案包含多個劑量，其各自彼此在時間上有所間隔。在一些實施例中，個別的劑量各自彼此間隔相同長度的時間段；在一些實施例中，給藥方案包含多個劑量以及間隔開個別劑量的至少兩個不同時間段。在一些實施例中，給藥方案內的全部劑量具有相同單位劑量的量。在一些實施例中，給藥方案內的不同劑量具有不同量。在一些實施例中，給藥方案包含呈第一劑量的量的第一劑量，接著是呈不同於第一劑量的量的第二劑量的量的一或多種其它劑量。在一些實施例中，給藥方案包含呈第一劑量的量的第一劑量，接著是呈與第一劑量的量相同的第二劑量的量的一或多種其它劑量。在一些實施例中，當跨越相關群體投與時，給藥方案與所需或有利結果相關(即，是治療性給藥方案)。
表位： 如本文中所用，術語「表位」通過免疫球蛋白(例如抗體或受體)結合組分特異性地識別的任何部分。在一些實施例中，表位包含抗原上的多個化學原子或基團。在一些實施例中，此類化學原子或基團在抗原採取相關三維構形時經表面暴露。在一些實施例中，此類化學原子或基團在抗原採取此類構形時在空間上彼此物理接近。在一些實施例中，至少一些此類化學原子為在抗原採取替代構形(例如經線性化)時彼此物理分離的基團。
外多醣 ：術語「外多醣」於本文中係用以指由糖殘基組成且由微生物分泌於其環境內之高分子量天然聚合物。外多醣可互換地稱為細胞外多醣(EPS)。EPS建立了生物膜的功能及結構完整性，且被認為是決定生物膜的生理化學特性之基本成分。EPS占生物膜總有機質的50%至90%。
片段 ： 如本文中所述之材料或實體的「片段」具有一種結構，其包括整體的離散部分，但不具有在整體中發現一或多個部分。在一些實施例中，片段由這類離散部分組成。在一些實施例中，片段包含整體的離散部分，其中離散部分共享在整體中發現的一或多個功能特徵。在一些實施例中，片段係由這類的離散部分組成。在一些實施例中，片段由在整體中發現的特徵結構元件或部分組成或包含在整體中發現的特徵結構元件或部分。在一些實施例中，聚合物片段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個或更多個如在完整聚合物中發現的單體單元(例如殘基)或由其組成。在一些實施例中，聚合物片段包含至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、25%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的在完整聚合物中發現的單體單元(例如殘基)或由其組成。在一些實施例中，完整材料或實體可稱為整體的「親本」。
同源性 ：如本文所用，術語「同源性」是指聚合分子之間，例如核酸分子（例如DNA分子及/或RNA分子）之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中，若聚合物分子的序列至少為25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相同的，則認為其彼此為「同源的」。在一些實施例中，若聚合物分子的序列至少為25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%近似的，則認為其彼此為「同源的」。
一致性 ：如本文中所使用，術語「一致性」是指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中，如果聚合分子的序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致，那麼認為所述聚合分子彼此「基本上一致」。兩個核酸或多肽序列之間的一致性百分比的計算可例如通過出於最佳比較目的而比對兩個序列來進行(例如可將間隙引入第一和第二核酸序列中的一個或兩個中以便最佳比對且出於比較目的可以忽略非一致序列)。在一些實施例中，出於比較目的所比對的序列長度是參考序列長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或基本上100%。接著比較相應位置處的核苷酸。當第一序列中的一個位置由與第二序列中相應位置相同的殘基(例如核苷酸或胺基酸)佔據時，那麼所述分子在所述位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比與所述序列共有的一致位置的數目有關，考慮最佳比對兩個序列需要引入的間隙的數目和每個間隙的長度。序列的比較和兩個序列之間一致性百分比的確定可以使用數學演算法實現。舉例來說，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用邁爾和米勒演算法(CABIOS, 1989, 4: 11-17)確定，其已併入ALIGN程式(2.0版)中。在一些例示性實施例中，由ALIGN程式進行的核酸序列比較使用PAM120加權殘基表、空位長度罰分是12和空隙處罰是4。或者，可以使用GCG套裝軟體中的GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣確定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。
「改進 」、「增加 」、「抑制」 或「降低」： 如本文中所用，術語「改進」、「增加」、「抑制」或「降低」或其語法等效物，指示相對於基線量測值或其他參考量測值之值。在一些實施例中，適合的參考量測值可以是或包括，在沒有特定藥劑或治療存在（例如，於之前及/或之後）的其他可比較條件下，或在有適當的可比較參考試劑下，於一特定系統中的量測值（例如，在單一個體中）。在一些實施例中，適合的參考量測值可以是或包括，在有相關的試劑或治療之存在下，在一個已知或預期以特定方式反應的可比較系統中之量測值。
經分離： 如本文中所用，其是指如下物質及/或實體：(1)已與最初產生時與其相關的至少一些組分分離(無論在自然界中及/或在實驗環境中)；及/或(2)通過人力設計、產生、製備及/或製造。經分離的物質及/或實體可與約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%的與其最初相關的其它組分分離。在一些實施例中，經分離的藥劑是約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%純。如本文中所使用，物質在其基本上不含其它組分時是「純」的。在一些實施例中，如所屬領域的技術人員將瞭解，在與某些其它組分(例如一或多種載劑或賦形劑(例如緩衝劑、溶劑、水等))組合之後，物質仍可被視為「經分離」或甚至「純」；在這類實施例中，在不包括這類載劑或賦形劑的情況下計算物質的分離或純度百分比。僅舉一個例子，在一些實施例中，當在自然界中產生的生物聚合物如多肽或多核苷酸在以下情況下時被認為是「分離的」：a)由於其起源或獲取來源與在自然界中在其天然狀態下伴隨它的某些或全部組分不相關聯；b)它基本上不含與自然界中產生它的物種相同物種的其他多肽或核酸；c)由不屬於在自然界中產生它的物種的細胞或其他表達系統表達或以其他方式與來自不屬於在自然界中產生它的物種的細胞或其他表達系統的組分相關。因而，例如，在一些實施例中，被化學合成或在與自然界中產生它的細胞系統不同的細胞系統中合成的多肽被認為是「分離的」多肽。可替代地或另外地，在一些實施例中，已經經歷一種或多種純化技術的多肽可被認為在已經與其他組分分離的程度上是「分離的」 多肽，所述其他組分a)在自然界中與多肽相關聯；及/或b)在初始產生時與多肽相關聯。
連接子 ： 如本文中所用，其係用於指將不同元件相互連接的多元件試劑的部分。例如，本領域的普通技術人員認識到，其結構包括兩個或更多個功能或組織結構域的多肽通常在這些結構域之間包括使其彼此連接的一段胺基酸。在一些實施例中，包含連接子元件的多肽具有通式S1-L-S2的總體結構，其中S1和S2可以相同或不同，並且代表通過連接子彼此相關聯的兩個結構域。在一些實施方案中，多肽連接子為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個胺基酸長度。在一些實施方案中，連接子的特徵在於其傾向於不採用剛性三維結構，而是為多肽提供靈活性。當設計本領域已知的多肽(例如融合多肽)時，可以適當地使用各種不同的連接子元件（Holliger等人, 1993; Poljak, 1994）。
醫藥組成物 ：如本文中所用，術語「醫藥組成物」係指與一或多種醫藥學上可接受的載劑一起調配的活性劑組成物。在一些實施例中，活性劑以適合於投與的單位劑量的量存在於治療方案中，其在投與相關群體時展示出統計學上顯著的實現預定治療作用的概率。在一些實施例中，醫藥組成物可專門調配用於以固體或液體形式投與，其包括適合於以下的醫藥組成物：口服投與，例如頓服藥(水性或非水性溶液或懸浮液)、片劑，例如靶向頰內、舌下和全身吸收的片劑、用於向舌施加的大丸劑、散劑、顆粒、糊劑；腸胃外投與，例如作為例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放調配物通過皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射投與；局部施用，例如施用於皮膚、肺或口腔的乳膏、軟膏或控制釋放貼片或噴霧；經***內或直腸內，例如作為子宮托、乳膏或發泡體；經舌下；經眼；經皮；或經鼻、經肺和到其它黏膜表面。
醫藥學上可接受的 ： 如本文中所用，應用於配製如本申請所公開的組合物的載體、稀釋劑或賦形劑之術語「醫藥學上可接受的」係指所述載體、稀釋劑或賦形劑必須與所述組合物的其它成分相容並對其接受者無害。
多醣 ：術語「多醣」於本文中係用以指聚合碳水化合物分子，其係由通過醣苷鍵結合在一起的單醣單元長鏈所組成，且於水解時得到所組成的單醣或寡醣。多醣的結構範圍從線性的到高度分枝化的。實例包含諸如澱粉及肝醣之儲存性多醣、諸如纖維素及幾丁質及微生物多醣之結構性多醣，以及在微生物中發現的抗原性多醣，包含(但不限於) OPS、CPS、COPS及LPS。
「預防」 或「預防」 ：當與疾病，病症及/或病症的發生相關地使用時，本文中所用的預防」或「預防」係指降低發展疾病、病症及/或病況的風險及/或延遲發生疾病、病症或病況的一或多種特徵或症狀。當疾病、病症或病況的發作已經延遲了一預定時間期間時，可認為預防是完整的。
蛋白質 ： 如本文中所使用，術語「蛋白質」是指多肽(即，通過肽鍵彼此連接的至少兩個胺基酸的鏈帶)。蛋白質可包括除胺基酸以外的部分(例如可以是醣蛋白、蛋白多醣等)及/或可以其它方式加工或修飾。所屬領域的技術人員將瞭解，「蛋白質」可以是如由細胞產生的完整多肽鏈(具有或不具有信號序列)，或可以是其特徵部分。所屬領域的技術人員將瞭解，蛋白質有時可包括例如由一或多個二硫鍵連接或通過其它方式締合的超過一個多肽鏈。多肽可含有L-胺基酸、D-胺基酸或其兩者，且可含有所屬領域中已知的多種胺基酸修飾或類似物中的任一種。適用的修飾包括例如末端乙醯化、醯胺化、甲基化等。在一些實施例中，蛋白質可包含天然胺基酸、非天然胺基酸、合成胺基酸和其組合。術語「肽」一般用於指長度小於約100個胺基酸、小於約50個胺基酸、小於20個胺基酸或小於10個胺基酸的多肽。在一些實施例中，蛋白質是抗體、抗體片段、其生物活性部分及/或其特徵性部分。
多肽 ：如本文中所用之術語「多肽」通常具有其領域公認的為至少3個胺基酸的聚合物的含義。本領域的普通技術人員將瞭解，術語「多肽」旨在足夠一般地不但涵蓋具有本文敘述的完整序列的多肽，而且涵蓋表示此類完整多肽的功能片段(即，保持至少一種活性的片段)的多肽。而且，本領域的普通技術人員瞭解，蛋白質序列通常耐受不破壞活性的某種取代。因此，在如本文中所用的有關術語「多肽」中涵蓋保持活性並且與相同類別的另一個多肽共有至少約30-40%總體序列同一性，常常高於約50%、60%、70%或80%，並且進一步地通常在一個或多個高度保守區域內包括同一性高得多，常常高於90%或甚至95%、96%、97%、98%或99%的至少一個區域，通常涵蓋至少3-4個且常常多達20個或更多個胺基酸的任何多肽。多肽可含有L-胺基酸、D-胺基酸或兩者並且可含有本領域已知的各種胺基酸修飾或類似物。有用的修飾包括，例如，末端乙醯化、醯胺化、甲基化等。在一些實施例中，蛋白質可包含天然胺基酸、非天然胺基酸、合成胺基酸及其組合。
預防 ：如本文中所用之術語「預防」係指延遲發作及/或降低特定疾病、病症或病況的一個或多個症狀的頻率及/或嚴重性。在一些實施例中，預防基於群體進行評價，以致如果在對疾病、病症或病況易感的群體中在疾病、病症或病況的一個或多個症狀的發生、頻率及/或強度方面觀察到統計學顯著降低，則試劑被認為“預防”特定疾病、病症或病況。當疾病、病症或病況的發作已經延遲了一預定時間期間時，可認為預防是完整的。
蛋白質 ：如本文中所使用，術語「蛋白質」是指多肽(即，通過肽鍵彼此連接的至少兩個胺基酸的鏈帶)。蛋白質可包括除胺基酸以外的部分(例如可以是醣蛋白、蛋白多醣等)及/或可以其它方式加工或修飾。所屬領域的技術人員將瞭解，「蛋白質」可以是如由細胞產生的完整多肽鏈(具有或不具有信號序列)，或可以是其特徵部分。所屬領域的技術人員將瞭解，蛋白質有時可包括例如由一或多個二硫鍵連接或通過其它方式締合的超過一個多肽鏈。多肽可含有L-胺基酸、D-胺基酸或其兩者，且可含有所屬領域中已知的多種胺基酸修飾或類似物中的任一種。適用的修飾包括例如末端乙醯化、醯胺化、甲基化等。在一些實施例中，蛋白質可包含天然胺基酸、非天然胺基酸、合成胺基酸和其組合。術語「肽」一般用於指長度小於約100個胺基酸、小於約50個胺基酸、小於20個胺基酸或小於10個胺基酸的多肽。在一些實施例中，蛋白質是抗體、抗體片段、其生物活性部分及/或其特徵性部分。
重組體 ：如本文中所用，其意欲指藉由重組方式設計、工程改造、製備、表現、產生、製造及/或分離之多肽，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之多肽；自重組、組合人類多肽庫分離之多肽；自動物(例如小鼠、兔子、綿羊、魚等)分離的多肽，所述動物轉殖或以其他方式操作來表現(多個)基因、或是編碼及/或直接表現多肽或其一或多個組件、部分、元件、結構域之基因組分；及/或藉由涉及所選核酸序列元件相互剪接或接合之任何其他方式製備、表現、產生或分離的多肽，化學合成所選序列元件，及/或以其他方式產生編碼及/或直接表現多肽或其一或多個組件、部分、元件、結構域之核酸。在一些實施例中，在自然界中發現此類所選序列元件中之一或多者。在一些實施例中，此類所選序列元件中之一或多者經計算機設計。在一些實施例中，一或多個此類所選序列元件由例如來自天然或合成來源之已知序列元件的突變誘發(例如活體內或活體外)產生，諸如(例如)在相關源生物體(例如人類、小鼠等)之生殖系中之序列元件。
參考物 ： 如本文所用，其描述相對於其進行比較的標準物或對照物。例如，在一些實施例中，所感興趣的藥劑、動物、個體、群體、樣品、序列或數值係與參考或對照藥劑、動物、個體、群體、樣品、序列或數值進行比較。在一些實施例中，參考物或對照物實質上與相關測試或測定同時測試及/或測定。在一些實施例中，參考物或對照物為視情況在有形介質中實施之歷史參考物。通常，如熟習此項技術者將理解，參考物或對照物係於可與評估時的條件或環境相當的條件或環境下測定或表徵。熟習此項技術者將理解當證明依賴於及/或與特定可能的參考物或對照物相比時係存在足夠的相似性。
反應： 如本文中所使用，對治療的反應可指由治療引起或與治療相關的個體病狀中任何有利變化。這類變化可包括病狀的穩定(例如預防將在不存在治療的情況下發生的惡化)、病狀的症狀的改善和/或病狀的治癒前景的改良等。其可指個體反應或對腫瘤的反應。腫瘤或個體反應可根據廣泛多種準則測量，包括臨床準則和目標準則。用於評估反應的技術包括(但不限於)臨床檢驗、正電子發射斷層攝影法、胸腔X射線CT掃描、MRI、超音波、內窺鏡檢查、腹腔鏡檢查、從個體獲得的樣品中腫瘤標記物的存在或含量、細胞學和/或組織結構。許多這些技術嘗試測定腫瘤的尺寸或以其他方式測定總體腫瘤負荷。用於評估對治療的反應的方法和指南論述於Therasse等人 (2000)之「評估實體腫瘤中對治療的反應的新指南(New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors)」中，歐洲癌症研究和治療組織(European Organization for Research and Treatment of Cancer)，美國國家癌症研究所(National Cancer Institute of the United States)，加拿大國家癌症研究所(National Cancer Institute of Canada)中。可以任何適合的方式選擇確切反應準則，限制條件是當比較腫瘤和/或患者的群組時，待比較的群組是基於用於測定反應率的相同或類似準則來評估。所屬領域的技術人員將能夠選擇適合的準則。
風險 ： 正如將從上下文將理解的那樣，疾病、病症及/或病狀的「風險」係指特定個體將發展所述疾病、病症及/或病狀的可能性程度。在一些實施方案中，將風險表示為百分比。在一些實施方案中，風險為自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90高達至100%。在一些實施方案中將風險表示為相對於和一個參考樣品或一組參考樣品相關聯的風險的風險。在一些實施方案中，一個參考樣品或一組參考樣品具有已知的疾病、病症、病狀及/或現象風險。在一些實施方案中一個參考樣品或一組參考樣品來自於與特定個體可比較的個體。在一些實施方案中，相對風險為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。
血清型 ：如本文中所用，術語「血清型(serotype)」亦稱為血清變形(serovar)，係指在細菌或病毒種類或不同個體的免疫細胞中之不同變異型。這些微生物、病毒或細胞係根據其細胞表面抗原而分類在一起，使生物體的流行病學分類達到亞種級別。一群具有共同抗原的血清型可稱為血清群(serogroup)或有時稱為血清複合物(serocomplex)。
短寡醣 ：出於本發明之目的，寡醣若在任何線性鏈尚有少於4個、或肯定少於3個殘基，則通常被認為是「短的」。
個體： 如本文中所用，術語「個體」係指有機體，通常為哺乳動物(例如人類，在一些實施例中，包含胎兒期的人類形式)。在一些實施例中，個體患有相關疾病、病症或病狀。在一些實施例中，個體易患疾病、病症或病狀。在一些實施例中，個體顯示疾病、病症或病狀的一或多種症狀或特徵。在一些實施例中，個體不顯示疾病、病症或病狀的任何症狀或特徵。在一些實施例中，個體是具有對疾病、病症或病狀的敏感性或風險的一或多種特性特徵的個體。在一些實施例中，個體為患者。在一些實施例中，個體是進行及/或已進行診斷及/或治療的個體。
易患 ：「易患」疾病、病症或病狀的個體具有發展疾病、病症或病狀的風險。在一些實施例中，易患疾病、病症或病狀的個體不表現出疾病、病症或病狀的任何症狀。在一些實施例中，易患疾病、病症或病狀的個體還沒有被診斷出患有所述疾病、病症或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病症或病狀的個體是已暴露於與所述疾病、病症或病狀的發展相關的條件下的個體。在一些實施例中，發展疾病、病症或病狀的風險是基於人群的風險(例如，個體的家庭成員患有所述疾病、病症或病狀)。
症狀減輕 ： 根據本發明，「症狀減輕」是指特定疾病、病症或病狀的一種或多種症狀的嚴重程度(例如，強度、嚴重程度等)和/或頻率減少。為了清楚起見，特定症狀的發作延遲被認為是症狀頻率減少的一種形式。
治療有效量 ： 如本文中所用，其意謂產生投與所期望之效果的量。在一些實施例中，該術語係指當根據治療給藥方案向罹患或易患疾病、病症及/或病狀之群體投與時足以治療該疾病、病症及/或病狀的量。在一些實施例中，治療有效量為降低疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀之發生率及/或嚴重性，及/或延遲其發作的量。一般技術者將瞭解術語「治療有效量」實際上不需要在特定個體中實現成功治療。確切而言，治療有效量可為當向需要此類治療之患者投與時在顯著數目之個體中提供特定所需藥理學反應的該量。在一些實施例中，提及治療有效量可為提及如在一或多種特定組織(例如受疾病、病症或病狀影響之組織)或流體(例如血液、唾液、血清、汗液、淚液、尿液等)中量測之量。一般技術者將瞭解，在一些實施例中，治療有效量之特定藥劑或療法可以單次劑量調配及/或投與。在一些實施例中，治療有效之藥劑可以複數個劑量，例如作為給藥方案之一部分調配及/或投與。在一些實施例中，治療有效量可以指適宜引發免疫反應的免疫原性組成物或疫苗的數量。例如，「治療有效量」係指無毒但足以為治療、減弱或預防任何個體的感染及/或疾病（例如，細菌感染、肺炎球菌感染等）的數量。
治療 ：如本文中所用，術語「治療(treatment/treat/treating)」係指部分或完全減輕、改善、緩解、抑制特定疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵及/或病因、延遲其發作、降低其嚴重性及/或降低其發生率之任何療法的施與。在一些實施例中，此類治療可向不展示相關疾病、病症及/或病狀之徵象之個體及/或僅展示疾病、病症及/或病狀之早期徵象之個體投與。或者或另外，這類治療可為一個展現出相關疾病、病症及/或病狀之一或多種已確立徵象之個體的治療。在一些實施例中，這類治療可為對已診斷為罹患相關疾病、病症及/或病狀之個體的治療。在一些實施例中，治療可為對已知具有一或多種在統計學上與相關疾病、病症及/或病狀發展風險增加相關的易感性因素之個體的治療。
變異體 ： 如本文中所用，在例如核酸、蛋白質或小分子之分子的上下文中，術語「變異體」係指顯示與參考分子之顯著結構一致性，但與參考分子結構上的不同之處在於與參考分子相比，例如一或多個存在或不存在之化學部分及/或在該化學部分層級之分子。在一些實施例中，變異體亦在功能上與其參考分子不同。一般而言，特定分子是否恰當地視為參考分子之「變異體」係基於其與參考分子之結構一致性的程度。如熟習此項技術者將瞭解，任何生物或化學參考分子都具有某些特徵結構元件。根據定義，變異體為共有一或多種此類特徵結構元件、但在至少一方面上與該參考分子不同之不同分子。僅給出一些實例，多肽可具有由複數個在線性或三維空間中具有相對於彼此之指定位置及/或促成特定結構模體及/或生物功能的胺基酸構成之特徵序列元件；核酸可具有由複數個在線性或三維空間中具有相對於彼此之指定位置的核苷酸殘基構成之特徵序列元件。在一些實施例中，變異體多肽或核酸可因胺基酸或核酸序列中之一或多種差異及/或共價連接於多肽或核酸組分（例如，連接於）之化學部分（例如碳水化合物、脂質、磷酸基團）中之一或多種差異而不同於參考多肽或核酸。在一些實施例中，變異體多肽或核酸顯示與參考多肽或核酸至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%之總體序列一致性。在一些實施例中，變異體多肽或核酸並不與參考多肽或核酸共有至少一種特徵序列元件。在一些實施例中，參考多肽或核酸具有一或多種生物活性。在一些實施例中，變異體多肽或核酸共有參考多肽或核酸之生物活性中的一或多者。在一些實施例中，變異體多肽或核酸缺乏參考多肽或核酸之生物活性中的一或多者。在一些實施例中，變異體多肽或核酸與參考多肽或核酸相比係顯示一或多種生物活性的程度降低。在一些實施例中，若相關多肽或核酸之胺基酸或核酸序列與參考物之胺基酸序列一致但在特定位置有少量序列變化，則相關多肽或核酸視為該參考多肽或核酸之「變異體」。通常，與參考物相比，變異體中少於約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%之殘基經取代、***或缺失。在一些實施例中，與參考物相比，變異體多肽或核酸包括約10、約9、約8、約7、約6、約5、約4、約3、約2或約1個經取代之殘基。變異體多肽或核酸相對於參考物通常包括極少數目(例如少於約5、約4、約3、約2或約1個)之經取代、***或缺失的功能殘基(即參與特定生物活動之殘基)。在一些實施例中，如與親本相比，變異體多肽或核酸通常包括不超過約5、約4、約3、約2或約1個添加或缺失，並且，在一些實施例中，與該參考物相比係不包括添加或缺失。在一些實施例中，與該參考物相比，變異體多肽或核酸包括少於約25、約20、約19、約18、約17、約16、約15、約14、約13、約10、約9、約8、約7、約6個添加或缺失，且通常少於約5、約4、約3或約2個添加或缺失。在一些實施例中，參考多肽或核酸為在自然界中發現的多肽或核酸。在一些實施例中，參考多肽或核酸為人類多肽或核酸。
接種 ：如本文中所用，術語「接種」係指施與一組成物而意欲產生免疫反應，例如致病試劑。為達到本發明之目的，可在暴露於該致病試劑之前、期間及/或之後施與接種，且在一些實施例中在暴露於試劑之前、期間及/或之後不久。在一些實施例中，接種包含以適當間隔時間多次施與接種組成物。
本發明大致上係有關於包含有錯合的蛋白與多醣（例如具有錯合的蛋白與多醣之疫苗）之組成物、系統及方法。這類複合物可用以(例如)在有院內感染風險之患者中誘導及/或增加免疫保護反應。
院內感染係為在醫院或其他醫療照護機構入院後至少約48小時所獲得的感染。為了強調醫院及非醫院環境，院內感染有時被稱為醫療照護相關感染（HAI或HCAI）。在一些實施例中，院內感染可能在醫院、護理之家、復健機構、門診或其他臨床環境中獲得。在一些實施例中，院內感染係通過各種方式在臨床環境中傳播給易感染的患者。在一些實施例中，除了受污染的設備、床單或空氣中的飛沫外，醫療照護人員也會傳播院內感染。在一些實施例中，院內感染可以來自外部環境、另一個已感染的病人、可能被感染的工作人員，或在一些情況中來自於無法確定的院內感染來源。在一些情況中，造成院內感染的微生物係來自於患者自身的皮膚微生物區，在手術或其他損害皮膚保護屏障的處置後而變得有伺機性。儘管患者可能已經從自身的皮膚感染了感染，但這類感染因為其在醫療照護環境中發展而仍被認為是院內的。抗微生物劑抗藥性
已越來越認識到疫苗在面臨抗微生物劑抗藥性(AMR)問題中的角色。疫苗可以通過降低使用抗微生物劑的需要來降低抗藥性的盛行，並可通過降低病例總數來降低其衝擊。通過降低可能導致特定臨床症狀的病原體數量，疫苗可以允許使用窄效性抗生素進行經驗性治療。這些影響可以通過群體免疫來擴大，擴大對人群中未接種疫苗的人的保護。因為抗藥性的選擇很多是因為對正常人群的旁觀者選擇，所以疫苗接種可以降低抗藥性壓力，即使是未包含在疫苗中的病原體也是如此。一些疫苗對目標物種內的抗藥性譜系已有不成比例的影響，這可能是疫苗設計中更深思熟率地開發的一個效益(Lipsitch及Siber, 2016)。疫苗通過這些機制對抗AMR的效益係可通過間接保護或群體免疫而放大(Fine, 1993)，導致當接種疫苗的個體本身不會被感染或拓殖時，不會將病原體傳播到其他個體。在這種方式下，不僅可以在接種疫苗的個體中降低感染、抗藥性感染及抗微生物劑的使用，且可降低對它們的接觸。最後，對於無症狀地拓殖到鼻咽、皮膚、腸道或其他部位的生物體的疫苗，理論上有可能通過接種降低微生物族群的密度而降低抗藥性元件的遺傳交換機會(Levin等人, 1979; Levin及Cornejo, 2009)。
特別感興趣的疫苗是靶向HAI之經常對多種抗生素具有抗藥性之最重要成因的疫苗(CDC, 2013; Chang等人, 2015)。HAI之最一般成因包含多重抗藥性的革蘭氏陰性細菌；最近的公開報導了來自全球的分離株已經對最終的試劑多黏菌素B及柯利黴素有抗藥性(Du等人, 2015: Liu等人, 2016)。對第一線及第二線試劑的抗藥性在革蘭氏陽性細菌中也是個問題。念珠菌屬是免疫功能降低的患者黏膜及播散性感染的重要成因且為抗微生物劑治療的結果(CDC, 2013)。革蘭氏陰性細菌大腸桿菌、假單胞菌、克雷白氏菌及不動桿菌屬也越來越對多種抗生素具有抗藥性(McGann等人, 2016; Collignon, 2009; Agodi等人, 2011, WHO報告, 2014)。為解決這知識落差，CDC於2009年開始了一個三階段的工作，對HAI及抗微生物試劑的使用研製及進行數個州的盛行率調查。盛行率調查結果已使用在其它國家以描述這類感染問題的範疇與規模。CDC的工作於2011年的一項大型調查中告終，其估計了急症照護醫院中的HAI盛行率，根據如表1中所見感染部位及病原體而判定這些感染的分佈情況，並產生這些感染對國家負擔的最新預估值(Magill等人, 2014)。
調查是在美國183家醫院進行(Magill等人, 2014)。在11,282位患者中有452位患有一或多種HAI（4.0%; 信賴區間為95%, 3.7至4.4）。在504種這類的感染中，最常見的類型為肺炎(21.8%)、手術部位感染(21.8%)及胃腸(GI)感染(17.1%)。困難梭狀芽孢桿菌是最常被報告出來的病原體（引起12.1%的醫療照護相關感染）。在這類感染中佔25.6%的裝置相關感染（即中心靜脈導管相關的血流感染、導管相關泌尿道感染及呼吸器相關肺炎）在傳統上一直是預防HAI的計劃重點。作者估計，於2011年在美國急症照護醫院中共有648,000位患者，其中有721,800例HAI。藉由在醫院環境中接種靶向定克雷白氏肺炎菌、綠膿桿菌、大腸桿菌或其組合的疫苗會顯著影響最常見的HAI感染（諸如肺炎、手術部位及尿道感染）的發病率，並且降低表1中所示抗生素抗藥性的盛行率。表 1 ： HAI 的多州點盛行率調查：根據感染類型 (Magill 等人 , 2014) 免疫原性複合物
本發明係涵蓋包含有主鏈聚合物、多醣及多肽之免疫原性複合物。
在一些實施例中，免疫原性複合物為多重抗原呈現系統(MAPS)。某些MAPS系統先前係已描述於WO 2012/155007案中。一般而言，本文中所述之免疫原性複合物係呈現出新的變異MAPS類型複合物，其包含(i)包括有一聚合物及與該聚合物共軛的一或多種多醣（例如抗原性多醣）之主鏈聚合物；及(ii)與該聚合物及/或抗原性多醣非共價錯合之一或多種多肽（例如抗原性多肽及/或載體肽）。一些例示性主鏈聚合物係繪示於表7A-7D中所示免疫原性複合物之中。在一些實施例中，所述變異MAPS複合物為BP-1 MAPS。在一些實施例中，所述變異MAPS複合物為BP-1.2 MAPS。在一些實施例中，所述變異MAPS複合物為BP-2a MAPS。在一些實施例中，所述變異MAPS複合物為BP-2b MAPS。在一些實施例中，所述變異MAPS複合物為BP-3 MAPS。
在一些實施例中，藉由形成至少一親和分子/互補親和分子對，一或多種多肽抗原係與一主鏈聚合物非共價錯合，及/或與該聚合物共軛的抗原性多醣，所述親和分子/互補親和分子對包括：(i)與該聚合物及/或抗原性多醣結合之第一親和分子；及(ii)與一或多個多肽抗原結合之互補親和分子。在一些實施例中，所述一或多種多醣係與該聚合物化學連接。在一些實施例中，所述一或多種抗原性多醣係衍生自革蘭氏陰性細菌及/或革蘭氏陽性細菌。在一些實施例中，一或多種微生物抗原性多醣係衍生自克雷白氏肺炎菌、綠膿桿菌及大腸桿菌抗原性多醣。
在一些實施例中，一或多種多肽係與本文中所述之互補親和分子共價連接(例如，融合)。
在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係與一主鏈聚合物共軛。在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係以約0.01至約10 w/w比例與該主鏈聚合物共軛。在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係以約0.01至約0.1 w/w比例與該主鏈聚合物共軛。在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係以約0.01至約1 w/w比例與該主鏈聚合物共軛。在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係以約0.1至約1 w/w比例與該主鏈聚合物共軛。在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係以約0.1至約10 w/w比例與該主鏈聚合物共軛。在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係以約1至約10 w/w比例與該主鏈聚合物共軛。
在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係衍生自一或多種病原體。在一些實施例中，一或多種抗原性多醣係衍生自一病原體的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25種血清型或菌株。
在一些實施例中，主鏈聚合物係包括一或多種與該主鏈聚合物共軛的親和分子。在一些實施例中，所述抗原性多醣係包括一或多種與該抗原性多醣共軛的親和分子。在一些實施例中，所述主鏈聚合物及抗原性多醣係與一或多種親和分子共軛。在一些實施例中，所述主鏈聚合物係與一或多種親和分子共軛，而所述抗原性多醣未與親和分子共軛。在一些實施例中，所述主鏈聚合物未與親和分子共軛，而所述抗原性多醣係與一或多種親和分子共軛。在一些實施例中，所述親和分子係包括生物素或生物素衍生物。
在一些實施例中，主鏈聚合物係包括與複數個該主鏈聚合物共軛的親和分子。在一些實施例中，所述抗原性多醣係包括複數個與該抗原性多醣共軛的親和分子。在一些實施例中，所述主鏈聚合物及抗原性多醣係與複數個親和分子共軛。在一些實施例中，所述主鏈聚合物係與複數個親和分子共軛，而所述抗原性多醣未與親和分子共軛。在一些實施例中，所述主鏈聚合物未與親和分子共軛，而所述抗原性多醣係與複數個親和分子共軛。在一些實施例中，所述親和分子係包括生物素或生物素衍生物。
在一些實施例中，可包含在免疫原性複合物中之多醣及/或多肽係以重組方式或合成方式產生。在一些實施例中，可包含在免疫原性複合物中之多醣及/或多肽係從天然來源分離出及/或衍生出。例示性多醣及/或多肽係如下所述。克雷白氏菌
絕大多數的克雷白氏菌感染係與住院有關。具伺機性的病原體克雷白氏菌屬主要是攻擊免疫功能降低之住院且患有嚴重隱晦疾病（諸如糖尿病或慢性肺阻塞）的個體。院內的克雷白氏菌感染主要是由克雷白氏肺炎菌造成，其為該屬在醫學上最重要的物種。據估計，克雷白氏菌屬造成美國與歐洲全部院內細菌感染的8% (Podschun and Ullmann, 1998)。除了主要在亞洲發現而在歐洲和西半球並不常見之高毒性K1莢膜菌株之外，在發生頻率上未注意到有很大的地理差異。在美國，克雷白氏菌佔全部院內細菌感染的3%至7%，使其列為八種醫院中最重要的感染性病原體之一(Horan等人, 1988; Schaberg等人, 1991)，從英國收集的數據(Bergogne-Berezin, 1995)及從德國收集的數據(Ullmann, 1986)與CDC報導的非常相似。因此，在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物包含了一或多種克雷白氏菌多醣及/或多肽。
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一或多種克雷白氏菌LPS衍生的多醣及/或CPS多醣。在一些實施例中，LPS衍生的多醣為OPS。在一些實施例中，LPS衍生的多醣為COPS。在一些實施例中，莢膜幾乎由全部克雷白氏菌菌株產生；其呈現出表面結構中與宿主環境接觸的最外層，且其已被證實有高度免疫原性且無毒性(Cryz等人, 1985)。克雷白氏肺炎菌(KP) CPS疫苗的不利條件是數量眾多的莢膜(K)抗原（超過80種不同的抗原）。然而，在對菌血症的克雷白氏菌分離株中之莢膜類型發生率的研究中，觀察到只有25種血清型占全部菌血症菌株的70% (Cryz等人, 1986a)。根據其血清流行病學發現，配製了24價KP CPS疫苗，隨後被證明是安全且具免疫原性(Edelman等人, 1994)。然而，普通的多醣本身不具有足夠的免疫原性來展開及維持長期有效的記憶反應，且必須經常與蛋白質共軛才有效。開發24價KP多醣共軛物疫苗是複雜且具挑戰性的，因為將24種糖共軛物組合成一種疫苗可能需要平衡由每種組分引發的免疫原性。
由於其內毒素特性，LPS被認為在敗血症的病理學中是重要的。直到最近，克雷白氏菌LPS O抗原一般被認為被CPS掩蔽且因而未暴露在細菌表面上。然而有若干研究展現出，在表現特定莢膜血清型的菌株中，O抗原的表面暴露和抗體可及性(Tomas等人, 1988)。與K抗原相反，僅知道有8種O型，O1為臨床分離株中最常發現到的O型。四種KP分離物(O1, O2, O3, O5)佔了大多數的臨床分離株(Hansen等人, 1999)。已有報告指出，在致死性內毒素血症的小鼠模型中施與針對克雷白氏菌O1抗原的單株抗體(mAb)係具有保護性(Mandine等人, 1990)。
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含克雷白氏菌第3型線毛蛋白或多肽。與其它纖毛不同，第3型線毛會凝集已用丹寧處理過的紅血球。雖然其名稱「具甘露糖抗性之克雷白氏菌樣的血球凝集素(MR/K-HA)」暗指這種纖毛類型僅由克雷白氏菌合成，後來的研究展現了第3型線毛會在許多腸道屬中出現(Clegg及Gerlach, 1987)。此外，第3型線毛在全部腸內細菌屬中係明顯不一致，因為血清學研究顯示出相當的抗原多樣性(Old及Adegbola, 1985)。最初被描述為棲息在植物根部之克雷白氏菌的黏附胞器，後來發現這些線毛能夠結合各種人類細胞。表現第3型線毛之克雷白氏肺炎菌菌株係黏附於內皮細胞、呼吸道上皮細胞及尿道上皮細胞(Hornick等人, 1992; Tarkkanen等人, 1997; Würker等人, 1990)。在腎臟中，這些線毛介導細菌黏附於管狀基底膜、鮑氏囊(Bowman’s capsule)及腎血管上(Tarkkanen等人, 1990)。MrkA為第III型線毛複合物的主要蛋白質，且與宿主細胞附著和生物膜形成有關(Murphy及Clegg, 2012)，此為細菌病原體用於建立感染的策略(Burmolle等人, 2008)。先前顯示出是MrkA促進生物膜的形成而不是黏著素(MrkD) (Langstraat等人, 2001)。MrkA抗原在不同的KP分離株之中展現出高度的序列保守性，且通常可作為細胞外的標靶而可接近(Wang等人, 2016)。來自於兩個最主要的致病性分離株克雷白氏肺炎菌及產酸克雷白氏菌之MrkA係展現出95%的同源性。另外，於腸內桿菌科家族的代表性成員中之MrkA同源性係＞90%，因此這些序列數據暗示了研發基於MrkA之抗克雷白氏肺炎菌及泛革蘭氏陰性細菌策略的潛在機會。克雷白氏肺炎菌多醣
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一或多種克雷白氏肺炎菌多醣。除CPS (例如，K抗原)之外，OPS是另一個重要的克雷白氏肺炎菌毒力因子。至少存在有9種克雷白氏肺炎菌OPS亞型，其每一者有不同的多醣化學結構。在一些實施例中，OPS多醣係包含在本文所述免疫複合物之中。本文中所使用之每一個血清型名稱是根據世界衛生組織(WHO)之大腸桿菌與克雷白氏菌參考與研究合作中心所指定。
在一些實施例中，免疫原性複合物係包含一或多種克雷白氏菌多醣，所述多醣可以是或是衍生自一或多種選自以下之克雷白氏肺炎菌血清型：O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12。在一些實施例中，免疫複合物包含來自或衍生自一或多種血清型O1、O2、O3及O5或其組合之克雷白氏菌多醣。在一些實施例中，免疫複合物包含來自或衍生自血清型O1、O2、O3及O5中之每一者的克雷白氏菌多醣。
在一些實施例中，免疫原性複合物係包含一或多種克雷白氏菌多醣，所述多醣可以是或是衍生自OPS。在一些實施例中，OPS係為或衍生自克雷白氏菌血清型O1、O2、O3、O5以及其變異體或組合。在一些實施例中，免疫複合物包含選自或衍生自一或多種血清型O1、O2、O3及O5或其組合之克雷白氏菌OPS。在一些實施例中，免疫複合物包含來自或衍生自血清型O1、O2、O3及O5中之每一者的克雷白氏菌OPS。
在一些實施例中，免疫原性複合體包含一或多種克雷白氏菌多醣，所述多醣可以是或衍生自CPS。在一些實施例中，CPS係為或是衍生自克雷白氏菌K1、K2、K10、K16及K19。在一些實施例中，CPS係為或是衍生自克雷白氏菌K19。 克雷白氏肺炎菌多肽
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合體包含一或多種克雷白氏肺炎菌多肽。在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或衍生自克雷白氏肺炎菌第I型纖毛蛋白或其免疫原性片段。在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或包括公開於Gerlach等人, 2012, J Bacteriology之SEQ ID NO:1多肽。在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或包括一與SEQ ID NO:1序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽，或其免疫原性片段。
克雷白氏肺炎菌第I型纖毛蛋白SEQ ID NO:1 MKIKTLAMIVVSALSLSSTAALADTTTVNGGTVHFKGEVVNAACAVDAGSIDQTVQLGQVRSAKLATAGSTSSAVGFNIQLDDCDTTVATKASVAFAGTAIDSSNTTVLALQNSAAGSATNVGVQILDNTGTPLALDGATFSAATTLNDGPNIIPFQARYYATGAATAGIANADATFKVQYE
在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或衍生自克雷白氏肺炎菌保守的第III型纖毛蛋白MrkA或其免疫原性片段。在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或包括SEQ ID NO:2的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或包括一與SEQ ID NO:2序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽，或其免疫原性片段。
克雷白氏肺炎菌保守的第III型纖毛蛋白MrkA SEQ ID NO:2 MKKVLLSAAMATAFFGMTAAHAADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQ
在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或衍生自克雷白氏肺炎菌第III型纖毛蛋白MrkA或其免疫原性片段，例如具有重複序列以對於MrkA單體蛋白提供穩定交互作用。在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或包括SEQ ID NO:3的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，克雷白氏肺炎菌多肽係為或包括一與SEQ ID NO:3序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽，或其免疫原性片段。
克雷白氏肺炎菌穩定的第III型纖毛蛋白MrkA SEQ ID NO:3 ADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVS假單胞菌
假單胞菌為HAI感染的主要成因，特別是在因嗜中性白血球缺乏症而免疫功能降低及機械通氣的患者中，且其為囊腫性纖維化患者死亡的主要原因。假單胞菌感染亦涉及燒傷、眼（例如，角膜）損傷、創傷等。因此，在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物包含一或多種假單胞菌多醣及/或多肽。
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物包含假單胞菌O抗原。Wellcome Research提供了開發基於此抗原的疫苗的大部分早期工作，將含有20種O-抗原血清型中的16種之純化萃取物組合到PEV-1疫苗中。1976年至1984年之間共發表了5個1-2期臨床試驗的結果(Jones等人, 1976, 1978, 1979, 1980; Langford及Hiller, 1984)。疫苗安全性數據指出其都有良好耐受性。在正常志願者及燒傷或囊腫性纖維化(CF)患者的接種組中的血清轉換似乎相對一致。疫苗接種對燒傷拓殖具有從很小或沒有效果到有顯著效果的不同效果。在一項研究中的血液培養顯示，因為接種疫苗而降低了近10倍。在每一個燒傷患者的研究中，儘管綠膿桿菌導致的死亡人數並不總是很明顯，但死亡率卻下降到70%至100%不等。在CF的研究中(Langford及Hiller, 1984)，疫苗接種似乎對綠膿桿菌拓殖沒有臨床益處也沒有差異，且抗體ELISA效價與臨床或細菌學讀數之間沒有相關性。瑞士血清研究院、Berna Biotech及Crucell公司開發了一種八價O-抗原-外毒素A共軛疫苗(Aerugen)，該疫苗經歷了三次公開的1-2期臨床試驗(Schaad等人, 1991; Lang等人, 1995; Cryz等人, 1994)。他們的肌內(IM)施用疫苗似乎有良好的耐受性，且在所有的研究中認為其對所有血清型的血清轉換都是顯著的。在大部分的研究中，疫苗接種導致了拓殖顯著減少，且在疫苗或安慰劑組中未有PA相關死亡的報告。在Crucell公司於CF患者中對476位患者的第3期研究中，疫苗並未達到先前研究中所觀察到的期望指標或重複結果。
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含假單胞菌鞭毛或其抗原性部分。早期研究的功效研究(Holder等人, 1982; Holder及Naglich, 1986; Montie等人, 1987)已證實，a型或b型鞭毛可在鼠類燒傷模型中提供特定類型之免於死亡的保護，但b型鞭毛似乎更擅於如此。在臨床前研究中，IMMUNO AG公司(Crowe等人, 1991)係使用由a0、a0a1a2、a0a2、a0a3、a0a3a4及b型鞭毛組成的個別疫苗來判定b抗原似乎是更好的免疫原，在免疫功能降低的小鼠模型中提供高於a型製劑的高保護率。相同論文中的第1期研究顯示出，這些免疫源皆引發高效價且持久的血清抗體，如同後續的第2期研究(Döring等人, 1995)中的單一b型免疫原，其也顯示了支氣管肺泡洗液中有IgG、IgA及sIgA血清轉換。在CF患者（第3期）中施與結合型的a型(a0a1a2) + b型鞭毛疫苗會產生高效價且持久的血清IgG。然而，儘管有一些針對綠膿桿菌肺感染的保護功效，與該疫苗不相關之血清型的存在卻使結果的闡釋蒙上了陰影(Döring及Dorner, 1997; Döring等人, 2007)。在一篇後續的評論中，Döring及Pier (2008)暗示了二價鞭毛疫苗可能不是最好的，並且說了，於包含b型鞭毛和所有a型亞型之單一疫苗中似乎不存有數據。
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合體係包含假單胞菌鞭毛蛋白或其抗原性片段。在對鞭毛次單元的研究中，鞭毛蛋白沒有超越研究階段。該等研究已包含純化的鞭毛蛋白(Campodonico等人, 2010; Faezi等人, 2013)、具有鞭毛蛋白之DNA疫苗(Saha等人, 2007)、以及鞭毛蛋白/聚甘露糖醛酸共軛物(Campodonico等人, 2011)。儘管這些皆具免疫原性及保護性，其似乎未達到鞭毛製劑所實現的程度。也已用抗b型血清(Barnea等人, 2006)、mAb抗a型(Barnea等人, 2009)及抗a型血清(Faezi等人, 2011)來研究被動預防接種。全部的製劑均顯示在小鼠燒傷模型中的死亡減少。
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含假單胞菌PcrV (分泌第III型)或其抗原性片段。與疾病嚴重程度相關的關鍵毒力因子為綠膿桿菌第III型分泌系統(T3SS)，其將細菌毒素直接注入宿主細胞的細胞質內。位於T3SS注射體(injectisome)複合物末梢處的PcrV蛋白對於T3SS功能是必需的，且在靶向綠膿桿菌之免疫預防策略的動物模型中是一個經過充分驗證的標靶。基於先前對於PcrV的基礎，在各種動物模型中主動及被動預防接種(Sawa等人, 1999; Holder等人, 2001; Shime等人, 2001; Frank等人, 2002)皆顯示出保護性，KaloBios公司已開發了「Humaneered，具高親和力之聚乙二醇化Fab'」(KB-001)，其在臨床前(Baer等人, 2009)及臨床試驗(Francois等人, 2012; Milla等人, 2014)中做為被動療法進行調查研究。在小鼠及「人類改造的(humaneered)」mAbs及其Fab’片段在動物研究中證實是有效的同時，使用KB-001的臨床試驗則顯示出在綠膿桿菌之拓殖數量、症狀或肺功能測定之間並無顯著差異，並且，用於在囊腫性纖維化患者中治療綠膿桿菌感染之新改良版本的KB-001於第2期人類臨床試驗中並未達到其主要指標(ClinTrials.gov, 2014)。直到本揭露內容之前，關於以PcrV蛋白抗原做為活性疫苗使用的工作做得很少。
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含假單胞菌外多醣。在一些實施例中，本文中所述之免疫複合物係包含假單胞菌PsL。此外多醣對於綠膿桿菌附接至哺乳動物細胞，以及對於由非黏液樣與黏液樣綠膿桿菌分離株所產生的生物膜之形成及維持生物膜是重要的。PsL多醣的功能為將生物膜細胞維持在一起，因此在黏附上PsL扮演了重要的角色(Ma等人, 2006)。功能性的篩選顯示出針對PsL表位的mAb在OPK及細胞黏附測試中會展現出極佳的活性，並在多個動物模型中會賦予顯著的保護性。
多醣PsL為一種抗體可接近的非血清型依存性表面結構特徵，且其在非黏液樣與黏液樣臨床分離株中普遍存在(DiGiandomenico等人, 2012)。在動物中，PsL抗體係於效應細胞的存在下介導OPK，並抑制綠膿桿菌結合到上皮細胞。PsL推定的特異性mAb Cam-003係以劑量依存性方式在小鼠的器官中被動進行保護及降低細菌承載量(DiGiandomenico等人, 2012)。Cam-003在小鼠肺炎模型中對於多種綠膿桿菌血清型亦具有保護性。類似的結果係可在劃傷的角膜或燒傷的小鼠模型中獲得，在這兩個例子，Cam-003都能有效減少感染。MEDI 3902是一種靶向非血清型依存性TTSS毒力因子PcrV與持久性因子PsL外多醣之雙特異性抗體(DiGiandomenico等人, 2014)。將MEDI 3902用於預防由假單胞菌引起的肺炎(呼吸器相關肺炎)之第1期安全試驗係已經完成(https://clinicaltrials.gov/NCT02255760)。直到本揭露內容之前，關於以PsL外多醣抗原做為活性疫苗使用的工作做得很少。 綠膿桿菌多醣
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一或多種綠膿桿菌多醣。由 IATS方法已知大約有20種的O-抗原血清型。該分子的O-抗原多醣對於疫苗的開發提供了無毒性的潛在目標。在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一或多種假單胞菌OPS、LPS及/或外多醣。在一些實施例中，LPS衍生的多醣為OPS。在一些實施例中，LPS衍生的多醣為COPS。
在一些實施例中，免疫原性複合物係包含一或多種假單胞菌多醣，所述多醣係為或衍生自一或多種選自O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19及O20之綠膿桿菌血清型(IATS)。在一些實施例中，免疫原性複合物係包含一或多種假單胞菌多醣，所述多醣係為或衍生自一或多種選自O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10及O11或其組合之綠膿桿菌血清型。在一些實施例中，免疫原性複合物係包含複數假單胞菌多醣，所述多醣係為或衍生自選自O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10及O11綠膿桿菌血清型中之每一者。
在一些實施例中，免疫原性複合物係包含一或多種假單胞菌多醣，所述多醣係為或衍生自OPS。在一些實施例中，所述OPS係為或衍生自第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19及O20型或其組合之假單胞菌。在一些實施例中，所述OPS係為或衍生自第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10或O11型或其組合之假單胞菌。在一些實施例中，所述OPS係為或衍生自第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10或O11型假單胞菌。
在一些實施例中，免疫原性複合物係包含一或多種假單胞菌多醣，所述多醣係為或衍生自莢膜或莢膜樣細胞外多醣。在一些實施例中，該莢膜或莢膜樣多醣係為或衍生自假單胞菌海藻酸鹽、Psl或Pel。
在一些實施例中，免疫原性複合物係包含一或多種假單胞菌多醣，所述多醣係為或衍生自外多醣。在一些實施例中，該外多醣係為或衍生自PsL。在一些實施例中，該PsL係包括至少一表位與一單株抗體結合，該單株抗體包括SEQ ID NO:4及/或SEQ ID NO:5。在一些實施例中，結合PsL的至少一表位的單株抗體係為或包括一與SEQ ID NO:4序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽，或其PsL結合片段。在一些實施例中，結合PsL的至少一表位的單株抗體係為或包括一與SEQ ID NO:5序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽，或其PsL結合片段。在一些實施例中，結合PsL的至少一表位的單株抗體係為或包括一與SEQ ID NO:4序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽或其PsL結合片段，以及一與SEQ ID NO:5序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽或其PsL結合片段。
PsL中結合Cam-003 mAb的序列SEQ ID NO:4 QVRLQQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSTSPYFWSWLRQPPGKGLEWIGYIHSNGGTNYNPSLKSRLTISGDTSKNQFSLNLSFVTAADTALYYCARTDYDVYGPAFDIWGQGTMVTV
PsL中結合Cam-003 mAb的序列SEQ ID NO:5 SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVL 綠膿桿菌多肽
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一或多種綠膿桿菌多肽。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或衍生自綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A1或其免疫原性片段。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或包括SEQ ID NO:6之多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或包括一與SEQ ID NO:6序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽或其免疫原性片段。
綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A1 SEQ ID NO:6 MALTVNTNIASLNTQRNLNNSSASLNTSLQRLSTGSRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRMRDLSLQSANGSNSDSERTALNGEVKQLQKELDRISNTTTFGGRKLLDGSFGVASFQVGSAANEIISVGIDEMSAESLNGTYFKADGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFSDGDTISYVSKAGKDGSGAITSAVSGVVIADTGSTGVGTAAGVTPSATAFAKTNDTVAKIDISTAKGAQSAVLVIDEAIKQIDAQRADLGAVQNRFDNTINNLKNIGENVSAARGRIEDTDFAAETANLTKNQVLQQAGTAILAQANQLPQSVLSLLR
在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或衍生自綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B或其免疫原性片段。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或包括SEQ ID NO:7之多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或包括一與SEQ ID NO:7序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽或其免疫原性片段。
綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B SEQ ID NO:7 MALTVNTNIASLNTQRNLNASSNDLNTSLQRLTTGYRINSAKDDAAGLQISNRLSNQISGLNVATRNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRIRDLALQSANGSNSDADRAALQKEVAAQQAELTRISDTTTFGGRKLLDGSFGTTSFQVGSNAYETIDISLQNASASAIGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSVASVDISTADGAQNAIAVVDNALAAIDAQRADLGAVQNRFKNTIDNLTNISENATNARSRIKDTDFAAETAALSKNQVLQQAGTAILAQANQLPQAVLSLLR
在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或衍生自綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B之缺少TLR5結合模體的D2結構域或其免疫原性片段。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或包括SEQ ID NO:10之多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或包括一與SEQ ID NO:10序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽或其免疫原性片段。
綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B之缺少TLR5結合模體的鞭毛蛋白D2結構域SEQ ID NO:10 GSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSS
在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或衍生自綠膿桿菌第III型分泌系統(TTSS)毒力因子PcrV或其免疫原性片段。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或包括SEQ ID NO:8之多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，綠膿桿菌多肽係為或包括一與SEQ ID NO:8序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽或其免疫原性片段。
綠膿桿菌第III型分泌系統(TTSS)毒力因子PcrV SEQ ID NO:8 MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI大腸桿菌
即使採用最佳的抗微生物劑治療及支持性照護，與大腸桿菌敗血症相關的死亡率為20%-40% (Grandsen等人, 1990; Kreger等人, 1980; Rayner and Willcox, 1988; Bryan等人, 1983; Cross等人, 1983)。明顯需要有新的預防及治療方法，包含用這些及其他革蘭氏陰性細菌的抗體進行輔助治療。儘管O-抗原特異性抗體可針對同源細菌菌株感染進行保護，鑒於革蘭氏陰性細菌的血清型多樣性，研究人員認為用這類抗體的免疫治療的價值有限(Baumgartner, 1990)。然而，與腸外侵入性大腸桿菌感染相關的細菌血清型的流行病學調查顯示，數量有限的O血清群係佔了菌血症病例的近60% (Grandsen等人, 1990; Cross等人, 1984; McCabe等人, 1978)。因此，仍需要有效的技術來預防及/或治療這類感染。純化多醣之方法
在一些實施例中，本揭露係提供從一或多種細菌的細胞組分來純化本文所述之一或多種多醣。在一些實施例中，該等方法係涉及從一或多種細菌的細胞組分來純化O-抗原多醣。在一些實施例中，該等方法係涉及從一或多種細菌的細胞組分來純化CPS。
在一些實施例中，該細菌為革蘭氏陰性細菌。在一些實施例中為克雷白氏肺炎菌、綠膿桿菌及大腸桿菌。
在一些實施例中，該細胞組分係包含蛋白質。在一些實施例中，該細胞組分係包含核酸。在一些實施例中，該細胞組分係包含脂質。在一些實施例中，該細胞組分係包含多醣。在一些實施例中，該細胞組分係包含部分的溶胞產物。
在一些實施例中，從細菌的一或多個細胞組分純化多醣之方法係包括使細胞組分與氧化劑及酸接觸以得到一混合物。在一些實施例中，該氧化劑包括亞硝酸納。在一些實施例中，該酸為乙酸。在一些實施例中，該混合物的pH係介於約3及約5之間。在一些實施例中，該方法包括從該混合物中的一或多個細胞組分中分離出O-抗原多醣。在一些實施例中，分離的OPS於其還原末端含有游離醛。在一些實施例中，分離的OPS係含有於其還原末端含有游離醛之2,5-脫水甘露糖殘基。在一些實施例中，該方法包括提取OPS，其中經提取的OPS基本上不含有一或多種其他細胞組分。在一些實施例中，經提取的OPS於其還原末端含有游離醛。在一些實施例中，經提取的OPS於其還原末端含有游離醛之2,5-脫水甘露糖殘基。
在一些實施例中，從革蘭氏陰性細菌的一或多個細胞組分純化多醣之方法係包括使細胞組分與酸性試劑接觸以得到一混合物。在一些實施例中，該混合物的pH係介於約3及約5之間。在一些實施例中，該方法包括將該混合物加熱至約80°C至約135°C之間。在一些實施例中，該方法包括從該混合物中之一或多種細胞組分中分離出核部及O-抗原多醣(COPS)。在一些實施例中，經分離的COPS於其還原末端含有KDO。在一些實施例中，經分離的COPS於其還原末端含有酮於KDO內。在一些實施例中，該方法包括提取COPS，其中經提取的COPS基本上不含有一或多種其他細胞組分。在一些實施例中，經提取的COPS於其還原末端含有酮。親和分子對
如本文中所述，在一些實施例中，本揭露之免疫複合物係包含與一或多種聚合物及/或一或多種抗原性多醣非共價錯合之一或多種多肽。在一些實施例中，一或多種多肽係經由與一或多種聚合物及/或一或多種抗原性多醣的親和相互作用而進行錯合。在一些實施例中，本揭露之免疫複合物係包含使用一或多種親和分子/互補親和分子對，而與一或多種聚合物及/或一或多種抗原性多醣非共價錯合之一或多種多肽。在一些實施例中，免疫複合物係包含(i)本文中所述之第一親和分子，其係與一或多種聚合物共軛及/或與一或多種抗原性多醣共軛；以及(ii)融合蛋白，其係為或包括本文中所述之互補親和分子及多肽。當該第一親和分子與該互補親和分子結合時，所述一或多種多肽係與所述一或多種聚合物及/或一或多種抗原性多醣非共價錯合。
在一些實施例中，該親和分子/互補親和分子對係選自生物素/生物素結合蛋白、抗體/抗原、酶/基質、受體/配體、金屬/金屬結合蛋白、碳水化合物/碳水化合物結合蛋白、脂質/脂質結合蛋白、及His標籤/His標籤結合分子中之一或多者。
在一些實施例中，該該第一親和分子為生物素（或其衍生物或片段），且該互補親和分子為生物素結合蛋白或其生物素結合域。於一些實施例中，該生物素結合蛋白為利查維啶(rhizavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)、巴達維啶(bradavidin)、塔馬維啶(tamavidin)、倫蒂維啶(lentiavidin)、西勃維啶(zebavidin)、中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)、生物素連接蛋白(CaptAvidin™)、或其生物素結合片段、或其組合。在一些實施例中，該生物素結合片段為利查維啶或其生物素結合片段。在一些實施例中，生物素結合蛋白係包括SEQ ID NO:13之多肽或其生物素結合片段。在一些實施例中，生物素結合蛋白係包括SEQ ID NO:14之多肽或其生物素結合片段。融合蛋白
在一些實施例中，本文中所述之免疫複合物包含一係為或包括本文中所述之互補親和分子之融合蛋白，以及本文中所述之一或多種多肽。在一些實施例中，這類融合蛋白具有載體及/或抗原性特性。在一些實施例中，融合蛋白係為或包括生物素結合蛋白或其生物素結合結構域，以及多肽。
在一些實施例中，該生物素結合蛋白包括SEQ ID NO:13之多肽或其生物素結合片段。在一些實施例中，該多肽係為或包括一與SEQ ID NO:13序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽或其生物素結合片段。在一些實施例中，該生物素結合蛋白包括SEQ ID NO:14之多肽或其生物素結合片段。在一些實施例中，該多肽係為或包括一與SEQ ID NO:14序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之多肽或其生物素結合片段。
在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）及一或多種衍生自克雷白氏肺炎菌、綠膿桿菌及大腸桿菌中之一或多者的多肽。
在一些實施例中，融合蛋白係包括一或多種連接子及/或組胺酸標籤。在一些實施例中，連接子係包括一包括有SEQ ID NO:15之胺基酸序列(GGGGSSS)的多肽。在一些實施例中，連接子係包括一與SEQ ID NO:15序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列的多肽。
在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FlaB鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:6序列（綠膿桿菌FlaA1鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:9序列（綠膿桿菌FlaA2鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。
在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:10序列（綠膿桿菌FlaB鞭毛蛋白之缺少TLR5結合模體的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:11序列（綠膿桿菌FlaA1鞭毛蛋白之缺少TLR5結合模體的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:12序列（綠膿桿菌FlaA2鞭毛蛋白之缺少TLR5結合模體的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌第III型分泌系統(TTSS) PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。
在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及一包括有與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，融合蛋白係包括一包括有與SEQ ID NO:23序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:10序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B之缺少TLR5結合模體的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及一包括有與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，融合蛋白係包括一包括有與SEQ ID NO:26序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。
在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FliC亞型B鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及一包括有與SEQ ID NO:2序列（克雷白氏肺炎菌之保守型MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。
在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:10序列（綠膿桿菌FliC亞型B鞭毛蛋白之缺少TLR5結合模體的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及一包括有與SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌之穩定型MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。在一些實施例中，融合蛋白係包括SEQ ID NO:24之多肽。
在一些實施例中，融合蛋白係包括本文中所述之互補親和分子（例如本文中所述之生物素結合蛋白）以及一包括有與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段以及一包括有與SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌之穩定型MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽或其免疫原性片段。主鏈聚合物
如本文中所述，在一些實施例中，本揭露之免疫複合物係包含一主鏈聚合物，該主鏈聚合物包括有一與一或多種抗原性多醣共軛之聚合物。在一些實施例中，該聚合物係為或包括多醣、多肽或合成樹枝狀聚合物。在一些實施例中，該聚合物係為或包括聚L-離胺酸(PLL)。在一些實施例中，該聚合物係為或包括線性PLL，或L-離胺酸樹枝狀聚合物。在一些實施例中，該聚合物係為衍生自革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌之CPS。在一些實施例中，該CPS為克雷白氏肺炎菌CPS、綠膿桿菌外多醣及/或大腸桿菌CPS。在一些實施例中，該聚合物為KP K19 CPS。在一些實施例中，該聚合物為合成單醣或寡醣之樹枝狀聚合物。在一些實施例中，該聚合物的大小為約50 KDa至約2000 KDa。在一些實施例中，該聚合物具有抗原性特性。在一些實施例中，該聚合物不具有抗原性。在一些實施例中，該聚合物係為或包括一或多種抗原性多醣。在一些實施例中，該一或多種抗原性多醣係可為克雷白氏肺炎菌OPS、綠膿桿菌OPS或其組合。主鏈聚合物 1 (BP-1)
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一主鏈聚合物，該主鏈聚合物包括有一與一或多種抗原性多醣共軛之聚合物。在一些實施例中，主鏈聚合物係包含一與該聚合物共軛（例如交連或共價鍵結）之本文中所述之第一親和分子（例如生物素）。在一些實施例中，該聚合物為多醣。在一些實施例中，該抗原性多醣為O-抗原多醣、核部-O-抗原、或核部多醣。在一些實施例中，該主鏈聚合物包含至少一生物素化的聚合物（例如多醣）以及至少一非生物素化的抗原性多醣（例如至少一O-抗原多醣）。
在一些實施例中，包含有至少一生物素化的聚合物（例如生物素化的多醣）及至少一非生物素化的O-抗原多醣之主鏈聚合物的產生係藉由將一含有一級胺基（天然的或具有一連接子）之非生物素化的O-抗原多醣與一含有醛基之部分氧化的多醣以及與一含有一級胺之生物素結合得到一混合物；並且用還原劑還原胺化該混合物以將該O-抗原多醣（即抗原性多醣）與該多醣（即聚合物）化學連結，藉以形成包含有一與非生物素化的抗原性多醣（即非生物素化的O-抗原多醣）化學鍵結之生物素化多醣的主鏈聚合物。
在一些實施例中，該O-抗原多醣係通過間隔體而與一部分氧化的聚合物（例如多醣）化學鍵結。在一些實施例中，該間隔體為短間隔體。在一些實施例中，該短間隔體在間隔體的每一末端係含有一級胺。在一些實施例中，該間隔體係可為己二酸二醯肼。在一些實施例中，該聚合物（例如多醣）係經生物素化，而所化學鍵結的O-抗原多醣係非經生物素化。
在一些實施例中，O-抗原多醣係包括一級胺基。在一些實施例中，該一級胺基為綠膿桿菌外核O-多醣之L-丙胺酸α-胺基群，或為藉由用還原劑進行還原胺化以與一在各末端含有一級胺基之間隔體分子化學鍵結而已引入到該O-抗原多醣的還原端內之胺基團。在一些實施例中，包括有一級胺基之O-抗原多醣的化學鍵結係藉由將包括有一級胺基的O-抗原多醣與一含有醛基之部分氧化的聚合物（例如多醣）以及與一含有一級胺之生物素混合得到一混合物；並且用還原劑還原胺化該混合物以形成一主鏈聚合物，其中該聚合物（例如多醣）係經生物素化，而所化學鍵結的O-抗原多醣係非經生物素化。
在一些實施例中，該聚合物（例如多醣）係用氧化劑進行部分氧化。在一些實施例中，該氧化劑係包括過碘酸鈉。在一些實施例中，該還原劑係包括氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉。主鏈聚合物 1.2 (BP-1.2)
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一主鏈聚合物，該主鏈聚合物包括有一與一或多種抗原性多醣共軛之聚合物。在一些實施例中，主鏈聚合物係包含一與該聚合物共軛（例如交連或共價鍵結）之本文中所述之第一親和分子（例如生物素）。在一些實施例中，該聚合物為多醣。在一些實施例中，該抗原性多醣為O-抗原多醣、核部-O-抗原、或核部多醣。在一些實施例中，該主鏈聚合物包含至少一生物素化的聚合物（例如多醣）以及至少一非生物素化的抗原性多醣（例如至少一O-抗原多醣）。
在一些實施例中，包含有至少一生物素化的聚合物（例如生物素化的多醣）及至少一非生物素化的O-抗原多醣之主鏈聚合物的產生係藉由將一含有一級胺基（天然的或具有一連接子）之非生物素化的O-抗原多醣與一含有一或多種醛基之部分氧化的多醣結合，及藉由與碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)一起反應及使用該多醣之糖醛酸殘基的羧酸鹽而使一或多個生物素殘基被引入正交位置，並且用還原劑還原胺化該混合物以將該O-抗原多醣（即抗原性多醣）與該多醣（即聚合物）化學連結，藉以形成包含有一與非生物素化的抗原性多醣（即非生物素化的O-抗原多醣）化學鍵結之生物素化多醣的主鏈聚合物。在一些實施例中，該O-抗原多醣係通過間隔體而與一部分氧化的聚合物（例如多醣）化學鍵結。在一些實施例中，該間隔體為短間隔體。在一些實施例中，該短間隔體在間隔體的每一末端係含有一級胺。在一些實施例中，該間隔體係可為己二酸二醯肼。在一些實施例中，該聚合物（例如多醣）係經生物素化，而所化學鍵結的O-抗原多醣係係非經生物素化。
在一些實施例中，O-抗原多醣係包括一級胺基。在一些實施例中，該一級胺基為綠膿桿菌外核O-多醣之L-丙胺酸α-胺基群，或為藉由用還原劑進行還原胺化以與一在各末端含有一級胺基之間隔體分子化學鍵結而已引入到該O-抗原多醣的還原端內之胺基團。在一些實施例中，包括有一級胺基之O-抗原多醣的化學鍵結係藉由將包括有一級胺基的O-抗原多醣與一含有醛基之部分氧化的聚合物（例如多醣）以及與一含有一級胺之生物素混合得到一混合物；並且用還原劑還原胺化該混合物以形成一主鏈聚合物，其中該聚合物（例如多醣）係經生物素化，而所化學鍵結的O-抗原多醣係非經生物素化。
在一些實施例中，該聚合物（例如多醣）係用氧化劑進行部分氧化。在一些實施例中，該氧化劑係包括過碘酸鈉。在一些實施例中，該還原劑係包括氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉。
在一些實施例中，包括有醛或酮之OPS係藉由與氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)還原胺化，使用一在各末端含有一級胺的短間隔體（例如己二酸二醯肼ADH）在其還原末端進行胺化，以產生醯肼衍生的OPS。在一些實施例中，藉由使該多醣的糖醛酸殘基的羧酸鹽與碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及含有一級胺之生物素衍生物（諸如(例如)胺-PEG3-生物素）一起反應，KP19 CPS主鏈係經生物素化且有一或多個生物素殘基被引入於正交位置。在一些實施例中，經生物素化的KP 19 CPS聚合物係接著用過碘酸鹽部分氧化以生成一或多種醛基，與醯肼衍生的OPS混合，且該混合物係用諸如氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)之還原劑進行還原胺化，以形成一在聚合物主鏈之糖醛殘基上包括有一或多個生物素部分而在O-抗原多醣上沒有生物素之主鏈聚合物BP-1.2。主鏈聚合物 1.3 (BP-1.3)
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一主鏈聚合物，該主鏈聚合物包括有一與一或多種抗原性多醣共軛之聚合物。在一些實施例中，主鏈聚合物係包含一與該聚合物共軛（例如交連或共價鍵結）之本文中所述之第一親和分子（例如生物素）。在一些實施例中，該聚合物為多醣。在一些實施例中，該抗原性多醣為O-抗原多醣、核部-O-抗原、或核部多醣。在一些實施例中，該主鏈聚合物包含至少一生物素化的聚合物（例如多醣）以及至少一非生物素化的抗原性多醣（例如至少一O-抗原多醣）。
在一些實施例中，包含有至少一生物素化的聚合物（例如生物素化的多醣）及至少一非生物素化的O-抗原多醣之主鏈聚合物的產生係藉由將一含有一級胺基（天然的或具有一連接子）之非生物素化的O-抗原多醣與一CDAP-活化的多醣結合，及藉由與碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)一起反應及使用該多醣之糖醛酸殘基的羧酸鹽而使一或多個生物素殘基被引入正交位置，藉以形成包含有一與非生物素化的抗原性多醣（即非生物素化的O-抗原多醣）化學鍵結之生物素化多醣的主鏈聚合物。在一些實施例中，該O-抗原多醣係通過間隔體而與一CDAP-活化的聚合物（例如多醣）化學鍵結。在一些實施例中，該間隔體為短間隔體。在一些實施例中，該短間隔體在間隔體的每一末端係含有一級胺。在一些實施例中，該間隔體係可為己二酸二醯肼。在一些實施例中，該聚合物（例如多醣）係經生物素化，而所化學鍵結的O-抗原多醣係係非經生物素化。
在一些實施例中，包括有醛或酮之OPS係藉由與氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)還原胺化，使用一在各末端含有一級胺的短間隔體（例如己二酸二醯肼ADH）在其還原末端進行胺化，以產生醯肼衍生的OPS。在一些實施例中，藉由使該多醣的糖醛酸殘基的羧酸鹽與碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及含有一級胺之生物素衍生物（諸如(例如)胺-PEG3-生物素）一起反應，KP19 CPS主鏈係經生物素化且有一或多個生物素殘基被引入於正交位置。在一些實施例中，經生物素化的KP 19 CPS聚合物係接著用CDAP活化，與醯肼衍生的OPS混合，以形成一在聚合物主鏈之糖醛殘基上包括有一或多個生物素部分而在O-抗原多醣上沒有生物素之主鏈聚合物BP-1.3。主鏈聚合物 2a (BP-2a)
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一主鏈聚合物，該主鏈聚合物包括有一與一或多種抗原性多醣共軛之聚合物。在一些實施例中，主鏈聚合物係包含一與該聚合物共軛（例如交連或共價鍵結）之本文中所述之第一親和分子（例如生物素），且包含一與一或多種抗原性多醣共軛（例如交連或共價鍵結）之本文中所述之第一親和分子（例如生物素）。在一些實施例中，該聚合物為多醣。在一些實施例中，該抗原性多醣為O-抗原多醣。在一些實施例中，該主鏈聚合物包含至少一生物素化的聚合物（例如多醣）以及至少一生物素化的O-抗原多醣。
在一些實施例中，包含有至少一生物素化的聚合物（例如生物素化的多醣）及至少一生物素化的O-抗原多醣之主鏈聚合物的產生係藉由將一含有一級胺基（天然的或具有一連接子）之O-抗原多醣與一含有醛基之部分氧化的聚合物結合以得到一混合物；並且用還原劑還原胺化該混合物以將該O-抗原多醣與該聚合物（例如多醣）化學連結，藉以形成一包含有O-抗原多醣及聚合物（例如多醣）之主鏈聚合物；並用CDAP或另一氰基化試劑（例如CNBr）及一含有一級胺之生物素來衍生化該主鏈聚合物，藉以形成一包含有經生物素化聚合物與經生物素化O-抗原及聚合物多醣化學鍵結之主鏈聚合物（例如經生物素化的多醣）。
在一些實施例中，該O-抗原多醣係通過間隔體而與一部分氧化的多醣主鏈化學鍵結。在一些實施例中，該間隔體為短間隔體。在一些實施例中，該短間隔體在間隔體的每一末端係含有一級胺。在一些實施例中，該間隔體係可為己二酸二醯肼。
在一些實施例中，O-抗原多醣係包括一級胺基。在一些實施例中，該一級胺基為綠膿桿菌外核O-抗原多醣之L-丙胺酸α-胺基群，或為藉由用還原劑進行還原胺化以與一在各末端含有一級胺基之短間隔體分子化學鍵結而已引入到該O-抗原多醣的還原端內之胺基團。
在一些實施例中，該聚合物（例如多醣）係用氧化劑進行部分氧化。在一些實施例中，該氧化劑係包括過碘酸鈉。在一些實施例中，該還原劑係包括氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉。主鏈聚合物 2b (BP-2b)
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一主鏈聚合物，該主鏈聚合物包括有一與一或多種抗原性多醣共軛之聚合物。在一些實施例中，主鏈聚合物係包含一與該抗原性多醣共軛（例如交連或共價鍵結）之本文中所述之第一親和分子（例如生物素）。在一些實施例中，該聚合物為多醣。在一些實施例中，該抗原性多醣為O-抗原多醣。在一些實施例中，該主鏈聚合物包含至少一非生物素化的聚合物（例如多醣）以及至少一生物素化的O-抗原多醣。
在一些實施例中，包含有至少一非生物素化的聚合物（例如非生物素化的多醣）及至少一生物素化的O-抗原多醣之主鏈聚合物的產生係藉由以CDAP及一含有一級胺之生物素將包括有該O多醣重複及一或多種核部α KDO及/或庚醣部分之O-抗原多醣生物素化，以得到經生物素化的O-抗原多醣混合物；以過碘酸鈉部分氧化該經生物素化的OPS混合物以將醛引入核部KDO及/或庚醣部分及/或OPS殘基內；用己二酸二醯肼將該生物素化多醣還原胺化；將經生物素化的及胺化的OPS與一部分氧化的聚合物（例如多醣）混合以形成一混合物；並還原胺化該混合物；藉此形成一含有非生物素化的聚合物（例如多醣）及一生物素化且化學鍵聯的O-抗原多醣之主鏈聚合物。
在一些實施例中，該O-抗原多醣係用氧化劑進行部分氧化。在一些實施例中，該氧化劑係包括過碘酸鈉。在一些實施例中，該還原劑係包括氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉。主鏈聚合物 3 (BP-3)
在一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合物係包含一主鏈聚合物，該主鏈聚合物包括有一與一或多種抗原性多醣共軛之聚合物。在一些實施例中，主鏈聚合物係包含一與該抗原性多醣共軛（例如交連或共價鍵結）之本文中所述之第一親和分子（例如生物素）。在一些實施例中，該聚合物為聚-L-離胺酸(PLL)聚合物。在一些實施例中，該抗原性多醣為O-抗原多醣。在一些實施例中，該主鏈聚合物包含至少一經生物素化的O-抗原多醣以及一PLL聚合物。
在一些實施例中，包含有至少一非生物素化的聚合物（例如非生物素化的PLL聚合物）及至少一生物素化的O-抗原多醣之主鏈聚合物的產生係藉由用PLL聚合物的ε-NH2基團胺化一含有醛末端或KDO之O-抗原多醣以產生OPS PLL聚合物；以醯化劑處理或不處理該混合物，以覆蓋PLL聚合物之未反應的ε-NH2基團；以CDAP將該OPS衍生化以形成一衍生混合物；且將該衍生混合物與一含有一級胺之生物素混合；藉此製造一主鏈聚合物，其中經覆蓋的N-醯化PLL聚合物或未經覆蓋的PLL係未經生物素化，而該化學鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。
在一些實施例中，該醯化劑為醋酸酐或乙醯氯。
在一些實施例中，「點擊化學」係用以將在其羧酸鹽基團上配備有炔官能基或氧化的多醣醛之聚合物（例如多醣）連接到在其末端用疊氮基團衍生的O-抗原多醣。該二多醣之點擊鍵聯係以在水介質中之催化劑進行。 O-抗原多醣與該多醣之點擊鍵聯係可以用一與OPS連接的疊氮基團及與該多醣連接的炔基反向使用，反之亦然。生物素化可以使用此化學選擇性在多醣上產生主鏈聚合物-1或在O-抗原多醣上產生主鏈聚合物-2b。
在一些實施例中，用於炔-疊氮化物環加成反應的催化劑為硫酸銅。在一些實施例中，用以將該多醣衍生化之炔基團係選自由以下組成之群：1-胺基-3-丁炔、1-胺基-4-戊炔、DBCO-胺及炔-PEG4-胺。
在一些實施例中，用以將該O-抗原多醣於其還原末端衍生化之疊氮化物基團係選自由以下組成之群：胺基-PEG-疊氮基、疊氮基-PEG3-胺、疊氮基-丙胺及疊氮基-丁胺。免疫原性複合物之用途
在一些實施例中，本文中所述之包含有一或多種免疫原性多醣之免疫原性複合體的特徵在於，一或多種助噬作用潛勢，該一或多種抗原性多醣之免疫原性，於以ELISA及/或以功能性抗體測定法測量時係相對於一預定程度增加。於一些實施例中，一或多種助噬作用潛勢，或該一或多種抗原性多醣之免疫原性，於以ELISA及/或以功能性抗體測定法測量時係相對於一預定程度增加至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。於一些實施例中，該預定程度為免疫前程度。於一些實施例中，該一或多種抗原性多醣之表位配價係高於天然多醣至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。於一些實施例中，一或多種多肽抗原為用於一或多種抗原性多醣之攜載蛋白。
於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體以ELISA測量係以大於一僅包括有抗原性多醣而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的抗體產生。於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體以ELISA測量係以大於一包括有該主鏈聚合物而非單僅有抗原性多醣之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的抗體產生。
於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體係以大於一僅包括有抗原性多醣而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的免疫反應。於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體係以大於一包括有該主鏈聚合物而非單僅有抗原性多醣之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的免疫反應。於一些實施例中，該免疫反應為抗體或B細胞反應。於一些實施例中，該免疫反應為CD4+ T細胞反應，包含Th1、Th2或Th17反應，或為CD8+ T細胞反應，或為CD4+/CD8+ T細胞反應。於一些實施例中，該免疫反應為抗體或B細胞反應以及T細胞反應。
於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體以ELISA測量係以大於一僅包括有多肽抗原而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的抗體產生。於一些實施例中，該一或多種病原體係選自克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌。於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體係引發對抗克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者的免疫反應。
於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體係引發對抗革蘭氏陰性細菌及/或革蘭氏陽性細菌的免疫反應。於一些實施例中，該革蘭氏陰性細菌係選自克雷白氏菌、假單胞菌、大腸桿菌、及其組合。於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體係引發會辨識表現MrkA的克雷白氏肺炎菌上之天然MrkA的抗體。
於一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合體係包括一或多種多肽抗原。於一些實施例中，該一或多種多肽抗原為細菌多肽、真菌多肽、及/或病毒多肽。於一些實施例中，該一或多種多肽抗原為衍生自克雷白氏菌、假單胞菌及/或大腸桿菌多肽之多肽。
於一些實施例中，該等抗原性多醣中之至少一者為綠膿桿菌外多醣PsL。於一些實施例中，PsL係包括至少一表位與一單株抗體結合，該單株抗體包括一與SEQ ID NO:4序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列及/或一與SEQ ID NO:5序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之序列(Cam-003)。於一些實施例中，至少一多肽抗原包括一與SEQ ID NO:1序列（克雷白氏肺炎菌第I型纖毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。於一些實施例中，至少一多肽抗原係包括一與SEQ ID NO:2序列（克雷白氏肺炎菌保留第III型纖毛蛋白MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列，或一與單體穩定型MrkA SEQ ID NO:3序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。於一些實施例中，至少一多肽抗原係為綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A、綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B、或其免疫原性片段。於一些實施例中，至少一多肽抗原係包括一與SEQ ID NO:6序列（亞型A1）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列、一與SEQ ID NO:9序列（亞型A2）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列，或其免疫原性片段。免疫原性複合體的製造
本揭露係包含用於製造本文中所述之免疫原性複合體的方法。於一些實施例中，製造免疫原性複合體的方法包括將至少一生物素化的主鏈聚合物與至少一生物素結合融合蛋白錯合。於一些實施例中，該融合蛋白包括一與SEQ ID NO:16至26中之任一者有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。疾病、病症及病況
於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體（例如一包括有本文中所述之免疫原性複合體的組成物）以ELISA測量係以大於一包括有抗原性多醣而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的抗體產生。於一些實施例中，所述一或多種病原體係選自克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌。
於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體（例如一包括有本文中所述之免疫原性複合體的組成物）係引發該個體中之抗一或多種病原體的免疫反應。於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體係以大於一包括有抗原性多醣而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，引發該個體中之抗一或多種病原體的免疫反應。於一些實施例中，所述一或多種病原體係選自克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌。
於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體（例如一包括有本文中所述之免疫原性複合體的組成物）係用以治療或預防感染。於一些實施例中，所述感染為燒燙傷感染、GI感染、手術部位感染、尿道感染、角膜感染、皮膚及/或軟組織感染、糖尿病傷口感染、裝置相關感染（例如導管、外科植入物、假體）。於一些實施例中，當施與個體時，本文中所述之免疫原性複合體係用以治療或預防肺炎、敗血症及/或拓殖。免疫原性組成物與製劑
本說明書亦提供了包含有一或多種本文中所述之免疫原性複合體的組成物。例如，免疫原性複合體(例如)疫苗組成物係可包含一或多種本文中所述之免疫原性複合體。於一些實施例中，這類組成物可包含複數種本文中所述之免疫原性複合體之一種類型。另外地或替代性地，這類組程物可包含複數種本文中所述之免疫原性複合體之超過一種的類型。於一些實施例中，本文中所述之免疫原性複合體係配製成一醫藥組成物。於一些實施例中，醫藥組成物可以是疫苗。於一些實施例中，醫藥組成物係包括一醫藥學上可接受的載劑。
於一些實施例中，疫苗組成物係為一多重效價或多價疫苗。於一些實施例中，疫苗組成物的配價係指該疫苗組成物中存在的免疫原性複合物類型數量。本文中所述之疫苗的配價並不侷限於所述醫藥組成物、免疫原性複合物或疫苗中之全部抗原，亦不侷限於施與所述醫藥組成物、免疫原性複合物或疫苗組成物所可能誘導免疫保護反應的病原體菌株數量。於一非限制性的實例中，12價的疫苗組成物可包括超過12種抗原性組成物（例如，肽及/或多糖組成物），且可針對超過12種病原體或致病菌株誘導免疫保護反應。
於一些實施例中，疫苗組成物包括1至50種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括1至25種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括1至15種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括1至10種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括1至5種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗為多重效價疫苗。
於一些實施例中，疫苗組成物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括1種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括2種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括4種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括6種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括8種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括10種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物包括12種類型的免疫原性複合物。於一些實施例中，疫苗組成物在數量上係包括二或多種類型的免疫原性複合物，使得在來自於各個免疫原性組成物的疫苗組成物中之OPS重量有所不同，例如以非約1:1的w/w比例存在。於一些實施例中，疫苗組成物在數量上係包括二或多種類型的免疫原性複合物，使得在來自於各個免疫原性組成物的疫苗組成物中之OPS重量大約相同，例如以約1:1的w/w比例存在。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS重量約為1 μg。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS重量約為2 μg。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS重量約為3 μg。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS重量約為4 μg。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS重量約為5 μg。
於一些實施例中，疫苗組成物在數量上係包括二或多種類型的免疫原性複合物，使得在來自於各個免疫原性組成物的疫苗組成物中之OPS與CPS的總重量有所不同，例如以非約1:1的w/w比例存在。於一些實施例中，疫苗組成物在數量上係包括二或多種類型的免疫原性複合物，使得在來自於各個免疫原性組成物的疫苗組成物中之OPS與CPS的總重量有所不同，例如以非約1:1的w/w比例存在。於一些實施例中，疫苗組成物在數量上係包括二或多種類型的免疫原性複合物，使得在來自於各個免疫原性組成物的疫苗組成物中之OPS與CPS的總重量大約相同，例如以約1:1的w/w比例存在。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS與CPS的總重量約為1 μg。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS與CPS的總重量約為2 μg。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS重量約為3 μg。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS與CPS的總重量約為4 μg。於一些實施例中，在來自於各個免疫原性組成物的疫苗中之OPS與CPS的總重量約為5 μg。
於一些實施例中，疫苗組成物包括二或多種類型之選自以下的免疫原性組成物： (a)包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (c) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (d) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (d’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌 屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (e) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (e’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌 屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (f) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌 屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (f’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (g) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (g’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (h) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (h’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (i) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (j) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (k) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (l) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物包括二或多種類型之選自以下的免疫原性組成物： (a) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (a’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (b) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (c) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (c’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (d) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (d’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (e) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (e’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (f) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (f’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (g) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (g’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (h) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (h’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (i) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (i’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (j) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (j’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (k) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (k’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (l) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (l’) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (c) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (d) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (e) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (f) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (g) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (h) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (i) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (j) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (k) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (l) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (c) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (d) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (e) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (f) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (g) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (h) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (i) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (j) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (k) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (l) 包括有一主鏈聚合物之免疫原性組成物，該主鏈聚合物包括一聚合物，該聚合物包括一生物素化的克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、一與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及一與該經生物素化主鏈聚合物非共價錯合的Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，疫苗組成物包括二或多種類型之選自以下的免疫原性組成物： (a) 包括有KP O1 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (a’) 包括有KP O1 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (b) 包括有KP O2 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (b’) 包括有KP O2 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (c) 包括有KP O3 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (c’) 包括有KP O3 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (d) 包括有KP O5 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (d’) 包括有KP O5 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (e) 包括有PA O1 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (e’) 包括有PA O1 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (f) 包括有PA O2 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (f’) 包括有PA O2 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (g) 包括有PA O3 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (g’) 包括有PA O3 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (h) 包括有PA O4 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (h’) 包括有PA O4 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (i) 包括有PA O5 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (i’) 包括有PA O5 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (j) 包括有PA O6 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (j’) 包括有PA O6 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (k) 包括有PA O10 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物； (k’) 包括有PA O10 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物； (l) 包括有PA O11 OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物；以及 (l’) 包括有PA O11 OPS及FlaBD2- PcrV融合蛋白之免疫原性組成物。
於一些實施例中，一或多種類型的免疫原性組成物係進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括選自以下之免疫原性組成物： (a) 包括有第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之組合的免疫原性組成物；以及 (b) 包括有第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS及FlaBD2-MrkA融合蛋白之組合的免疫原性組成物。
於一些實施例中，一或多種類型的免疫原性組成物係進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，克雷白氏肺炎菌OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一免疫原性組成物，包括： (i) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS及其任意組合；及 (ii) FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及/或 (b) 一免疫原性組成物，其包括： (i) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS及其任意組合；及 (ii) FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，一或多種類型的免疫原性組成物係進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括選自以下之免疫原性組成物： (a) 包括有第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS、FlaBD2-PcrV融合蛋白及FlaBD2-MrkA融合蛋白之組合的免疫原性組成物；以及 (b) 包括有第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS、FlaBD2-PcrV融合蛋白及FlaBD2-MrkA融合蛋白之組合的免疫原性組成物。
於一些實施例中，該疫苗進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該聚合物共軛。於一些實施例中，該聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS；以及 (b) 一或多種多肽，其包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12、或16-26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，該一或多種OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS；以及 (b) 一或多種多肽，其包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12、或16-26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS； (b) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS；以及 (c) 一或多種多肽，其包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12、或16-26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS；以及 (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS；以及 (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS； (b) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS；以及 (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS；以及 (b) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS；以及 (b) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS； (b) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS； (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS、該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS；以及 (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS、該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS； (b) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS；及 (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (d) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該疫苗組成物進一步包括一或多種聚合物。於一些實施例中，OPS係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS、該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共軛；以及 (b) 一或多種多肽，其包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12、或16-26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中，該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS，其中該綠膿桿菌OPS係與一或多種聚合物共軛；以及 (b) 一或多種多肽，其包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12、或16-26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中，該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該一或多種多肽係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種第一聚合物共軛； (b) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS，其中該綠膿桿菌OPS係與一或多種第二聚合物共軛；以及 (c) 一或多種多肽，其包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12、或16-26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中，該一或多種多肽係與該一或多種第一聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種多肽係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種多肽係與該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是相同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是不同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括一來自第一病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括一來自第二病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同的細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為相同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括PLL。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共軛；以及 (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS，其中該綠膿桿菌OPS係與一或多種聚合物共軛；以及 (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共軛； (b) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS，其中該綠膿桿菌OPS係與一或多種第二聚合物共軛；以及 (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白。
於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是相同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是不同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括一來自第一病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括一來自第二病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同的細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為相同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括PLL。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS，其中該綠膿桿菌OPS係與一或多種聚合物共軛；以及 (b) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種第一聚合物共軛； (b) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS，其中該綠膿桿菌OPS係與一或多種第二聚合物共軛；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是相同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是不同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括一來自第一病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括一來自第二病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同的細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為相同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括PLL。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共軛； (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS、該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS，其中該綠膿桿菌OPS係與一或多種聚合物共軛； (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，OPS、該FlaBD2-MrkA融合蛋白及該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種聚合物係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物係包括： (a) 一或多種第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種第一聚合物共軛； (b) 一或多種第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS，其中該綠膿桿菌OPS係與一或多種第二聚合物共軛；及 (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (d) FlaBD2-PcrV融合蛋白。
於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是相同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是不同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括一來自第一病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括一來自第二病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同的細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為相同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括PLL。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括PLL。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛，而該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛，而該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物共軛。
於一些實施例中，疫苗組成物包括二或多種類型之選自以下的免疫原性組成物： (a) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之KP O1 OPS的免疫原性組成物； (a’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之KP O1 OPS的免疫原性組成物； (b) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之KP O2 OPS的免疫原性組成物； (b’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之KP O2 OPS的免疫原性組成物； (c) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之KP O3 OPS的免疫原性組成物； (c’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之KP O3 OPS的免疫原性組成物； (d) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之KP O5 OPS的免疫原性組成物； (d’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之KP O5 OPS的免疫原性組成物； (e) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之PA O1 OPS的免疫原性組成物； (e’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之PA O1 OPS的免疫原性組成物； (f) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之PA O2 OPS的免疫原性組成物； (f’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之PA O2 OPS的免疫原性組成物； (g) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之PA O3 OPS的免疫原性組成物； (g’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之PA O3 OPS的免疫原性組成物； (h) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之PA O4 OPS的免疫原性組成物； (h’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之PA O4 OPS的免疫原性組成物； (i) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之PA O5 OPS的免疫原性組成物； (i’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之PA O5 OPS的免疫原性組成物； (j) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之PA O6 OPS的免疫原性組成物； (j’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之PA O6 OPS的免疫原性組成物； (k) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之PA O10 OPS的免疫原性組成物； (k’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之PA O10 OPS的免疫原性組成物； (l) 包括有與FlaBD2-MrkA融合蛋白共價連接之PA O11 OPS的免疫原性組成物；以及 (l’) 包括有與FlaBD2-PcrV融合蛋白共價連接之PA O11 OPS的免疫原性組成物。
於一些實施例中，疫苗組成物包括二或多種類型之選自以下的免疫原性組成物： (a) 包括有一聚合物、KP O1 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或KP O1 OPS共價連接； (a’) 包括有一聚合物、KP O1 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或KP O1 OPS共價連接； (b) 包括有一聚合物、KP O2 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或KP O2 OPS共價連接； (b’) 包括有一聚合物、KP O2 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或KP O2 OPS共價連接； (c) 包括有一聚合物、KP O3 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或KP O3 OPS共價連接； (c’) 包括有一聚合物、KP O3 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或KP O3 OPS共價連接； (d) 包括有一聚合物、KP O5 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或KP O5 OPS共價連接； (d’) 包括有一聚合物、KP O5 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或KP O5 OPS共價連接； (e) 包括有一聚合物、PA O1 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O1 OPS共價連接； (e’) 包括有一聚合物、PA O1 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O1 OPS共價連接； (f) 包括有一聚合物、PA O2 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O2 OPS共價連接； (f’) 包括有一聚合物、PA O2 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O2 OPS共價連接； (g) 包括有一聚合物、PA O3 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O3 OPS共價連接； (g’) 包括有一聚合物、PA O3 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O3 OPS共價連接； (h) 包括有一聚合物、PA O4 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O4 OPS共價連接； (h’) 包括有一聚合物、PA O4 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O4 OPS共價連接； (i) 包括有一聚合物、PA O5 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O5 OPS共價連接； (i’) 包括有一聚合物、PA O5 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O5 OPS共價連接； (j) 包括有一聚合物、PA O6 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O6 OPS共價連接； (j’) 包括有一聚合物、PA O6 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O6 OPS共價連接； (k) 包括有一聚合物、PA O10 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O10 OPS共價連接； (k’) 包括有一聚合物、PA O10 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O10 OPS共價連接； (l) 包括有一聚合物、PA O11 OPS、與FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O11 OPS共價連接；以及 (l’) 包括有一聚合物、PA O11 OPS、與FlaBD2-PcrV融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或PA O11 OPS共價連接。
於一些實施例中，至少一聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括選自以下的免疫原性組成物： (a) 包括有一聚合物、第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS之組合物、及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接；以及 (b) 包括有一聚合物、第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS之組合物、及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係與該聚合物及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，至少一聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括選自以下的免疫原性組成物： (a) 包括有一或多種第一聚合物、第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS之組合物、FlaBD2-PcrV融合蛋白、及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物的至少一部分及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接，且其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物的至少一部分及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接；以及 (b) 包括有一或多種第二聚合物、第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS之組合物、FlaBD2-PcrV融合蛋白、及FlaBD2-MrkA融合蛋白之免疫原性組成物，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第二聚合物的至少一部分及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接，且其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第二聚合物的至少一部分及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛，且該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物共軛，且該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物共軛。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是相同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物及該一或多種第二聚合物是不同的。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括一來自第一病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括一來自第二病原體之莢膜多醣。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同的細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為相同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該第一病原體及該第二病原體為不同血清型的相同細菌。於一些實施例中，該一或多種第一聚合物係包括PLL。於一些實施例中，該一或多種第二聚合物係包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者；以及 (c) 包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12或16至26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 同一性之胺基酸序列的多肽，其中該多肽係與該一或多種聚合物及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者；以及 (c) 包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12或16至26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 同一性之胺基酸序列的多肽，其中該多肽係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者； (c) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者；以及 (d) 包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12或16至26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 同一性之胺基酸序列的多肽，其中該多肽係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者；以及 (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者；以及 (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者； (c) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者；以及 (d) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者； (c) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者；以及 (d) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者； (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接；以及 (d) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者；以及 (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接；以及 (d) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者； (c) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者；以及 (d) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接；以及 (e) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共價連接；以及 (b) 包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12或16至26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 同一性之胺基酸序列的多肽，其中該多肽係與該聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者，其中該綠膿桿菌OPS係與該一或多種聚合物共價連接；以及 (b) 包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12或16至26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 同一性之胺基酸序列的多肽，其中該多肽係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共價連接； (b) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者，其中該綠膿桿菌OPS係與該一或多種聚合物共價連接；以及 (c) 包括有一與SEQ ID NO: 1-3、6-12或16至26中之一或多者的序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 同一性之胺基酸序列的多肽，其中該多肽係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共價連接；以及 (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者，其中該綠膿桿菌OPS係與該一或多種聚合物共價連接；以及 (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共價連接； (b) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者，其中該綠膿桿菌OPS係與該一或多種聚合物共價連接；以及 (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 一或多種聚合物； (b) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者，其中該綠膿桿菌OPS係與該一或多種聚合物共價連接；以及 (b) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共價連接； (b) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者，其中該綠膿桿菌OPS係與該一或多種聚合物共價連接；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共價連接； (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者，其中該綠膿桿菌OPS係與該一或多種聚合物共價連接； (b) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接；以及 (c) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 第O1、O2、O3、O5型克雷白氏肺炎菌OPS中之一或多者，其中該克雷白氏肺炎菌OPS係與一或多種聚合物共價連接； (b) 第O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型綠膿桿菌OPS中之一或多者，其中該綠膿桿菌OPS係與該一或多種聚合物共價連接； (c) FlaBD2-MrkA融合蛋白，其中該FlaBD2-MrkA融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接；以及 (d) FlaBD2-PcrV融合蛋白，其中該FlaBD2-PcrV融合蛋白係與該一或多種聚合物之至少一部份及/或該等OPS類型中之至少一者共價連接。
於一些實施例中，該一或多種聚合物包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
於一些實施例中，疫苗組成物包括： (a) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之KP O1 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-MrkA融合蛋白的第一免疫原性組成物； (b) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之KP O2 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-PcrV融合蛋白的第二免疫原性組成物； (c) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之KP O3 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-MrkA融合蛋白的第三免疫原性組成物； (d) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之KP O5 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-PcrV融合蛋白的第四免疫原性組成物； (e) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之PA O1 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-PcrV融合蛋白的第五免疫原性組成物； (f) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之PA O2 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-PcrV融合蛋白的第六免疫原性組成物； (g) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之PA O3 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-PcrV融合蛋白的第七免疫原性組成物； (h) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之PA O4 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-PcrV融合蛋白的第八免疫原性組成物； (i) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之PA O5 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-MrkA融合蛋白的第九免疫原性組成物； (j) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之PA O6 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-MrkA融合蛋白的第十免疫原性組成物； (k) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之PA O10 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-MrkA融合蛋白的第十一免疫原性組成物；以及 (l) 包括有一聚合物、與該聚合物共軛之PA O11 OPS、及與該聚合物共價連接之FlaBD2-MrkA融合蛋白的第十二免疫原性組成物。
於一些實施例中，該等聚合物中之至少一者係包括一莢膜多醣。於一些實施例中，該莢膜多醣為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。於一些實施例中，該一或多種聚合物包括PLL。
通過涉及在個體中合適的免疫反應觀察之標準研究可確定特定疫苗的最佳組分含量。在初次接種疫苗後，個體可以適當時間間隔接受一次或數次追加的預防接種。
本文中所述之免疫原性複合物，及/或其製劑，係可配製成單位劑型以易於施用並使劑量一致。任何特定患者或生物體的特定治療有效劑量程度可取決於多種因素，包含感染風險的嚴重程度或程度；所用特定疫苗或疫苗組成物的活性；所用特定疫苗或疫苗組合物的其他特性；年齡、體重、總體健康狀況、個體性別、個體的飲食、個體的藥動性狀況、施用時間（例如，關於個體的其他活動，諸如進食、睡眠、接受包含其他疫苗劑量之其他藥物等）、施與途徑、所用特定疫苗或疫苗組合物的***率；與所用疫苗組合物組合或同時使用的疫苗；以及醫學領域中眾所周知的類似因素。
可以根據已知技術將根據本發明使用的免疫原性複合物配製成組成物（例如，藥物組成物）。疫苗的製備大致上係描述於Vaccine Design (Powell及Newman, 1995)之中。例如，免疫原性數量的疫苗產物係可與一或多種有機或無機、液體或固體之醫藥學上適宜載體材料一起配製。肺炎球菌多醣與共軛疫苗的製備係描述於(例如) 2006年3月31日提交之美國專利申請案第11/395,593號之中，其內容係以引用方式併入本文中。
一般而言，醫藥學上可接受的載體包含溶劑、分散介質等，其與藥物施用相容。例如，可當成醫藥學上可接受的載體之材料包含(但不限於)諸如乳糖、葡萄糖、右旋糖及蔗糖；諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉之澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及醋酸纖維素；粉末黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；諸如可可脂及栓劑蠟之賦形劑；諸如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油之油類；諸如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇之多元醇；諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯之酯類；瓊脂；諸如氫氧化鎂之緩衝劑；海藻酸；無熱原水；等滲透壓鹽水；林格氏液；乙醇、磷酸鹽緩衝液、以及諸如月桂酸硫酸鈉及硬脂酸鎂之其他無毒相容的潤滑劑，以及防腐劑和根據調製者判斷也可存在於該組成物中之抗氧化劑(Martin, 1975)。
疫苗可藉由任何可用的方法將本文中所揭露之一或多種免疫原性複合物與載體及/或其他可選擇的成分組合配製，包含(例如)習用的混合、製粒、溶解、凍乾或類似製程。
可以將用於所提供方法中之疫苗組成物凍乾直至其即將使用時，此時其係以稀釋劑臨場復原。在一些實施例中，疫苗成分或組成物係於一或多種其他組分（例如佐劑）的存在下凍乾，並用鹽水溶液臨場復原。替代性地，可以單獨凍乾及/或儲存個別的組分或一組組分（例如在疫苗接種套組中），將組分復原並在使用前混合或分別施與個體。
凍乾可以產生更穩定的組成物（例如藉由預防或降低多醣抗原的分解）。疫苗或疫苗組分的凍乾法在本領域中是眾所周知的。通常，液體疫苗或疫苗組分通常在抗結塊劑（諸如(例如)，諸如蔗糖或乳糖之糖類）的存在下冷凍乾燥。在一些實施例中，抗結塊劑例如以10-200 mg/ml的初始濃度存在。凍乾通常出現在一系列的步驟中，例如在-69°C下開始一個循環，在3小時內逐漸調整到-24°C，接著保持此溫度18小時，接著在1小時內逐漸調整到-16°C，接著維持此溫度6小時，接著在3小時內逐漸調整到+34°C，最後保持此溫度超過9小時。
根據本發明使用之疫苗或疫苗組分係可併入脂質體、脂質卷、諸如聚丙交酯、聚乙交酯及聚丙交酯-共-乙交酯之可生物降解的聚合物、或免疫刺激複合物(ISCOMS)中。
在某些情況下，可能期望能延長疫苗的效果或根據本發明使用，例如藉由減緩一或多種疫苗組分的吸收。這樣的延遲吸收係可藉由(例如)使用水溶性差的結晶或無定形材料的液體懸浮液來實現。產物的吸收速率接著取決於其溶解速率，而溶解速率又取決於大小及形式。替代性地或另外地，延遲吸收可藉由將一或多種疫苗組分溶解於或懸浮於油性載體中來實現。也可利用可注射的貯存形式來延遲吸收。這類貯存形式可藉由形成具有一或多種疫苗組分的微膠囊基質的可生物降解聚合物網絡來製備。取決於聚合物與疫苗組分的比例，以及所用之特定聚合物的性質，而可控制釋放速率。
可根據本發明而利用的可生物降解聚合物實例包含(例如)聚(原酸酯)及聚(酸酐)。一特定的例示性聚合物為聚丙交酯及聚乙交酯。
可注射的貯存型製劑亦可藉由將產物包埋在與身體組織相容的脂質體或微乳液中來製備。
聚合物遞送系統亦可用於非貯存型製劑，包含(例如)口服製劑。例如，可生物降解的、生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸等係可用於口服製劑中。多醣抗原或共軛物係可與這類聚合物一起配製，以(例如)製備顆粒、微粒、擠出物、固體分散劑、混入物或其他組合，以便於製備有用的製劑（例如口服）。
根據本發明使用的疫苗係包含免疫原性組成物，且可額外包含一或多種另外的活性劑（即，發揮生物效應的試劑 - 非惰性成分）。應理解，這類額外的試劑係可與一或多種其他疫苗組分一起配製，或可在施用時或接近施用時單獨維持及組合。在一些實施例中，這類額外的組分係可在適當的一段時間內與一些或所有其他疫苗組分分開施用，以達到相關效果。
例如，在疫苗的製備中常見包含有一或多種佐劑。佐劑通常為增強對於抗原的免疫反應之試劑。在一些實施例中，其利用了會增強Th1型免疫反應的佐劑。 在一些實施例中，其利用了會增強Th17型免疫反應的佐劑。佐劑
於一些實施例中，本文中所述的免疫原性複合物係與佐劑組合配製及/或施用。在一些實施例中，佐劑係選自由以下組成之群：氫氧化鋁、磷酸氫鋁、磷酸鋁、TLR致效劑、TLR2致效劑（例如，皂苷（例如，QS21等）、孔蛋白等）、TLR3致效劑（例如，dsRNA、polyI:polyC、poly-ICLC、Hiltonol® 等）、TLR4致效劑（例如，單磷醯脂A (MPL A)）、TLR5致效劑（例如，鞭毛蛋白）；TLR 7、8或9致效劑（例如，CpG-寡核苷酸等）。
於一些實施例中，適合根據本發明使用的佐劑包含(但不限於)： (1) 鋁鹽(礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等； (2) 水包油型乳化製劑(含有或不含有其他特異性免疫刺激劑，諸如胞壁肽(如下文定義的)或細菌細胞壁組分)，諸如(例如)， (a) MF59（PCT公開第WO 90/14837號），其含有利用微流化儀（諸如型號110Y的微流化儀(Microfluidics, Newton, MA)）配製在次微米顆粒中的5%角鯊烯、0.5% Tween 80及0.5% Span 85（可選擇地含有不同量的MTP-PE(參見下文，儘管不是必需的)）， (b) SAF，其含有10%角鯊烯、0.4% Tween 80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121、及thr-MDP (見下文)，其被微流化在次微米顆粒乳劑內或被渦旋以生成更大細微性的乳劑，及 (c) Ribi™佐劑系統(RAS) (Corixa, Hamilton, MT)，其含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80、及一或多種細菌細胞壁組分，所述細胞壁組分來自由美國專利號4,912,094描述的3-O-脫醯基單磷醯脂質A (MPL™)(Corixa)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)組成之群組，較佳為MPL + CWS (Detox™)； (3) 皂素佐劑，諸如Quil A或STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA)(美國專利號5,057,540)可以利用或者從其產生的顆粒諸如ISCOMs (免疫刺激複合物)； (4) 細菌脂多醣、合成的脂質A類似物諸如胺烷基葡萄糖胺磷酸化合物(AGP)、或其衍生物或類似物，其可以從Corixa公司購買到，且在美國專利號6,113,918中描述過；一種這樣的AGP為2-[(R)-3-十四醯氧基十四醯胺基]乙基2-去氧-4-O-膦醯基-3-O-[(R)-3-十四醯氧基十四醯基]-2-[(R)-3-十四醯氧基十四醯胺基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其亦稱為529 (以前稱為RC529)，其被配製為水性形式或配製為穩定的乳劑，合成的多核苷酸諸如含有CpG模體的寡核苷酸(美國專利號6,207,646)；TLR3致效劑(合成的dsRNA, 聚I:聚C (polyI:polyC), Hiltonol® ，可獲自InvivoGen公司)； (5) 細胞介素，諸如介白素（例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等）、干擾素（例如γ干擾素）、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞株刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等； (6) 細菌ADP-核糖基化毒素的去毒突變體，諸如野生型或突變形式的霍亂毒素(CT)，例如，按照公開的國際專利申請號WO 00/18434 (亦參見WO 02/098368及WO 02/098369)，其中胺基酸位置29的麩胺酸被另一胺基酸取代，較佳地被組胺酸取代；百日咳毒素(PT)；或大腸桿菌熱不穩定毒素(LT)（特別是LT-K63、LT-R72）、以及名為LT(R192G/L211A)之新穎LT突變體，或dmLT可引發對於疫苗抗原的Th17反應(Andreasen, 2009; Norton, 2011; Norton, 2012; Leach, 2012; Toprani, 2017)、CT-S109、PT-K9/G129（參見例如WO 93/13302及WO 92/19265）；以及 (7) 做為免疫刺激劑以增強組成物功效的其他物質，例如δ菊糖(Advax® )、Matrix M。
胞壁肽包含(但不限於) N-乙醯基-胞壁醯基 -L-蘇胺醯基-D-異穀醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-正胞壁醯基-L-丙胺酸-2-(1’-2’二棕櫚醯基-sn -甘油-3-羥基磷醯氧)-乙胺(MTP-PE)等。
根據本發明使用之疫苗可包含其它抗微生物劑治療，或可同時與其施用。例如，這類疫苗可包含一或多種殺死或延緩病原體生長的試劑或與其一起施用。這類試劑包含(例如)青黴素、萬古黴素、紅黴素、亞茲索黴素以及克拉黴素、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、左氧氟沙星、加替沙星。
替代性地或另外地，根據本發明使用之疫苗可包含一或多種其它疫苗或治療，或可與其一起施用。例如，可包含一或多種非肺炎球菌抗原於其內或與該等疫苗一起施用。施用
於一些實施例中，係將免疫原性複合物施與有疾病風險的個體，例如住院患者。應理解，可以認為一個體可處於發展疾病的風險下而沒有被診斷出患有任何疾病症狀。例如，若已知一個體已經或將會暴露於感染風險相對較高的情況下，該個體將被認為有發展該疾病的風險（例如，住院患者、長期住在照護機構的年長個體等）。
可利用任何有效的施與途徑，例如口服、經鼻、腸內、腸胃外、肌內或靜脈內、皮下、皮內、直腸、***、局部、眼、肺、或藉接觸施用。在一些實施例中，可以注射疫苗組成物（例如，經由肌內、腹膜內、皮內及/或皮下途徑）；或經由黏膜遞送（例如，遞送至口道/消化道、呼吸道及/或泌尿生殖道）。在某些情況下鼻內施與疫苗可特別有用，例如用於治療肺炎或中耳炎（因為可以更有效預防鼻咽攜帶的肺炎球菌，從而在其早期階段使感染減弱）。在本發明的一些實施例中，可能期望藉由不同途徑施用不同劑量的疫苗；在一些實施例中，可能期望經由不同途徑施用一種劑量的不同組分。
在本發明的一些實施例中，藥物組合物（例如疫苗）係皮內施用。皮內注射之習用技術「芒圖氏程序(mantoux procedure)」包括以下步驟：清潔皮膚，且然後將一隻手伸展開，且在小號注射針(規格26至31)之斜面朝上之情形下，以10°至15°之間的角度將針***。在針之斜面***時，使針之針筒降低並在提供輕微壓力的同時進一步推進，以將針在皮膚下抬高。然後極緩慢地注射液體，由此在皮膚表面上形成小泡或***，隨後緩慢抽出針。
特定設計用來將液體藥劑投與皮膚中或穿過皮膚之裝置係已有描述，例如描述於WO 99/34850及EP 1092444之裝置，以及例如描述於WO 01/13977、美國專利號5,480,381、美國專利號5,599,302、美國專利號5,334,144、美國專利號5,993,412、美國專利號5,649,912、美國專利號5,569,189、美國專利號5,704,911、美國專利號5,383,851、美國專利號5,893,397、美國專利號5,466,220、美國專利號5,339,163、美國專利號5,312,335、美國專利號5,503,627、美國專利號5,064,413、美國專利號5,520,639、美國專利號4,596,556、美國專利號4,790,824、美國專利號4,941,880、美國專利號4,940,460、WO 97/37705及WO 97/13537之噴射注射裝置。經真皮內投與疫苗製劑之其他方法可包含習用注射器及針或經設計用於固體疫苗的彈道式遞送裝置(WO 99/27961)、或經皮貼片(WO 97/48440、WO 98/28037)或塗抹於皮膚表面(經皮或經表皮遞送，WO 98/20734、WO 98/28037)。
如上所述，醫藥組成物（例如疫苗）係可以單劑量或多劑量施與。應理解，施與為單一「劑量」的施與，只要所有相關組分是在一段時間內施與個體；不必每種成分皆存在於單一組成物中。例如，在小於24小時的時間內施與兩種不同的免疫原性組成物係被認為是單一劑量。僅舉一個例子，具有不同抗原性組分的免疫原性組成物係可在分開的組成物中施與，但是做為單一劑量的一部分。如上所述，這類分離的組成物可經由不同途徑或經由相同途徑施用。替代性地或另外地，在疫苗包括有免疫原性組成物及額外類型的活性試劑之組合的實施例中，免疫原性組成物可經由一種途徑施用，而第二種活性試劑則可經由相同途徑或經由不同途徑施用。
醫藥組成物（例如疫苗）係以達到期望結果所需的數量及時間施用。在本發明的一些實施例中，疫苗組成物包括一治療有效量之至少免疫原性組成物。達到治療有效量所需的確切數量可有所變化，這取決於該免疫原性組成物及個體之間的不同，取決於個體的種族、年齡及一般狀況，取決於疾病的階段、特定的醫藥混合物、及其施與模式等。
各醫藥組成物（例如疫苗）劑量中的多醣抗原或共軛物的數量係經選定以使疫苗在如本文中所述施用時，在沒有明顯不利的副作用之情況下誘導適當的免疫保護反應。如本文中所用之「免疫保護性」或「保護性免疫」反應係為足以保護一免疫接種個體不受到疫苗所針對的特定病原菌或多個病原菌（例如克雷白氏肺炎菌感染）的生產性感染之免疫反應。這類數量可取決於使用哪種特定的免疫原性組成物或組合物以及其如何呈現而變化。
在一些實施例中，包括有本文中所揭露之免疫原性複合物的醫藥組成物在施用於一個體時係引發Th1及/或Th17細胞反應。在一些實施例中，包括有本文中所揭露之免疫原性複合物的醫藥組成物在施用於一個體時係針對克雷白氏肺炎菌、綠膿桿菌及大腸桿菌中之一或多者引發助噬反應/殺菌反應。 在一些實施例中，包括有本文中所揭露之免疫原性複合物的醫藥組成物在施用於一個體時係降低克雷白氏肺炎菌、綠膿桿菌及大腸桿菌中之一或多者於黏膜表面的穿透率及/或拓殖率。
在一些實施例中，包括有本文中所揭露之免疫原性複合物的醫藥組成物於穿透時係降低克雷白氏肺炎菌、綠膿桿菌及大腸桿菌中之一或多者於GI道的穿透率及/或拓殖率。
一些實施例係提供一種對個體進行預防接種以抗克雷白氏肺炎菌感染之方法，包括將有效量之如本文中所述之免疫原性組成物施與該個體。一些實施例係提供一種對個體進行預防接種以抗克雷白氏肺炎菌感染之方法，包括將有效量之如本文中所述之醫藥組成物施與該個體。
一些實施例係提供一種對個體進行預防接種以抗綠膿桿菌感染之方法，包括將有效量之如本文中所述之免疫原性組成物施與該個體。一些實施例係提供一種對個體進行預防接種以抗綠膿桿菌感染之方法，包括將有效量之如本文中所述之醫藥組成物施與該個體。
一些實施例係提供一種對個體進行預防接種以抗大腸桿菌感染之方法，包括將有效量之如本文中所述之免疫原性組成物施與該個體。一些實施例係提供一種對個體進行預防接種以抗大腸桿菌感染之方法，包括將有效量之如本文中所述之醫藥組成物施與該個體。給藥
根據本揭露內容，醫藥組成物（例如，疫苗）的施與可涉及僅單一劑量的遞送，或替代性地可涉及在一初始劑量之適當間隔後有一或多個額外的預防接種劑量。預防接種時程係為在一或多個特定年齡的個體中，藉由一或多種特定的施用途徑，施與一或多種特定劑量的一或多特定肺炎球菌疫苗的規劃。
本揭露內容係提供涉及向幼年個體施與至少一劑疫苗之預防接種方法。在一些實施例中，幼年個體為18歲或更年輕。在一些實施例中，幼年個體先前已接受一或多劑共軛的肺炎球菌多醣疫苗；在其他實施例中，幼年個體對肺炎球菌疫苗是未經驗過的。在一些實施例中，幼年個體先前已被克雷白氏菌、假單胞菌及/或大腸桿菌感染或暴露於其感染下。
本揭露內容係提供涉及向成年個體施與至少一劑疫苗之預防接種方法。在一些實施例中，成年個體係大於約50歲。在一些實施例中，成年個體係大於約65歲。在一些實施例中，成年個體先前已接受一或多劑共軛的肺炎球菌多醣疫苗；在其他實施例中，成年個體對肺炎球菌疫苗是未經驗過的。在一些實施例中，成年個體先前已被克雷白氏菌、假單胞菌及/或大腸桿菌感染或暴露於其感染下。
本揭露內容之預防接種時程係供以在個體中引發或誘導免疫反應（例如，免疫保護性反應），其足以降低選自由以下組成的至少一種度量：在個體族群中及/或個體次族群中之至少一感染、疾病或病症之發病率、盛行率、頻率及/或嚴重性，及/或該感染、疾病或病症之至少一替代指標。增補的預防接種時程為相對於其補充的標準時程有這種效果的時程。補充時程係可要求額外施用及/或超免疫原性劑量之在標準時程中所設立之本文中所揭露之免疫原性組成物，或要求施用不是標準方案的一部分的疫苗。本發明的完整預防接種時程可包括標準時程及增補時程。例示性樣本疫苗接種時程係供用於說明之目的。評估本文中所討論之免疫原性反應的方法詳細說明係使得技術人員可開發該樣本預防接種時程的變化而無需過多的實驗。
於本揭露內容的一實施例中，肺炎球菌疫苗的第一次施用通常發生在個體超過約50歲、超過約55歲、超過約60歲、超過約65歲、或超過約70歲時。
於本揭露內容的一實施例中，其係使用單一次疫苗施用。本發明之目的係可以用單一次施用來提供，特別是當一或多種所利用的疫苗多醣及/或共軛物或其組合有強度的時候，且在這種情況下單劑量計劃即足以誘導持續的免疫保護反應。
在一些實施例中，期望能施與二或多種劑量的疫苗以有更大的免疫保護性功效及涵蓋範圍。因此，在一些實施例中，許多劑量是至少兩次、至少三次或更多次劑量。未設定有最大的劑量數量，然而為了達到期望的效果，臨床實踐上最好不要經常進行預防接種。
在不受理論束縛下，根據本揭露內容施用的第一劑疫苗可以被認為是「主要」劑量。在一些實施例中，有一個以上的劑量被包含在預防接種時程之中。在這樣的方案下，後續劑量可被認為是「增強」劑量。
可以將主要劑量施用於未經驗過的個體（先前從未接受過多醣疫苗的個體）。在一些實施例中，於施與根據本發明之初始疫苗劑量之前，可以將主要劑量施用於之前已接受過多醣疫苗至少五年或更多年的個體。在其他實施例中，於施與根據本發明之主要疫苗之前，可以將主要劑量施用於之前已接受過共軛物疫苗至少二十年或更多年的個體。
當預防接種時程要求二或多個分離的劑量，係考量到該等劑量之間的間隔。兩個揭序劑量之間的間隔在整個預防接種時程中係可相同，或因個體年齡改變。在本發明之預防接種時程中，一旦已施用第一個疫苗劑量，在施與隨後的劑量之前會有一第一間隔。第一間隔一般至少為約2週、1個月、6週、2個月、3個月、6個月、9個月、12個月或更久。當施與超過一個隨後的劑量，可在這類隨後的劑量之間設置第二(或更高)間隔。在一些實施例中，隨後的劑量之間的全部間隔為相同長度；在其他實施例中，該等第二間隔的長度可改變。在一些實施例中，隨後的劑量之間的間隔係可為至少約12個月、至少約15個月、至少約18個月、至少約21個月或至少約2年。在一些實施例中，該等劑量之間的間隔可高達3年、高達約4年或高達約5年或10年或更久。在一些實施例中，隨後的劑量之間的間隔係可因個體年齡而減少。
熟習此項技術者應理解，第一次施用的時間、最短間隔、最大間隔及總施用次數（絕對值，或在規定的時間內）的各種情況會有多種可能的組合及子組合，且雖然未在此明確列舉，所有這些組合及子組合應被認為落入發明人的考慮範圍內。判定免疫原性反應之測定法
在一些實施例中，評估免疫原性複合體（及/或包括有免疫原性複合物之組成物）之免疫原性及/或效價之方法係包括評定對於該免疫原性組成物的免疫反應。在一些實施例中，所述評定係藉由執行一系列活體外測定法中之一或多者而完成。在一些實施例中，所評定的免疫反應為B細胞或T細胞反應。
在一些實施例中，活體外測定法係選自以下之一或多者：ELISA、流式細胞儀分析、Th1/ Th17細胞反應、藉OPK所測得之細胞介素濃度量測及功能性抗體濃度、血清殺菌試驗(SBA)、凝集性、移動性、細胞毒性、黏著性、凝集性。
在一些實施例中，評定係藉由執行一系列活體內測定法中之一或多者而完成。在一些實施例中，活體內測定法係利用院內疾病的動物模型。在一些實施例中，該動物模型為肺炎、敗血症、燒傷、GI感染或手術部位感染中之一或多種的模型。在一些實施例中，活體內測定法係測量在一或多種目標病原菌攻擊後以被動保護之細菌清除、拓殖或死亡中之一或多者，或是在一或多種目標病原菌攻擊後以主動保護之細菌清除、拓殖或死亡中之一或多者。在一些實施例中，該目標病原菌為院內病原菌。
一般而言，可能期望評估兩者之間的體液反應、細胞反應及/或相互作用。在評估體液反應的情況下，可判定針對特定病原體血清型的抗體效價及/或類型（例如，總IgG、IgG1、IgG2、IgM、IgA等），例如在施用疫苗初始劑量或疫苗增強劑量之前及/或之後（及/或與沒有抗原性刺激時的抗體濃度相比）。可藉由監測對載體蛋白的反應（諸如延遲型高敏性反應等）來評估細胞反應。也可藉由評定週邊血液單核細胞(PBMC)對於用感興趣的抗原刺激之反應來直接測量細胞反應。前驅及記憶B細胞群係可在針對特定病原菌CPS及/或OPS之酵素連結免疫斑點分析法(ELISpot)來評估。
可採用多種測定法中的任何一種來檢測個體血清中抗體的濃度及/或活性。適宜測定法包含(例如)配位體結合測定法，諸如放射免疫測定法(RIAs)、ELISA及多重測定法(Luminex, Bioplex)；功能測定法，諸如吞噬細胞助噬測定法(OPA)；以及活體內保護測定法（幼年大鼠保護及成年小鼠肺及囓齒動物GI拓殖與死亡模型）。
RIA方法係通過將血清與懸浮液中之放射性標記的類型特異性多醣一起培養而檢測類型特異性抗體（例如，Schiffiman等人, 1980）。抗原-抗體複合物係接著用硫酸銨沉澱，並測定有放射性標記之片狀沉澱物的每分鐘讀數(cpm)。
在ELISA檢測方法中，來自經免疫接種之個體血清的血清型特異性抗體係藉由與已吸附至固體支持物的血清型特異性多醣一起培養來定量（例如，Koskela及Leinonen (1981); Kojima等人, 1990; Concepcion及Frasch, 2001）。結合的抗體係使用與酶共軛的二級檢測抗體來檢測。ELISA也允許藉由使用同型-特異性或子型-特異性二級抗體對免疫反應進行同型分類及亞類化（即，IgM對IgG或IgG1對IgG2），且可適以評定血清型特異性抗體的結合性(Anttila等人, 1998; Romero-Steiner等人, 2005)。多重測定法（例如，Luminex，Bioplex）使得能夠同時檢測針對多種血清型的抗體。血清型特異性CPS及/或OPS係與光譜上不同的微球體共軛，而其係與稀釋的血清混合一起培養。結合的抗體係以與藻紅素共軛的二級抗體檢測，並在專門的流式細胞儀中定量，該流式細胞儀係使用一雷射來辨識珠粒類型（血清型）且使用第二種雷射來定量已結合的二級抗體(Pickering等人, 2002; Lal等人, 2005)。
OPA為評估血清中之功能性抗體的方法，其僅定量可以對細菌有助噬作用的抗體，導致細菌的攝入及致死。標準的測定法係利用人類吞噬效應細胞、補體來源、細菌及稀釋的血清。測定讀數為血清終點效價，與僅用補體及人類細胞培養的細菌相比，其致死率＞ 50% (Romero-Steiner等人, 1997)。此致死的OPA亦可藉由利用攜載不同抗生素抗性標記的目標病原菌菌株進行多重化(Kim等人, 2003)。1:8或更高的終點效價被認為是這些致死型OPA的陽性結果。另一類型的多重助噬測定法為非致死測定法，其中在稀釋血清及補體來源的存在下，藉由吞噬效應細胞攝取螢光染色的囊封病原菌或與來自目標病原菌之抗原性CPS及/或OPS共軛的螢光微球體而藉由FC進行評估(Martinez等人, 1999)。血清抗體加上補體的助噬活性也可藉由測量人類吞噬效應細胞對攝入之病原菌的氧化反應來評估(Munro等人, 1985; Ojo-Amaize等人, 1995)。
某些體內模型系統可用於評定由本發明之疫苗所引發的血清抗體所提供的保護作用。在這類被動保護系統中，用病原菌及稀釋的血清攻擊小鼠或大鼠，並判定針對菌血症、器官或組織拓殖、或死亡提供保護的血清的終點效價(Stack等人, 1998; Saeland等人, 2000)。抗體組成物 一些實施例提供了一種抗體組合物，其包括有用本發明之免疫原性複合物預防接種的哺乳動物中養出的抗體。在一些實施例中，抗體包括至少一選自由mAb及抗個體遺傳型抗體組成之群組的抗體。在一些實施例中，抗體組成物包括經分離的γ球蛋白部分。套組
本揭露內容亦提供用於產生如本文中所揭露之免疫原性複合物的套組，其有用於研究者用其偏好的抗原定製一免疫原性複合物，例如用於研究目的以評估抗原或抗原組合對免疫反應的影響。這類套組可容易由可獲得的材料與試劑來製備。例如，這類套組可包括任一或多個以下材料：一包括有與複數個第一親和分子交聯之主鏈聚合物的容器；以及一包括有與該第一親和分子結合之互補親和分子的容器，其中該互補親和分子係與一抗原結合。
於另一實施例中，該套組可包括一包括有聚合物（例如多醣）之容器、一包括有複數個第一親和分子之容器、以及一包括有用於將該等第一親和分子與該主鏈聚合物交聯的交聯劑之容器。
在一些實施例中，該套組進一步包括一用以將該互補親和分子連接至抗原之手段，該手段係可藉由交聯劑或藉由一些中介融合蛋白。在一些實施例中，該套組可包括至少一可添加至該聚合物的共同刺激因子。在一些實施例中，該套組包括交聯劑，例如(但不限於) CDAP (l-氰基-4-二甲基胺基吡啶四氟硼酸鹽)、EDC (l-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺氫氯化物)、氰基硼氫化鈉、溴化氰、碳酸氫銨/碘乙酸，用於將該輔助因子與聚合物連接。
取決於套組的預期用途、特定的目標抗原及使用者的需求，可以製備多種套組及組分以用於本文所述之方法中。範例
以下實例係為了可以更全面地理解本文中所述的發明而提出。代表性的實例含有資訊、範例及指導，其可適用於實踐本發明之各種實施例及其等效物。應理解，這些實例僅用於說明目的，且不應被解釋為以任何方式限制本發明。實例 1 ：細菌菌株
試劑菌株係於無動物產物的培養基上繼代三次以除去任何可能的動物產物污染物。在繼代之前、繼代期間及繼代之後比較菌株的特性。對於假單胞菌：革蘭氏染色、菌落形態、API、氧化酶試驗MacConkey瓊脂上的生長、IATS血清型分型、生長動力學。對於克雷白氏菌：革蘭氏染色、菌落形態、API、藉由聚合酶鏈反應(PCR)的分子血清型分型、藉由PCR及定序確認突變（必要時）、K分型（藉由PCR）、生長動力學。表 2 ：使用在本研究中之克雷白氏菌菌株及試劑菌株
使用λ Red重組法來刪除guaBA 及wzabc 基因。簡言之，guaBA 及wzabc 基因的DNA上游及下游係融合至一個康黴素抗性卡匣，且線性DNA係轉形至也含有可表現λ重組酶基因之輔助質體的克雷白氏肺炎菌菌株內。於誘導時，這些基因係促進同源重組而使得guaBA 及wzabc 基因能夠被康黴素抗性卡匣取代。康黴素抗性卡匣隨後係使用可促進與該卡匣側接之FRT位置之間之重組的內翻轉酶來移除。已確認突變體為對康黴素敏感的且已藉由PCR確認該缺失及該缺失的序列。表 3 ：使用在本研究中之綠膿桿菌 (PA) 菌株 過度產生外多醣 PsL 之 PA 菌株的建立
使用來自於Genscript公司(Piscataway, NJ)之1886 bp的合成DNA來重新建構綠膿桿菌PsL-誘導型菌株PAO1 Δpsl /pBAD-psl 之例示性基因方法係顯示於圖9B中。
araC-pBAD啟動子係藉由同源重組而***綠膿桿菌PAO1pslA 基因的上游。基本上，pslA 的DNA上游係擴增自綠膿桿菌PAO1且在上游融合有建它黴素抗性卡匣。由含有araC-pBAD啟動子及pslA 基因之合成DNA所組成之構築體係融合至建它黴素抗性卡匣的下游。此整個構築體係***pEX100T克雷白氏菌突變誘發質體。突變誘發係如先前所述(Schweizer等人, 1992)來執行。建它黴素抗性基因係隨後被移除，並藉由PCR及定序而確認araC-pBAD啟動子的***。實例 2 ： O- 多醣抗原及 K- 多醣抗原的產生 克雷白氏菌屬及綠膿桿菌菌株的生長
全部的試劑克雷白氏菌及綠膿桿菌菌株係於無動物產物的培養基上繼代三次以除去任何可能的動物產物污染物。研究細胞庫(RCB)係生長在搖動燒瓶之Hy-Soy培養液中並轉移到無菌等分的小瓶中之最終濃度為15%的甘油內。 細菌係生長在8 L BioFlo 415發酵槽中之化學成分確定的培養液(CDM)內，該培養液含有磷酸二氫鉀、磷酸銨、檸檬酸單水合物、，硫酸鎂（MgSO4 ）、聚丙二醇(PPG)（消泡劑）、做為碳源的3%甘油、微量維生素及元素，並根據需求選擇胺基酸。溶解的氧係保持在30%，噴流模式設為最小攪拌速率為200 RPM，並用氫氧化銨將pH校正至7。在發酵期間，於需要時以分批模式補充含有50%甘油、MgSO4 、微量維生素及微量維生素和元素之培養液。使細菌生長12-18小時至靜止期，此時點收穫培養物以得到多醣。KP O- 多醣及 PA 核部 -O- 多醣的純化
KP及PA OPS之下游純化過程的流程圖係顯示於圖8A中。簡言之，在發酵結束時，對於綠膿桿菌細胞培養液係將整個發酵培養液用1%乙酸在100°C下處理4小時，對於克雷白氏菌細胞培養液係將整個發酵培養液用亞硝酸鈉於乙酸中在4℃下處理12小時。於藉由離心及深層過濾(0.45 μm)澄清後，將含有經過水解及釋放的OPS之澄清溶液以10 kDa或30 kDa NMWCO膜進行切向流過濾(TFF) UF-DF，對1M NaCl及接著對Tris緩衝液進行透析過濾。接著使滲餘物通過強陰離子交換膜以Tris緩衝液進行離子交換層析（IEC）。帶負電荷的PA OPS係藉由該膜捕獲（圖8A），接著用氯化鈉溶析。中性KP及中性或弱酸性PA OPS係於該IEC膜的流出物（FT）中獲得。該IEC流出物或析出物係接著進行硫酸銨沉澱以除去殘餘蛋白質。硫酸銨上清液中的KP OPS係接著進行兩次連續的TFF過濾，從300 kDa NMWCO膜開始，接著將FT濃縮並用5或10 kDa NMWCO膜透析過濾。後來的TFF FT滲餘物中含有純化過的KP中性OPS（圖8A）。硫酸銨(NH4 SO4 )上清液中之純化過的中性及酸性PA OPS係用5-10 kDa TFF（圖8A）進行處理，且其係於滲餘物中回收。藉由SEC-多角度雷射散射法（SEC-MALLS）測得之最終OPS產物的平均MW範圍為10-30 kDa（視O-類型而定），並且具有低內毒素、蛋白質及核酸內容物。產酸克雷白氏菌 K19 莢膜多醣 (KP K19 CPS) 之純化
KP K19 CPS之下游純化過程的流程圖係顯示於圖9A中。簡言之，在以甲醛去活化、以及藉由不連續的離心及表層過濾(0.45 μm)之後，含有CPS之澄清液係以30 kDa NMWCO膜使用TFF進行濃縮及透析過濾。藉由CTAB來沉澱30 kDa滲餘物。將沉澱物用氯化鈣重新溶解並用20%乙醇沉澱以除去核酸及蛋白質污染物。離心之後，所採集的上清液係以80%乙醇沉澱。含有沉澱物之CPS係重新溶解於Tris緩衝液中並捕獲於弱陰離子交換樹脂上。從該樹脂溶析出的K19 CPS係進一步用0.1 M NaOH之90%乙醇溶液處理（去毒）以除去任何會促成其聚集及內毒素（藉鱟變形細胞溶胞產物(LAL)活性來測得）之殘餘末端脂質（圖9A）。最終的K19多醣產物於使用SEC-MALLS測量時係具有220 kDa的平均分子量，並且具有低內毒素、蛋白質及核酸內容物。PA 外多醣 PsL 之純化
外PS PsL之例示性純化過程的流程圖係顯示於圖9C中。簡言之，PA細菌培養液係在室溫下以10,000x g離心40分鐘，並使上清液過濾通過0.5-0.3 um的深層過濾器。過濾過的上清液係藉由TFF使用100 kDa MWCO PES膜及10倍透析體積的注射用水(WFI)進行透析過濾，使用2 kDa Hydrosart膜並以10–20x UF來收集並濃縮滲透物，且以10倍透析體積之pH 7.5的50 mM Tris HCl及50 mM NaCl進行透析過濾。經濃縮的析出物係接著在GE Q-Sepharose Fast Flow管柱上通過強陰離子交換樹脂(IEX)層析，並再以另一管柱體積沖洗溶析液而收集流出物。接著以WFI使用2 kDa Hydrosart膜來濃縮及透析過濾該析出物，接著在室溫下以80%乙醇沉澱18小時。以4000 x g離心30分鐘之後，將片狀沉澱物溶解在WFI中，無菌過濾通過0.2 µm過濾器，並凍乾。最終的經純化多醣材料係藉HPAEC/PAD（具有脈衝電化學檢測的高性能陰離子交換層析法）來分析，使用Dionex ICS-4000毛細管儀及CarboPac PA10管柱及可商業購得的單醣標準試劑對單醣組成物進行分析，以Bradford測定法分析殘留蛋白，以Q-bit Life Technologies公司的quant-IT套組分析殘留核酸，以LAL測定法分析內毒素，以及以蒽酮測定法分析總碳水化合物。也藉由高解析度H-NMR來分析最終的物質以確認其結構，並以SEC-HPLC推算分子量。O- 抗原及 K- 抗原定性分析方法
由上述方法所得之OPS及CPS之純度及特性係如下判定。以Bradford及/或BCA測定法判定殘餘蛋白濃度；使用pico green測定法或在260 nm的吸光度判定核酸濃度；使用LAL測定法測量內毒素濃度；以及藉由酸水解來判定多醣的糖組成，接著如上所述藉由HPAEC-PAD (Dionex)分離各個單醣。多醣的物理完整性係藉由高解析度的1H-NMR以500、800或950 MHz使用Bruker光譜儀來判定，記錄光譜並將所得光譜與文獻中公開的光譜進行比較。在純化過程中及最終產物中之多醣特性及經純化之天然及化學衍生的多醣上的表位完整性係藉由ELISA使用特異性OPS及CPS單株抗體以及針對熱滅菌型特異性細菌所養出的多株兔子抗血清來確認。以Hestrin比色測定法及1H-NMR來判定多醣上O-乙醯基的存在。以SEC-HPLC（圖8B及8C）及SEC-MALLS使用合適的分粒管柱來判定多醣的大小。以蒽酮測定法來判定多醣濃度。實例 3 ： OPS 及 CPS 生物素化的一般方法
使用CDAP做為活化劑對含有羥基的多醣(PS)進行生物素化。將多醣溶解於不含LPS的水（細胞培養級；HyClone）中，最終濃度為1-5 mg/mL。在時間0時，在渦動期間加入一體積的CDAP（於乙腈中新鮮配製至濃度100 mg/mL）至1 mg CDAP/1 mg PS的最終比例。在30秒時，加入一體積的0.2 M三乙胺(TEA; Sigma-Aldrich)以將pH提升至8（對於中性PS，TEA體積係等於CDAP體積；對於酸性PS，TEA體積加倍）。在2.5分鐘時，加入一體積的生物素衍生物（Pierce EZ-Link Amine-PEG3-Biotin, 20 mg/mL水溶液）至最終比例為1 mg生物素對1 mg的PS，接著在室溫下培養1-4小時。對於稀釋更多倍的樣品(＜1 mg/ mL)，使用過夜培養。加入25 mM甘胺酸終止反應，並藉由對PBS進行大量透析而除去過量的生物素。
對於主鏈聚合物BP-1.2，聚合物K19 CPS的生物素化係藉由以1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺氫氯化物(EDC, Pierce)及N -羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化糖醛酸殘基的羧酸鹽基團而進行，以改善功效或產生建立乾燥穩定的（胺反應性）中間產物。EDC係將NHS與羧基偶聯，形成比O -醯基異脲中間產物更加穩定的NHS酯，同時可在生理pH下與一級胺有效共軛。生物素胺衍生物(Pierce EZ-Link Amine-PEG3-Biotin)係接著使用於K19 CPS之NHS酯中間產物的生物素化。
總糖濃度係以用於對於克雷白氏菌OPS/CPS之蔥酮測定法或是用於PA OPS之間苯二酚測定法來判定。實例 4 ：重組型利查維啶及利查維啶 - 融合蛋白抗原之建構 衍生自克雷白氏肺炎菌及綠膿桿菌之利查維啶 - 融合蛋白表現構築體的設計及工程化
對於假單胞菌鞭毛蛋白(FliC) A (FlaA)及B (FlaB)，基於將假單胞菌FliC封裝於晶體中之鞭毛纖絲的電腦模擬構築體暗示了Domain 2 (D2)會暴露於溶液中且在免疫原性上扮演重要角色(Song, 2014)。另外，假單胞菌FliC經由TLR5的識別而活化了先天免疫反應，這可能導致反應原性，因此我們生成並評估了一些已移除掉TLR5結合域及相鄰區域而僅留下結構域2之假單胞菌鞭毛蛋白。所產生之缺少TLR5結構域的序列FlaA2-結構域2及FlaB-結構域2係表現為一個單有利查維啶之融合體或是具有利查維啶及克雷白氏菌MrkA或PcrV之融合體。所生成及表現衍生自假單胞菌的利查維啶-抗原融合蛋白變異體(FlaB; FlaA1; FlaA2; PcrV; FlaB-PcrV; FlaB-D2; FlaA2-D2; FlaB-D2-PcrV)以及衍生自克雷白氏菌與假單胞菌之雜合利查維啶融合蛋白(FlaB-D2-MrkA; PcrV-MrkA)的示意圖係顯示於圖12A中。
對於綠膿桿菌，由於鞭毛蛋白為鞭毛的主要組分，且已知抗鞭毛蛋白的抗體抑制了需要用來播散性感染的移動性，並在動物感染模式中已顯示出具有保護性，鞭毛蛋白係選來做為一個可能的載體蛋白及保護性抗原。鞭毛蛋白的血清型A2是高度保守的，但與A1型有些微變化，與血清型B的結構域2則有顯著變化。為評估這些變異的活性，血清型A1 (FlaA1)、A2 (FlaA2)及B (FlaB)鞭毛蛋白係經選殖並表現成完整長度的蛋白質。僅來自於鞭毛蛋白A2及B的結構域2亦經選殖並表現成此結構域鑲嵌已組裝鞭毛的外部，且可能是中和抗體的靶標。這使得可單獨評估TLR5結合結構域對適性免疫反應的貢獻。所選定的序列係經合成並選殖到質體中，以用胺基端的利查維啶融合體及六個組胺酸標籤來引導大腸桿菌中的表現以用於初期親和性的純化（圖12A）。
對於綠膿桿菌，由於PcrV係編碼第III型分泌設備的末梢蛋白而也選擇了PcrV。已知對於做為保護性抗原之PcrV具特異性的抗體可針對侵襲性感染提供保護性。其序列係高度保守的，在18種不同的綠膿桿菌菌株之中，294個胺基酸只有4個位置有胺基酸的改變。該序列係經合成並選殖到質體中，以用胺基端的利查維啶融合體及六個組胺酸標籤來引導大腸桿菌中的表現以用於初期親和性的純化（圖12A）。
對於克雷白氏肺炎菌，由於MrkA係編碼第3型線毛的主要纖毛次單元以及纖毛的免疫顯性部分而選擇了MrkA。第3型纖毛係需要用來媒介生物膜的形成，且MrkA在生物膜的形成及黏著性中扮演了主要的角色，暗示了此抗原可在疫苗製劑中提供保護。已發現MrkA在9種不同基因型的克雷白氏肺炎菌中是高度保守的，在180個胺基酸中只有1個位置有胺基酸的變化。另一個基因型則提供了稍微較高的改變，在180個胺基酸中有9個位置具有胺基酸變化（表4）。對於其他第3型線毛的纖毛次單元，一個用來在表現期間穩定單體之名為供給股互補方法的對策係已被開發出來(Walczak, 2014)。此對策在羧基端採用該胺基酸序列及重複，使其可回折並以β股通常由結構中的下一個次單元提供之方向來結合。我們試圖將此策略延伸至克雷白氏肺炎菌第3型線毛次單元MrkA，藉由先移除所計劃的分泌信息序列以專注於我們的利查維啶融合體的細胞質表現。推定的分泌信息係制定於Chan等人, 2012, Langmuir中，其係基於與大腸桿菌FimA胺基酸1-24比對。我們接著將一個有六個甘胺酸的連接子加到羥基酸，接著加入MrkA的N端的前20個胺基酸重複（不含該信息序列）來提供供給股互補。該序列係經合成並選殖到質體中，以用胺基端的利查維啶融合體及六個組胺酸標籤來引導大腸桿菌中的表現以用於初期親和性的純化（圖12A）。表 4 ： 克雷白氏肺炎菌 MrkA Clustal 0 (1.2.1) 多重序列比對 克雷白氏肺炎菌MrkA CLUSTAL 0 (1.2.1)多重序列比對對於高度保守的克雷白氏肺炎菌MrkA蛋白，表4中的AEO27492序列(粗體)係使用為來源序列以產生該合成基因。
在未併入所預測的信息序列（胺基酸1-44）之情況下，使用在這些研究中的重組型利查維啶(rRhavi)係跨越由該基因體所編碼之蛋白質的胺基酸45至179。為將rRhavi在大腸桿菌中的表現程度最佳化，編碼利查維啶多肽的基因序列(45-179; SEQ ID NO:14)係使用偏好大腸桿菌的表現密碼子而重新設計並合成。經密碼子最佳化的基因係被選殖入pET21b載體以引導蛋白質表現。為促使正確的折疊以及利查維啶中的雙硫鍵形成，已選擇一可促進細胞質中的雙硫鍵形成之大腸桿菌菌株T7 shuffle express (NEB)來進行表現。
為建構利查維啶-抗原融合蛋白，將一個編碼了由七個胺基酸(GGGGSSS; SEQ ID NO:15)組成之可彎曲連接子區域的DNA序列直接***該合成rRhavi基因的3'端，以提供與rRhavi分離並促進後續融合蛋白的正確折疊。編碼候選抗原（全長或期望片段）的基因係經合成並就在該連接子區域之後***rRhavi表現載體。為便於純化，將一個有六個組胺酸的標籤加到該構築體的末端。
引導rRhavi融合蛋白表現之含有DNA的質體係依據製造商的實驗方案而轉形到T7 shuffle express大腸桿菌內。從單一菌落開始培養並接種於30 ml之含有胺苄青黴素(Amp+)的Luria-Bertani (LB)培養基，在30°C下過夜培養。在第2天，將5 ml的起始培養液接種於1公升的LB培養基/Amp+，並30°C下生長直至達到OD600 約1.2至1.6。在將培養液冷卻至16°C之後，加入IPTG直至最終濃度為0.1 mM。經誘導的培養液係在16°C下震盪培養16至20小時。細菌係以5000 x g離心20分鐘來收集，並將沉澱物冷凍在-20° C。例示性融合蛋白
本發明之例示性利查維啶融合蛋白係陳述於下列序列清單中。為方便參考，提供該融合蛋白之單字母胺基酸序列於下：
Rhavi-PcrV-His SEQ ID NO:16 MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH
Rhavi-MrkA-供給-股-互補-His SEQ ID NO:17 MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVSGSGHHHHHH
Rhavi-FlaA1-His SEQ ID NO:18 MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMALTVNTNIASLNTQRNLNNSSASLNTSLQRLSTGSRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRMRDLSLQSANGSNSDSERTALNGEVKQLQKELDRISNTTTFGGRKLLDGSFGVASFQVGSAANEIISVGIDEMSAESLNGTYFKADGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFSDGDTISYVSKAGKDGSGAITSAVSGVVIADTGSTGVGTAAGVTPSATAFAKTNDTVAKIDISTAKGAQSAVLVIDEAIKQIDAQRADLGAVQNRFDNTINNLKNIGENVSAARGRIEDTDFAAETANLTKNQVLQQAGTAILAQANQLPQSVLSLLRGSGHHHHHH
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Rhavi-MrkA-供給-股-互補-PcrV-His SEQ ID NO:25 MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVSAAAAMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH
Rhavi-FlaB-結構域2-PcrV-His SEQ ID NO:26 MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSAAAAMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH融合蛋白之純化
開始純化時，將細菌沉澱物之每克細胞沉澱物重新懸浮於4 ml之冷卻的20 mM Tris pH 8.0、500 mM NaCl、20 mM咪唑、10 mM MgCl2 及2X Halt蛋白酶抑制劑(Thermo Fisher)中。以超音波使細菌破裂，接著加入DNase I至最終濃度為25 µg/ml。不溶的殘渣係以5000 x g離心20分鐘而除去。透明的溶胞產物係以等體積的20 mM Tris pH 8.0及500 mM NaCl稀釋，使最終緩衝液濃度達到20 mM Tris、500 mM NaCl、10 mM咪唑、5 mM MgCl2 及1x Halt蛋白酶抑制劑。蛋白質係藉由與鎳親和樹脂結合，以20 mM Tris、500 mM NaCl、20 mM咪唑洗滌，及以20 mM Tris、500 mM NaCl、500 mM咪唑溶析經結合的蛋白質來純化。在所期望的目標蛋白二聚體之溶析中的波峰分餾物係經彙集與濃縮。從這些管柱溶析出的蛋白質係進一步藉由凝膠過濾層析及/或SEC來純化。這些蛋白質係接著以SDS-PAGE、西方墨點法及SEC來分析。全部的融合蛋白係以預期的分子量在SDS-PAGE中移動。每一個樣本的蛋白濃度係使用BCA蛋白測定套組(BioRad)測量。將純化的蛋白質等分，在液態氮中快速冷凍，並儲存在-80°C下留待將來使用。
表5中顯示了例示性利查維啶融合蛋白及本發明之變異體的物理屬性的概要。本發明之全部利查維啶融合蛋白係經表現且藉由尺寸篩除層析術(SEC)顯示而判定為二聚體蛋白（表5）。表 5 ：本發明之大腸桿菌所表現的利查維啶融合蛋白之物理屬性 鞭毛蛋白融合蛋白中之 TLR5 活性的評估
為評估該等融合蛋白是否適當地折疊，藉由以如圖12B中所示之各個試驗蛋白或複合物一起培養4小時來刺激HEK293-NFkB: Luc細胞。先前已有記錄HEK293-NFkB: Luc細胞會對鞭毛蛋白反應但不會對LPS或非有鞭毛的沙門氏菌反應(Simon及Samuel, 2007)。 在細胞溶解之後，以Promega公司的螢火蟲螢光素酶判定螢光素酶活性。該測定法測量了NF-kB的活性。(Simon及Samuel, 2007)。
在使用HEK293-NFkB: Luc細胞以及天然假單胞菌鞭毛蛋白及利查維啶融合蛋白單獨或做為與PnPS 6B之MAPS複合物的測定法中之TLR5生物活性係顯示於圖12B中。這些結果清楚指出利查維啶鞭毛蛋白構築體FlaB、FlaA1、FlaA2係仰賴自己來促進TLR5活性或做為與PnPS 6B之MAPS複合物來促進TLR5活性，因而係適當地折疊。例示性融合蛋白之免疫原性
對於該等融合蛋白變異體之高效價血清係經生成以評估蛋白特異性抗體之活體外活性。對於以下融合蛋白(FP)中之每一者之對應免疫原的ELISA IgG效價係顯示於圖14中：Rhavi-FlaB-D2；Rhavi-FlaA2-D2；Rhavi-FlaB-PcrV；Rhavi-FlaB-D2-MrkA及Rhavi-PcrV-MrkA。全部的FP非常具有免疫原性並引發高效價的FP-特異性IgG抗體。
利用針對含有利查維啶融合蛋白的FlaB所養出的兔子血清之FlaB及FlaA1交叉反應性係總結於表6中。表 6 ：來自於用含有利查維啶融合蛋白之 FlaB 預防接種的兔子的血清對於純化自 PA PAO1 之天然 FlaB 或純化自 PA PAK 之 FlaA1 的交叉反應性
抗-Rhavi-FlaB-D2及-Rhavi-FlaB-PcrV兔子血清皆具有高效價的FlaB-特異性抗體，但在比較下抗-Rhavi-FlaB-D2-MrkA血清具有低效價的FlaB 特異性抗體。抗-Rhavi-FlaB-PcrV血清具有顯著交叉反應性的FlaA1-特異性抗體，因此暗示了該融合蛋白的FlaB組分係適當地折疊，且交叉反應性的FlaA1表位可能位於鞭毛蛋白結構域2之外的共同保守的D0和D1結構域(Song及Yoon, 2014)，在Rhavi-FlaB-D2或FlaB-D2-MrkA中並不表現。因此，因為其與FlaA1的顯著交叉反應性，Rhavi-FlaB-PcrV為一個可針對假單胞菌感染提供廣泛的鞭毛蛋白免疫力之極佳候選融合蛋白。實例 5 ：免疫原性複合物的製備 天然 OPS 主鏈聚合物的製備 天然OPS
克雷白氏肺炎菌(KP OPS)血清型O1、O2、O3及O5以及綠膿桿菌OPS (PA OPS)血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11之O-多醣(OPS)係分離自生長在CDM中之有機體發酵的生物質，對於PA OPS該生物質係經在1%的乙酸中以100°C沸騰處理，或對於KP OPS該生物質係經以乙酸及亞硝酸鈉(NaNO2 )處理。對於PA LPS，乙酸的處理裂解了LPS內核的KDO鍵及脂質A（圖1A），並在COPS的還原端產生KDO部分。對於KP LPS，亞硝酸脫胺作用胺基裂解了內核葡萄糖胺殘基與LPS內核脂質A部分的其餘部分之間的鍵，並在碳-1上產生還原型2,5-脫水甘露糖殘基（圖1C）。PA OPS的結構(Knirel等人, 2006)及KP OPS的結構(Vinogradov等人, 2002)係分別顯示於圖1B及1D中。PA及KP OPS的下游純化過程係顯示於圖8A中。這些純化過程產生了高含量(＞ 50-100 mg/L的純化物質)的高純度OPS，且其具有低程度的殘餘蛋白質、核酸及內毒素。OPS的化學和免疫化學特性的確定係藉由TFA解聚合作用及Dionex HPAEC-PAD、比較NMR光譜數據之高解析度1H-NMR（化學位移及偶聯常數）與已發表的文獻，以及藉由利用以熱滅菌的全細菌所養出之KP OPS及PA OPS型特異性的單株抗體或抗血清之ELISA免疫反應性（圖6C）。由SEC及SEC-MALLS測得的OPS平均分子量範圍為約10 kDa至30 kDa，是其類型而定，且PA OPS通常大於KP OPS。經純化之KP OPS及PA OPS的HPAEC-PAD (Dionex)單醣組成物分析總結係顯示於表7中。表 7. 經純化之 KP OPS 及 PA COPS 的 HPAEC-PAD 單醣組成物分析 主鏈聚合物OPS
圖1E繪示了產酸克雷白氏菌(KO)莢膜多醣(CPS) K19的重複單元化學結構，其係與克雷白氏肺炎菌K19 CPS相同。圖1F繪示了經純化之KP K19 CPS於950 MHz的H-NMR光譜。平均分子量為10-30 kDa之天然KP OPS及PA OPS係共價連接至較大的K19 CPS（平均分子量為218 kDa）上以增加其有效分子量大小及其表位配價。主鏈聚合物OPS係隨後生物素化或在增大過程期間選擇性地在K19 CPS主鏈聚合物上生物素化以產生BP-1、BP-1.2或BP-1.3 (圖2A-2C)，或隨機皆在OPS及CPS上生物素化以產生BP-2a (圖3)或選擇性地在OPS上生物素化以產生BP-2b (圖4)。
主鏈聚合物在尺寸篩除管柱上明顯比單獨的K19 CPS或OPS較早溶析出，暗示了其尺寸比單獨的組分顯著增加，且顯示出相對於起始材料中的數量其游離OPS濃度降低而表明摻入到主鏈聚合物中。
使用諸如K19 CPS之CPS做為主鏈聚合物的這種增大過程係為一種可應用於任何CPS/OPS或小分子量細菌多醣之通用過程，可導致一成分確定且一致的產物，並對OPS/CPS表位的變化最小或沒有變化。如圖6C中所示，藉由ELISA及天然PA OPS O1、O2、O3、O6、O10及O11以及對應的PA OPS: K19 BP-1構築體，並使用來自HK-PA預防接種的兔子高度免疫血清，這清楚顯示了以下的抗原性分析(圖6C)。在這些實驗中，在天然PA OPS和對應的主鏈聚合物OPS之間沒有觀察到抗原性的差異，表明在增大過程中OPS表位被保留。主鏈聚合物 (BP) 之生物素化 BP-1
OPS係藉由與NaBH3 CN之還原胺化反應而先在其還原端配有一在各末端含有一級胺(例如ADH)之短間隔體。在KP OPS上反應的醛係位於末端的2,5-脫水甘露糖(2,5-anMan)殘基上，該2,5-脫水甘露糖殘基係於萃取過程期間藉由將整個LPS與亞硝酸鈉一起處理而產生(圖8A)，而在PA OPS上反應的酮係位於PA OPS內核的還原末端KDO殘基上，該KDO殘基係藉由將LPS與乙酸一起處理而產生，如圖8A所繪示。ADH衍生化的OPS係隨後與該部分過碘酸鹽氧化的KP 19 CPS主鏈（這些衍生物的例示性SEC-HPLC記錄曲線係繪示於圖6A及6B中）以及與一含有一級胺之生物素（諸如胺-PEG3-生物素）混合，且該混合物係還原胺化以形成一在多醣主鏈上獨特地生物素化之OPS主鏈聚合物，我們稱之為主鏈聚合物-1 (BP-1) (圖2A)。BP-1.2
替代性地，KP 19 CPS主鏈反應的羧酸鹽基團係可先以l-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)以及一含有一級胺之生物素（諸如胺PEG生物素）進行生物素化，接著過碘酸鹽氧化，與ADH衍生化的OPS混合，且該混合物係還原胺化以形成一在多醣主鏈上獨特地生物素化之OPS主鏈聚合物，我們稱之為BP-1.2 (圖2B)。替代性地，ADH步驟對於PA OPS係可被排除，因為其含有一個胺基酸丙胺基的取代基以及在其外核半乳糖胺殘基的碳-2上的游離α-胺基(圖1A)。因此，這些可得的胺基可立即用來藉由還原胺化而直接與過碘酸鹽氧化的K19 CPS聚合物以及該含有胺的生物素偶聯，以形成生物素化的BP-1 (圖2A)或BP-1.2 (圖2B)。
替代性地，在還原端含有醛或酮的OPS係在還原劑的存在下用疊氮化物胺基團進行衍生化，以產生一在末端具有疊氮化物基團的OPS。多醣主鏈係接著經由多醣羧酸鹽基團及EDC而配有炔基。該主鏈多醣係進一步用CDAP及生物素-醯肼化合物進行生物素化，以產生一含有生物素化及炔基化的多醣。經衍生化的疊氮化物-OPS及經生物素化的炔-CPS係接著與一銅催化劑點擊鍵聯以形成(OPS)n -CPS BP-1，其中該主鏈聚合物係經生物素化且該OPS未經生物素化(圖5B；流程圖1)。使用此點擊鍵聯化學反應，OPS BP-1的獲得亦可藉由使用羥酸鹽及EDC而先將炔基引入CPS，接著使用胺-PEG-疊氮化物及硫酸銅催化劑胺化，用CDAP及生物素醯肼將CPS生物素化；含有一級胺基團之經生物素化CPS係與天然OPS（在其還原末端含有醛或酮基）混合並用還原劑還原胺化，以產生OPS/CPS BP-1 (圖5B；流程圖2)。BP-2b的獲得可藉由此點擊化學反應，藉由先將生物素殘基選擇性地引入所述在末端以疊氮化物基團衍生化的OPS中，並接著使用CDAP化學及生物素醯肼進行生物素化；並且第二次點擊鍵聯所述用炔基化的CPS使經生物素化的OPS疊氮化物衍生化，如圖5B；流程圖3中所示。BP-2a
替代性地，ADH衍生化的OPS或未衍生化的OPS係與部分過碘酸鹽氧化的KP菌株19 CPS主鏈混合並還原胺化，以形成OPS主鏈聚合物；該主鏈聚合物係進一步用CDAP及生物素PEG胺進行衍生化，以得到一隨機以生物素在主鏈多醣及OPS上皆生物素化之主鏈聚合物，我們稱之為BP-2a (BP-2a) (圖3)。BP-2b
替代性地，OPS係先用CDAP及胺PEG生物素進行衍生化；所得的經生物素化OPS係用過碘酸鹽部分氧化以將醛引入其內核KDO或庚醣中，並用ADH還原胺化；經生物素化及胺化的OPS係接著與部分過碘酸鹽氧化的KP 19 CPS主鏈混合並還原胺化，以形成一選擇性地在其OPS上生物素化的OPS主鏈聚合物，我們稱之為BP-2b (圖4及圖5B，流程圖3)。BP-3
替代性地，ADH衍生化的OPS係先用PLL主鏈的ε-NH2基團進行還原胺化，以產生OPS-PLL主鏈聚合物。所得的OPS-PLL係以醯化劑處理，使得乙酸酐覆蓋PLL主鏈的未反應胺(ε-NH2)基團，以形成OPS-聚-N-乙醯基-離胺酸(OPS-PNAcLL)主鏈聚合物。此OPS-PNAcLL主鏈聚合物係接著藉由先用CDAP在接著用胺PEG生物素處理而在其OPS上進行生物素化。此主鏈聚合物係於其OPS上選擇性地進行生物素化，其被稱之為BP-3 (圖5A)。
未反應的OPS、生物素、CPS及殘餘共軛化學物係藉由FPLC-SEC以Superdex 200移除或藉由50-300 kDa TFF UF-DF來移除。 例示性免疫原性複合物之生成及純化
MAPS複合物或變異型MAPS複合物係藉由在20 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl中以選定的比例（通常為3:1，蛋白質:PS w:w）將候選的rRhavi-抗原融合蛋白加入經生物素化的多醣而產生，並添加0.01%乙汞硫柳酸鈉來抑制微生物生長。樣本係以翻滾旋轉方式在25°C下過夜培養，接著以10,000x g離心5分種以除去任何不溶物質(Zhang等人, 2013)。收集可溶物質並用尺寸篩除層析術在Superdex 75管柱(天然OPS PS MAPS)上或在Superdex 200管柱(CPS MAPS及主鏈聚合物PS變異型MAPS)上以2 mM Tris、pH 8.0、150 mM NaCl純化MAPS複合物或變異型MAPS複合物(Zhang等人, 2013)。用還原型樣本的SDS-PAGE在不加熱的情況下用全蛋白染料視覺化來分析波峰分餾物的蛋白含量。含有MAPS或變異型MAPS複合物的分餾物係藉由觀察凝膠中大分子量複合物中的染色蛋白質滯留情況而不是觀察蛋白質二聚體大小的預期遷移情況來識別(Zhang等人, 2013)。含有MAPS複合物的分餾物係經彙集，且該MAPS或變異型MAPS的蛋白質/多醣比例係使用BCA蛋白測定套組來判定，並以蔥酮測定法判定多醣(Zhang等人, 2013)。MAPS或變異型MAPS複合物的完整性係用還原型樣本的SDS-PAGE在不加熱的情況下用全蛋白染料視覺化來評估(Zhang等人, 2013)。MAPS或變異型MAPS複合物的游離蛋白含量係藉由在不加熱的情況下SDS-PAGE MAPS或變異型MAPS複合物上之蛋白質二聚體含量的光密度測定與對照蛋白質二聚體的標準量相比下而定量(Zhang等人, 2013)。併入MAPS或變異型MAPS複合物的蛋白質分子量係以還原型且煮過的樣本的SDS-PAGE以全蛋白染料視覺化及一分子量蛋白標準試劑來分析。
KP/PA OPS係使用K19 CPS為主鏈聚合物而產生成各種OPS主鏈聚合物形式(1, 2a, 2b)，並用下列衍生自KP及PA基因體之重組型大腸桿菌利查維啶融合蛋白而錯合至變異型MAPS內：在SEQ ID NO: 16-26中的Rhavi-PcrV、Rhavi-MrkA、Rhavi-FlaA1、Rhavi-FlaA2、Rhavi-FlaB、Rhavi-FlaB-Domain2、Rhavi-FlaA2-Domain2、Rhavi-FlaB-PcrV、Rhavi-FlaB-Domain2-MrkA、Rhavi-MrkA-PcrV、Rhavi-FlaB-Domain2-PcrV，且使用PRO-CN做為對照蛋白質。
與本發明之利查維啶融合蛋白一起生成並與生物素化肺炎球菌PS第6B、7F及19A型多醣錯合的一些MAPS批次之例示性屬性係顯示於表8中。變異型MAPS複合物的例示性純化係顯示於圖10及11中。變異型MAPS複合物係藉由SEC而純化自未反應的蛋白質以及SDS-PAGE所分析的凝膠溶析分餾物，圖10中顯示了一種典型的分析方法，其中游離蛋白質係顯示其溶析於凝膠中後面的部分內且可從變異型MAPS分離，如在Zhang等人, 2013中最初提到的MAPS複合物。圖11A-11C係繪示純化後之K19-PA O1 OPS BP-1 MAPS複合物、K19-PA O2 OPS BP-1 MAPS複合物及K19-PA O10 OPS BP-1 MAPS複合物與PRO-CN (圖11A)；Rhavi-FlaB-PcrV (圖11B)；Rhavi-FlaB-D2-MrkA (圖11C)的SDS-PAGE分析。純化後之變異型MAPS複合物中之每一者係分別以沸騰處理且不加熱處理。變異型MAPS複合物在沒有加熱的情況下沒有被破壞，且變異型MAPS複合物中的蛋白質係保留在凝膠的最頂部(Zhang等人, 2013)。在沸騰處理的情況下，變異型MAPS複合物被破壞，蛋白質被釋放並且通過利查維啶分子間的交互作用所形成的蛋白質二聚體也被解離(Zhang等人, 2013)。接著然後用BCA測定法判定變異型MAPS的蛋白質含量，並用蒽酮測定法判定多醣含量。蛋白質與多醣的比例係以重量/重量比及莫耳比計算。
全部最後純化的MAPS及變異型MAPS係可用0.22 μm過濾器進行無菌過濾處理(Table 8及未示出的數據)。表 8 ：利查維啶融合蛋白純化的 MAPS 屬性 實例 6 ：預防接種研究 動物的預防接種
在兔子的預防接種之前，MAPS或變異型MAPS複合物或單獨PS係於注射前約48小時與佐劑一起配製。MAPS或變異型MAPS係以各血清型PS的最終濃度為10 µg/ml而吸附至佐劑，且其為含有40 mM組胺酸pH 5.5、150 mM NaCl及0.25 mg/ml磷酸鋁凝膠之單價或多價混合物，並在4° C下以翻滾方式混合過夜。將該配製的混合物直接以0.5 ml體積含5 μg劑量的PS進行預防接種。對於較低的PS劑量，以40 mM組胺酸、pH 5.5、150 mM NaCl進行適當的稀釋。以2週或4週的間隔對4個月大的新西蘭白兔(Cocalico Biologicals公司，每組n = 8至10)施與兩次IM預防接種(0.5 ml)。在2週劑量間隔的第一次及第二次預防接種之後的2週獲得血液樣本。對於4週的劑量間隔，在第一次預防接種後的2週及4週，以及第二次預防接種後的2週收集樣本。
為得到針對候選載體融合蛋白之高效價抗體，分別在第一次預防接種使用佛氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)，而第二及第三次預防接種使用佛氏不完全佐劑。各個載體蛋白(0.1 mg)係分別與佛氏佐劑混合，最終體積為1 ml，在4個不同部位皮下注射0.2 ml，每次預防接種每隻兔子IM注射0.2 ml。在第0天、第14天及第21天對4個月大的新西蘭白兔(Cocalico Biologicals) (每組n = 3)施與預防接種，並在第二次和第三次預防接種後2週收集血液樣本。抗體的測量
針對莢膜多醣(CPS)或OPS或不同蛋白抗原的兔子抗體測定係於Immulon 2 HB或Greneir Bio-one培養基結合96微孔盤(Thermo Scientific Waltham Mass公司)中進行，該96微孔盤塗覆有(1 μg之與HSA共軛的CPS或OPS或PS/ml PBS)或蛋白抗原(1 μg蛋白質/ml PBS)。用1% BSA之PBS溶液阻斷該微孔盤。添加稀釋於PBS-T中的抗體並在室溫下培養2小時。以PBS-T洗滌微孔盤，加入與兔子免疫球蛋白G（獲自Sigma公司）的第二HRP共軛抗體並在室溫下培養1小時。微孔盤係經洗滌並以SureBlue TMB微孔過氧化物酶受質(KPL公司, Gaithersburg, MD)顯色。
血清樣本中之對不同蛋白抗原有特異性的兔子IgG效價係用ELISA及標準曲線依據多株血清分配任意單位判定。蛋白抗原係於室溫下在Immulon 2 HB 96微孔盤(Thermo Scientific公司)中以0.5 – 1 μg蛋白/ml PBS及每孔100 μl塗覆過夜。除去蛋白溶液並用PBS + 1.0% BSA在室溫下阻斷1小時，並用含有0.05% Tween-20的Dulbeco磷酸鹽緩衝鹽液(PBS-T)洗滌。兔子血清係稀釋於PBS-T中，並添加至該微孔盤在室溫下培養2小時。以PBS-T洗滌微孔盤，將與HRP共軛的二級驢抗兔子IgG (Santa Cruz Biotechnology公司)以1:20,000稀釋於PBS-T中，且每孔添加100 µl在室溫下培養1小時。將微孔盤洗滌並以SureBlue TMB微孔過氧化物酶受質(KPL公司, Gaithersburg, MD)顯色。以等體積的1 N HCl終止反應並在Spectramax讀盤儀(Molecular Devices公司)中讀取450 nm的吸光值。每個微孔盤上包含的多株血清標準品的AU值指定為12,500 AU/ml，並使用來自4參數曲線擬合的方程式，基於450 nm的吸光值為每個稀釋的血清樣本指定AU並校正稀釋係數。多株血清(AFV160，具PRO-CN特異性，利查維啶及6個組胺酸標籤)標準曲線驗收準則為該等重複之間的4參數曲線擬合的R2 為0.99或更大且小於10% CV。每個微孔盤上還包含了內部對照血清(AFV151，具PRO-CN特異性，利查維啶及6個組胺酸標籤)，並為了數據的驗收，微孔盤之間的CV指定值必須等於或小於20%。載體功能的評估
利查維啶融合蛋白之對MAPS複合體中的多醣產生增強免疫反應的載體功能能力係經評估，並與單獨利查維啶及一個先前對複合的多醣會產生強健免疫反應的對照載體蛋白(PRO-CN)進行比較。所生成的各種融合蛋白係與已知免疫原性的多醣（肺炎鏈球菌6B、7F及19A）錯合(Zhang等人, 2013)，並與有強健功能的載體蛋白對照組(PRO-CN)進行比較。所有融合蛋白皆能夠與生物素化的PS錯合並形成高分子量複合物，經得起純化且隨後用於兔子預防接種及載體功能的評估。
兔子係以用不同利查維啶融合蛋白產生之肺炎球菌多醣(PnPS) 6B and 19A所產生之MAPS複合體進行預防接種。在第一次預防接種(P1)及第二次預防接種(P2)之後的2週收集血清。各個樣本中對於PnPS 19A及6B之兔子IgG濃度係藉由ELISA測量並報告成AU，而AU係從一個AU指定為12,500 AU/ml的多株血清的標準曲線來判定。如圖13A及13B所示，以假單胞菌鞭毛蛋白B (FlaB)做為利查維啶融合蛋白(Rhavi-FlaB)以及以與假單胞菌PcrV融合之假單胞菌FlaB做為利查維啶融合蛋白(Rhavi-FlaB-PcrV)係能夠產生與先前識別的載體蛋白PRO-CN相似之對於肺炎球菌多醣(PnPS) 6B及19A的IgG效價。以假單胞菌FlaA1及FlaA2做為利查維啶融合蛋白(Rhavi-FlaA1及Rhavi-FlaA2)以及以與克雷白氏菌MrkA融合之假單胞菌FlaB結構域2做為利查維啶融合蛋白(Rhavi-FlaBD2-MrkA)係顯示出效價係近似於Rhavi-FlaB及PRO-CN的2倍或在其2倍之內。0.044 µg劑量的克雷白氏菌MrkA及假單胞菌PcrV顯示出其對於攻擊19A PS係有著非常低到無法測得的IgG效價，而對於攻擊6B及7F的效價低下。為克服MrkA不良的載體功能，同時產生針對MrkA的抗體，其係與強載體FlaB-結構體2蛋白融合以保留載體功能(Rhavi-FlaBD2-MrkA)。
表9總結本發明之例示性利查維啶融合蛋白的載體屬性。與PRO-CN相比時每種融合蛋白的載體功能係呈現成以載體蛋白PRO-CN所表露的百分比，並與單獨利查維啶蛋白相比，其對6B的免疫反應僅為4%，對19A的免疫反應為5%。Rhavi-FlaB-PcrV是一種雙重病原菌特異性蛋白（具有FlaB和PcrV兩種假單胞菌衍生抗原與利查維啶融合的嵌合蛋白），相對於PRO-CN (100%)，在提高針對6B型(62%)及19A型(102%)的強健PnPS特異性兔子免疫反應方面其係顯現為強載體。相對於PRO-CN，Rhavi-FlaB亦顯現出強載體作用，係皆對6B (66%)及19A (49%)有強健的反應。相對於PRO-CN，Rhavi-MrkA對於6B (27%)及19A (2%)係分別有較低的載體蛋白作用。Rhavi-FlaBD2對於6B (66%)係有強健的載體蛋白作用，而對於19A (20%)則有較低的載體作用。含有假單胞菌(FlaBD2)及克雷白氏菌(MrkA)抗原之嵌合Rhavi-FlaBD2-MrkA對於6B (34%)及19A (45%)係提供了載體作用，大約低於載體蛋白PRO-CN兩倍，且增加超過單獨利查維啶。因為對於兩種PnPS所產生的免疫反應係大於PRO-CN的30%，且因為表現出較大量的病原菌特異性蛋白，Rhavi-FlaB-PcrV及Rhavi-FlaBD2-MrkA變異體係皆選做為候選載體蛋白以在變異型MAPS中與本發明之OPS主鏈聚合物錯合。除了顯現出載體作用之外，對高度保守的假單胞菌PcrV具有特異性、在某種程度上對FlaB (即假單胞菌菌株表現的FlaB的約45%)具有特異性、且對保守的克雷白氏菌MrkA具有特異性之載體蛋白IgG係針對這些FP所產生，其對於這兩種病原菌造成的疾病可帶來顯注額外的廣效保護涵蓋性。表 9 ：例示性利查維啶融合蛋白及變異體之載體蛋白屬性 免疫原性的評估
在圖15中顯示了在兔子中之天然PA O6和O10 OPS的各種製劑做為具有利查維啶融合蛋白PRO-CN或利查維啶之MAPS複合物的比較免疫原性研究。OPS特異性IgG ELISA效價係以ELISA單位報告。在2次預防接種(P2)之後，比P0大於100倍之OPS特異性IgG抗體效價係無法用這些製劑中的任一種產生。這暗示了天然PA OPS（10-30 kDa）的分子大小太小，表位配價太低，或者分子結構不適合誘導反應，即使在做為具有載體蛋白PRO-CN之MAPS複合物時。
比較各種錯合到變異型MAPS中之KP-O1 OPS主鏈聚合物變異體的免疫原性研究係在兔子中進行。評估了與克雷白氏菌莢膜多醣(CPS) K19連接的KP O1 OPS的BP-1、BP-2a及BP-2b變異體的免疫原性。還評估了與K19連接的KP O5的BP-1變異體。比較了四種變異型MAPS複合物的混合物的免疫原性；2價KP-O1及-O5 OPS BP-1（其示意圖係顯示於圖2A中）；KP-O1 BP-2a（圖3）及KP-O1 BP-2b（圖4）。這些多醣全部皆與載體蛋白PRO-CN錯合在變異型MAPS中，並在注射前與明礬一起配製。對於預防接種前(P0)、第一次(P1)或第2次預防接種(P2)之後的血清，抗KP-O1 OPS IgG效價係以ELISA單位顯示，並顯示於圖16中。BP-2a OPS（12,000 EIA單位）顯示了O1 OPS特異性IgG效價係比P0大100倍。O1 OPS BP-1及O5 OPS BP-1顯示了比P0高10倍的效價。
同樣地，兔子中的免疫原性研究比較了PA-O6及-O10 OPS BP-1的各種製劑：具有明礬的2價PA-O6、-O10 OPS BP-1 PRO-CN MAPS；不含佐劑（無明礬）的2價PA-O6、-O10 OPS BP-1 PRO-CN MAPS；僅2價PA-O6、-O10 OPS BP-1多醣（明礬，無蛋白質）；2價PA-O6、-O10 OPS BP-1混合物，未錯合有PRO-CN（未生物素化；明礬；無變異型MAPS形成）；以及具有明礬的單價PA-IATS O6 OPS BP-1 PRO-CN MAPS（OPS的另外的PA O6菌株來源）。對於預防接種前(P0)、第一次(P1)或第2次預防接種(P2)之後的血清，抗PA-O6及PA-O10 OPS IgG效價係以ELISA單位給定並顯示於圖17中。只有當OPS主鏈聚合物存在於具有明礬的變異型MAPS複合物中時，才能實現PA-O6及PA-O10 OPS-特異性IgG比P0大100倍（在ELISA單位中的範圍為5,000-11,000）。
使用實驗室標準化的生長條件及化學成分確定的培養基所產生的KP OPS的大小在10-15 kDa的範圍內，相對小於在類似條件下獲得的PA OPS（20-30 kDa）的大小， 這些大小差異可能部分解釋了為什麼在此比較免疫原性研究中PA OPS BP-1會比KP OPS BP-1更具免疫原性。另一方面，KP OPS BP-2b構築體具有顯著的免疫原性（圖16）。OPS重複單元中的其他結構差異也可能是一個因素，諸如電荷，PA-O6和-O10的重複單元都帶負電，而KP-O1 OPS則呈中性。實例 7 ：功能性抗體測定 吞噬細胞助噬滅殺測定
使用HL-60的吞噬細胞助噬滅殺(OPK)測定法：測定法係如前述並加以修飾後執行(Ramachandran等人, 2016)。簡言之，測定法係於96孔圓底盤中執行，使用來自於對數生長期培養物稀釋至3x 105 細胞/ml之綠膿桿菌及克雷白氏肺炎菌菌株；幼兔補體(BRC)；做為多形核白血球來源的PMA分化的HL-60細胞（2x 107 細胞/ml）；及若干稀釋度的兔子免疫前/免疫血清。在37°C下培養45分鐘之後，從小孔中取出等分試樣並塗覆在細菌瓊脂盤上（5% Hy-酵母萃取物[Kerry Bio-Science公司]、10%未含動物之大豆蛋白腖[Teknova公司]、5% NaCl [Americanbio公司]及1.4%瓊脂[Americanbio公司]，在下文中稱為HySoy瓊脂或HSA）。在HSA上過夜培養之後計數CFU。當用免疫血清處理的細菌之CFU從近似稀釋度的免疫前血清的CFU降低時，即獲得陽性OPK反應。
圖18A以HL-60細胞及兔子抗血清比較了克雷白氏菌菌株KP 12-0581 (O1: K62)對於以下各物的反應：預防接種之前與第二次預防接種之後的KP-O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS（左圖）以及預防接種之前與第二次預防接種之後的KP-O1 OPS BP-2a /利查維啶PRO-CN MAPS（右圖）。當與在相同兔子中的免疫前血清(P0)相比時，在BP-2a免疫血清(P2)中觀察到顯著的KP滅殺性。對於BP-1免疫血清並未觀察到顯著的滅殺性，與利用這些構築體所得到的O1-OPS-特異性IgG效價結果一致，即在相對效價上BP-2a ＞ BP-1。
以HL-60細胞及兔子抗血清之假單胞菌菌株PA IATS O6對於二價PA O6, O10-OPS BP-1 PRO-CN MAPS及單價PA IATSO6 –OPS BP-1 PRO-CN MAPS的OPK結果係顯示於圖18B中。兩個兔子個體P2血清(AFV 624; AFV 625)對於PA O6, O10-BP-1 MAPS產生了顯著的PA IATSO6 OPK作用（圖塊左），兔子免疫後血清(P2)對於PA IATSO6-BP-1 MAPS產生了顯著的PA IATSO6 OPK作用，儘管血清AFV643 (P2)產生了暗示強OPS抗體效價的前帶效應。
以2價PA-O6, -O10 OPS BP-1-PRO-CN-MAPS疫苗產生的四個兔子個體免疫血清(P2)在HL-60細胞中誘導對假單胞菌O10細菌的強健OPK作用（圖18C）。
以彙集的兔子抗-Rhavi-FlaB-His抗血清及HL-60細胞對於標靶菌株綠膿桿菌菌株PAO1（O5:表現有FlaB）之OPK結果係顯示於圖22中。在此實驗中，抗-Rhavi-FlaB-His抗血清引發了一些OPK作用（達至稀釋度1/100）。以假單胞菌疫苗及抗假單胞菌FlaB血清所養的人類IVIG係顯出強OPK作用。(-)對照血清並未誘導任何OPK作用。使用人類 PMN 的 OPK 測定
測定係如前述並加以修飾後執行(Cross等人, 1986)。簡言之，測定法係於96孔圓底盤中執行，使用來自於健康人類供體以葡聚醣沉降及Ficoll-Hypaque密度梯度離心新鮮分離出的多形核白血球(PMN)。PMN儲備液係於含有鈣/鎂的HBSS中調整到23 x 106 細胞/ml。將60 µl的PMN儲備液添加至微量測試孔，以及在各種稀釋度中存有在或不存有10 µl熱滅活的免疫前或免疫後血清之下，添加10-20 µl的幼兔補體或新鮮正常人類血清(NHS)、10 µl的細菌(~106 CFU，MOI ~1:1)。於時間0取得樣本並稀釋及塗覆於HySoy培養盤上，接著將該96孔培養盤在37o C下震盪培養2小時。在2小時的時候，再次取得樣本並稀釋及塗覆。在37o C下隔夜培養之後，對培養盤進行計數。每個孔的2小時讀數係除以時間0的讀數，並以1.0-T2h CFU/T0 CFU 計算滅殺百分比。 替代性地，我們將各孔的CFU轉換成log CFU，從時間0的log CFU讀數中減去2小時樣本的log CFU讀數，並將滅殺的差異表示為「Δ log CFU」。我們接著用免疫前血清及免疫後血清與非抗體對照組比較得到每孔的滅殺結果。基於流式細胞儀分析之結合測定
將對數生長中期的綠膿桿菌及克雷白氏肺炎菌菌株濃縮於PBS中至OD600 為0.8。對於多醣抗原，在添加抗體係將細菌以1%甲醛固定。對於蛋白質抗原，為了保存細胞表面抗原，在添加抗體之前並不用甲醛來固定細菌。將細菌與各種稀釋度的兔子免疫前免疫血清/免疫血清一起培養1小時。未結合的抗體係藉由將細菌離心沉澱並用PBS洗滌而除去，洗滌過的細胞係與Alexa Fluor 488山羊抗兔子IgG抗體(Invitrogen公司)在室溫下一起培養1小時。未結合的抗體係藉由將細菌離心沉澱並用PBS洗滌而除去。免疫染色的細菌係以1%甲醛固定以滅殺任何存活的生物體。將樣本注射入LSR II流式細胞儀(BD公司)並使用FACS Diva (v. 6.1.3; BD)及FlowJo (v. 9.2; Tree Star)分析。
對於克雷白氏菌菌株B5055 (O1: K2)以兔子抗血清對K-19: O1-及O5-OPS BP-1以及BP-2a PRO-CN MAPS之FC結合結果係顯示於圖19A中。對於完整克雷白氏菌菌株B5055，顯示了個別的兔子血清對2價KP O1, O5 OPS BP-1 (#651-655) (左圖)及KP O1 OPS BP-2a (#666-670) (右圖)之FC結合結果。
如表10中所示，這些含有完整細菌的FC結合結果係與對於純化的KP O1 OPS之對應IgG ELISA效價有很高的關聯性，亦即，低效價對應了低FC結合程度，少數雙陽性事件表明在KP B5055上的抗體結合力薄弱或OPS抗體的可及性受限。表 10 ： 對於 O1-OPS 主鏈聚合物 BP-1 MAPS 及 BP-2a MAPS 構築體之 KP O1-OPS IgG ELISA 效價
圖19B係比較三種克雷白氏菌O1菌株與用KP O1 OPS BP-2a PRO-CN MAPS複合物養出的兔子抗血清(AFV667)的FC結合散佈圖；在上面圖塊中可觀察到對於KP B5055的結合力弱（左），與克雷白氏菌菌株K. caroli的結合力弱（中），而對於未囊封的KP CVD 3001的結合力強（右）。在下面圖塊（圖19B）中，其係對同樣三種克雷白氏菌O1菌株比較以2價KP O1, O5 OPS BP-1 (AFV651) PRO-CN MAPS免疫接種的兔子血清與以單價KP O1 OPS BP-2a PRO-CN MAPS所養出的兔子血清(AFV667)之間的FC全部結合結果。值得注意的是，與O1 OPS BP-2a構築體的FC抗體結合力係比與對應的BP-1 OPS的結合力更為顯著，且這些數據似乎與對於O1 OPS的IgG效價有關連性，亦即，KP O1 OPS BP-2a係比其等效物BP-1有更強的免疫原性。這些結合數據也暗示了CPS數量會影響抗體OPS的裸露，這可能受到生長條件的影響。
FC抗體對於完整假單胞菌菌株PAK (O6:FlaA1)的結合力比較結果係顯示於圖20中：兔子血清（3隻兔子的彙集血清，第二次預防接種之後）對2價PA-O6, -O10天然OPS-PRO-CN-MAPS（左）；兔子血清（3隻兔子的彙集血清，第二次預防接種之後）對2價PA O6, O10-OPS BP-1-PRO-CN MAPS（中）；兔子血清（3隻兔子的彙集血清，第二次預防接種之後）對單價PAO6-IATS -OPS BP-1-PRO-CN MAPS；當與天然形式的PA O6 OPS MAPS相比時，觀察到PAO6 OPS BP-1 PRO-CN MAPS與PAK菌株的FC抗體結合更強，表明OPS最低的大小對其免疫原性至關重要，亦即，天然PA OPS的大小太小且需要通過化學鍵聯到主鏈多醣來增大，以增加其表位配價以及其大小。
對於以含有FlaB表位的不同利查維啶FP變異體所養出之個別兔子抗FlaB抗體之假單胞菌菌株PAO1（表現FlaB的O5）的結合力係藉由FC來檢驗，並總結在表11中。與第三次預防接種(P3)之後的血清相比，3隻兔子個體血清對於融合蛋白抗原的結果顯示出其結合百分比高於閾值且免疫前血清(P0)有高結合力。這些結合數據顯現出，利查維啶FlaB-D2及FlaB-PcrV融合蛋白可以誘導強抗體結合並識別出會表現FlaB鞭毛的完整假單胞菌菌株PAO1，暗示了這兩種蛋白質係通過正確的折疊而產生，且對於完整假單胞菌細菌上的天然鞭毛B表位係能夠特異性地誘導FlaB抗體。抗RhaviFlaB-D2-MrkA融合蛋白血清並沒有顯著地（或者充其量很差地）識別完整假單胞菌菌株PAO1上的鞭毛，表明利查維啶構築體的FlaB部分並未正確折疊或在評估時單獨以一個單白質與佛氏佐劑進行預防接種的情況下含有MrkA的融合蛋白並沒有足夠的免疫原性。
表11中列出的一些兔子個體血清(#792、#798及#800)的FC散佈圖係也顯示於圖21B中（上圖）且顯示出兔子個體# 792 (P3放血)血清與利查維啶FlaB-D2的FC結合力強；（中圖）兔子血清＃798（P3放血）與利查維啶FlaB-PcrV的FC結合力居中；以及（底部）兔子個體血清#800（P3放血）與利查維啶FlaB-D2-MrkA的FC結合力差。在圖21A中，來自於用利查維啶FlaB-結構域2融合蛋白（缺乏TL5結合區域）(P3)進行預防接種之兔子的兔子彙集血清係顯示其與免疫前(P0)相比係有高比例的已標記假單胞菌菌株PAO1群體（散佈圖右圖）。表 11 ：兔子抗 FlaB 抗體對假單胞菌菌株 PAO1 菌株之 FC 結合力（表現 FlaB 的 O5 ）
ELISA及FC結合數據支持了含有FlaB的利查維啶融合蛋白（諸如利查維啶FlaB-結構域2及利查維啶FlaB-PcrV）可以用適當的折疊產生，以誘導能夠識別完整假單胞菌生物體上之天然鞭毛B的功能性抗體的看法。移動性及移動性抑制測定
綠膿桿菌菌株PAO1（(O5:會表現FlaB）係在HySoy培養液中生長至對數生長中期。細菌係藉由離心沉澱，並懸浮於PBS中至OD600 讀數為0.3，接著在PBS中稀釋100倍。在存有或不存有針對鞭毛蛋白培養之各種稀釋度的抗血清的情況下，將軟瓊脂倒入24孔培養盤中。以重複三孔的方式進行抗血清稀釋。將燒紅過的針浸入細菌懸浮液中，接著用以接種瓊脂塞的中心。使培養盤在30°C 下培養14小時或更久，直至細菌從接種位點擴散到瓊脂表面。通過數位相機擷取培養盤影像以記錄細菌菌落的直徑。當在具有抗鞭毛蛋白血清的瓊脂上的菌落大小相對於免疫前血清顯著降低時，即發生陽性移動性抑制試驗。
以利查維啶FlaB構築體免疫接種的兔子血清之ELISA及對應的移動性抑制效價：Rhavi-FlaB-D2; Rhavi-FlaB-PcrV; 及Rhavi-FlaB-D2-MrkA係總結於表12中。在此表中，也顯示出FlaA1和FlaB的ELISA效價為第三次預防接種之後(P3)的抗血清，及使用綠膿桿菌菌株PAO1（O5：會表現FlaB）之各個P3抗血清的移動性抑制效價。抗-FlaB抗體濃度（ELISA效價）與相應的移動性抑制效價之間係有良好的關聯性，亦即具有高效價的FlaB特異性抗體的Rhavi-FlaB-D2及Rhavi-FlaB-PcrV抗血清皆會誘導高程度的PAO1移動性抑制作用，而Rhavi-FlaB-D2-MrkA融合蛋白構築體則沒有，可能是因為低濃度的FlaB抗體可能是由於構築體中FlaB蛋白組分的不當折疊或者是在評估時單獨以一個單白質與佛氏佐劑進行預防接種的情況下含有MrkA的融合蛋白並沒有足夠的免疫原性。表 12 ：含有不同利查維啶 FlaB 的構築體之 ELISA 及移動性抑制效價 細胞毒性測定（用於 PcrV 蛋白構築體）
測定係如下進行。簡言之，將針對細菌分泌系統蛋白PcrV養出的兔子抗血清加入到種在平底96孔培養盤(Corning Costar公司)中的A549細胞內。所有抗血清及細菌的稀釋均在不含抗生素的RPMI培養液中進行。將表現ExoU之對數生長期的綠膿桿菌菌株PAK以約10的MOI加入並在37°/5% CO2 下培養2小時，在此期間A549細胞中毒並且不再存活。通過細胞攝取活體染劑中性紅(Neutral Red)來估計每個孔中的活細胞數量（假單胞菌也代謝Alamar Blue而無法使用）。通過測量Neutral Red吸光度並將這些值與未暴露於細菌下的細胞進行比較而估計每個孔中的活細胞百分比。當PcrV抗血清與相等稀釋度的免疫前血清相比增加活細胞數量（即能夠攝取Neutral Red的細胞）時，此測定即發生陽性測試結果。
以假單胞菌細菌預防細胞毒性的模型(Warrener等人, 2014)已使用來測試抗Rhavi-FlaB-PcrV FT兔子抗體的效價，並顯示在圖24A中。保護A549 (肺癌細胞)不受假單胞菌菌株PAK (O6:FlaA1)中毒之抗PcrV抗體係以下方式獲得。在用Rhavi-FlaB-PcrV融合蛋白免疫接種之兔子10%血清（3隻的彙集血清，第3次預防接種之後，P3）的存在下，以單胞菌菌株PAK (O6:FlaA1)感染A549單層4小時。與免疫前血清相比，抗Rhavi-FlaB-PcrV血清係保護細胞免於假單胞菌菌株PAK中毒，如同在較少的圓形分離細胞中所觀察到。在隨後的實驗中（圖24B），A549單層細胞係在各種稀釋度的血清抗Rhavi-FlaB-PcrV（彙集3隻，P3）的存在下以假單胞菌菌株PAK感染4小時。細胞係以PBS洗滌並與Neutral-Red一起培養1小時。將細胞裂解並記錄每個孔中的染劑吸光度。與免疫前血清相比，抗Rhavi-FlaB-PcrV (P3)血清在稀釋度1至40係可保護細胞免於PAK中毒。
不希望受任何理論束縛下，對於Rhavi-FlaB-PcrV的多株反應性質以及其在融合蛋白內的構型可能是抗體對PcrV組分的親和力增加的原因。若干假單胞菌菌株係經過此使用A549細胞及抗FlaB-PcrV兔子血清（第3次預防接種之後，P3）之細胞毒性測定的測試（圖25）：高毒性PA IATS O1（閉合菱形），未觀察到受到血清的細胞毒性保護；具細胞毒性的PA M-2 O5菌株（閉合圓形），也沒有血清保護作用；非細胞毒性PA IATS O6（閉合三角形），未發現毒性；具細胞毒性的PA 17002 (O10)（閉合矩形），有明顯的血清保護作用；取決於菌株的這些血清保護變化可能反映出假單胞菌菌株上的PcrV靶標表現與程度。細胞黏附測試
克雷白氏菌與A549細胞的黏附係如前述(Clements等人, 2008)並加些許修飾後測試。針對纖毛蛋白MrkA所養出的兔子抗血清係稀釋於RPMI緩衝液（不含補充物）中，並加入到種在96孔培養盤中的A549細胞內。將等體積的克雷白氏肺炎菌O5菌株6997 (104 CFU/ml)與抗血清稀釋液混合。將感染的細胞在37ºC及5% CO2 下培養1小時，然後用無菌PBS將孔洗滌6次以除去未結合的細菌。用0.1% Triton X-100之PBS溶液裂解細胞，並將等分試樣的溶液塗覆到HSA上。將培養盤過夜培養並計數CFU數。與相同稀釋度的免疫前血清相比，當用MrkA抗血清降低黏附的克雷白氏菌的數量時，即發生陽性測試結果。
通過抗Rhavi-FlaBD2-MrkA兔子血清阻斷克雷白氏菌KP O5 6997（起源於南非）黏附A549細胞的結果係顯示於圖23中。高效價Rhavi-FlaBD2-MrkA（第三次預防接種之後，P3）特異性血清係顯著抑制KP菌株6997結合到A549細胞直至1/1000的稀釋度，而免疫前血清(P0)則不。這表明Rhavi-FlaBD2-MrkA FP的MrkA蛋白組分係經正確折疊並且能夠引發對於KP細菌表面的天然MrkA具特異性的功能性阻斷抗體。第二個實驗係使用藉由用兩種MrkA利查維啶融合蛋白Rhavi-FlaB-D2-MrkA及Rhavi-PcrV-MrkA進行預防接種而獲得的個別抗MrkA兔子抗血清來進行，其結果係總結於表13中。所有的MrkA FP兔子血清（除了#804之外）皆能夠降低克雷白氏菌O5菌株6997對A549細胞的黏附，表明這2個利查維啶FP具有引發功能性MrkA特異性抗體的潛力。表 13 ：抗 MrkA 血清抑制了克雷白氏菌 O5 菌株 6997 結合到 A549 細胞 MrkA 抗體反應測定
表現MrkA / 3型纖毛的克雷白氏菌係藉由抗MrkA抗體而凝集，導致細菌聚集並從溶液中脫落。由已經用Rhavi-MrkA-his、Rhavi-FlaB-D2-MrkA-his或Rhavi-PcrV-MrkA-his載體蛋白接種的兔子來評估免疫前血清或免疫血清。將克雷白氏菌菌株4425 (O5: K57)與血清之PBS稀釋液在25°C下於96孔圓底微量滴定盤中培養1小時。輕輕搖動滴定盤以使非凝集的細菌懸浮。小心取出每個孔的上清液並轉移到新的微量滴定盤中，測量600 nm的光散射以評估溶液濁度。當吸光度從不含抗體的對照孔的吸光度降低即獲得陽性測試結果，表明上清液中的細菌數量減少是因為抗體誘導了凝集作用。於藉由600 nm的吸光度差異測量時，將測定結果記錄為由免疫血清對肺炎克雷伯氏菌凝集的最高抗體稀釋度（最低濃度）係高於免疫前血清。
以兔子抗血清對不同MrkA利查維啶融合蛋白構築體Rhavi-FlaB-D2-MrkA及Rhavi-PcrV-MrkA，克雷白氏肺炎菌O5K57、菌株4425及O1 K22、菌株170381的凝集評估結果 係總結於表14中。第二次(P2)及第三次(P3)預防接種後對每個構築體具特異性的3隻兔子個體抗血清的效價為具有可檢測到凝集的最高血清稀釋度。在此實驗中，使凝集的團塊沉降，並在光密度(OD) 600 nm下測量剩餘的（非凝集的）的細菌數量。由2種構築體Rhavi-FlaB-D2-MrkA和Rhavi-PcrV-MrkA誘導的MrkA特異性抗體係識別在這兩種克雷白氏菌菌株上表現的MrkA，表明這2種融合蛋白上的MrkA組分係正確折疊並產生功能性抗體反應。表 14 ：通過利查維啶 FP MrkA- 特異性抗體之克雷白氏菌凝集結果 實例 8 ：綠膿桿菌熱損傷及菌血症小鼠模型
熱損傷及菌血症模型係如前述(Neely等人, 2002)並加以修飾而進行。對於熱損傷，將11週齡CD-1遠親雜交小鼠背部剃毛並用***及甲苯噻嗪麻醉，之後暴露於具有1×1.5英寸開口的耐熱聚合物卡片模板。此平台係設計用來誘導12-15%的總體表面積熱損傷。將乙醇(0.5 ml 100%)均勻地塗抹在窗口所勾勒的背部區域上，點燃並使其確切燃燒10秒鐘然後吹熄。燒傷後立即給予小鼠0.5 ml無菌生理鹽水進行水合作用。接著在熱傷口皮下注射綠膿桿菌。不覆蓋傷口。感染後密切監測動物的死亡率及器官負荷14天（即遠距擴染）。
為了評估抗假單胞菌FlaB兔抗體的效價，使用燒傷敗血症小鼠模型(Cryz等人, 1984)。在此模型中，CD1小鼠係如上所述燃燒，並將28 CFU的綠膿桿菌菌株M2 (O5:FlaB)（燒傷感染LD50 ＜ 1 x 102 )注射入燒傷傷口內。在燒傷攻擊之前，向CD-1小鼠IP注射PBS、免疫前或抗-FlaB血清。如圖26中的Kaplan-Meier存活圖所示，以表現FlaB之假單胞菌菌株M2攻擊傷口的小鼠係受到抗-FlaB的保護達10天或更久，而來自其他群組的所有小鼠均死於傷口攻擊。
在菌血症模型中，7週齡BALB/c小鼠在用克雷白氏肺炎菌或綠膿桿菌進行IV攻擊之前的24小時，係藉由IP施用方式以對照IgG處理或以疫苗誘導的抗體處理。取決於生物體，以1-4小時的間隔對動物進行放血以監測血液的清除率，並通過在感染後1-24小時對小鼠實施安樂死並收穫肝臟及脾臟來進行。 實例9：小鼠保護測定清除及器官負荷小鼠模型
KP OPS特異性抗體之預防克雷白氏菌感染的能力係於清除及器官負荷小鼠模型中測試。CD1小鼠（3組）係IP施與抗KPO1 BP-2a OPS-PRO-CN MAPS的兔子血清，並接著克雷白氏菌KP B5055 O1 (9x104 CFU)攻擊(IV)。在攻擊14小時之後測量脾臟KP活菌計數。與接受免疫前血清(P0)的小鼠脾臟相比，觀察到接受免疫血清(P2)的小鼠脾臟中KP活菌計數顯著降低（圖27）。此數據表明由OPS BP-2a MAPS疫苗誘導的O1 OPS特異性抗體具有從小鼠脾臟中清除生物體的能力，因此對克雷白氏菌感染具有保護性。於水楊酸鈉中生長的 KP (O1: K2)
克雷白氏肺炎菌菌株B5055 (O1: K2)係隔夜生長在含有2.5 mM水楊酸鈉(Sigma公司)的HySoy培養液中，以減少CPS的表現(Domenico, 1989)。含有2.5 mM水楊酸鈉12 ml的HySoy培養液係以5%過夜培養方式接種且接著生長至對數生長中期(在37ºC下震盪)。細菌係經離心沉澱並重新懸浮於無菌PBS中至約1 x 108 CFU/ml的濃度。經濃縮的細菌係稀釋在PBS中至2 x 105 CFU/ml。IP施與0.1 ml兔子血清1小時之後，8-12週齡的雌性小鼠CD-1係以0.1 ml的2x 104 CFU B5055進行IP感染。在7天的時間內監測小鼠的死亡率。
在實驗1中，於以 2x104 的KP O1 B5055生物體進行IP攻擊之前1小時，係經IP給予CD1小鼠0.1 ml的KP O1 OPS BP-1; BP-2a PRO-CN MAPS兔子或HK KP O1: K2兔子抗血清(以1/10稀釋)。實驗結果係總結於表15中。表 15 ：以生長在水楊酸鈉中的 KP O1: K2 進行小鼠被動保護
在實驗1中，陽性對照組HK KP O1細菌及KP O1 OPS BP 2 PRO-CN MAPS抗血清係針對KP O1: K2 (B5055)的攻擊提供完全保護，其中PBS對照組及KP O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS抗血清並未保護小鼠。
在實驗2中，在以2x104 的KP O1 B5055細菌進行IP細菌攻擊之前，CD1 小鼠（每組5隻）係經IP給予0.1 mL的兔子免疫或免疫前彙集血清。接受PBS及KPO1 HK血清(以1/10稀釋)的小鼠係分別做為陰性及陽性對照組。所有KP O1 OPS PRO-CN MAPS係能夠在該模型中提供保護，儘管接受BP-2a的小鼠（5隻中的4隻）在攻擊中生存得更好。KP O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS血清提供了一些保護，5隻小鼠中有2隻存活。接受PBS的小鼠均未在攻擊中存活。這些存活結果非常一致，並且與抗KP O1 OPS特異性IgG ELISA效價的程度非常有關聯（即，用更高濃度的抗體可觀察到更好的保護程度）。於小鼠模型中針對假單胞菌生物體之被動保護
PA OPS特異性抗體之預防假單胞菌感染的能力係在被動保護存活小鼠模型中使用被PA菌株17002 (O10) IP攻擊的CD1-小鼠以及D-半乳糖胺來測試，以使動物對內毒素的致死效應敏感(Galanos等人, 1979)並使它們更容易受到感染。在用(1x106 CFU)及D-半乳糖胺攻擊之前1小時，小鼠係接受兔子抗2價PA O6/O10 BP-1 PRO-CN MAPS（兔子AFV624或AFV629，以IP方式給予）。結果係總結於表16中。在此保護研究中，與免疫前血清(AFV624 P0)相比，PA O6/O10 2v BP-1 PRO-CN MAPS免疫血清(AFV624; P2)給小鼠針對PA O10菌株17002的保護多40%。同樣地，與免疫前血清(AFV629 P0)相比，PA O6/O10 2v BP-1 PRO-CN MAPS免疫血清(AFV629; P2)給小鼠針對PA O10菌株17002的保護多40%。以熱滅菌的PA O10細菌所養出的高效價兔子抗血清陽性對照組相對於PBS對照組係產生顯著的保護性。與PBS (AFV624 P0)相比，來自一些兔子的免疫前血清可提供一些保護性。於藉由ELISA測量時，保護程度（存活的）和疫苗誘導的PA O10 OPS特異性IgG抗體程度之間似乎存在某種關聯性（表16）。表 16 ：在以 PA O10 菌株 17002 與來自 2 價 PA O6/O10 BP-1 PRO-CN MAPS 群之 D- 半乳糖胺攻擊的小鼠中之被動保護。 圖28係繪示小鼠被動保護的Kaplan-Meier存活結果，其係於以生長在柳酸鹽中的克雷白氏菌菌株B5055 (O1: K2)感染之前，針對KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS施與兔子血清以降低莢膜的表現。CD1小鼠（每組5隻）在用2x 104 CFU克雷白氏菌菌株B5055 (O1: K2) IP細菌攻擊之前，係IP給予0.1 mL的兔子免疫(P2)或免疫前(P0)彙集血清。其顯示了用於接受P0或P2 KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS血清之小鼠的Kaplan-Meier存活圖。對於已接受KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS抗血清存活的且相對於施與P0血清的小鼠延長一段時間之小鼠，P2血清在該模型中保護了較高比例的小鼠。實例 10 ：例示性多效價免疫原性組成物 例示性 4 價 KP 疫苗
4種不同的免疫原性複合物係單獨製備並接著配製在一起以製備例示性4價KP疫苗。
各複合物係含有BP-1聚合物，其係藉由來自於KP單一細菌血清型的OPS與氧化的K19多醣共軛以及隨後K19多醣的生物素化來製備。這些係接著與利查維啶融合載體蛋白錯合。這些複合物中之每一者的組分係詳列於表17中。表 17 ：包含在例示性 4 價 KP 疫苗中的複合物組分。
這四種複合物係與如下面表21中詳列的佐劑配製一起。例示性 8 價 PA 疫苗
8種不同的免疫原性複合物係單獨製備並接著配製在一起以製備例示性8價PA疫苗。
各複合物係含有BP-1聚合物，其係藉由來自於單一PA細菌血清型的OPS與氧化的K19多醣共軛以及隨後K19多醣的生物素化來製備。這些係接著與利查維啶融合載體蛋白錯合。這些複合物中之每一者的組分係詳列於表18中。表 18 ：包含在例示性 8 價 PA 疫苗中的複合物組分。
這八種複合物係與如下面表21中詳列的佐劑配製一起。例示性 12 價 KP/PA 疫苗 1
12種不同的免疫原性複合物係單獨製備並接著配製在一起以製備例示性12價KP/PA疫苗1。
各複合物係含有BP-1聚合物，其係藉由OPS與氧化的K19多醣共軛以及隨後K19多醣的生物素化來製備。這些係接著與利查維啶融合載體蛋白錯合。這些複合物中之每一者的組分係詳列於表19中。表 19 ：包含在例示性 12 價 KP/PA 疫苗 1 中的複合物組分。
這十二種複合物係與如下面表21中詳列的佐劑配製一起。例示性 12 價 KP/PA 疫苗 2
12種不同的免疫原性複合物係單獨製備並接著配製在一起以製備例示性12價KP/PA疫苗2。
各複合物係含有BP-1聚合物，其係藉由OPS與氧化的K19多醣共軛以及隨後K19多醣的生物素化來製備。這些係接著與利查維啶融合載體蛋白錯合。這些複合物中之每一者的組分係詳列於表20中。表 20 ：包含在例示性 12 價 KP/PA 疫苗 2 中的複合物組分。
這十二種複合物係與如下面表21中詳列的佐劑配製一起。實例 11 ：綠膿桿菌 / 克雷白氏肺炎菌 12 價疫苗的兔子預防接種研究 動物的預防接種
在兔子預防接種之前，在注射前用佐劑配製例示性4價KP疫苗、例示性8價PA疫苗、例示性12價KP/PA疫苗1及例示性12價KP/PA疫苗2約48小時。對於每種血清型BP-1的5 µg PS劑量，複合物係以10 µg/ml的最終濃度吸附佐劑，而對於1 µg PS劑量，複合物係以2 µg/ml的最終濃度吸附佐劑，以具有40 mM組胺酸、pH 5.5、150 mM NaCl及1.25 mg/ml磷酸鋁凝膠之單價或多價混合物在4°C下翻滾混合過夜。這些配製的混合物係以每劑0.5 ml的體積直接用於預防接種。例示性4價KP疫苗、例示性8價PA疫苗、例示性12價KP/PA疫苗1及例示性12價KP/PA疫苗2的組成物總結係提供於表21中。表 21 ：兔子研究 NCB012 中所使用的疫苗製劑總結。
將12價KP/PA疫苗1施與治療組5及6（用FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV做為載體蛋白），並將12價KP/PA疫苗2施與治療組1及2（用FlaBD2-MrkA做為載體蛋白）。此研究包含了兩個接受8價PA疫苗或4價KP疫苗的額外治療組以進行比較。治療組3係接受8價PA疫苗，而治療組4接受4價KP疫苗。第1、3、4及5組係接受5 μg的各種疫苗多醣(PS)，治療組2及6係接受較低劑量的1μg各種疫苗PS。所有疫苗皆含相同量的磷酸鋁佐劑(625 μg)。
以4週的間隔向4個月大的新西蘭白兔（Cocalico Biologicals公司，每組n = 10）施與兩次IM預防接種(0.5 ml)。在第一次預防接種後4週及第二次預防接種後2週收集血液樣本。對於 OPS 的免疫反應 與4價KP疫苗相比下之對於12價KP/PA疫苗1之KP OPS的免疫反應
圖29係繪示與4價KP疫苗（劑量5 μg，治療組4）相比下之對於用12價KP/PA疫苗1（劑量5 μg，治療組5）預防接種之兔子彙集血清的KP OPS IgG終點ELISA效價的結果。
對所有KP OPS疫苗血清型（以及KP19 CPS）的強健IgG反應係顯現出，4價KP疫苗中的各種KP OPS類型之間的效價與12價KP/PA疫苗1之各個對應KP OPS IgG效價沒有顯著差異。以12價KP/PA疫苗1誘導係有著KP OPS反應稍微較好的趨勢。這些結果也表明，當其與包含在12價KP/PA疫苗1中之另外8種PA OPS（皆製備為BP-1 MAPS）組合時，對於4價KP疫苗之各種KP OPS的免疫反應沒有負面干擾。 與8價PA疫苗相比下之對於12價KP/PA疫苗1之PA OPS的免疫反應
圖30係繪示與8價PA疫苗（劑量5 μg，治療組3）相比下之對於用12價KP/PA疫苗1預防接種之兔子彙集血清的PA OPS IgG終點ELISA效價的結果（劑量5 μg，治療組5）。
如針對KP OPS反應所觀察到的，對所有PA OPS疫苗血清型的強健IgG反應係顯現出，8價PA MAPS疫苗中的各種PA OPS類型之間的效價與12價KP/PA疫苗1之各個對應PA OPS IgG效價沒有顯著差異。這些結果表明，當其與12價KP/PA疫苗1中之另外4種KP OPS（皆製備為BP-1 MAPS）組合時，對於8價疫苗之各種PA OPS的免疫反應沒有負面干擾。強健的IgG反應也顯現出，在一次預防接種(P1)之後的各種PA OPS在第二次預防接種(P2)之後沒有顯著增加。 在兩次不同劑量濃度下之對於12價KP/PA疫苗1的免疫反應
圖31係繪示在與疫苗中有1 μg之各類BP所獻出的PS之12價KP/PA疫苗1（治療組6）相比之下，以在疫苗劑量中有5 μg之各類BP所獻出的PS之12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子彙集血清之PA OPS IgG終點ELISA效價的結果（治療組5）。
當在一次預防接種(P1)之後或兩次預防接種(P2)之後對5 μg劑量及1 μg劑量治療組進行比較時，觀察到12價KP/PA疫苗1之對於PA及KP OPS的IgG效價沒有顯著差異，除了KP O3的第二次預防接種顯示出IgG反應有改善之外。
第一次預防接種(P1)後第28天及第二次預防接種(P2)後第14天之12價KP/PA疫苗1的個別IgG OPS特異性ELISA效價係顯示於圖32及圖33中。5 μg劑量（圖32）及1 μg劑量（圖33）的12價KP/PA疫苗1顯現出對於所有12種OPS疫苗血清型及對於KP K19 CPS有強健IgG反應。然而，儘管有強健的反應，但對OPS KPO2及KPO3的IgG反應幅度不如對KPO1及KPO5的反應那麼大，特別是在第一次預防接種後。觀察到KO K19有最高的反應。
對5 μg劑量治療組進行了對於12價KP/PA疫苗1的抗OPS IgG的個別誘導x倍數比較。結果係顯示於圖34中。除了兩個異常值之外，所有動物對於各種OPS血清型皆顯示出誘導了ELISA效價超過基線(P2/P0)至少4倍。對於12價KP/PA疫苗1，所有OPS血清型平均皆誘導超過20倍。觀察到KO 19有最高誘導結果。
圖35係提供了比較5 μg及1 μg劑量的12價KP/PA疫苗1的抗OPS IgG ELISA效價超過於基線(P2/P0)的個別誘導x倍數結果。有趣的是，如已對於5 μg劑量治療組所述，1 μg劑量治療組的所有動物皆顯示出比基線增加至少4倍。對於以5 μg以及1 μg施與動物的所有OPS血清型，包含在12價KP/PA疫苗1中的所有OPS血清型之IgG效價平均增加x倍數係超過基線增加20倍。在兩個劑量濃度皆觀察到KO K19有最高的誘導x倍數，且觀察到KP O2及KP O3有最低的誘導x倍數。 在兩個不同劑量濃度下之對於12價KP/PA疫苗2的免疫反應
圖36係顯示用12價KP/PA疫苗2進行預防接種之兔子在第一次免疫接種(P1)後第28天及第二次免疫接種後第14天(P2)的彙集血清中的KP/PA OPS反應的比較結果。值得注意的是，在5 μg劑量治療組中，疫苗在第一次預防接種之後對所有OPS血清型誘導了強健的IgG反應，在第二次預防接種後的效價沒有顯著增加，除了KP O2及KP O3 OPS之外。對於那些OPS血清型，第二次預防接種產生了顯著的效價增加。對於5 μg及1 μg劑量治療組，OPS IgG反應是相等的，除了KP O3 OPS在較低劑量下顯示出較低的免疫原性反應。
第一次預防接種(P1)後28天及第二次預防接種後第14天(P2)之對於12價KP/PA疫苗2的個別IgG OPS特異性ELISA效價係顯示於圖37及圖38中。5 μg劑量（圖37）及1 μg劑量（圖38）的12價KP/PA疫苗2係顯現出對於所有12種OPS疫苗血清型以及KP K19 CPS的強健IgG反應。在第二次免疫接種後14天，各種OPS血清型的效價係進一步增加。然而，除了KP O3之外，此增加幅度並不顯著。如在12價KP/PA疫苗1所觀察到的，5 μg及1 μg劑量治療組之間的免疫反應差異很小。觀察到OPS血清型KO K19有最高的效價，且觀察到KP O2及KP O3有最低的反應。 12價KP/PA疫苗1及12價KP/PA疫苗2的OPS免疫反應總結
對於兔子彙集血清中之12價KP/PA疫苗1中之所有PA OPS的抗OPS免疫反應係相當於8價PA MAPS疫苗的抗OPS免疫反應。
對於兔子彙集血清中之12價KP/PA疫苗1中之所有KP OPS的抗OPS免疫反應係近似於或稍微較佳於4價KP MAPS疫苗的抗OPS免疫反應。
觀察到PA OPS抗體係超過基線約200倍，而KP OPS抗體係超過基線約50倍。
在12價KP/PA疫苗1及12價KP/PA疫苗2之間，在彙集血清中之用於每BP劑量5 μg PS及每BP劑量1 μg PS的治療組的抗體是相似的，除了KP O3之外。
對於12價KP/PA疫苗1，用於每BP劑量5 μg PS及每BP劑量1 μg PS的治療組的個別血清分析顯現出，在單次預防接種後對所有KP及PA OPS有強健反應，在第二次預防接種後幾乎沒有增加，除了對KP O2及KP O3 OPS的反應之外，其中第二次預防接種係產生顯著的IgG抗體效價增加。
對於12價KP/PA疫苗2，用於每BP劑量5 μg PS及每BP劑量1 μg PS的治療組的個別血清分析也顯現出，在單次預防接種後對所有KP及PA OPS有強健反應，在第二次預防接種後幾乎沒有增加，除了對KP O3 OPS的反應之外，其中第二次預防接種係產生顯著的IgG效價增加。載體蛋白的性能 對於載體蛋白的抗體反應
以用FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV做為載體蛋白的12價KP/PA疫苗1和僅用FlaBD2-MrkA做為載體蛋白的12價KP/PA疫苗2所誘導的載體蛋白抗體反應係經評估。對於個體兔子載體蛋白的反應係表示為免疫前(P0)程度的ELISA IgG單位，並在一次(P1)及兩次預防接種(P2)之後獲得。使用相應的個別重組蛋白組分做為包覆抗原（即FlaBD2、MrkA及PcrV）來判定個別兔子IgG對於載體蛋白的ELISA分析。在每個分析中，係將對於疫苗1及2的載體蛋白組分的反應與對於8價PA FlaBD2-MrkA疫苗及4價KP FlaBD2-MrkA疫苗的反應進行比較。表21中提供了疫苗劑量及治療組的詳細說明。 (a) 不同載體蛋白的ELISA結果
FlaB-D2的ELISA IgG效價的結果係提供於圖39中。在第一次預防接種之後係觀察到IgG效價強健增加，然後在所有比較的群組中第二次預防接種之後其效價第二次增加。在每次免疫接種後的抗體濃度在所有群組之間是相似的，該等群組分別為兩個不同的劑量組（由存在於疫苗組成物中之各類複合物所獻出之1 μg或5 μg的總PS，例如，存在於12價KP/PA疫苗1及疫苗2組成物中之全部12 μg或60 μg的PS）之12價KP/PA疫苗1及12價KP/PA疫苗2及8價PA疫苗及4價KP疫苗（在疫苗中皆有5 μg的PS，例如，分別總共有40 μg或20 μg的PS存在於疫苗中）。
MrkA的ELISA IgG效價的結果係提供於圖40中。如對於FlaBD2所觀察到的，在第一次預防接種之後係觀察到IgG效價強健增加，且在所有群組的第二次預防接種之後有另一次每組增加相似的上升，該等群組分別為兩個不同的劑量組（由存在於疫苗組成物中之各類複合物所獻出之1 μg或5 μg的總PS）之12價KP/PA疫苗1及12價KP/PA疫苗2及8價PA疫苗及4價KP疫苗（在疫苗中皆有由各類複合物所獻出之5 μg的PS）。
圖41係顯示在用12價KP/PA疫苗1（於該疫苗中有1 µg及5 µg的各種PS）進行預防接種後針對PcrV的抗體反應結果。第一次預防接種後有強健的IgG反應，且在第二次預防接種後的效價係進一步增加。然而，兩個劑量組之間的反應相似。
用FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV做為載體蛋白來誘導12價KP/PA疫苗1的載體蛋白反應，以FlaBD2-MrkA做為載體蛋白來誘導12價KP/PA疫苗2的載體蛋白反應，8價PA疫苗(FlaBD2-MrkA)及4價KP疫苗(FlaBD2-MrkA)在一次(P1)及兩次預防接種(P2)後之超過免疫前(P0)效價程度的ELISA效價x倍數變化係顯示於圖42中。
12價KP/PA疫苗1中的三種載體蛋白FlaBD2、MrkA及PcrV中之每一者係顯現出強健的反應，在第一次預防接種後有超過30倍的變化，且在第二次預防接種後有超過500倍的變化。在5 μg及1 μg劑量組之間並未觀察到對三種蛋白質的免疫原性有顯著差異。
在一次預防接種後已觀察到對兩種蛋白組分中之每一者有強健的IgG反應，對於12價KP/PA疫苗2中的兩種融合蛋白組分FlaBD2及MrkA係增加超過30倍。在第二次預防接種後觀察到有增加超過1000倍的額外顯著增加。在5 μg及1 μg劑量組之間，FlaBD2及MrkA的x倍數變化並未觀察到有顯著差異。
在接受8價PA疫苗或4價KP疫苗的群組之間並未觀察到FlaBD2及MrkA兩個組分的免疫原性有顯著差異。然而，與12價KP/PA疫苗2組及8價PA疫苗組相比，4價疫苗組中的這些反應略低。 (b) 在三個研究中對於不同載體蛋白的IgG反應的x-倍數變化比較
對於FlaB的IgG反應的x-倍數變化比較係在三個兔子免疫原性研究中檢驗：NCB007、NCB008及NCB012。在NCB007中，5 μg劑量的6價PA FlaBD2-MrkA（含有PA O1、O2、O3、O6、O10及O11 OPS）係與相等的6價PA FlaB-PcrV比較，在NCB008中係將5 μg劑量的4價（O1、O2、O3、O5）KP FlaBD2-MrkA的劑量與4價KP FlaB-PcrV進行比較，並在NCB012中將5 μg劑量之具有FlaBD2-MrkA的12價KP/PA疫苗2與具有FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV的12價KP/PA疫苗1進行比較。所有疫苗均為BP-1支架型。x倍數變化的結果係提供於圖43、圖44及圖45中。
圖43係顯示對FlaB的IgG反應的x倍數變化，對12價KP/PA疫苗1及12價KP/PA疫苗2的反應增加最高。在第一次預防接種後已觀察到良好反應，且在第二次預防接種後有進一步的增加。在NCB008中對於4價KP FlaBD2-MrkA及4價FlaB-PcrV複合物的反應顯示出在第一次預防接種後有良好的反應，且在FlaBD-2-MrkA的第二次預防接種後幾乎沒有額外的增加，並且在任一次的FlaB-PcrV預防接種後基本上沒有反應。在NCB007中的第一次預防接種之後，也觀察到6價PA FlaBD2-MrkA對FlaB的反應不佳，但在第二次預防接種後即引發顯著的增加。在NCB007中對FlaB-PcrV的反應於第一次預防接種後是強健的，在第二次預防接種後則未額外增加。
圖44係顯示當與對於NCB008中之4價KP FlaBD2-MrkA及NCB007中之6價PA FlaBD2-MrkA的反應相比時，NCK012中之12價KP/PA疫苗2及12價KP/PA疫苗1對於MrkA的反應有反應最高的基線變化。在第一次及第二次免疫接種後，在NCB008中幾乎沒有觀察到對MrkA的反應，而在6價PA FlaBD2-MrkA第一次預防接種後觀察到對於MrkA有強健的反應，且在第二次預防接種後進一步增加。
圖45係顯示在NCB012研究中的第一次及第二次預防接種後12價KP/PA疫苗1對於PcrV的IgG反應的x倍數變化有最高的增加。在NCB008的4價KP FlaB-PcrV研究中幾乎沒有觀察到對PcrV的反應。在NCB007研究中的第一次及第二次預防接種後觀察到對PcrV的強健反應。 (c) 結果總結 · 12價KP/PA疫苗1及12價KP/PA疫苗2顯現出對全部三種載體蛋白有強健的IgG抗體反應。 · 1 μg及5 μg劑量組對載體蛋白的反應相似。 · 12價KP/PA疫苗1對三種載體蛋白中之每一者所產生的x倍數增加約為500至1000倍。 · 在未經驗過的動物中在第一次給藥與第二次給藥之間會持續增加。在不希望受任何理論的束縛下，在經驗過的成體中，在給藥一次後及在7-10天內係預期有接近極大的反應。 · 在用12價KP/PA疫苗1或12價KP/PA疫苗2進行預防接種的動物中並未觀察到在用4價KP疫苗進行預防接種的動物中所遭遇到對MrkA和PcrV的反應較低的前述問題。 在僅含有FlaB2的載體蛋白中缺少TLR5促效生物活性
圖12B係使用會表現NF-kB驅動的螢光素酶報告基因的HEK293細胞描述融合蛋白及含有FlaA及FlaB蛋白的MAPS複合物之TLR5生物活性。鞭毛蛋白TLR5的活化係致使報告基因表現的向上調控。
已發現到僅含有FlaB結構域2（FlaBD2）的KP/PA MAPS載體蛋白係缺乏TLR5促效生物活性，如圖46中由FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV的螢光素酶測定數據所顯現的。FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV為12價KP/PA疫苗中的兩種載體蛋白1。
FlaB對照組及融合蛋白Rhavi-FlaB-his顯示出強烈的TLR5促效生物活性，而FlaBD2、FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV均僅含有FlaB結構域2（FlaBD2），在此測定中未顯示活性。通過 FACS 的結合廣泛性及非 OPS 疫苗菌株的凝集
非OPS疫苗菌株血清型之KP及KA菌株係藉由流式細胞儀分析及凝集測定法進行試驗，以研究抗體對12價KP/PA疫苗1的覆蓋廣泛性。
表22係顯示用兔子彙集血清(AFV1502-1511)獲得的非OPS KP菌株的FACS結合及細菌凝集的結果，所述血清係以每種BP-1為5 μg劑量的12價KP/PA疫苗1進行預防接種。測試的14個菌株中的12個在凝集測定中係通過P0和P2血清的識別而顯示出明顯的差異，並且通過流式細胞儀分析以1:100的血清稀釋度測量到細菌結合的增加。 表22： 對於12價KP/PA疫苗1之反應 -非OPS KP疫苗菌株的結合與凝集
表23係顯示非OPS PA菌株與以各血清型BP-1為5 µg劑量之12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子彙集血清(AFV1502-1511)的FACS結合及細菌凝集結果。對於鞭毛蛋白B，7種菌株中的6種有凝集現象，藉由流式細胞儀分析7種菌株中的7種有抗體結合現象。對於鞭毛蛋白A1，藉由流式細胞儀分析4種菌株中的3種有抗體結合現象。對於鞭毛蛋白A2，在4種菌株中未觀察到有抗體識別的證據。 表23： 對於12價KP/PA疫苗1之反應 -非OPS PA疫苗菌株的結合與凝集
非OPS疫苗血清型的14種KP及15種PA菌株係經測試以判定兔子中對12價KP/PA疫苗1所產生的抗體的覆蓋廣泛性。總結如下： · 引發的抗體結合且凝集14種非OPS KP血清型菌株中的12種： · 不含MrkA基因的血清型不會與抗體結合 · 與這些菌株的結合可能是由於MrkA定向抗體 · 引發的抗體係結合15種非OPS PA疫苗血清型中的10種： · 對於具有FlaB的菌株和一些具有FlaA1的菌株會發生結合 · 結合很可能是因為FlaB定向抗體以及因為與FlaA1的交叉反應 · 針對載體蛋白(FlaBD2及MrkA)的抗體擴大了非OPS疫苗血清型的覆蓋廣泛性。由載體蛋白抗體誘導的動物被動保護
使用如表24中詳述的抗O1血清及抗MrkA血清，在具有克雷白氏菌KP B5055 (O1: K2)的燒傷感染模型中評估載體蛋白誘導小鼠被動保護的潛力。
結果表明存在有MrkA (FlaBD2-MrkA)在預防經囊封的KP菌株感染之動物死亡中有保護作用的趨勢。在攻擊後第6天，60% (3/5)的動物仍然存活著。在此實驗中，OPS O1抗體無法防止感染。 表24： 使用抗O1及抗MrkA血清抵禦KP B5055 (O1: K2)的燒傷感染 *小鼠係經以200 μl血清被動轉移兩次，燒傷後以12 CFU B5055進行SC感染。 KPO1抗體：來自NCB008 FlaB-PcrV 4價KP MAPS的3個最高效價彙集血清 MrkA抗體：NCB010 FlaBD2-MrkA 1v PA MAPS的10個彙集血清
疫苗製劑中兩種載體蛋白的性能總結： · 12價KP/PA疫苗1及12價KP/PA疫苗2中的載體蛋白FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV被證明為KP/PA OPS的強健載體。 · 12價KP/PA疫苗1中之FlaBD2-MrkA及FlaBD2-PcrV以及12價KP/PA疫苗2中的FlaBD2-MrkA係皆出現強烈的抗蛋白反應。 · 針對12價KP/PA疫苗1中之載體蛋白的抗體擴大了非OPS疫苗血清型的覆蓋廣泛性。 · 與僅包含FlaB結構域2 (FlaBD2)的FlaB之實驗設計一致，證實了FlaBD2融合蛋白的TLR5促效活性完全消除。 · 小鼠克雷白氏菌感染的燒傷模型中之第一次挑戰的結果係顯示出針對MrkA的抗體的保護趨勢。實例 12 ：綠膿桿菌 / 克雷白氏肺炎菌 12 價疫苗的功能性測定 吞噬細胞助噬滅殺 (OPK) 測定法 人類嗜中性白血球的OPK測定
使用人類嗜中性白血球細胞吞噬細胞助噬滅殺(OPK)測定法來評估以使用了無莢膜KP血清型O2 (KP O2 K-)菌株7380之5 μg劑量的12價KP/PA疫苗1（NCB012，表21）所養出的兔子彙集血清(P2)的功能性反應。OPK的測定結果顯示於圖47中。
免疫血清在培養24小時後以1/10稀釋度提供100%致死的KP O2細菌，而1/100稀釋度不具有細菌致死活性。血清的致死活性可歸因於KP O2 OPS或MrkA，或兩種疫苗組分的組合。 J774巨噬細胞株的OPK測定
此OPK測定法係於抗生素建它黴素存在或不存在的情況下使用J774巨噬細胞株來評估功能活性。有幾種抗生素無法穿透真核細胞。因此，這些抗生素不會傷害已經內化的細菌。使用這類抗生素可以區分成功穿透真核細胞的細菌和不能穿透真核細胞的細菌。將這類抗生素應用於被細菌感染的真核細胞培養物係會殺死保留在細胞外的細菌，同時保留那些滲透細菌的細菌。此測定法所選擇的抗生素為胺基糖苷類建它黴素。
來自治療組5的兔子的兔子彙集血清係用於J774巨噬細胞細胞株的OPK測定中，其中治療組5係接受NCB012中之5 μg劑量的12價KP/PA疫苗1並且顯示出最高的OPS效價(1502, 1506, 1508, 1511)，以評估血清對克雷白氏菌菌株KP O1、KP O2、KP O3及KP O5的吞噬攝取的影響。
在實驗前24小時，將J774巨噬細胞種在96孔培養盤中。各種O型克雷白氏菌菌株係於培養液中生長至對數生長中期，並將彙集的血清用於滅殺測定。將大約1x105 CFU細菌與彙集的免疫前(P0)或免疫(P2)血清一起培養30分鐘。將經過助噬調理的細菌與J774細胞在室溫下一起培養15分鐘，該時間足以讓抗體介導吞噬作用。從細胞中除去未結合的細菌，並加入新鮮緩衝液±50 μg/ml建它黴素再培養20分鐘。用PBS洗滌細胞兩次，接著加入純水裂解。從每個孔中以二重複方式種入10 ml，並在第二天計數菌落形成單位(CFU)。
該測定結果顯示於圖48A及48B中。以1/20、1/100及1/500稀釋度之免疫或免疫前血清進行助噬調節的J774細胞對克雷白氏菌的吞噬攝取係顯現出，在免疫血清及建它黴素的存在下，KP O1、KP O2、KP O3及KP O5的攝取作用增加（圖48A）。對於KP O1、KP O2及KP O3，在1/100稀釋度下觀察到最高的攝取作用。對於KP O5，在1/20及1/100的稀釋度下之攝取作用相似。
在不存在建它黴素的情況下，與具有較低細菌攝取的免疫前相比，用P2血清也觀察到J774細胞對KP O1、KP O3及KP O5有顯著的攝取作用。對於KP O2，沒有給出結果，因為CFU計數太高而無法計數（圖48B）。對於KP O1及KP O3，攝取隨著稀釋度的增加而降低，而對於KP O5，觀察到1/100稀釋度的攝取作用最高，1/20稀釋度的攝取作用略低，且1/500稀釋度的攝取作用最低。
來自接受NCB012中之5 μg劑量的12價KP/PA疫苗1且顯示最高OPS效價(1502、1506、1508、1511)的兔子彙集血清係也用於J774巨噬細胞細胞株的OPK測定中，以評估血清對假單胞菌PA（O5:FlaB及O6:FlaA1）及克雷白氏菌菌株KP O5（菌株6997）的吞噬攝取的影響。測定法係如上所述對克雷白氏菌菌株KP O1、KP O2、KP O3及KP O5的J774 OPK測試進行。
此測定結果係顯示於圖49、50及51中。免疫血清(P0)介導了吞噬細胞對這些細菌菌株的攝取，如圖49所示。巨噬細胞樣J774細胞的細菌攝取係進一步藉由顯微鏡使用GFP標記的PA（PA O1、PA O5 FlaB）來顯示，如圖50中所示。暴露於免疫血清的PA被細胞強烈吸收。每個J774細胞中的多個P2處理的PA分離物係顯示於圖50的放大視圖中。圖51係顯示，對於那些用免疫血清處理的細胞在與用免疫前血清處理的細胞相比下，係觀察到更高比例的細胞（左圖）及每個細胞中有更高數量的細菌細胞（右圖）。 HL-60 OPK測定
在此類測定中，KP O2菌株7380細菌係先以血清進行助噬調理，接著將分化的HL-60細胞加入混合物中。於培養混合物45分鐘後，計數活菌量。OPK效價的定義為相對於陰性對照組（僅細菌+ HL-60細胞）存活的細菌小於50%之效價。
圖52及表25係顯示用KP O2菌株7380進行的HL60 OPK以及以5 μg劑量的12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子彙集血清之測定結果。預防接種前及預防接種後之抗KP O2熱滅殺(HK)兔子血清做為陽性對照。此測定係使用1/200至1/204,800稀釋度的血清進行。
以12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子血清係顯示出針對KP O2菌株7380有顯著的OPK活性，而對應的免疫前血清則顯示出殺死細菌的效果低得多。滅殺活性可歸因於KP O2 OPS抗體或MrkA或此二者。關於預防接種前及預防接種後的血清以及陽性對照組的OPK效價的詳細說明係顯示於表25中。在免疫前血清(1/800)及免疫後血清(1/12,800)之間的滅殺活性有顯著的差異（增加＞ 15倍）。 表25： KP O2菌株7380於HL-60測定中之OPK效價
使用菌株KP O5菌株6997進行類似的測定。將細菌與來自NCB012之免疫前(P0)或免疫血清(P2)彙集物混合，並在有補體的存在下加入HL-60細胞（表26）。免疫血清以1:1,280的效價係觀察到存活率降低50%，而免疫前的彙集血清在1:40血清稀釋度下係展現出適度的降低。表 26 ：在使用彙集血清的 HL-60 細胞中之 KP O5 菌株 6997 的存活百分率 不同OPK測定的結論
使用三次不同的OPK測定來評估於施用兩次12價KP/PA疫苗1後，在兔子中誘導的抗體的功效。可在使用人類PMN、J774巨噬細胞或分化的HL60細胞的測定中顯現出對KP類型O1、O2、O3及和O5血清型有顯著的OPK活性。此OPK活性可歸因於OPS特異性抗體及/或抗載體蛋白MrkA的抗體。由12價免疫血清所促進之巨噬細胞對KP及PA的攝取可能是因為OPS抗體。對於細胞毒性的保護
根據實例7中描述的實驗方案（對於假單胞菌PcrV蛋白構築體的細胞毒性測定），假單胞菌菌株PAK (O6 FlaA1)係於隔夜生長後，在不同濃度（10%、5%、2.5%或不存在）之經以12價KP/PA疫苗-1預防接種之兔子血清的存在下來感染源自人類肺上皮細胞的A549單層細胞，所述血清係含有抗PcrV抗體，該抗體由針對MAPS載體蛋白的免疫反應產生，或該等細胞含有來自同樣這些兔子之相同血清濃度範圍的免疫前血清。假單胞菌誘導的A549細胞毒性係藉由細胞變圓來定性，因為細胞變成細胞凋亡狀態並從組織培養板的表面脫離。當與用相似濃度的免疫前血清處理的細胞相比時，在給定顯微鏡視野中變圓的（細胞凋亡）細胞數量減少即表明有抗PcrV抗體介導的細胞毒性保護。在血清濃度為2.5%時可觀察到於免疫及免疫前血清治療之間的變圓（細胞凋亡）細胞有最大的差異（圖53，左圖）。以2.5%血清處理的代表性經PAK感染的A549細胞的顯微照片顯現出此差異，即在免疫血清處理的樣本中高度折射的圓形細胞的數量減少（圖53，右圖）。類似的影像係用以估計在各血清濃度下受影響的細胞數量（圖53，左圖）。
通過抗FlaB的抗體降低綠膿桿菌的移動性
如圖54中所示，經以每PS劑量5μg（例如，疫苗中的全部PS為60 μg；疫苗中各類BP獻出5 μg的PS）之12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子彙集血清處理的細胞顯示，當與以免疫前血清處理相比時，PA O5 FlaB菌株通過抗FlaB的抗體會降低移動性。經由 FlaB 抗體的綠膿桿菌聚集
使綠膿桿菌菌株PAO1 (O5 FlaB)隔夜生長並懸浮於PBS中至濃度107 CFU/ml，接著與來自於經以4價KP疫苗免疫接種的1%血清或是與來自於相同兔子的免疫前血清一起在室溫下培養1小時。由對Rhavi-FlaBD2-MrkA-His載體蛋白的免疫反應所產生的血清中之抗FlaB抗體係能夠凝集表現有FlaB的假單胞菌，如在顯微照片中看到的黑色桿狀及標記的聚集細菌簇所顯現（圖55，右圖），而用免疫前血清處理的細菌則未觀察到這樣的聚集（圖55，左圖）。FlaBD2是此疫苗製劑中唯一的假單胞菌抗原，且觀察到交聯細菌即表明載體蛋白誘導了能夠識別細菌鞭毛蛋白中所產生之天然表位的功能性抗體產生。用12價KP/PA MAPS疫苗-1進行預防接種的兔子血清係能夠凝集具有在疫苗中所不含的O型之表現FlaB的假單胞菌（數據未顯示），這強烈暗示了含有FlaBD2的載體蛋白會引發12價製劑中的功能性抗FlaB抗體，雖然不能排除假單胞菌O型之間的交叉反應性會促成所觀察到的凝集。黏著性抑制測定
在此測定中，來自NCB012的彙集血清係用於評估對不同例示性疫苗所產生的抗體反應的黏著抑制性。將表現第3型纖毛的KP O5菌株6997細菌細胞與免疫前及免疫血清(10%)混合，並與A549上皮細胞株細胞一起培養。在裂解細胞和判定黏著細菌的數量之前，從細胞中洗去非黏著的細菌。黏著的抑制係導致培養盤上的CFU更低。圖56係顯示用12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子匯集血清、用8價PA疫苗進行預防接種的兔子彙集血清（MrkA為該8價PA疫苗中唯一的KP抗原）、用4價KP疫苗進行預防接種的兔子彙集血清會阻斷KP O5菌株6997對於A549細胞的黏著性。在不希望受任何理論的束縛下，由於用只有8價PA OPS的疫苗進行預防接種的兔子彙集血清也抑制了黏著性，這暗示了由載體蛋白誘導的MrkA抗體會提供保護性。實例 13 ：小鼠保護測定
被動預防接種的研究係於具有獲自用KP/PA疫苗進行預防接種之兔子的抗血清的小鼠中進行。表21提供了使用於兔子預防接種的疫苗製劑資訊。來自兔子預防接種前及預防接種後的血清（彙集血清）係如針對不同模型所述而用於小鼠的被動預防接種。亦根據研究而描述不同攻擊菌株的細節。使用以 12 價 KP/PA 疫苗免疫 1 進行預防接種的兔子血清在小鼠中針對致死性 PA 感染的被動保護研究
使用以NCB012研究中之各PS劑量為5 µg（例如，在疫苗中的全部PS為60 μg；在疫苗中各類BP貢獻5 μg的PS）之12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子彙集血清在小鼠中進行的被動保護研究（表21，群組5）。用免疫前血清或免疫血清（兔子彙集血清）預先處理小鼠，並用不同的PA菌株以IP攻擊。
在致死的PA攻擊劑量下，免疫血清保護小鼠免於PA O5及PA O6的感染。可看到對於PA O10及O11的攻擊有保護趨勢，但是在用免疫前血清處理並用1x 108 CFU攻擊的小鼠中有顯著的存活率差異以及劑量僅低3倍係說明了對於許多革蘭氏陰性細菌的劑量反應曲線陡峭程度。這經常在進行這些測定時帶來挑戰。存活率的詳細說明係呈現於表27中。表 27 ： 在用 PA 的致死攻擊研究中之小鼠存活率 使用 12 價 KP/PA 疫苗 1 進行預防接種的兔子血清在小鼠中對於克雷白氏菌 KP O3 的被動保護研究
將來自於以NCB012中之各PS劑量為5 µg的12價KP/PA疫苗1（例如，在疫苗中總共有60 μg的PS；疫苗中有由各類BP獻出的5 μg PS）（群組5）進行預防接種的四個有最高抗KP-O3反應者（兔子1502、1506、1508及1511；表28）的血清彙集，並在用KP O3菌株700603進行IV攻擊前的20小時及2小時以含有50,000 CFU的0.1 ml量進行IP注射（免疫前或免疫血清）。表 28 ： 包含在彙集樣本中之兔子血清的免疫前免疫及免疫效價
攻擊後4小時，將小鼠安樂死並收穫血液、肝臟及脾臟，並判定菌落計數。結果係提供於表29中。與用來自相同兔子的免疫前血清處理的小鼠相比，給予彙集免疫血清的小鼠係顯示出在肝臟和脾臟中有血液清除現象且存活細菌數量減少。這些結果係與使用來自於NCB008研究之4價KP MAPS進行預防接種之兔子的等效效價血清進行細菌清除的結果相似。表 29 ： 於用克雷白氏菌 KP O3 攻擊後在器官中的血液清除及存活細菌的幾何平均 CFU 使用以 12 價 KP/PA 疫苗 1 進行預防接種的兔子血清在小鼠中對克雷白氏菌 KP O1 菌株 B5055 的被動保護研究
在此研究中，每組三隻的小鼠係經注射來自於NCB012研究中之用各PS劑量為5 µg之12價KP/PA疫苗1（例如，在疫苗中總共有60 μg的PS；疫苗中有由各類BP獻出的5 μg PS）（表21，群組5）進行預防接種的兔子彙集血清（免疫前及免疫血清），接著用KP O1菌株B5055以5x 106 進行靜脈內(IV)攻擊。在攻擊後1小時及4小時的血液清除測定結果係以幾何平均CFU/ml血液而列在表30中，並針對個別小鼠顯示於圖57。
在攻擊後4小時，來自免疫血清組的小鼠血液中之CFU/ml係顯著降低，而接受免疫前血清的小鼠中之CFU/ml係保持升高的。表 30 ： 在以 KP O1 菌株 B5055 攻擊後，以幾何平均 CFU/ml 呈現之小鼠血液清除測定結果
這些小鼠中脾臟和肝臟的器官負荷結果係以三隻小鼠的幾何平均CFU/g組織列舉於表31中。圖58顯示在攻擊後20小時之三隻小鼠的脾臟和肝臟的器官負荷結果。
與接受免疫前血清的小鼠相比，三隻接受免疫血清之小鼠中的兩隻係顯示出肝臟中的幾何平均CFU讀數減少。與接受具有顯著更高細菌數的免疫前血清之小鼠相比，脾臟的結果顯示用免疫血清預處理的小鼠顯示有在攻擊後20小時顯著降低的近似模式。表 31 ： 以 KP O1 菌株 B5055 攻擊後之以幾何平均 CFU/g 組織呈現的小鼠器官負荷 使用以 12 價 KP/PA 疫苗 1 進行預防接種之兔子血清在小鼠中對克雷白氏菌 KP O5 菌株 6997 的被動保護研究
在此研究中，每組三隻的小鼠係經注射來自於NCB012研究中之用各PS劑量為5 µg之12價KP/PA疫苗1（例如，在疫苗中總共有60 μg的PS；疫苗中有由各類BP獻出的5 μg PS）進行預防接種的兔子彙集血清（表21，群組5，免疫前及免疫血清），接著用KP O5菌株6997以5x 106 以IV方式進行攻擊。在攻擊後1小時及4小時的血液清除測定結果係以平均CFU/ml血液而列在表32中，並針對個別小鼠顯示於圖59。
在攻擊後4小時，來自免疫血清組3隻小鼠中的2隻的血液係已清除細菌且在第3隻小鼠中的CFU負荷係顯著降低，而接受免疫前血清的小鼠中之CFU在攻擊後4小時係保持升高的（3隻小鼠中的2隻）。表 32 ： 在以 KP O5 菌株 6997 攻擊後，以小鼠中之幾何平均 CFU/ml 呈現的血液清除測定
在這些小鼠中之脾臟器官負荷結果係以三隻小鼠的幾何平均CFU/g組織列在表33中，且圖60係顯示攻擊後20小時三隻小鼠的脾臟器官負荷結果。
對於脾臟，係觀察到接受免疫血清的小鼠在攻擊後20小時具有比接受免疫前血清的小鼠更低得多之細菌讀數。表 33 ： 以 KP O5 菌株 6997 攻擊後之以幾何平均 CFU/g 組織呈現的小鼠器官負荷 以 12 價 KP/PA 疫苗 1 進行預防接種之兔子在小鼠中對於克雷白氏菌 KP O2 ( 菌株 KPN 12) 的被動保護研究
在此研究中，CD-1小鼠（每組3隻）係於靜脈內施與用2x 105 CFU KP O2菌株KPN-12之前24小時及2小時，給予0.2 ml之免疫前或免疫血清彙集物（每彙集物有10隻兔子，研究NCB012）。在感染後72小時收穫脾臟，判定每克組織的細菌負荷。與用免疫前血清處理的小鼠相比，接受免疫血清的小鼠顯示了存活的細菌數量減少（7,978比114,687平均CFU；圖61）。彙集的免疫血清從血液循環中促進了KP O2（菌株KPN-12）的清除。
使用NCB012免疫前及免疫血清進行了若干實驗，以研發及優化使用克雷白氏菌KP O2的致死攻擊模型中的被動保護實驗方案。可進行類似的實驗以研發及優化用於其他生物體、其他疫苗或免疫原性組合物及/或其他病原菌/菌株之被動保護實驗方案。諸如細菌攻擊劑量、接種物的遞送（例如在注射前促進該細菌的吞噬）以及用於被動保護的血清數量、時間及強度（例如用5 μg或1 μg多醣劑量所生成的血清）等變因係經檢驗。測試的例示性參數及結果係繪示於圖62中。在攻擊下之 CD-1 小鼠的 Th17 反應及拓殖
此實驗係設計用來判定三種施與小鼠之含有FlaBD2及MrkA的KP O1 MAPS劑量的能力，每次劑量係於先前劑量後的14天施用，以在最後一次預防接種後兩星期的細菌攻擊之後降低細菌的拓殖。兩組CD-1小鼠係經受細菌攻擊；一組用KPO1/FlaBD2-MrkA MAPS疫苗進行預防接種，另一組單僅用緩衝液(PBS)進行預防接種。
每組五隻的小鼠係經氣管內(IT)方式以3-5x103 CFU KP B5055 (O1:K2)攻擊。在細菌攻擊後48小時收穫肺並秤重，塗覆均勻混合物以進行細菌計數並接著離心。評估上清液的IL-17a濃度。同時，如上所述地將脾與PBS、FlaBD2及MrkA一起培養，並在三天後評估上清液的IL-17a程度。
圖63係顯示細菌攻擊後之經刺激的脾細胞之IL-17a誘導結果。經FlaBD2刺激的脾細胞中係觀察到顯著的誘導(p = 0.02)。預防接種對綠膿桿菌的胃腸道拓殖的影響
以下實驗方案係設計來檢驗以單價PA O6 MAPS疫苗進行預防接種之對於綠膿桿菌的胃腸道（GI）拓殖的影響。
八隻Sprague-Dawley大鼠係經以2週的間隔經皮下施與0.5 ml的單價MAPS疫苗MA6-93-PAO6兩次（克雷白氏肺炎菌K19: 綠膿桿菌O6 /Rhavi-FlaBD2-MrkA-his BP-1）。7隻大鼠係僅用緩衝液進行預防接種。第二次預防接種後14天，大鼠係經以頭孢噻肟(50 mg/kg IM)處理，並持續接受每天一次抗生素劑量9天。大鼠係經給予抗生素以克服胃腸道中伺機性細菌（諸如PA）的拓殖抗性，並模擬臨床情況。單獨給予抗生素4天後，通過灌服方式給大鼠施用108 CFU的綠膿桿菌(PA, IATS O6)總共5天。在5次每日給予PA和9次每日給予頭孢噻肟之後，對大鼠實施安樂死，並取出盲腸、秤重，接著培養。在施與抗生素及細菌之前取得血液測量抗體濃度，並且在第一劑PA的前一天和之後兩天取得糞便樣本以用於PA培養。亦可以在圖64的上半部分找到詳細說明。
在具有兩劑量PA O6 FlaBD2-MrkA MAPS疫苗的大鼠中之拓殖研究結果係顯示在圖64的底部。接受PA O6疫苗的大鼠具有比接受PBS的大鼠更高的ELISA IgG效價（圖的左下角）。與中位數＞104 CFU/g的對照大鼠（圖的右下方）相比，經免疫接種的大鼠亦顯示出小於103 CFU/g細菌的中位數。研究結果表明，用單價PA O6 MAPS疫苗進行兩次預防接種後，PA O6的盲腸拓殖情況降低。實例 14 ：表現 Gal-III 表位的抗碳青黴烯 KP (CRKP) 菌株的抗 OPS 抗體
與其他種類的細菌碳青黴烯酶（例如氧雜-48或金屬-β-內醯胺酶）相反，KPC（克雷白氏肺炎菌碳青黴烯酶）的擴散似乎至少部分為殖株事件。一稱為序列類型(ST) 258的特定譜系已顯示是造成在幾個地理區域中特有的大多數產生KPC之克雷白氏菌感染的原因。目前在美國東北部各州，所有院內克雷白氏肺炎菌感染中有超過30%是由CRKP引起的，其中約70%屬於產生KPC的ST258殖株。同樣地，此殖株（包含單個基因座ST變異體）在世界其他地區流行，包含以色列、波蘭、義大利、希臘、南美及中國。最近，一個對ST258分子進化的調查識別出兩個與不同莢膜多醣表現相關的演化支(Chen 2014a, Chen 2014b, DeLeo 2014)。克雷白氏肺炎菌ST258是一種散佈全球且極具抗藥性的院內殖株，其治療選擇有限。
KP O1及KP O2抗原係由半乳糖的均聚物（即半乳聚醣）所構成。稱為d-半乳聚醣-I (gal-I)的KP O2抗原係由半乳糖雙醣重複單元所組成。在KP O1的例子中，gal-I係被稱為d半乳聚醣-II (gal-II)之抗原性不同的重複半乳糖雙醣所覆蓋，且其判定血清型特異性。罕見的血清型KP O2ac具有類似的結構，即重複的gal-I次單元係被不同的聚合物覆蓋，在這種情況下該聚合物為非半乳聚醣重複單元。因此，KP O1、KP O2及KP O2ac菌株係皆共享gal-I抗原，然而，在KP O2中，這是唯一的O-抗原決定因子，在KP O1和KP O2ac的例子中，gal-I係被外部重複單位所遮蔽。此外，gal-I雙醣重複單元可以藉由在KP O2血清群內之產生亞型的化學計量及非化學計量加成的O-乙醯基-或半乳糖基進行修飾（圖65）。絕大多數的ST258分離株係表現經修飾的d-半乳聚醣-I脂多醣O-抗原，其中半乳糖基修飾的Gal-I在下文中係稱為d-半乳聚醣-III(Szijártó V.等人, 2016)。
KP O1 OPS係藉由一個含有D-Gal-I或D-Gal-III的短「引子」段及隨後之含有D-Gal-II的長段所組成。KP O2 OPS係僅由D-Gal-I或D-Gal-III所組成（圖65）。Gal-II表位僅對KP O1血清型具有特異性。
做為MAPS疫苗中之KP O1抗原來源的B5055 OPS係具有含D-Gal-II的短段及隨後之長D-Gal-II聚合物。KP 7380（KP O2疫苗抗原來源）僅具有D-Gal-I。
為了研究KP/PA MAPS疫苗是否具有產生抗Gal-III表位的抗體的潛力，因此調查了是否具有預防由於KPCR ST 258殖株菌株引起感染的潛力。來自以5 μg劑量之4價KP PRO-CN MAPS疫苗進行預防接種的兔子彙集血清(P2)係使用於流式細胞儀測定法中以顯現對於表現KP D-Gal-III及KP D-Gal-I的表位之結合能力。在這種情況下，唯一相關的反應為OPS識別的D-Gal-I O2及D-Gal-III O2 OPS、D-Gal-II O1 OPS。結果顯示出，在D-Gal III及D-Gal I OPS之KP O1及KP O2的對應免疫前血清(P0)上的結合增加（圖66）。因此，抗體可能針對所有三種KP D-Gal類型來產生。
如於表34及圖67中提供的流式細胞儀分析顯示，用12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子彙集血清中之抗體係與來自菌血症分離株的三種ST258菌株中的兩種結合。12價KP/PA疫苗1抗血清係與未包含在疫苗中的四種血清型菌株中的三種結合，包含具有次要序列變體的MrkA等位基因的菌株（圖67）。在不希望受任何理論的束縛下，這些數據暗示了大多數的KP菌株，不僅僅是那些具有12價KP/PA疫苗1的OPS成分的血清型之菌株，將被經由疫苗的MrkA融合蛋白組分所養出的抗體識別出來。 表34： 12價血清疫苗-1對於未包含在疫苗中的血清型之具有MrkA的突變等位基因之克雷白氏菌菌株的流式細胞儀結果
4價KP MAPS疫苗對於表現KP D-Gal-I與D-Gal-III表位之結合能力的結果表明12價KP/PA疫苗具有產生抗Gal-III表位並預防因KPCR ST 258殖株菌株引起的感染之抗體的潛力。實例 15 ： BP-1.2 的製備
BP-1係得益於具有僅位於BP的CPS特徵的生物素殘基，這在產物定性及最低的OPS表位干擾方面可以是有利的。已研發出此方法的變異型以用於製造這類主鏈，其仰賴於使用多醣的醣醛酸殘基之與醛相對的羧酸鹽，將生物素殘基連接到正交位點處的CPS。此涉及使用碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)的反應是可高度控制的，且允許在CPS及所得的BP中有一致程度的生物素化。藉由這種方法製備的BP稱為BP-1.2。製備BP-1.2的例示性方法示意圖係描繪於圖2B中。
此方法的一些優點包含提供一致的生物素化過程，且對生物素衍生化程度更好控制，且有更好的產品一致性，因為所有BP皆衍生自相同的生物素化CPS批次，提供穩定且可大批次儲存的生物素化中間產物，並且有在BP中達到更高的OPS/CPS比例的潛力，因為CPS上有更多可用的醛基團，導致對相同結合位點的競爭較少。實例 16 ： BP-1 及 BP-1.2 免疫原性複合物的預防接種研究
將4價疫苗製備為BP-1 MAPS或BP-1.2 MAPS，並根據表35配製。這些組成物係使用上述實驗方案施與兔子，例如實例6及11。表 35 ：使用於 BP-1 及 BP-1.2 比較研究的疫苗製劑總結。
對於BP-1及BP-1.2組係觀察到對KP及PA OPS皆有強健的IgG抗體反應。群組1及群組2的個別OPS及CPS K19 IgG效價係顯示於圖68中。對PA O6和PA O11 OPS二者的抗OPS免疫反應對於BP-1和BP-1.2 MAPS構築體是相等的。同樣地，觀察到KP O3及KP O5 OPS有相等的反應，即使具有BP-1.2 MAPS構築體的KP O3有明顯較好的效價（幾何平均效價高約5至6倍）。BP-1及BP-1.2 MAPS構築體對於K19 CPS的IgG效價是相等的。BP-1和1.2組對於FlaB-D2及MrkA載體蛋白也都有強健的IgG抗體反應。對於兩種載體蛋白的抗體反應（彙集血清）在BP-1及BP-1.2組都是相當的（圖69）。結果的總結如表36中所示。表 36 ： BP-1 MAPS （組 1 ）與 BP-1.2 MAPS （組 2 ）的免疫原性比較： OPS IgG 反應
群組1及群組2的個別OPS及CPS K19 IgG效價係顯示於圖68中。BP-1及BP-1.2 MAPS構築體對PA O6及PA O11 OPS的抗OPS免疫反應是相等的。同樣地，觀察到KP O3及KP O5 OPS有相等的反應，即使具有BP-1.2 MAPS構築體的KP O3有明顯較好的效價（幾何平均效價高約5至6倍）。BP-1及BP-1.2 MAPS構築體對K19 CPS的IgG效價是相等的。 於NCB013研究中，係在兔子中進行BP-1（支架-1）及BP-1.2（支架-1.2）2價KP/PA疫苗的比較（關於疫苗製劑的描述也參見表35）。圖70及圖71分別顯示了BP-1及BP-1.2（KP/PA 4價）對兩種載體蛋白FlaBD2及MrkA的個別抗體反應。兩種支架在針對兩種載體蛋白的第一次預防接種後係觀察到抗體效價顯著增加。在第二次預防接種後抗體效價係進一步增加。BP-1及BP-1.2組係觀察到對FlaBD2及MrkA有強健的抗體反應，且BP-1及BP-1.2組對兩種蛋白質的抗體反應是相當的。 序列表 參考文獻 Agodi A, Voulgari E, Barchitta M, Politi L, Koumaki V, et al. Containment of an outbreak of KPC-3-producingKlebsiella pneumoniae in Italy. J Clin Microbiol. 2011 Nov;49(11):3986-9. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10. Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402. 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熟習此項技術者將意識到，或能夠使用不超過常規實驗確定，本文中所述之發明特定實施例的許多等效物。本發明之範疇並不意欲受限於以上的描述，而是如以下申請專利範圍中所陳述：
與附圖一起閱讀時，本文中所述之發明教示將可藉由以下各種說明性實施例的描述而更充分瞭解。應瞭解以下所述之圖式僅用於說明目的，而非意欲以任何方式限制本發明的教示。
圖1A係顯示來自綠膿桿菌（PA）的脂多醣的內核（頂部）及外核（底部）的化學結構，標記為「裂解」的箭頭係指向由乙酸介導之介於「酮酸基團」（KDO）與脂質A分子之間的裂解位點。圖1B係顯示含有幾種國際公認的分型標準（IATS）類型之不同PA核部的重複O多醣（OPS）單元的化學結構。圖1C係顯示當用亞硝酸鈉和乙酸（亞硝酸）處理LPS時，克雷白氏肺炎菌脂多醣（LPS）的核心多醣的部分結構，其中於核部的葡萄糖胺與半乳醣醛酸殘基之間具有脫胺基裂解位點，其導致在OPS的共同部分（CP）的還原端在C-1位置形成具有醛基的2,5-脫水甘露糖。圖1D係顯示幾種克雷白氏肺炎菌（KP）OPS的重複單元化學結構，在OPS的CP的還原端具有2,5-脫水甘露糖。圖1E係顯示產酸克雷白氏菌（KO）莢膜多醣（CPS）K19的重複單元化學結構，其與克雷白氏肺炎菌K19 CPS相同（Brisse等人，2013），因此這兩者在本文中可互換地指為KP K19 CPS。圖1F為純化的KP K19 CPS在950 MHz的H-核磁共振（H-NMR）光譜。
圖2A為用己二酸二肼（ADH）標記並藉由還原胺化與在CPS （BP-1）上選擇性地生物素化之氧化CPS連接的KP/PA OPS的生產例示性化學程序示意圖。圖2B係顯示用於產生KP/PA CPS/OPS BP-1.2的例示性化學程序示意圖，其中生物素殘基係經由1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺N-羥基琥珀醯亞胺(EDC-NHS)反應而連接在主鏈聚合物的CPS的羧酸鹽基團上，經ADH標記的OPS係通過用高碘酸鹽氧化的及生物素化的CPS進行還原胺化而與經生物素化的CPS主鏈聚合物連接。圖2C係顯示用於產生KP/PA CPS/OPS BP-1.3的例示性化學程序示意圖，其中生物素殘基係經由1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺N-羥基琥珀醯亞胺(EDC-NHS)反應而連接在主鏈聚合物的CPS的羧酸鹽基團上，且隨後經ADH標記的OPS係與經生物素化及CDAP活化的CPS主鏈聚合物連接。
圖3係顯示用於產生與一個氧化的CPS連接且接著在CPS及OPS（BP-2a）上添加生物素殘基之ADH標記的OPS的例示性化學程序示意圖。
圖4係顯示用於產生與一個氧化的CPS連接之OPS的化學程序例示性示意圖，其中生物素殘基係選擇性地與OPS (BP-2b)連接。
圖5A係顯示用聚-L-離胺酸（PLL）聚合物產生OPS主鏈聚合物之化學程序例示性示意圖，其中生物素殘基係選擇性地引入OPS且PLL之未反應的ε-游離胺基係經覆蓋以產生生物素化的OPS N-乙醯基化PLL（NAPLL）主鏈聚合物（BP-3）。圖5B係描繪用於製備例示性主鏈聚合物的三種流程圖。流程圖1及流程圖2係顯示兩種使用點擊化學產生CPS/OPS主鏈1（BP-1）的方式之化學程序示意圖；流程圖3係顯示使用點擊化學法產生CPS/OPS主鏈-2b（BP-2b）的化學程序示意圖。
圖6A係描繪例示性尺寸篩除層析術（SEC）高效能液相層析法（HPLC）（Waters BioAlliance系統及Phenomenex BioSep SEC -4000管柱於含有疊氮化鈉(0.02%)之pH 7.4的PBS中進行，流速為1 mL/min）溶析曲線含KP K19氧化的CPS、OPS-ADH衍生化的KPO1（記錄曲線1）、KPO5（記錄曲線5）、PAO6（記錄曲線6）、PAO10（記錄曲線10）。圖6B係描繪SEC HPLC（Waters BioAlliance系統及Phenomenex BioSep SEC -4000管柱於含有疊氮化鈉(0.02%)之pH 7.4的PBS中進行，流速為1 mL/min）溶析曲線(左圖)：OPSADH ；氧化的KP K19 CPSOX (在圖中係以K19OX 表示)及K19 CPSOX : OPSADH 主鏈聚合物；溶析曲線(右圖)：K19 CPSOX ：OPSADH 在使用SEC或使用100 kDa標稱分子量截留(NMWCO)膜之超微過濾(UF)進行分子分粒之後的主鏈聚合物。圖6C係描繪藉由酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)對PA COPS或PA COPS: K19 BP-1構築體的免疫原性分析，其係使用來自於熱滅殺(HK)的綠膿桿菌的預防接種之兔子高度免疫血清（第四次預防接種後）。腸毒性大腸桿菌（ETEC）COPS係做為ELISA中的陰性對照組使用。PA COPS K19 BP-1與綠膿桿菌特異性OPS抗血清的強烈反應性係表明主鏈聚合物中的OPS表位被保留。
圖7A係描繪具有利查維啶融合蛋白及OPS BP-1或BP-1.2之BP-1 MAPS複合物的例示性示意圖；圖7B係描繪具有利查維啶融合蛋白及OPS BP-2a之BP-2a MAPS複合物的例示性示意圖；圖7C係描繪具有利查維啶融合蛋白及OPS BP-2b之BP-2b MAPS複合物的例示性示意圖；圖7D係描繪具有利查維啶融合蛋白及OPS BP-3之BP-3 MAPS複合物的示意圖；圖7E係描繪具有利查維啶融合蛋白及天然OPS之MAPS複合物的示意圖。
圖8A係描繪來自KP之OPS及來自PA之OPS的下游純化程序的例示性流程圖。圖8B係描繪例示性SEC-HPLC（Waters BioAlliance系統及Phenomenex BioSep SEC -4000管柱於含有疊氮化鈉(0.02%)之pH 7.4的PBS中進行，流速為1 mL/min）曲線，從左到右的純化KP OPS及K19 CPS重疊的折射指數(RI)記錄曲線為 K19 CPS、O1、O3、O2及O5。圖8C係描繪例示性SEC-HPLC（Waters BioAlliance系統及Phenomenex BioSep SEC -4000管柱於含有疊氮化鈉(0.02%)之pH 7.4的PBS中進行，流速為1 mL/min）曲線，從左到右的純化PA OPS重疊的RI記錄曲線為：O2、O6、O3、O4、O5、O1、O10及O11。
圖9A係描繪KO CPS K19的下游純化程序的例示性流程圖。圖9B係描繪過量產生外多醣PsL之假單胞菌試劑菌株的基因構建圖。圖9C係描繪PA外多醣PsL的下游純化程序的流程圖。
圖10的上面圖塊係顯示含有Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白與K19: KPO2-ADH BP-2a之BP-2a MAPS複合物於Superdex-200管柱上之例示性SEC溶析曲線。圖10的下面圖塊係顯示藉由十二基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS PAGE)及SEC管柱溶析出的分餾物的總蛋白質染色之篩選結果，樣本在SDS-PAGE之前係於具有10 mM二硫蘇糖醇(DTT)之十二基硫酸鈉(SDS)樣本緩衝液中不加熱處理以使得MAPS複合物保持完整。
圖11A-11C係描繪使用不同融合蛋白製備的例示性BP-1變體MAPS複合物的SDS-PAGE分析及總蛋白染色的實例。圖11A係描繪分別與PA O10 OPS BP-1（泳道4和5）、PA O1 OPS BP-1（泳道6和7）及PA O2 OPS BP-1（泳道8和9）形成的利查維啶融合蛋白(PRO-CN)之間的變異BP-1 MAPS複合物的例示性SDS-PAGE。圖11B係描繪分別與PA O10 OPS BP-1（泳道4和5）、PA O1 OPS BP-1（泳道6和7）及PA O2 OPS BP-1（泳道8和9）形成的利查維啶-FlaB-PcrV蛋白（Rhavi-FlaB-PcrV）之間的BP-1變異MAPS複合物的例示性SDS-PAGE。圖11C係描繪含有PA O10 OPS BP-1（泳道4和5）、PA O1 OPS（泳道6和7）及PA O2 OPS BP-1（泳道8和9）之利查維啶-FlaB-D2-MrkA蛋白（Rhavi-FlaBD2-MrkA）之間的BP-1變異MAPS複合物的例示性SDS PAGE。在圖11A-11C中，係以單獨利查維啶融合蛋白跑膠以做為對照組（泳道1和2）。每個樣品係經加熱處理（通過沸騰）（泳道1、4、6和8）及不加熱處理（泳道2、5、7及9）。BP-1變異MAPS複合物在沒有加熱的情況下沒有被破壞，且BP-1變異MAPS複合物中的蛋白質係保留在凝膠的最頂端。在沸騰處理下，BP-1變異MAPS複合物被破壞，蛋白質被釋放且蛋白質二聚體也被解離。蛋白質分子量標記物（泳道3）係也包含在內，標準物的分子量係以kDa表示在凝膠的左側。
圖12A係顯示衍生自假單胞菌（PcrV; FlaB; FlaA2; FlaA1; FlaB-PcrV; FlaB-D2; FlaA2-D2）或克雷白氏菌（MrkA）所產生之利查維啶-抗原融合蛋白、或衍生自克雷白氏菌及假單胞菌(FlaB-D2-MrkA; PcrV-MrkA)之雜合蛋白的示意圖。圖12B係顯示天然假單胞菌鞭毛蛋白及Rhavi融合蛋白的類鐸受體(TLR)5生物活性，其為單獨的或做為具有肺炎球菌多醣(PnPS) 6B的變異MAPS複合物，在此測定中HEK293-NFkB:Luc細胞對鞭毛蛋白有反應但對單獨培養基則無。這些結果表明單獨利查維啶鞭毛蛋白構築體(FlaB, FlaA1, FlaA2)或其與PnPS 6B的MAPS複合物會促進TLR5活性，因此是正確折疊的。
圖13A-13B係比較用各種利查維啶-抗原融合蛋白及肺炎球菌莢膜多醣（PnCPS）產生之MAPS複合物通過ELISA測量在兔子中引發抗CPS 19A抗體（圖13A）反應或抗CPS-6B抗體（圖13B）反應的能力。在預防接種（P0）之前、第一次預防接種（P1）後兩週及第二次預防接種（P2）後兩週評估血清樣本。測得的IgG反應係從一個12,500 AU/ml之標準曲線來指定一任意單位（AU）。幾何平均值係以水平黑線表示，誤差槓為95%置信區間。圖13A之上面圖塊：對於具有以下各者之PnCPS 19A的免疫球蛋白（IgG）反應：PRO-CN; 單獨利查維啶(Rhavi); 利查維啶-FlaB-D2 (FlaBD2); 利查維啶-FlaA2-D2 (FlaA2D2); 利查維啶-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); 利查維啶-FlaB-D2-MrkA (FlaBD2-MrkA); 利查維啶-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA)。圖13A之下面圖塊：PRO-CN; 利查維啶-PcrV (PcrV); 利查維啶-FlaB (FlaB); 利查維啶-FlaA1 (FlaA1); 利查維啶-FlaA2 (FlaA2); 利查維啶-MrkA (MrkA)。圖13B上面圖塊：對於具有以下各者之PnCPS 6B的IgG反應：單獨利查維啶(Rhavi); 利查維啶-FlaB-D2 (FlaBD2); 利查維啶-FlaA2-D2 (FlaA2D2); 利查維啶-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); 利查維啶-FlaB-D2-MrkA (FlaBD2-MrkA); 利查維啶-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA)。圖13B下面圖塊：PRO-CN; 利查維啶-PcrV (PcrV); 利查維啶-FlaB (FlaB); 利查維啶-FlaA1 (FlaA1); 利查維啶-FlaA2 (FlaA2); 利查維啶-MrkA (MrkA)。
圖14係顯示用利查維啶-抗原融合蛋白（於佛氏佐劑中的100 μg蛋白質）進行預防接種的兔子的免疫反應。在預防接種（P0）之前及第二次預防接種（P2）後兩週，用血清樣本通過ELISA測量兔子對於免疫抗原的IgG。測得的IgG反應係從一個12,500 AU/ml之標準曲線來指定AU。幾何平均值係以水平黑線來表示。以下蛋白質的效價係以AU顯示：Rhavi-FlaB-D2 (FlaB-D2); Rhavi-FlaA2-D2 (FlaA2-D2); Rhavi-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); Rhavi-FlaB-D2-MrkA (FlaB-D2-MrkA); 及Rhavi-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA)。
圖15係比較在具有利查維啶融合蛋白PRO-CN或利查維啶(Rhz)之MAPS複合物中的PA O6及O10天然OPS二價製劑於在兔子中的免疫原性。抗O6或O10 OPS IgG效價係以注射前(P0)、注射一次後(P1)或注射兩次後(P2)的ELISA單位顯示。
圖16係比較以下各製劑在兔子中的免疫原性：2價KP O1及KP O5 OPS BP-1製劑；單價KP O1 BP-2a製劑；及KP O1 BP-2b製劑，該等製劑皆在具有利查維啶融合蛋白PRO-CN及磷酸鋁之不同MAPS複合物中。抗KP O1或KP O5 OPS IgG效價係以注射前(P0)、注射一次後(P1)或注射兩次後(P2)的ELISA單位顯示。
圖17係比較以下各製劑在兔子中的免疫原性：與PRO-CN錯合之 2價PA O6, O10 OPS BP-1; 與PRO-CN錯合之PA O6, O10 OPS BP-1 (不含明礬); PA O6, O10-BP-1 (不含蛋白質，例如不含PRO-CN); PA O6, O10 OPS BP-1 (不含MAPS; 例如不含生物素畫但含有主鏈聚合物組分及PRO-CN); 及單價PA-O6 OPS BP-1，除非另有說明，該等製劑皆在具有利查維啶融合蛋白PRO-CN及磷酸鋁之BP-1 MAPS複合物中。抗PA O6及抗PA O10 OPS IgG效價係以注射前(P0)、注射一次後(P1)或注射兩次後(P2)的ELISA單位顯示。
圖18A係以人類早幼骨髓性白血球細胞(HL-60)比較了兔子抗血清（來自於兔子AFV651及AFV667）對於以下各者之克雷白氏菌菌株12-0581 (O1: K62)的吞噬細胞助噬滅殺(OPK)作用：預防接種之前與第二次預防接種之後的KP O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS (左圖)；預防接種之前與第二次預防接種之後的KP O1 OPS BP-2a /利查維啶PRO-CN MAPS (右圖)。當與相同兔子中的免疫前血清相比時，對於BP-2a免疫血清係觀察到滅殺作用增加。圖18B係以HL-60比較了兔子抗血清對於二價PA O6, O10-OPS BP-1 PRO-CN MAPS及單價PA IATSO6 –OPS BP-1 PRO-CN MAPS之綠膿桿菌PA IATSO6的OPK作用。經測試的個別兔子血清係對產生了PA IATSO6作用，兔子血清AFV643產生了暗示強OPS抗體效價的前帶效應。圖18C係顯示以2價PA-O6, -O10 OPS BP-1-PRO-CN-MAPS疫苗產生的四個兔子個體免疫血清(P2)在HL-60細胞中誘導對PA O10細菌的強健OPK作用。
圖19A係比較對於完整克雷白氏菌菌株B5055 (O1: K2)以個別兔子抗血清對MAPS KPO1, O5 OPS BP-1 (左圖)及KPO1 OPS BP-2a (右圖)的PRO-CN變異型之FC結合結果。這些含有完整細菌的FC結合結果係與對於純化的KP O1 OPS之ELISA效價有類似的趨勢，即低效價及低FC結合性。少數雙陽性事件表明在克雷白氏菌菌株B5055表上的抗體結合力薄弱或OPS抗體的暴露度受限。圖19B（上面圖塊）係顯示一兔子個體血清(AFV667)對具有KPO1 OPS BP-2a之PRO-CN BP-2a MAPS複合物的FC散佈圖，其中係比較出對於B5055以及(克雷白氏肺炎菌，產酸克雷白氏菌，O1: K2)的結合力弱，而對於未囊封的克雷白氏菌(CVD 3001) O1菌株的結合力強。圖19B（下面圖塊）係顯示對同樣三種克雷白氏菌O1菌株之以2價KP O1, O5 OPS BP-1 PRO-CN MAPS免疫接種的兔子血清的FC全部結合事件。這些結合數據暗示了CPS數量會影響抗體OPS的裸露，這可能受到生長條件的影響。
圖20係比較FC抗體對於完整假單胞菌菌株PAK (O6:FlaA1)的結合力結果，包含（左圖）含2價PAO6-PAO10天然OPS-PRO-CN的兔子血清（3隻兔子的彙集血清，第二次預防接種之後）；（中圖）2價PAO6-PAO10 OPS BP-1-PRO-CN MAPS的兔子血清（3隻兔子的彙集血清，第二次預防接種之後）；（右圖）單價PAO6-IATSO6 – OPS BP-1-PRO-CN MAPS的兔子血清（3隻兔子的彙集血清，第二次預防接種之後）；當與天然形式的OPS MAPS相比時，觀察到PAO6 OPS BP-1 MAPS有更強的FC結合。
圖21A係描繪與表現FlaB的PAO1菌株O5結合的兔子抗FlaB的FC結合數據：右邊圖塊係顯示當與放血前(P0)血清（左圖）相比時，以利查維啶FlaB-D2（缺少TLR5結合區域）進行免疫接種的兔子在第三次放血（P3放血；10之兔子的彙集血清）中後有高比例之已標記的PAO1族群之散佈圖。圖21B上面圖塊係顯示一兔子個體P3放血血清對於利查維啶FlaB-D2的FC結果；中間圖塊係顯示一兔子個體P3放血血清對於利查維啶FlaB-PcrV的結果；下面圖塊係顯示一兔子個體P3放血血清對於利查維啶FlaB-D2-MrkA的結果。
圖22係描繪當與針對PAO1 FlaB養出的陽性對照組抗PA-FlaB抗體、多株人類靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)抗體以及陰性對照組（不含抗體）相比時，以彙集的兔子抗Rhavi-FlaB-His抗血清對於含有標靶菌株假單胞菌菌株PAO1（O5:表現有FlaB）之HL-60細胞的OPK結果。
圖23係顯示通過不同稀釋度的抗-FlaBD2-MrkA兔子血清來阻斷KP O5 6997（源自於南非）對A549（肺癌）細胞的黏附之結果。FlaBD2-MrkA（第三次預防接種之後，P3）血清係抑制克雷白氏菌菌株6997與A549細胞的結合，而免疫前血清則不然。這表明FlaBD2-MrkA FP的MrkA蛋白組分是正確折疊的並引發功能性抗體。
圖24A係顯示抗PcrV抗體保護A549細胞不受假單胞菌菌株PAK (O6:FlaA1)中毒。在用Rhavi-FlaB-PcrV融合蛋白免疫接種之兔子10%血清（3隻的彙集血清）的存在下，以單胞菌菌株PAK (O6:FlaA1)感染A549單層4小時。與免疫前血清相比，抗Rhavi-FlaB-PcrV血清（P3，第3次預防接種之後）係保護細胞免於假單胞菌菌株PAK中毒，如同在較少的圓形分離細胞中所觀察到。圖24B係顯示A549單層細胞係在各種稀釋度的NCB006 Rhavi-FlaB-PcrV血清（彙集3隻）的存在下以假單胞菌菌株PAK感染4小時。細胞係以PBS洗滌並與Neutral-Red一起培養1小時。將細胞裂解並記錄每個孔中的染劑吸光度。與免疫前血清相比，抗Rhavi-FlaB-PcrV (P3)血清在稀釋度1至40係可保護細胞免於假單胞菌菌株PAK細胞毒性中毒。
圖25係描繪以若干假單胞菌菌株使用A549細胞及抗FlaB-PcrV兔子血清（第3次預防接種之後，P3）之細胞毒性測定：高毒性PA IATS O1（閉合菱形），未受到血清的細胞毒性保護；具細胞毒性的PA M-2 O5（閉合圓形），沒有血清保護作用；具細胞毒性的PA 17002 (O10)（閉合矩形），有明顯的血清保護作用；非細胞毒性PA IATS O6（閉合三角形），未偵測到毒性。
圖26係描繪小鼠的Kaplan-Meier存活圖，所述小鼠係經燒傷並接著將28個菌落形成單位（CFU）之表現FlaB的假單胞菌菌株M-2 (O5)施用於燒傷傷口進行感染。在此模型中，CD-1小鼠被動轉移了免疫前兔子血清或抗FlaB兔子血清中，並用磷酸鹽緩衝溶液(PBS)或以在PBS中的假單胞菌菌株M-2模擬感染。經施與抗FlaB抗血清的小鼠在用假單胞菌菌株M-2傷口攻擊後係受到保護（5/5或100%存活）10天或更久，而來自其他群組的所有小鼠均死於傷口攻擊，除了模擬感染的小鼠之外。
圖27係顯示KP感染的小鼠模型中之清除率及器官負荷。小鼠（CD1；3組）係被動地經腹膜內(IP)施與抗KPO1 BP-2a OPS-PRO-CN MAPS的兔子血清，並接著用克雷白氏菌菌株KP B5055 O1: K2 (9x104 CFU)經靜脈注射攻擊(IV)。在攻擊14小時之後測量脾臟KP活菌計數。與接受免疫前血清(P0)的小鼠脾臟相比，觀察到接受免疫血清(P2)的小鼠脾臟中的KP活菌計數明顯降低。這些數據表明藉由該變異型MAPS疫苗中的主鏈聚合物所生成的OPS O1抗體係能夠從小鼠組織清除生物體，因此具有體內保護活性的功能。
圖28係繪示小鼠被動保護的Kaplan-Meier存活結果，其係於以生長在柳酸鹽中的克雷白氏菌菌株B5055 (O1: K2)感染之前，針對KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS施與兔子血清以降低莢膜的表現。CD1小鼠（每組5隻）在用2x 104 CFU克雷白氏菌菌株B5055 (O1: K2) IP細菌攻擊之前，係IP給予0.1 mL的兔子免疫(P2)或免疫前(P0)彙集血清。其顯示了用於接受P0或P2 KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS血清之小鼠的Kaplan-Meier存活圖。對於已接受KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS抗血清存活的且相對於施與P0血清的小鼠延長一段時間之小鼠，P2血清在該模型中保護了較高比例的小鼠。
圖29係繪示與4價KP疫苗（疫苗中各類BP獻出5 μg的PS，治療組4）相比下之對於用12價KP/PA疫苗1 （疫苗中各類BP獻出5 μg的PS，治療組5）預防接種之兔子彙集血清的KP OPS IgG終點ELISA效價的結果。
圖30係繪示與8價PA疫苗（疫苗中各類BP獻出5 μg的PS，治療組4）相比下之對於用12價KP/PA疫苗1 （疫苗中各類BP獻出5 μg的PS，治療組5）預防接種之兔子彙集血清的PA OPS IgG終點ELISA效價的結果。
圖31係繪示在與疫苗中有1 μg之各類BP所獻出的PS之12價KP/PA疫苗1（治療組6）相比之下，用12價KP/PA疫苗1（例如，疫苗中的全部PS為60 μg；疫苗中各類BP獻出5 μg的PS）進行預防接種的兔子彙集血清之PA OPS IgG終點ELISA效價的結果。
圖32係描繪針對5 μg 劑量之12價KP/PA疫苗1（例如，疫苗中的全部PS為60 μg；疫苗中各類BP獻出5 μg的PS）的個別IgG效價。
圖33係描繪針對1 μg 劑量之12價KP/PA疫苗1（例如，疫苗中的全部PS為12 μg；疫苗中各類BP獻出1 μg的PS）的個別IgG效價。
圖34係描繪5 μg劑量之12價KP/PA疫苗1在誘導個別抗OPS IgG方面係有所增加。
圖35係描繪5 μg PS/BP劑量及1 μg PS/BP劑量之12價KP/PA疫苗1在誘導個別抗OPS IgG方面的增加比較。
圖36係描繪在與以12 μg劑量之12價KP/PA疫苗2（該疫苗劑量中各類BP獻出1 μg的PS；治療組2）相比下，以60 μg劑量之12價KP/PA疫苗2（該疫苗劑量中各類BP獻出5 μg的PS；治療組1）進行預防接種的兔子彙集血清之PA及KP OPS IgG終點ELISA效價的結果。
圖37係描繪針對5 μg劑量之12價KP/PA疫苗2中的各PS的個別IgG效價。
圖38係描繪5 μg劑量之12價KP/PA疫苗2在誘導個別抗OPS IgG方面係有所增加。
圖39係描繪藉由施與12價KP/PA疫苗1、12價KP/PA疫苗2、8價PA疫苗及4價KP疫苗所誘導之抗FlaBD2的兔子IgG的ELISA分析。
圖40係描繪藉由施與12價KP/PA疫苗1、12價KP/PA疫苗2、8價PA疫苗及4價KP疫苗所誘導之抗MrkA的兔子IgG的ELISA分析。
圖41係描繪藉由施與12價KP/PA疫苗1所誘導之抗PcrV的兔子IgG的ELISA分析。
圖42係描繪藉由施與12價KP/PA疫苗1、12價KP/PA疫苗2、8價PA疫苗及4價KP疫苗所誘導之個別抗載體蛋白IgG在誘導方面係有所增加。
圖43係描繪在三隻兔子的免疫原性研究 NCB007、NCB008及NCB012中，藉由施與不同疫苗製劑所誘導之FlaB反應在誘導方面係有所增加。
圖44係描繪在三隻兔子的免疫原性研究 NCB007、NCB008及NCB012中，藉由施與不同疫苗製劑所誘導之MrkA反應在誘導方面係有所增加。
圖45係描繪在三隻兔子的免疫原性研究 NCB007、NCB008及NCB012中，藉由施與不同疫苗製劑所誘導之PcrV反應在誘導方面係有所增加。
圖46係描繪由僅含有FlaB結構域2之載體蛋白展現缺乏TLR5促效生物活性。
圖47係描繪使用KP O2 K-菌株7380進行人類嗜中性白血球細胞OPK測定的結果。
圖48A係描繪在建它黴素存在下用J774巨噬細胞株進行OPK攝取測定的結果。圖48B係描繪在建它黴素不存在下用J774巨噬細胞株進行OPK攝取測定的結果。
圖49係描繪以12價疫苗-1進行預防接種的兔子彙集血清進行助噬調節之PA及KP的建它黴素保護測定試驗的結果。免疫血清(P2)介導了巨噬細胞樣J774細胞對細菌的攝取，而免疫前血清(P0)則沒有。
圖50係描繪使用GFP標記的PA對巨噬細胞樣J774細胞攝取細菌的顯微鏡分析。PA在暴露於免疫血清後係被強烈吸收。
圖51係顯示來自接受5 μg劑量之12價KP/PA疫苗1（共有60 μg PS）的彙集血清促進了巨噬細胞的細菌攝取。
圖52係描繪使用KP O2菌株7380之HL60 OPK測定中的存活細胞百分比。
圖53係描繪顯現PcrV抗體保護細胞免受細胞毒性的測定結果。與來自相同兔子的免疫前血清相比，與12價免疫血清（彙集10隻，疫苗-1高劑量）混合的PA菌株（不含FlaB）顯示出細胞毒性降低。
圖54係顯現用5 μg劑量（例如，疫苗中的全部PS為60 μg；疫苗中各類BP獻出5 μg的PS）之12價KP/PA疫苗-1進行預防接種的兔子彙集血清處理的細胞顯示，當與使用免疫前血清的處理相比，PA O5 FlaB菌株通過抗FlaB的抗體可降低移動性。
圖55係顯示來自以4價KP疫苗（5 μg劑量，治療組4）進行預防接種的兔子之不含PA OPS的彙集血清係可增加表現FlaB的PA聚集，顯現出針對含有FlaB的載體蛋白所產生的抗體具有功能性。
圖56係顯示以12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子彙集血清、以8價PA疫苗進行預防接種的兔子彙集血清（MrkA為該8價PA疫苗中之唯一KP抗原）、以4價KP疫苗進行預防接種的兔子彙集血清係可阻斷KP O5菌株6997黏附至A549細胞。資料暗示了由載體蛋白FlaBD2-MrkA誘導的MrkA抗體是責任重大的。
圖57係描繪在3隻以KP O1菌株B5055攻擊的小鼠於攻擊後1小時及4小時的血液清除測定結果。
圖58係描繪以KP O1菌株B5055攻擊後之小鼠肝臟及脾臟中的器官負荷。
圖59係描繪在3隻以KP O5菌株6997攻擊的小鼠於攻擊後1小時及4小時的血液清除測定結果。
圖60係描繪以KP O5（菌株6997）攻擊後之小鼠脾臟中的器官負荷。
圖61係描繪小鼠脾臟中之器官負荷被動保護分析，其顯現出在用經以12價KP/PA疫苗1進行預防接種之兔子血清處理後可從血液循環中清除KP O2 (菌株KPN-12)。
圖62係描繪使用抗克雷白氏菌O2 K2之NCB012免疫前血清及免疫血清的CD-1小鼠被動保護實驗的各種例示性優化實驗方案與結果。
圖63係描繪在來自於用KP O1 MAPS疫苗進行預防接種並且接著以KP O1:K2菌株B5055進行細菌攻擊的小鼠的經刺激脾細胞中係誘導出了IL-17a。
圖64係描繪在用兩劑量的PA O6 MAPS疫苗進行預防接種並且接著以細菌攻擊之大鼠中，使用PA O6進行胃腸道拓殖研究的治療實驗方案與結果。
圖65係描繪KP OPS Gal-I、Gal-II及Gal-III表位的結構示意圖。
圖66係描繪藉由流式細胞儀分析來自於用4價KP PRO-CN MAPS疫苗進行預防接種之動物的抗血清與表現KP D-Gal-III與KP D-Gal-I之表位的結合結果。
圖67係描繪流式細胞儀分析的結果，其顯現出在用12價KP/PA疫苗1進行預防接種的兔子彙集血清中的抗體係與來自菌血症分離株之3株ST258菌株中的2株結合，並且還與4種不在該疫苗中且帶有MrkA的突變型等位基因之血清型中的3種結合。
圖68係描繪用BP-1（第1組）及BP-1.2（第2組）KP/PA 4價MAPS疫苗進行預防接種後的個別抗OPS IgG效價。
圖69係描繪從BP-1 MAPS（第1組）與BP-1.2 MAPS（第2組）的彙集血清比較中所觀察到的載體蛋白IgG反應。
圖70係描繪BP-1及BP-1.2（KP/PA 4價）在個別血清中分別對載體蛋白FlaBD2的抗體反應。
圖71係描繪BP-1及BP-1.2（KP/PA 4價）在個別血清中分別對載體蛋白MrkA的抗體反應。

Claims (135)

  1. 一種免疫原性組成物，包括：(i)一主鏈聚合物，其包括一聚合物及與該聚合物共軛的一或多種抗原性多醣；以及(ii)與該聚合物或抗原性多醣非共價錯合之一或多種多肽抗原。
  2. 如請求項1之免疫原性組成物，其中該一或多種抗原性多醣係以連接子或未以連接子與該聚合物共軛。
  3. 如請求項1至2中任一項之免疫原性組成物，其中該一或多種抗原性多醣係衍生自革蘭氏陰性細菌及/或革蘭氏陽性細菌。
  4. 如請求項1至3中任一項之免疫原性組成物，其中抗原性多醣係衍生自克雷白氏菌(Klebsiella )、假單胞菌(Pseudomonas )及/或大腸桿菌抗原性多醣。
  5. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中一或多種助噬作用潛勢，或該一或多種抗原性多醣之免疫原性，於以ELISA及/或以抗體功能測定法測量時係相對於一預定程度增加。
  6. 如請求項5之免疫原性組成物，其中一或多種助噬作用潛勢，或該一或多種抗原性多醣之免疫原性，於以ELISA及/或以抗體功能測定法測量時係相對於一對照組成物增加。
  7. 如請求項5或6之免疫原性組成物，其中一或多種助噬作用潛勢，或該一或多種抗原性多醣之免疫原性，於以ELISA及/或以抗體功能測定法測量時係相對於一預定程度增加至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
  8. 如請求項5至7中任一項之免疫原性組成物，其中該預定程度為免疫前程度。
  9. 如請求項5至7中任一項之免疫原性組成物，其中該一或多種抗原性多醣之表位配價係高於天然多醣至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
  10. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中該一或多種多肽抗原為用於一或多種抗原性多醣之攜載蛋白。
  11. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中當施與個體時，該免疫原性組成物以ELISA測量係以大於一包括有抗原性多醣而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的抗體產生。
  12. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中當施與個體時，該免疫原性組成物以ELISA測量係以大於一包括有多肽抗原而不包括有該主鏈聚合物之組成物的程度，誘導該個體中之抗一或多種病原體的抗體產生。
  13. 如請求項11或12之免疫原性組成物，其中該一或多種病原體係選自克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌。
  14. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中當施與個體時，該免疫原性組成物係引發對抗克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者的免疫反應。
  15. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中該一或多種多肽抗原包括細菌多肽、真菌多肽及/或病毒多肽。
  16. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中該一或多種多肽抗原包括衍生自克雷白氏菌、假單胞菌及/或大腸桿菌多肽之多肽。
  17. 2及4至16中任一項之免疫原性組成物，其中該聚合物為多醣、多肽或合成樹枝狀聚合物。
  18. 2及4至17中任一項之免疫原性組成物，其中該聚合物大小為約50 kDa至約2000 kDa。
  19. 2及4至18中任一項之免疫原性組成物，其中該聚合物為衍生自革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌之莢膜多醣。
  20. 如請求項19之免疫原性組成物，其中該莢膜多醣為克雷白氏菌莢膜多醣、假單胞菌胞外多醣及/或大腸桿菌莢膜多醣。
  21. 如請求項20之免疫原性組成物，其中該聚合物為克雷白氏菌屬K19莢膜多醣。
  22. 如請求項17之免疫原性組成物，其中該聚合物為線性聚L-離胺酸，或L-離胺酸之樹枝狀聚合物。
  23. 如請求項17之免疫原性組成物，其中該聚合物為合成單醣或寡醣之樹枝狀聚合物。
  24. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中該一或多種多肽抗原係藉由形成至少一互補親和分子對而與該聚合物或所述一或多種抗原性多醣非共價錯合，所述互補親和分子對包括：(i)第一親和分子，其係與該聚合物或該一或多種抗原性多醣結合；及(ii)互補親和分子，其係與一或多種多肽抗原結合。
  25. 如請求項24之免疫原性組成物，其中該互補親和分子對係選自由以下組成之群組：生物素/生物素結合蛋白、抗體/抗原、酶/基質、受體/配體、金屬/金屬結合蛋白、碳水化合物/碳水化合物結合蛋白、脂質/脂質結合蛋白、及His標籤/His標籤結合分子。
  26. 如請求項25之免疫原性組成物，其中該第一親和分子為生物素或其衍生物。
  27. 如請求項25或26之免疫原性組成物，其中該互補親和分子為生物素結合蛋白或其生物素結合域。
  28. 如請求項27之免疫原性組成物，其中該生物素結合蛋白為利查維啶(rhizavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)、巴達維啶(bradavidin)、塔馬維啶(tamavidin)、倫蒂維啶(lentiavidin)、西勃維啶(zebavidin)、中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)、生物素連接蛋白(CaptAvidin™)、或其組合。
  29. 如請求項24至28中任一項之免疫原性組成物，其中該第一親和分子係交聯或共價鍵合至該聚合物或該一或多種抗原性多醣上。
  30. 如請求項29之免疫原性組成物，其中該第一親和分子係交聯或共價鍵合至該主鏈聚合物之聚合物上。
  31. 如請求項29之免疫原性組成物，其中該第一親和分子係交聯或共價鍵合至該一或多種抗原性多醣上。
  32. 如請求項29之免疫原性組成物，其中該第一親和分子係交聯或共價鍵合至該主鏈聚合物之聚合物上及該一或多種抗原性多醣上。
  33. 如請求項30之免疫原性組成物，其中該聚合物為聚L-離胺酸。
  34. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中該一或多種抗原性多醣包括克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多種的多醣。
  35. 如請求項34之免疫原性組成物，其中該一或多種抗原性多醣包括O1、O2、O3、O5型或其組合之克雷白氏肺炎菌OPS。
  36. 如請求項34之免疫原性組成物，其中該一或多種抗原性多醣包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11、O12型或其組合之綠膿桿菌OPS。
  37. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中該抗原性多醣中之至少一者為綠膿桿菌外多醣PsL。
  38. 如請求項37之免疫原性組成物，其中該PsL包括至少一表位與一單株抗體結合，該單株抗體包括一與SEQ ID NO:4序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列及/或一與SEQ ID NO:5序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
  39. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中至少一多肽抗原包括一與SEQ ID NO:1序列（克雷白氏肺炎菌第I型纖毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列，或其免疫原性片段。
  40. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中至少一多肽抗原包括一與SEQ ID NO:2序列（克雷白氏肺炎菌保留第III型纖毛蛋白MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列及/或一與SEQ ID NO:3序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。
  41. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中至少一多肽抗原為綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A、綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B、或其免疫原性片段。
  42. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中至少一多肽抗原包括一與SEQ ID NO:6序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A1）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列、一與SEQ ID NO:9序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型A2）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列、或一與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。
  43. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，其中至少一多肽抗原包括一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列，或其免疫原性片段。
  44. 一種如前述請求項中任一項之免疫原性組成物，包括： (a) 一主鏈聚合物，包括： (i) 一聚合物，其包括克雷白氏菌屬K19莢膜多醣；及 (ii) 一或多種抗原性多醣，其包括與克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的克雷白氏菌或假單胞菌的多醣；以及 (b) 一或多種多肽抗原，其藉由形成至少一互補親和分子對而與該聚合物非共價錯合，所述互補親和分子對包括： (i) 第一親和分子，其係與該聚合物結合；及 (ii) 互補親和分子，其係與該一或多種多肽抗原結合。
  45. 如請求項44之免疫原性組成物，其中該一或多種抗原性多醣包括O1、O2、O3、O5型或其組合之克雷白氏肺炎菌OPS。
  46. 如請求項44或45之免疫原性組成物，其中該一或多種抗原性多醣包括O1、O2、O3、O4、O5、O6、O10、O11型或其組合之綠膿桿菌OPS。
  47. 如請求項44至46中任一項之免疫原性組成物，其中該第一親和分子為生物素或其衍生物且該互補親和分子為生物素結合蛋白或其生物素結合域。
  48. 如請求項47之免疫原性組成物，其中該生物素結合蛋白為利查維啶(rhizavidin)或其生物素結合域。
  49. 如請求項44至48中任一項之免疫原性組成物，其中該一或多種多肽抗原係選自綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B之缺少TLR5結合模體的D2結構域、綠膿桿菌PcrV、克雷白氏肺炎菌MrkA、其抗原性片段、或其組合。
  50. 如請求項44至49中任一項之免疫原性組成物，其中至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之FlaB鞭毛蛋白D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  51. 如請求項44至50中任一項之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係包括一包括有與SEQ ID NO:24序列（Rhavi-FlaB-結構域2-MrkA-His）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。
  52. 如請求項44至51中任一項之免疫原性組成物，其中至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  53. 如請求項44至52中任一項之免疫原性組成物，其中該融合蛋白係包括一包括有與SEQ ID NO:26序列（Rhavi-FlaB-結構域2-PcrV-His）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。
  54. 一種疫苗組成物，包括： (a) 一第一免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b) 一第二免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (c) 一第三免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (d) 一第四免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
  55. 一種疫苗組成物，包括： (a) 一第一免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b) 一第二免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (c) 一第三免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (d) 一第四免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白。
  56. 一種疫苗組成物，包括： (a) 一第一免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b) 一第二免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (c) 一第三免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (d) 一第四免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (e) 一第五免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (f) 一第六免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (g) 一第七免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (h) 一第八免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
  57. 一種疫苗組成物，包括： (a) 一第一免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (b) 一第二免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (c) 一第三免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (d) 一第四免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (e) 一第五免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (f) 一第六免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (g) 一第七免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (h) 一第八免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
  58. 一種疫苗組成物，包括： (a) 一第一免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b) 一第二免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (c) 一第三免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (d) 一第四免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (e) 一第五免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (f) 一第六免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (g) 一第七免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (h) 一第八免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (i) 一第九免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (j) 一第十免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (k) 一第十一免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (l) 一第十二免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
  59. 一種疫苗組成物，包括： (a) 一第一免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (b) 一第二免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (c) 一第三免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (d) 一第四免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的KP O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (e) 一第五免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O1 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (f) 一第六免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O2 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (g) 一第七免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O3 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (h) 一第八免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O4 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白； (i) 一第九免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O5 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (j) 一第十免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O6 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白； (k) 一第十一免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O10 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白；以及 (l) 一第十二免疫原性組成物，係包括一包括有聚合物之主鏈聚合物，所述聚合物包括有生物素化克雷白氏菌屬K19莢膜多醣、與該克雷白氏菌屬K19莢膜多醣共軛的PA O11 OPS、及與該生物素化主鏈聚合物非共價錯合之Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白。
  60. 如請求項54至59中任一項之疫苗組成物，其中該Rhavi-FlaBD2-MrkA融合蛋白係包括一包括有與SEQ ID NO:24序列（Rhavi-FlaB-結構域2-MrkA-His）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。
  61. 如請求項55、57、59至60中任一項之疫苗組成物，其中該Rhavi-FlaBD2-PcrV融合蛋白係包括一包括有與SEQ ID NO:26序列（Rhavi-FlaB-結構域2-PcrV-His）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的多肽。
  62. 如請求項54至61中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之OPS係以約1:1的w/w比例存在。
  63. 如請求項54至61中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之主鏈聚合物係以約1:1的w/w比例存在。
  64. 如請求項54至61中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之合併的OPS與CPS係以約1:1的w/w比例存在。
  65. 如請求項54至64中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之OPS係以約1 μg存在。
  66. 如請求項54至64中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之主鏈聚合物係以約1 μg存在。
  67. 如請求項54至64中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之合併的OPS與CPS係以約1 μg存在。
  68. 如請求項54至64中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之OPS係以約5 μg存在。
  69. 如請求項54至64中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之主鏈聚合物係以約5 μg存在。
  70. 如請求項54至64中任一項之疫苗組成物，其中各免疫原性組成物之合併的OPS與CPS係以約5 μg存在。
  71. 如請求項54至70中任一項之疫苗組成物，其中該主鏈聚合物為BP-1主鏈。
  72. 如請求項54至70中任一項之疫苗組成物，其中該主鏈聚合物為BP-1.2主鏈。
  73. 如前述請求項中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中當施與個體時，該免疫原性組成物係引發對抗革蘭氏陰性細菌及/或革蘭氏陽性細菌的免疫反應。
  74. 如請求項73之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中該免疫反應為抗體反應或B細胞反應。
  75. 如請求項74之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中該免疫反應為CD4+ T細胞反應，包含Th1、Th2或Th17反應，或CD8+ T細胞反應，或CD4+/CD8+ T細胞反應。
  76. 如請求項75之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中該免疫反應為： 抗體反應或B細胞反應；以及 T細胞反應。
  77. 如請求項70至76中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中該革蘭氏陰性細菌係選自克雷白氏菌、假單胞菌、大腸桿菌、及其組合。
  78. 如請求項24至77中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中該一或多種多肽抗原包括一或多種綠膿桿菌蛋白或變異體，且其中該互補親和分子包括生物素結合蛋白或其生物素結合域。
  79. 如請求項24至78中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中該等多肽抗原中之至少一者包括一與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FlaB鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。
  80. 如請求項24至79中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中該等多肽抗原中之至少一者包括一與SEQ ID NO:6序列（綠膿桿菌FlaA1鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段。
  81. 如請求項24至80中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:9序列（FlaA2鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  82. 如請求項24至81中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之FlaB鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽、或一包括有一與SEQ ID NO:11序列（缺少TLR5結合模體之FlaA1鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽、或一包括有一與SEQ ID NO:12序列（缺少TLR5結合模體之FlaA2鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  83. 如請求項24至82中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之FlaB鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  84. 如請求項24至83中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:11序列（缺少TLR5結合模體之FlaA1鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  85. 如請求項24至84中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:12序列（缺少TLR5結合模體之FlaA2鞭毛蛋白的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  86. 如請求項24至85中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括一融合蛋白，該融合蛋白包括一生物素結合蛋白或其生物素結合域以及一包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌第III型分泌系統(TTSS) PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  87. 如請求項24至86中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  88. 如請求項24至87中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之綠膿桿菌FliC鞭毛蛋白亞型B的D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  89. 如請求項24至88中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:7序列（綠膿桿菌FliC亞型B鞭毛蛋白）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  90. 如請求項24至89中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:10序列（缺少TLR5結合模體之綠膿桿菌FliC亞型B鞭毛蛋白D2結構域）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  91. 如請求項24至90中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中至少一互補親和分子對包括融合蛋白，該融合蛋白包括：(i)生物素結合蛋白或其生物素結合域；(ii)包括有一與SEQ ID NO:8序列（綠膿桿菌PcrV）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽；及(iii)包括有一與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列（克雷白氏肺炎菌MrkA）有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列或其免疫原性片段的多肽。
  92. 如請求項83至91中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物，其中當施與個體時，該組成物係引發會辨識表現MrkA的克雷白氏肺炎菌上之天然MrkA的抗體。
  93. 一種醫藥組成物，其包括如請求項1至92中之免疫原性組成物或疫苗組成物中之一或多者，以及一醫藥學上可接受的載體。
  94. 如請求項93之醫藥組成物，其進一步包括一或多種佐劑。
  95. 如請求項94之醫藥組成物，其中所述佐劑係選自由以下組成之群組：磷酸鋁、氫氧化鋁、磷酸化氫氧化鋁、諸如TLR2皂素(QS21)或孔蛋白之TLR促效劑及諸如(例如)單磷醯脂A (MPL)之TLR4促效劑及諸如鞭毛蛋白之TLR5等。
  96. 如請求項93至95中任一項之醫藥組成物，其中該組成物係經配製用於注射。
  97. 如請求項93至96中任一項之醫藥組成物，其中當施與個體時，該醫藥組成物係引發Th1反應及/或Th17反應。
  98. 如請求項93至97中任一項之醫藥組成物，其中當施與個體時，該醫藥組成物係引發對抗克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者的助噬反應/殺菌反應。
  99. 如請求項93至98中任一項之醫藥組成物，其中當施與個體時，該醫藥組成物係降低克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者於黏膜表面的穿透率及/或拓殖率。
  100. 如請求項93至99中任一項之醫藥組成物，其中當施與個體時，該醫藥組成物係降低克雷白氏菌、假單胞菌及大腸桿菌中之一或多者於GI的穿透率及/或拓殖率。
  101. 一種對個體進行預防接種以抗克雷白氏菌感染之方法，其包括將有效量之如請求項1至92中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物施與該個體。
  102. 一種對個體進行預防接種以抗克雷白氏菌感染之方法，其包括將有效量之如請求項93至100中任一項之醫藥組成物施與該個體。
  103. 一種對個體進行預防接種以抗綠膿桿菌感染之方法，其包括將有效量之如請求項1至92中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物施與該個體。
  104. 一種對個體進行預防接種以抗綠膿桿菌感染之方法，其包括將有效量之如請求項93至100中任一項之醫藥組成物施與該個體。
  105. 一種對個體進行預防接種以抗大腸桿菌感染之方法，其包括將有效量之如請求項1至92中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物施與該個體。
  106. 一種對個體進行預防接種以抗大腸桿菌感染之方法，其包括將有效量之如請求項93至100中任一項之醫藥組成物施與該個體。
  107. 一種抗體組成物，其包括在以如請求項1至92中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物預防接種的哺乳動物中所養出的抗體。
  108. 如請求項107之抗體組成物，其中該抗體組成物包括至少一選自由單抗抗體及抗個體遺傳型抗體組成之群組的抗體。
  109. 如請求項107或108之抗體組成物，其中該抗體組成物包括分離的γ球蛋白部分。
  110. 一種從克雷白氏菌的一或多種細胞組分純化O-抗原多醣之方法，其中該等細胞組分包含蛋白質及/或核酸，該方法包括以下步驟： 使一或多種細胞組分與氧化劑接觸以得到一混合物，其中該混合物的pH為約3及5之間； 從所述細胞組分中分離出O-抗原多醣；以及 提取OPS，其中該OPS基本上不含有其他細胞組分且於其還原末端含有游離醛。
  111. 如請求項110之方法，其中所述氧化劑為亞硝酸鈉，所述酸為乙酸，且其中所述OPS的還原末端為含有游離醛之2,5-脫水甘露糖殘基。
  112. 一種從革蘭氏陰性細菌的一或多種細胞組分純化O-抗原多醣之方法，其中該等細胞組分包含蛋白質及/或核酸，該方法包括： 使一或多種細胞組分與酸性試劑接觸以得到一混合物，其中該混合物的pH為約3及5之間； 將該混合物加熱至約80°C至約100°C之間； 從所述細胞組分中分離出O-抗原多醣；以及 提取OPS，其中該OPS基本上不含有其他細胞組分且於其還原末端含有酮。
  113. 一種製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣包括一級胺基，及至少一生物素化多醣，該方法包括： 藉由將O-抗原多醣與一含有醛基之部分氧化的多醣以及一含有一級胺之生物素混合而使該O-抗原多醣一級胺基化學鍵聯以得到一混合物；且以還原劑還原胺化該混合物而產生BP-1聚合物主鏈，其中該多醣為經生物素化的，而所述化學鍵聯的O-抗原多醣為非經生物素化的。
  114. 一種製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣包括一級胺基，及至少一生物素化多醣，該方法包括： 由將O-抗原多醣與一經生物素化及氧化的多醣混合而使該O-抗原多醣一級胺基化學鍵聯，所述經生物素化及氧化的多醣係先以1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及生物素醯肼處理多醣的羧酸鹽基團，並接著以氧化劑處理多醣而獲得；且以還原劑還原胺化該混合物而產生BP-1.2聚合物主鏈，其中該多醣為經生物素化的，而所述化學鍵聯的O-抗原多醣為非經生物素化的。
  115. 一種製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣包括一級胺基，及至少一生物素化多醣，該方法包括： 由將O-抗原多醣與一經生物素化及CDAP活化的多醣混合而使該O-抗原多醣一級胺基化學鍵聯，所述經生物素化及CDAP活化的多醣係先以1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及生物素醯肼處理多醣的羧酸鹽基團，並接著以CDAP處理多醣而獲得，藉以產生BP-1.3聚合物主鏈，其中該多醣為經生物素化的，而所述化學鍵聯的O-抗原多醣為非經生物素化的。
  116. 如請求項113至115中任一項之方法，其中該O-抗原多醣上的一級胺基為綠膿桿菌OPS外核的L-丙胺酸α-胺基群，或是藉由用還原劑還原胺化使得在每個末端含有一級胺基的短間隔分子化學鍵聯而已引入到O-抗原多醣之還原端的胺基群。
  117. 如請求項114之方法，其中用於氧化多醣的氧化劑為過碘酸鈉，含有二胺的短間隔體為己二酸二醯肼，而還原胺化的還原劑為氰基硼氫化鈉。
  118. 一種製造包括有至少一生物素化O-抗原多醣及至少一生物素化多醣之主鏈聚合物的方法，該方法包括： 使在核部含有一級胺之O-抗原多醣化學鍵聯，其係藉由還原胺化作用將在各末端含有一級胺的短間隔體與O-抗原多醣鍵聯以得到O-抗原多醣-間隔分子，或使用含有L-丙胺酸α-胺基群之未衍生化的OPS； 將含有一級胺之O-抗原多醣與部分氧化的多醣混合以得到一混合物； 還原胺化該混合物以形成OPS主鏈；以及 以CDAP及含有一級胺的生物素將該OPS主鏈衍生化； 藉此形成一主鏈聚合物，其中該多醣及化學鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。
  119. 一種製造包括有至少一生物素化O-抗原多醣及至少一非生物素化多醣之主鏈聚合物的方法，該方法包括： 以CDAP及含有一級胺之生物素將包括有一或多個核心KDO及/或庚醣部分之O-抗原多醣生物素化，以得到經生物素化的OPS混合物； 以過碘酸鈉將經生物素化的OPS混合物部分氧化，以將醛引入到所述核心KDO及/或庚醣部分； 用己二酸二醯肼將該生物素化混合物還原胺化； 將經生物素化及胺化的OPS與部分氧化的多醣混合，以形成一混合物；以及 還原胺化該混合物； 藉此形成一主鏈聚合物，其中該多醣係未經生物素化而該化學鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。
  120. 一種製造包括有至少一生物素化O-抗原多醣及PLL聚合物之主鏈聚合物的方法，該方法包括： 以PLL聚合物的ε-NH2基團將含有末端醛或α KDO之O-抗原多醣還原胺化，以產生OPS PLL聚合物； 以CDAP將OPS衍生化，以形成一衍生混合物； 使該衍生混合物與含有一級胺的生物素反應；以及 以醯化劑處理或不處理該混合物，以覆蓋PLL聚合物之未反應的ε-NH2基團； 藉此製造一主鏈聚合物，其中經覆蓋的N-醯化PLL主鏈或未經覆蓋的PLL係未經生物素化，而該化學鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。
  121. 如請求項120之方法，其中該醯化劑為醋酸酐或乙醯氯。
  122. 如請求項120或121之方法，其中該還原劑為氰基硼氫化鈉。
  123. 一種製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣於其還原末端包括疊氮基團，以及至少一含有炔基團的生物素化多醣，該方法包括： 於催化劑的存在下使在還原端含有疊氮基團的O-抗原多醣與一含有炔的生物素化多醣化學點擊鍵聯； 藉此形成一OPS主鏈聚合物，其中該多醣係經生物素化，但化學點擊鍵聯的O-抗原多醣係未經生物素化。
  124. 一種製造包括有至少一非生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該O-抗原多醣於其還原末端包括醛或酮基團，以及於催化劑的存在下使含有炔基團之生物素化多醣與一小分子量化合物點擊鍵聯而得到之至少一含有一級胺基的生物素化多醣，所述小分子量化合物於一端含有疊氮且於另一端含有游離胺基團，該方法包括： 藉由將O-抗原多醣與一含有一級胺基之生物素化多醣混合並以還原劑還原胺化該混合物而化學鍵聯所述含有醛或酮基團之O-抗原多醣； 藉此形成一主鏈聚合物，其中該多醣係經生物素化，但化學鍵聯的O-抗原多醣係未經生物素化。
  125. 一種製造包括有至少一生物素化O-抗原多醣之主鏈聚合物的方法，其中該生物素化O-抗原多醣於其還原末端包括疊氮基團，以及至少一含有炔的非生物素化多醣，該方法包括： 於催化劑的存在下使在還原端含有疊氮基團的生物素化O-抗原多醣與一含有炔的非生物素化多醣化學點擊鍵聯； 藉此形成一主鏈聚合物，其中該多醣係非經生物素化，但化學點擊鍵聯的O-抗原多醣係經生物素化。
  126. 如請求項123至125中任一項之方法，其中用於經由炔-疊氮化物環加成使該O-抗原多醣與該多醣點擊鍵聯的催化劑為硫酸銅。
  127. 如請求項123至126中任一項之方法，其中用以使該多醣衍生化之炔基團係選自由以下組成之群：1-胺基-3-丁炔、1-胺基-4-戊炔、DBCO-胺及炔-PEG4-胺。
  128. 如請求項123至127中任一項之方法，其中用以使多醣衍生化之疊氮基團係選自由以下組成之群：疊氮基-PEG3-胺、疊氮基-丙胺及疊氮基-丁胺。
  129. 一種主鏈聚合物，其係由如請求項113至128中任一項之方法所製成。
  130. 一種融合蛋白，其包括一生物素結合域及一多肽，該多肽包括一與SEQ ID NO:16至26中之任一者序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
  131. 一種融合蛋白，其包括一生物素結合域及一多肽，該多肽包括一與SEQ ID NO:1至3或6至26中之任一者序列有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列。
  132. 一種製造變異型MAPS，其包括將請求項128之至少一主鏈聚合物與請求項129至130中之任一項的融合蛋白中之至少一者錯合。
  133. 如請求項132之方法，其中該變異型MAPS為BP-1 MAPS、BP-1.2 MAPS、BP-2a MAPS、BP-2b MAPS或BP-3 MAPS。
  134. 一種評估如請求項1至92中任一項之免疫原性組成物或疫苗組成物之免疫原性及/或效價的方法，其中免疫反應係使用包含B細胞及T細胞反應之一系列活體外生物測定法中之一或多種來評估，諸如通過ELISA之抗體程度、通過FC之功能性抗體程度、OPK及其他如凝集作用、移動性、細胞毒性之功能性測試、Th1/Th17細胞及細胞介素程度、及院內疾病（肺炎、敗血症、燒燙傷、GI及手術部位感染）之活體內測定法，諸如細菌清除、被動及主動保護之接下來對於所述免疫原性組成物之靶標院內病原體的挑戰。
  135. 一種評估如請求項93至100中任一項之醫藥組成物之免疫原性及/或效價的方法，其中免疫反應係使用包含B細胞及T細胞反應之一系列活體外生物測定法中之一或多種來評估，諸如通過ELISA之抗體程度、通過FC之功能性抗體程度、OPK及其他如凝集作用、移動性、細胞毒性之功能性測試、Th1/Th17細胞及細胞介素程度、及院內疾病（肺炎、敗血症、燒燙傷、GI及手術部位感染）之活體內測定法，諸如細菌清除、被動及主動保護之接下來對於所述免疫原性組成物之靶標院內病原體的挑戰。
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