MXPA01003228A

MXPA01003228A - Holotoxina de colera mutante como un coadyuvante.

Info

Publication number: MXPA01003228A
Application number: MXPA01003228A
Authority: MX
Inventors: Randall K Holmes
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2003-06-24
Also published as: CA2344740C; WO2000018434A1; CN1320043A; IL142231A0; EP1117435A1; CA2344740A1; ATE378066T1; PT1117435E; DK1117435T3; CN1197618C; IL142231A; KR20010085859A; BR9914160A; DE69937571D1; AU6403999A; DE69937571T2; ES2293735T3; JP2002525093A; KR100659803B1; EP1117435B1

Abstract

Se describe una holotoxina de colera mutante que presenta un punto de mutacion en al aminoacido 29 de la sub-unidad A, en donde el residuo de acido glutamico se reemplaza por un aminoacido diferente al acido aspartico, siendo util como un coadyuvante en una composicion antigenica para aumentar la respuesta inmune en un huesped vertebrado para un antigeno seleccionado de una bacteria patogenica, virus, hongo o parasito. En una forma de realizacion particular, el aminoacido 29 es histidina. La holotoxina de colera mutante puede contener al menos una mutacion adicional en la sub-unidad A en una posicion diferente a la del aminoacido 29. La composicion antigenica puede incluir un segundo coadyuvante ademas de la holotoxina de colera mutante.

Description

HOLOTOXINA DE COLERA MUTANTE COMO UN COADYUVANTE Campo de la Invención Esta invención se refiere al uso de una holotoxina de cólera mutante inmunogénica que tiene una toxicidad reducida comparada con una toxina de cólera de tipo silvestre y una substitución diferente a la del ácido aspártico para el ácido glutámico en la posición 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera como un coadyuvante para permitir la respuesta inmune en un huésped vertebrado para un antigeno seleccionado .

Antecedentes de la Invención El sistema inmune usa una variedad de mecanismos para atacar los patógenos. Sin embargo, no todos estos mecanismos son necesariamente activados después de la inmunización. La inmunidad protectora inducida por la inmunización depende de la capacidad de la vacuna para elegir la respuesta inmune apropiada para resistir o eliminar el patógeno. Dependiendo del patógeno, puede REF: 128092 requerirse una respuesta inmune humoral y/o mediada por la célula.

Una sustancia que aumenta la respuesta inmune cuando se administra junto con un inmunógeno o antigeno se conoce como un coadyuvante.

La bacteria gram negativa Vibri o ch o l era e { V. Ch o l era e ) es el agente causante de la enfermedad de cólera gastrointestinal. La diarrea causada por V. Ch ol era e s e debe a la secreción de la toxina de cólera (CT) .

La CT comprende una sub-unidad A sencilla (CT-A), que es la responsable para la actividad enzimática de la toxina y cinco sub-unidades B idénticas (CT-B), que se involucran en la ligadura de la toxina a células epiteliales intestinales, asi como a otras células que contienen gangliosidas GMi en su superficie. De manera conjunta, las sub-unidades CT-A y CT-B comprenden una holotoxina. La secuencia de la CT ya se a descrito (Bibliografía completa 1) .

La CT es un complejo hexaheteromér ico que consiste en un polipéptido A y cinco polipéptidos B idénticos (2) . El pentámero B se requiere para ligarse al receptor de superficie de células gangliosidas GMi (3) . La sub-unidad A puede ser prot eolíticamente cortada dentro de un giro enlazado a un disulfuro sencillo entre C187 y C199 para producir el polipéptido Al 'enzimáticamente activo (4) y el polipéptido A2 más pequeño, que enlaza el fragmento Al al pentámero B (5) . Durante en la entrada de los enterocitos, las ADP-ribosilatos CT-A1, una proteina G regulante (Gsa), que lleva a una activación constitutiva de la adenilata ciclasa, incrementa la concentración intracelular de CAMP, y una secreción de fluido de fluido y electrolitos en la abertura del intestino pequeño (6) . La activación de la ADP-ribosil trasferasa de CT, i n vi t ro , se estimula por la presencia de proteinas de accesorio llamadas ARF (7), pequeñas proteinas enlazadas por GT-conocidas porque se involucran en el tráfico de la vesícula dentro de la célula eucariotica.

La necesidad para procedimiento de inmunización efectivo es particularmente agudo con respecto a los organismos infecciosos que causan infecciones agudas en, o que alcanzan la entrada en el cuerpo a través de, la superficie gastrointestinal, pulmonar, nasofaringeal o genitourinarias. Estas áreas se bañan en la mucosa, que contienen inmunoglobulinas consistentes en su mayor parte de la IgA secretoria (8, 9, 10) . Este anticuerpo se deriva de un gran número de células de plasma que producen IgA que infiltran las regiones de lámina propria fundamentalmente estas membranas mucosales (11, 12) . La IgA se transporta específicamente a la superficie abierta a través de la acción del componente secretorio (13) .

Sin embargo, los regímenes de inmunización parentenal son usualmente inefectivos para inducir las respuestas secretorias para la IgA. La inmunidad secretoria es la más frecuentemente realizada durante la inmunización directa de los tejidos linfoides asociados mucosalmente . Después de su inducción en un sitio de mucosal, los precursores de las células de plasma que producen IgA se extravasan y se diseminan a diversos tejidos mucosales donde ocurre una síntesis de diferenciación final para una alta relación de IgA (14, 15, 16) . Estudios extensos han demostrado la posibilidad de una inmunización mucosal para inducir este sistema inmune mucosal común (17), pero con raras excepciones las dosis grandes de antigeno requerido para realizar una inmunización efectiva han hecho esta aproximación no práctica para los antigenos de vacuna purificados. Entre las estrategias investigadas para vencer este problema, esta el uso de coadyuvantes mucosales. Se conoce que la CT es uno de los coadyuvantes más potentes, y que la co-administración de CT con un antigeno no relacionado resulta en la inducción de la circulación concurrente y la respuesta al anticuerpo mucosal para este antigeno (18) . De esta manera, la CT actúa como un coadyuvante.

Se prefiere el uso como un coadyuvante de una forma de holotoxina CT que tenga una toxicidad reducida para que de esta manera reduzca los sintomas indeseables de la diarrea causada por la CT de tipo silvestre. De esta manera, existe la necesidad de identificar una holotoxina CT mutante que tenga la habilidad de aumentar la respuesta inmune mientras reduce la toxicidad de la holotoxina CT Descripción de la Invención En consecuencia, es un objetivo de esta invención utilizar una fórmula mutante de holotoxina CT que tenga una toxicidad reducida comparada con una CT de tipo silvestre como un coadyuvante en una composición antigénica para aumentar la respuesta inmune en un huésped vertebrado para un antigeno seleccionado de una bacteria patogénica, virus, hongo o parásito.

Estos objetos de la invención se realizan con una holotoxina de cólera mutante que presenta un punto de mutación en el aminoácido 29 de la subunidad A, en donde el residuo del ácido glutámico se remplaza por un aminoácido diferente al ácido aspártico. En una forma de realización particular esta invención, el aminoácido 29 es histidina. La CT mutado (también referida como CT-CRM) es útil como un coadyuvante en una composición antigénica para aumentar la respuesta inmune en un huésped vertebrado para un antigeno seleccionado de una bacteria patogénica, virus, hongos o parásito. La CT mutante se produce por mutagénesis directa al sitio del ADN que codifica la CT de tipo silvestre usando técnicas convencionales. La composición antigénica puede además comprender un diluyente o portador .

La invención también se dirige a métodos para incrementar la habilidad de una composición antigénica que contiene un antigeno seleccionado de una bacteria patogénica, virus, hongos o parásitos para obtener la respuesta inmune de un huésped vertebrado incluyendo una cantidad efectiva de coadyuvante de una holotoxina de cólera mutante, en donde la holotoxina tiene una toxicidad reducida comparada con la CT de tipo silvestre y el ácido glutámico en la posición del aminoácido 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera se remplaza por un aminoácido diferente al ácido aspártico, en particular una histidina.

La invención se refiere además a plásmidos que contienen secuencias ADN aisladas y purificadas que comprenden secuencias ADN que codifican una holotoxina de cólera mutante inmunogénica que tiene una substitución diferente a la del ácido aspártico para el ácido glutámico en la posición 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera, y en donde tal secuencia del ADN se enlaza de manera operativa a un promotor inducible por arabinosa, asi como a células huésped apropiadas transformadas, transducidas o transfectadas con tales plásmidos. La holotoxinas de cólera mutante inmunogénicas se producen transformando, t ransduci endo o trasfectando una célula huésped con un plásmido descrito anteriormente y cultivando la célula huésped bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteina des toxi fi cada inmunogénica reconbinante por la célula huésped.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 describe la capacidad de las CT-CRM para enlazar la gangliosida GMi . Cada una de las CT-CRM se diluye tres veces a una concentración inicial de 3 µg/ml y se prueba por duplicado. La capacidad de enlazado se expresa como el medio de absorbencia a 410 nm para cada una de las diluciones.

La Figura 2 describe la reducción en la colonización nasal en un medio Logio cfu por nariz en un ratón inmunizado intranasalmente (n=10 por grupo) con pilina recombinante meningococal (rpilina) con o sin un coadyuvante CT-CRME29H, o un ratón no inmunizado, en donde cada uno de los grupos se enfrenta entonces con la cepa bacterial meningococal homologa.

La Figura 3 describe la reducción en la colonización nasal en un medio Logio cfu por nariz en un ratón inmunizado intranasalmente (n=5 por grupo) con rpilina meningococal con o sin un coadyuvante CT-CRME29H. proteina de membrana exterior de clase 1 meningococal (Por A) con un coadyuvante CT-CRME29H , KLH con coadyuvante CT-CRME29H, o un ratón no inmunizado, en donde cada uno de los grupos se enfrenta entonces con la cepa bacterial meningococal homologa.

La Figura 4 describe la reducción en la colonización nasal en un medio Log10 cfu de cepa meningococal 870227 por nariz en un ratón inmunizado intranasalmente (n=10 por grupo) con rpilina meningococal, PorA de cepa meningococal H355, PorA de cepa meningococal 870227, células completas de cepa meningococal inactivadas por calor 870227 o KLH, cada uno de los coadyuvantes con CT-CRME29H, donde cada uno de los grupos se enfrenta entonces con una cepa baterial meningococal heteróloga (870227) .

La Figura 5 describe la reducción en la colonización nasal en un medio Logio cfu de cepa meningococal 870227 por nariz en un ratón inmunizado subcutáneamente (n=10 por grupo) con PorA de cepa meningococal H355 con un coadyuvante CT-CRME29H, o MPL©, KLH con coadyuvante MPL©, o células completas de cepa meningococal inactivadas por calor 870227 con un coadyuvante MPL®, donde cada uno de los grupos se enfrenta entonces con una cepa bacterial meningococal heteróloga (870227) .

La Figura 6 describe un primer ensayo de la actividad citolitica dependiente del antigeno para células objetivo infectadas por un virus sincilial respiratorio (RSV) como el porcentaje de células lisis contra la relación resul tado : obj et ivo .

La Figura 7 describe un primer ensayo de la protección del pulmón del ratón para el estimulo al RSV por la inmunización con un coadyuvante más proteina F, donde la concentración del virus del pulmón se mide como Logio PFU por gramo.

La Figura 8 describe un segundo ensayo de la actividad citolitica dependiente del antigeno para células objetivo infectadas con RSV como el porcentaje de células lisis contra la relación resultado: objetivo.

La Figura 9 describe un segundo ensayo de la protección del pulmón del ratón para el estimulo con RSV por la inmunización con un coadyuvante más proteina F, donde la concentración del virus del pulmón se mide como Logio PFU por gramo.

La Figura 10 describe las respuestas al anticuerpo del suero especifico de rotavirus en un ratón BALB/c inmunizado intranasalmente con 2/6-VLP con o sin coadyuvante CT-CRME29H. Los ratones BALB/c se inmunizan intranasalmente con 2/6-VLP con (n= 4) o sin (n= 5) CT-CRME29H y los niveles de IgG (Figura 10A), IgM (Figura 10B) e IgA (Figura 10C) específicos de rotavirus se miden. Se muestran desviaciones estándar.

La Figura 11 describe las respuestas al anticuerpo del suero especifico de rotavirus en un ratón consanguíneo BALB/c inmunizado con 2/6-VLP. Los grupos de ratones BALB/c se inmunizaron, oralmente (cuadrado, n=4), intranasalmente (en diamante n=5) o en combinación (intranasal más oral, circulo, n=4), con 2/6-VLP más CT-CRME29H, en la semana 0 y 2. Se colectaron muestras de suero de cada ratón en cada uno de los grupos en las semanas mostradas, y los niveles de suero IgG (Figura HA), IgM (Figura 11B) e IgA (Figura 11C) se determinan para cada uno de los ratones por el ensayo ELISA. La concentración de medios geométricos (GMT) se calcula para cada uno de los grupos y se trazan contra las semanas posteriores a la inmunización.

La Figura 12 describe una subclase de anticuerpo IgGl e IgG2a en ratones BALB/c. Se usa para determinar las subclases de IgG, un suero previamente estimulado de ratón BALB/c inmunizado oralmente o IN, con partículas similares a la del virus 2/6-rotavirus (VLP) más CT-CRME29H. • Se muestran desviaciones estándar.

La Figura 13 describe una respuesta al anticuerpo intestinal especifico de rotavirus en ratones BALB/c consanguíneos inmunizados con 2/6-VLP. Grupos de ratones BALB/c se inmunizaron con 2/6-VLP más CT-CRME29H como se describe para la Figura 11, y se miden los niveles de IgA (Figura 13A) e IgG (Figura 13B) intestinal especifico de rotavirus. No se detecta IgM intestinal especifico de rotavirus en ningún ratón.

La Figura 14 describe la protección de ratones CD-1 y BALB/c inmunizados con 2/6-VLP después de estimularse con el rotavirus de murina. La Figura 14A describe una comparación del porcentaje de reducción en el derramamiento del antigeno (PRAS) entre ratones inmunizados con 2/6 VLP con (n= 5) o sin (n=4) CT-CRME29H. El PRAS para cada uno de los ratones (•) y el significado de cada uno de los grupos (-) se calcula. La Figura 14B describe grupos de ratones BALB/c inmunizados con 2/6-VLP más CT-CRME29H por diferentes rutas como se muestran, y los niveles de protección se determinan como se describen anteriormente. La Figura 14C describe grupos de ratones CD-1 hexógamos inmunizados con 2/6-VLP más CT-CRME29H oralmente e intranasalmente como se describe anteriormente. En la semana 26, los ratones inmunizados y de control se estimularon y se calculó el PRAS como se describe anteriormente. En el grupo oral (n=4), un ratón murió antes del estimulo (n= 3 para protección) .

Descripción Detallada de la Invención La utilidad de las formas mutantes de CT como coadyuvantes para composiciones antigénicas se describe en la presente. Se genera un conjunto de CT mutantes clonadas (CT-CRM) en E . co l i . Los datos indican que la CT-CRM con propiedades coadyuvantes superiores es el mutante con una substitución de aminoácido no conservadora (ácido glutámico para histidina) en la posición 29 en la sub-unidad A ( CT-CRME29H ) • Los datos acumulados demuestran que la CT-CRME29H es una holotoxina y es menos tóxica que la CT de tipo silvestre. De manera importante, la CT-CRME29H es hábil para aumentar las respuestas inmunes sistémicas y de mucosales después de ya sea la administración intragástrica (IG) o intranasal (IN) de antigenos de vacuna disparados. Estos antigenos de vacuna son ya sea de patógenos bacteriales o virales. Los resultados en los modelos de murina de Hel i coba c t er fel i s , e infección por virus sintilial respiratorio y rotavirus (RSV) indican que las respuestas inmunes se facilitan por la inmunización intragástrica o intranasal con una vacuna preparada con CT-CRME29H siendo protectoras. Los datos indican que la CT-CRME29H es al menos activa como un coadyuvante como la CT de tipo silvestre. Aun en presencia de respuestas inmunes anti CT previamente existentes, la CT-CRME29H es hábil para servir como un coadyuvante mucosal.

La CT-A mutante retenido tiene la habilidad para ensamblarse con la CT-B para formar una holotoxina que vuelve a ensamblarse a la CT de tipo silvestre en su coadyuvancia, pero exhibiendo una toxicidad reducida comparada con una CT de tipo silvestre. Las sub-unidades B pueden tener sus secuencias nativas o pueden ser por si mismas mut adas .

El nivel reducido resultante de toxicidad proporciona una CT alterada para usarse como un coadyuvante. La CT mutante inmunogénica de conformidad de la presente invención exhibe un balance reducido de toxicidad y una coadyuvancia retenida, de tal manera que la proteina funciona como un coadyuvante mientras es seguramente tolerada por el huésped vertebrado inmunizado con la composición antigénica.

Las composiciones antigénicas de la presente invención modulan la respuesta inmune mejorando la respuesta del anticuerpo del huésped vertebrado y la inmunidad mediada por la célula después de la administración de una composición antigénica que comprende un antigeno seleccionado de una bacteria patogénica, virus, hongos o parásitos y una cantidad coadyuvante efectiva de una CT mutante, donde la CT tiene una toxicidad reducida comparada con una CT de tipo silvestre y el ácido glutámico en la posición 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera se remplaza por un aminoácido diferente al ácido aspártico. En una forma de realización particular de esta invención, el aminoácido 29 es histidina.

Como se usa en la presente, el termino "la holotoxina tiene una toxicidad reducida" significa que la CT-CRM mutante, tal como la CT-CRME29H, exhibe una toxicidad sustancialmente menor por unida de proteina tóxica purificada comparada con la CT de tipo silvestre, lo que habilita a la mutante para usarse como coadyuvante en una composición antigénica sin causar efectos colaterales significantes.

Como se usa en la presente, el término "cantidad coadyuvante efectiva" significa una dosis de la CT-CRM mutante, tal como la CT-CRME29H, que es apropiada para obtener una respuesta inmune incrementada en un huésped vertebrado. La dosis particular dependerá de la edad, peso y condición médica del huésped, asi como por el método de administración. Las dosis apropiadas son fácilmente determinadas por las personas hábiles en la técnica .

Se generan cinco CT-CRM como se describe en el Ejemplo 1 siguiente con las siguientes mutaciones en la sub-unidad A: Ami no á c i do N a t i vo Mutante Abreviatura 7 Arginina Lisina CT-CRMR7K 11 Arginina Lisina CT-CRMR11K 29 Ácido glutámico Histidina CT-CRME29H 110 Ácido glutámico Ácido aspártico CT-CRMEI10D 112 Ácido glutámico Ácido aspártico CT-CRME?i2D Los efectos fenotipicos de estas mutaciones en la estructura y la función de la CT se analizan entonces .

Las variantes CT-A R7K, E29H, E110D y E112D son hábiles para ensamblarse en la holotoxina inmunoreact i va como se determina por un ensayo de enlace GMi de gangliosida (Figura 1) . Sin embargo, una porción de la RllK purificada no aparece para ser una holotoxina cuando se prueba con los anticuerpos policlonales descritos en el Ejemplo 2.

Cada una de las variantes de holotoxina se probaron en un ensayo de células de tumor adrenal Y-l (19) para determinar su toxicidad residual comparada con la holotoxina CT de tipo silvestre. Los resultados presentados en la Tabla 2 demuestran que la CT-CRME29H y la CT-B comercial (sigma) tiene una toxicidad residual del 1.2%. La toxicidad residual del 1.2% asociada con la CT-B comercial fue la más probable debido a la subunidad A contaminante (aproximadamente 0.5%) . La toxicidad residual de las restantes CT-CRM con mutaciones en el aminoácido de las posiciones 4, 11, 110, ó 112 fueron menores o iguales al 0.4%.

Se probaron las CT-CRME29H en un ensayo de peso del intestino de ratón de patente (20) para estimar la acumulación de fluido intestinal como una medida in vi vo de la toxicidad. Los resultados presentados en la Tabla 3 demuestran que la CT-CRME2gH fue significativamente menos activa para estimular un incremento en la acumulación de fluidos en el tracto intestinal de los ratones que la CT de tipo silvestre.

Cada una de las CT-CRM también se compara a la CT en un ensayo de actividad ADP-ribosiltransferasa . Los resultados generalmente están de acuerdo con aquellos generados en el ensayo de célula adrenal Y-l y sugieren que la mutación en la sub-unidad Al resulta en una actividad disminuida ADP-ribosil trans ferasa por las diferentes CT-CRM cuando se comparan con la CT de tipo silvestre (Tabla 4) . El mutante con la actividad de enzima más grande aparece para ser la CT-CRME29H. Esta actividad fue de aproximadamente del 10% que la de la CT de tipo silvestre.

La tripsinización a 37°C de la CT-CRME29H causa la disociación de la CT-A en los fragmentos Al y A2 de una manera no distinguible a partir del tratamiento de la CT de tipo silvestre basada en el análisis de mancha Western. Esto proporciona una evidencia adicional de que la estructura de la CT-CRME29H es similar a la de la CT de tipo s i 1ves t re .

Las diferencias aparentes en la actividad de la CT-CRME29H en la célula de tumor adrenal Y-l y los ensayos de actividad ADP-ribos i lación se deben a la activación de la tripsina de la holotoxina mutante en el último ensayo. De esta manera, la carencia de una CT-A disociada en sub-unidades Al y A2 se debe a la reducción de la actividad proteasa en la E. coli que contribuye al alivio de la CT-CRME29H expresada en la E. coli. De manera colectiva, los datos acumulados muestran que la CT-CRME29H es una holotoxina que se liga a la gangliosida GMi y es significativamente menos tóxica que la CT de tipo silvestre.

Se ha conducido una serie de estudios para evaluar la eficacia de la CT-CRME29H como un coadyuvante mucosal para composiciones que contiene antigenos bacteriales o virales que se han identificados como candidatos a vacunas como sigue: (1) Proteina P4 recombinante (NTHi) de Haemophilus influenzae no tipificable, también conocida como proteina "e" (rP4) (21), proteina P6 NTHi recombinante (rP6) (22), y proteina de penetración y adherencia (Haps) de Haemophilus influenzae nativa purificada (23); (2) proteina de Ureasa recombinante de Helicobacter pilori (rUreasa) (24); (3) pilina de clase 1 recombinante de grupo B Neisseria meningitidis (25) y proteina de membrana exterior de clase 1 del grupo B Neissería meningitidis (26); (4) proteina de fusión nativa purificada de virus respiratorio sincilial (RSV F) (27); y (5) partículas del tipo del virus 2/6 de rotavirus (28) .

La CT-CRME29H se compara con otras cuatro CT mutantes y CT de tipo silvestre como un coadyuvante para las proteinas rp4 y rP6 de NTHi. Los resultados indican que las cinco diferentes CT-CRM aumentan la capacidad de las proteinas rp4 y rP6 para obtener respuestas inmunes humorales sistémicas (Tablas 5 y 6) . Por ejemplo, dos semanas después la inmunización IN terciaria, las concentraciones de los anticuerpos IgG anti rP4 de ratones inmunizados con proteinas rP4 y rP6 formuladas ya sea de CT-CRME29H o CT-CRMEHOD. fueron 40 veces mayores que las de los ratones inmunizados con las proteinas recombinantes de PBS únicamente (Tabla 5) . Las concentraciones de anticuerpos de los ratones que se les administró la proteina recombinante más la holotoxina CT de tipo silvestre se elevaron 20 veces. Las concentraciones de anticuerpos anti-rP4 de los ratones inmunizados con la CT-CRMRnK se elevaron 10 veces .

Se observan diferencias aún más dramáticas cuando el suero se examina para las concentraciones de anticuerpo P6 anti-nativo (Tabla 6) . Dos semanas después de una inmunización IN secundaria, las concentraciones del anticuerpo P6 anti-nativo de ratones inmunizados ya sea con la CT-CRME29H o CT-CRMEUOD formula vacunas que son más de 30 veces mayores que las de los ratones inmunizados con rP6 más PBS. En comparación, la vacuna preparada con la CT de tipo silvestre obtiene un anticuerpo P6 anti-nativo que es 90 veces mayor que la que se genera por el PBS preparado de la formulación. Las concentraciones de anticuerpo P6 anti-nativo de los ratones inmunizados ya sea con preparaciones de la CT-CRME112D, CT-CRMR7K, O CT-CRMRHK, sólo es de dos hasta cuatro veces mayor que la de los recipientes inmunizados con rP4 más rP6 formulado sólo con PBS .

Una examinación de los anticuerpos específicos de proteina en las secreciones mucosales dos semanas después de una inmunización terciaria, indica, además, que la CT-CRM facilita la generación de respuestas inmunes locales contra la proteina rP4. Por otra parte, las concentraciones del anticuerpo anti-rP4 son comparables con aquellas inducidas por la CT de tipo silvestre (Tabla 7) . Las concentraciones de anticuerpo local no se detectan contra la proteina P6 nativa (datos no mostrados) . De esta manera, los datos cuando se toman juntos, sugieren que las CT mutantes más propias para generar tanto respuestas de anticuerpos locales y sistémicas contra las proteinas rP4 y rP6 son las CT-CRM que contienen una mutación ya sea la posición 29 ó 110.

Se realizó un estudio adicional para confirmar el potencial de la CT-CRME29H como un coadyuvante y para determinar la dosis apropiada para la inmunización IN (Tabla 8) . Los resultados indican que 1 µg de la CT-CRME29H facilita la mayor respuesta inmune humoral local y sistémica contra la proteina rP4. Cuando la dosis de CT-CRME29H se incrementa desde 1 hasta 10 ó 30 µg por dosis, los datos surgieren que tanto las respuestas inmune mucosal y sistémica, se disminuyen. Por ejemplo, las concentraciones de anticuerpos IgG anti-P4 de suero de ratones inmunizados con 10 µg de CT-CRME29H son de un séptimo de la de los ratones inmunizados con 1 µg de CT-CRME29H al dia 48 del estudio (Tabla 8) . Por otra parte, las concentraciones del anticuerpo IgA anti-P4 local de los fluidos de lavado broncoalveolar y vaginal del grupo formado son de un tercio-un cuarto y un dieciseisavo de los del último grupo de ratones al dia 49. Los datos indican que las respuestas inmunes humorales local y sistémica de los ratones inmunizados con rP4 más r P6 /CT-CRME29H son esencialmente idénticas a aquellas obtenidas después de la inmunización con la vacuna del coadyuvante de la CT de tipo silvestre (Tabla 8) .

El efecto de la adición de la CT-CRME29H en la respuesta del anticuerpo de suero obtenido por la inmunización con la proteina Haps se examina.

Además que la asistencia de la CT-CRME29H induce una respuesta de anticuerpos de suero a la proteina Haps (Tabla 9) . La respuesta inmune se observa en el suero de la semana 7; no se detectan concentraciones de anticuerpos en el suero previamente. Las concentraciones de anti-Haps del ensayo ELISA del suero obtenido de los ratones inmunizados se muestra en la Tabla 9. Las respuestas se incrementan en una dosis de manera dependiente y donde se aumenta aproximadamente tres veces por la adición de 0.1 µg de CT-CRME29H. Este aumento ocurre a ambos niveles de dosis.

El potencial de las cinco diferentes CT-CRM para aumentar las respuestas inmunes humorales sistémicas y locales después de la inmunización intragástrica (IG) con la proteina rUreasa de H . pyl ori se evalúan usando un modelo de ratón (29) . Los resultados son similares a aquellos obtenidos con las proteinas NTHi después de la administración intranasal. Los datos indican que la CT-CRME29H es el mutante con el mayor potencial para aumentar la respuesta inmune humoral sistémica y local después de una inmunización IG. Las concentraciones de anticuerpo IgG (Tabla 10) e IgA (Tabla 11) de suero de medio geométrico anti-rUreasa obtenidas por las vacunas formuladas con la CT-CRME29H son de seis y tres veces mayores, respectivamente, que aquellas inducidas por la CT-CRMEHOD el dia 28 del estudio. Adicionalmente, las concentraciones del anticuerpo IgG e IgA del suero obtenidas por las vacunas formuladas con la CT-CRME29H son equivalentes a aquellas generadas por la vacuna que contiene la CT de tipo silvestre.

De manera más importante, la inmunización IG con la rUreasa formulada con la CT-CRME29H aparase para generar las más altas respuestas inmunes humorales locales (Tabla 12) . Esto es más evidente después del examen de los fluidos de lavado broncoalveolares . Las concentraciones del anticuerpo IgA anti-rUreasa en los fluidos de lavado broncoalveolares es cinco veces mayor que el obtenido de la vacuna preparada con la CT-CRMEHOD- En comparación con la formulación de CT de tipo silvestre, las concentraciones del anticuerpo IgA anti-rUreasa están en un quinto del nivel. Sin embargo, las concentraciones del anticuerpo IgA especifico de proteina en los fluidos de lavado vaginal del grupo inmunizado con la vacuna formulada con CT-CRME29H son esencialmente equivalentes a aquellos obtenidos por la vacuna preparada con CT de tipo silvestre (Tabla 12) .

Es notable que los datos implican que la inmunización parenteral no obtiene anticuerpos IgA específicos de rUreasa remarcables en los fluidos de lavados broncoalveolar cuando se comparan aquellos obtenidos en ratones inmunizados IG con la vacuna preparada con ia CT-CRME29H (Tabla 12) .

Por lo tanto, se conduce un segundo estudio para probar la eficacia de las respuestas inmunes generadas por la rUreasa formulada con la CT-CRME29H- LOS datos sugieren que la CT-CRME29H es tan potente como la CT de tipo silvestre soportando la inducción de respuestas inmunes protectoras contra la H fel i s (Tabla 13) . Las concentraciones de anticuerpo IgA anti-rUreasa de suero del grupo formado son equivalentes a aquellas del último grupo de ratones el dia 28 del estudio. Las concentraciones de anticuerpo IgA de proteina especifica en el suero de ratones inmunizados parenteralmente con rUreasa más Stimulon© QS-21, fue 12 veces mayor que aquellas de los ratones inmunizados IG con la vacuna preparada con CT-CRME29H- Sin embargo, las concentraciones del anticuerpo IgA de proteina especifico en los fluidos de lavado broncoalveolares de los ratones inmunizados con la CT-CRME29H fueron más de diez veces mayores que aquellas de los ratones inmunizados parenteralmente (Tabla 13) .

Estos resultados sugieren una correlación entre la inmunización IG y la habilidad de los ratones para limpiarse de H . fel i s del tejido estomacal. Diez dias después del último estimulo, el 80% de los ratones inmunizados IG con las vacunas formuladas ya sea con la CT o la CT-CRME29H fueron hábiles para limpiarse de bacterias que contienen ureasa del tejido estomacal. En contraste, los ratones de control simples (10%), ratones inmunizados IG con rUreasa más PBS sólo (20%), o los ratones inmunizados subcutáneamente con rUreasa mezclada con Stimulon® QS-21 (30%), aparecen para tener menos habilidad para erradicar el fí. fel i s (Tabla 13) . Se notará que los datos no sugieren una relación entre la eficacia y las concentraciones del anticuerpo IgA de proteinas especifico en los fluidos de lavado broncoalveolares. Las concentraciones del anticuerpo IgA de proteina especifico en los fluidos de lavado broncoalveolares de ratones inmunizados IG con rUreasa más la CT de tipo silvestre son un décimo de aquellas de los ratones inmunizados con la CT-CRME29H (Tabla 13) . Aun, se realiza una protección del 80% con ambas vacunas. De esta manera, se monitorea las respuestas inmunes humorales locales en los tejidos pulmonares teniendo poca relevancia a las respuestas inmunes protectoras que ocurren en el estómago .

Se ha sugerido por el Dr. Jani O'Rourke (Universidad de New South Wales; comunicación personal) que los ratones C57B1/6, diferentes a los ratones BALB/c, experimentan una muerte similar a la que se observa en humanos después de una infección con H . pyl ori . Para probar la eficacia de las respuestas inmune anti-rUreasa facilitadas por la CT-CRME29H para limpiar de H . pyl ori los tejidos gástricos, se iniciaron una serie de estudios separados usando ratones C577B1/6. Los resultados sugieren que la inmunización IG con rUreasa formada por la CT-CRME29H genera respuestas inmunes humorales sistémicas y locales que son similares a aquellas obtenidas por la rUreasa formulada con la CT de tipo silvestre (Tabla 14). Las concentraciones de anticuerpo IgA anti-rUreasa en el fluido de lavado vaginal y broncoalveolar y de suero de los ratones inmunizado ya sea con las vacunas preparadas con la CT de tipo silvestre o la CT-CRME29H el dia 28 del estudio, fueron indistinguibles. Las únicas disparidades fueron las concentraciones de anticuerpo IgA detectadas en los extractos de peletizados fecales de ratones inmunizados con la vacuna preparada con la CT-CRME29H (Tabla 14), que son tres veces mayores. Se notará que las concentraciones de anticuerpo IgA de proteina especifica en las heces fecales de los ratones inmunizados parenteralmente con la rUreasa más alumbre, fueron sustancialmente menores que aquellas de los ratones inmunizados IG ya sea con formulaciones de la CT de tipo silvestre o la CT-CRME29H (un trigésimo octavo y un catorceavo, respectivamente) . De esta manera, el modelo de ratones C5777B1/6 aparece para ser capaz de evaluar la capacidad de la CT-CRME29H para respuestas inmunes de un coadyuvante generadas después de la inmunización IG. Por otra parte, los datos indican que el modelo es capaz de definir los papeles de las respuestas inmunes sistémicas y locales en la protección de la superficies mucosales de la H . pi l ori .

Se ha reportado que la CT es contraindicada como un coadyuvante para las respuestas inmune mucosales (30,31) . La hipótesis era que la CT predispone a las vacunas a obtener concentraciones de anticuerpos IgE pesados, que son indeseables. La IgE se asocia con la hipersensibilidad y reacciones alérgicas. Esto además implica que la toxina habilitada por calor de E . co l i (LT), o las LT-CRM, tienen menos potencial para obtener concentraciones de anticuerpos IgE pesados. Por lo tanto, la conclusión era que la LT o las LT-CRM son coadyuvantes de vacuna más apropiados para la generación de la respuesta inmune mucosal. Para probar esta hipótesis, se formulan vacunas compuestas de rUreasa ya sea con CT, LT, o CT-CRME29H y se prueban en ratones C57B1/6 para su habilidad para obtener anticuerpos IgE después de una inmunización IG (Tabla 15) . Los datos sugieren que las vacunas preparadas ya sea con la CT-CRME2gH o la CT de tipo silvestre son menos parecidas que las de LT de tipo silvestre para generar el total de anticuerpos de IgE de ureasa especifica en la circulación. En efecto, la implicación de que las vacunas formuladas con la CT-CRME29H son menos apropiadas para generar concentraciones de anticuerpos IgE elevadas. Tanto las concentraciones del punto final total y del anticuerpo IgE especifico de rUreasa son de un cuarto de aquellos de ios ratones inmunizados con la vacuna preparada con la LT de tipo silvestre (Tabla 15) . De esta manera, estos datos sugieren que, al menos en una formulación de rUreasa, la CT-CRME29H se prefiere sobre la LT como un coadyuvante .

Sin enlazarse por la teoría, el mecanismo de la LT recientemente activado propuesto por van den Akker y colaboradores (32) presenta una explicación más apropiada para reducir la toxicidad de las variantes de CT alternadas en o alrededor de E29. Después de la disociación del giro de disulfuro y la reducción de la unión de disulfuro enlazados a los dominios Al y A2 , el giro consiste de los residuos 30-33 en el dominio Al propuesto para cambiar de posición como una consecuencia del movimiento del eje largo del dominio A2. Las substituciones de E29 pueden alterar el comportamiento del giro 30-33, resultando en una activación reducida de la CT-A1. Una explicación potencial para toxicidad reducida de la CT-Y30WAH y CT-G34GGP también puede explicarse por los efectos del giro 30-33 que reducen la activación de la CT-A1. El siguiente paso en la via de activación propuesta es el movimiento del giro completo de 25-36, que rompe las interacciones entre R25 e Y55. La CT-R25G muestra una reducción en la toxicidad a una extensión mayor que la CT-R25W, posiblemente debido a las cadenas laterales de R25 e Y55 que participan en las interacciones hidrofóbicas, que pueden retenerse por la CT-R25W pero no por la CT-R25G. Los fenotipos de estas variantes son consistentes con el modelo para la activación de las enterotoxinas habilitadas por calor propuestas por van den Akker y colaboradores (32) .

Se conducen una serie de experimentos para evaluar la eficacia de las CT-CRME29H como un coadyuvante mucosal y parenteral para dos candidatos a vacunas de la Nei s s eri a m en i n gi t i di s del grupo B. El primer candidato es la pirina de clase 1 recombinante (rpirina) (25) . El segundo candidato es la proteina de membrana exterior de clase 1 (PorA) expresada por una cepa meningococal mutante que no expresa la proteina de clase 2/3 (26) .

Un efecto coadyuvante mucosal se muestra en un primer experimento, en el cual los anticuerpos IgG de suero especifico de rpilina se aumentan en grupos que se le agrega la CT-CRME29H, en el rango desde 3 hasta 19 veces incrementadas en comparación con las concentraciones obtenidas en los ratones que reciben rpilina en una solución salina (Tabla 16) . El suero IgA especifico también se incrementa de 2 hasta 5 veces en los ratones inmunizados con rpilina liberada en la CT-CRME29H (tanto a 0.1 y 1.0 µg) . Se notará que la CT-CRME29H (1 µg) incrementa el IgA especifico de rpilina de 3 hasta 10 veces en los lavados nasales, vaginales y broncoalveolares. Adicionalmente, la inmunización IN con rpilina más la CT-CRME29H reduce significativamente la colonización nasal por el grupo B de cepa homologa de N . m en i n gi t i di s hasta el nivel de detección en ratones Swiss-Webster (Figura 2) .

Se conduce un segundo experimento para demostrar que la CT-CRME29H aumenta la protección de la rpilina contra una cepa meningococal homologa. Como se muestra en la Tabla 17, las concentraciones del suero IgG de la célula completa B meningococal del ensayo ELISA se incrementan en la rpilina más el grupo CT-CRME29H a al menos 4 veces comparado con la cepa homologa, asi como cepas heterólogas FAM18 y M982 en comparación con las concentraciones de los ratones que recibe solamente la rpilina. Como un control, ratones inmunizados con KLH más la CT-CRME29H no inducen el IgG de suero en la célula completa del ensayo ELISA para ninguna de las cepas probadas. En la Tabla 18, los anticuerpos IgG e IgA específicos de rpilina se incrementan substancialmente en el grupo de la rpilina más la CT-CRME29HÍ como se compara en el grupo que no es coadyuvante. Sin embargo, la CT-CRME29H como un coadyuvante mucosal para la rpilina protege a los ratones contra la colonización nasal por la cepa meningococal del grupo B homólogo (Figura 3) .

A continuación, se demuestra la inmunogenicidad de la PorA más la CT-CRME29H en la inmunización IN. El grupo que recibe el coadyuvante PorA con la CT-CRME29H genera un incremento en los anticuerpos del suero IgG para las células completas H44/76 de N . m en i n gi t i di s y genera entre 7 y 14 veces más anticuerpos específicos de PorA comparados con el grupo PorA sin coadyuvantes (Tabla 19) . Sin embargo, los anticuerpos IgA del suero para la PorA H44/76 no se detectan. Tampoco se detectan anticuerpos específicos de PorA en ninguna de las muestras de secreción mucosal colectadas (Tabla 19) .

Se conduce un cuarto experimento para demostrar que la CT-CRME29H permite a la protección ya sea por la rpilina o la PorA contra una cepa meningococal heteróloga. Los datos, particularmente de la Tabla 20, indican que la administración IN de la rpilina de la clase 1 ó PorA liberadas con la CT-CRME29H no sólo obtiene concentraciones de anticuerpos de suero altas para los antigenos y células completas meningococales , sino también protege a los ratones Swi s s-Webs t er contra la colonización nasal con una cepa heteróloga del grupo B de N. men in gi t i di s . Específicamente, la CT-CRME29H aumenta la respuesta al anticuerpo del suero para la rpilina de clase 1 como se compara con la del grupo que no tiene coadyuvante. Similarmente, el grupo de rpilina de clase 1 coadyuvante proporciona un aumento en la limpieza nasal de bacterias.

Posteriormente, la habilidad de la CT-CRME29H para la inmunización parenteral meningococal se examina. Como se muestra en la Figura 5, el coadyuvante PorA H355 ya sea con MPL® o la CT-CRME29H reduce significativamente la colonización nasal de la cepa heteróloga meningococal del grupo B 870227. En particular, los ratones inmunizados subcutáneamente con PorA H355 más la CT-CRME29H tiene significativamente aún algunas .colonias más que el grupo de PorA H355 más MPL© en la nariz 24 horas después del estimulo. Sin embargo, las actividades bactericidas se detectan en el suero solo de la PorA y el coadyuvante de la célula completa eliminada por calor con grupos inmunizados por MPL© respectivamente (Tabla 22), pero no del grupo PorA más la CT-CRME29H. Aunque el coadyuvante PorA con la CT-CRME29H no obtiene actividades bactericidas homologas similares a las del coadyuvante MPL®, es altamente eficaz reduciendo la colonización por una cepa meningococal del grupo B heteróloga.

La capacidad de la CT-CRME29H para aumentar las respuestas inmunes sistémicas y mucosales contra las glicoproteinas del virus sincilial respiratorio (RSV), se examina usando una proteina de fusión nativa purificada (F) . Además, se investiga el impacto de los anticuerpos anti-CT previamente existentes en la potencia de la CT-CRME29H como un coadyuvante. Los resultados demuestran que los ratones BALB/c inmunizados IN con el coadyuvante con la proteina F ya sea con la CT o la CT-CRME29H genera concentraciones de anticuerpos sistémicos y locales IgG e IgA anti-CT (Tabla 23) . Por otra parte, los datos indican que las concentraciones de anticuerpo generadas por la formulación que contiene la CT-CRME29H son equivalentes a aquellas obtenidos por la formulación que contiene la CT de tipo silvestre. Por ejemplo 10 dias después de una inmunización secundaria con la proteina F/CT-CRME29H (1 µg por dosis), las concentraciones del anticuerpo IgA e IgG de suero anti-CT solo son ligeramente menores que aquellas de los ratones inmunizados con la proteina F/CT (1 µg por dosis) . También se obtienen resultados similares después del examen de los fluidos de lavado vaginal de los ratones inmunizados con la proteina F preparada ya sea con 1 ó 10 µg de la CT-CRME29H (Tabla 23) . Los datos sugieren por lo tanto que la CT-CRME29H fue un inmunogénico como la CT de tipo silvestre.

La pregunta de que si la respuesta inmune anti-CT puede afectar adversamente la inmunogenicidad del antigeno F se dirige en un segundo experimento donde ratones BALB/c son sebados primero por dos administraciones IN con tanto la CT de tipo silvestre o la CT-CRME29H en PBS únicamente (Tabla 24) . Posteriormente, los ratones apropiados se inmunizan dos veces con la proteina F mezclada ya sea con la CT de tipo silvestre o la CT-CRME2gH. Un examen del suero colectado dos semanas después de la última administración (dia 56) indica que los anticuerpos anti-CT existentes previamente no tienen un impacto negativo en nivel de los anticuerpos IgA e IgG anti proteina F local o sistémico. En efecto los datos indican que los anticuerpos anti-CT existentes previamente son benéficos para la generación de una respuesta de anticuerpo anti proteina F aumentada. Esto es más evidente cuando el anticuerpo anti proteina F titulado producido en las superficies mucosales se compara (Tabla 24) . Dos semanas después de la inmunización secundaria, las concentraciones de anticuerpo IgA anti proteina F en los fluidos de lavado broncoalveolar y vaginal de los ratones sebados primero con la CT-CRME29H y entonces inmunizados con la proteina F/CT-CRME29H , fueron de 7 y 17 veces mayores, respectivamente, que los de los ratones simples inmunizados solamente con la proteina F/CT-CRME29H (Tabla 24) .

En un tercer experimento, se analizaron la respuesta inmune sistémica y mucosal de los ratones BLB/c inmunizados IN con la proteina F RSV y la CT-CRME29H/ CT-B o alumbre. La Tabla 25 coloca las respuestas inmunes humorales del suero colectado nueve dias después de la inmunización terciaria. Los ratones que han recibido inmunizaciones que contienen la proteina F y ya sea 1 ó 10 µg de la CT-CRME29H (grupos 777 y 778, respectivamente) muestran concentraciones significativamente elevadas para el IgG, IgGl y IgG2 cuando se compara con ratones inmunizados con F/PBS, F/ALOH o RSV (grupos 784, 785 y 907, respectivamente) . Además, las concentraciones generadas por vacunas que contienen la F/CT-CRME29H (777 y 778) son al menos equivalentes a aquellas estimuladas por la proteina F y CTB (779 y 780) .

Los lavados de fluidos broncoalveolares, vaginales y nasales se colectaron de los animales inmunizados una semana después de la inmunización final con objeto de ejecutar los ensayos ELISA de los anticuerpos IgG e IgA. Los datos, colocados en la Tabla 26 muestran concentraciones del conjunto de cinco ratones. Los ratones inmunizados con la CT-CRME29H obtienen un IgA detectable tanto en lavados nasales y vaginales (grupos 777 y 778) . El IgA no se observa en los BAL derivados de los ratones inmunizados con la CT-CRME29H y esto representa un contraste para observarse en el BAL de los ratones inmunizados con RSV (grupo 907) y los ratones inmunizados con F/CTB (780) . El IgG se observa en todos los lavados mucosales incluidos los del BAL. Los niveles de IgG observados en los lavados de ratones inmunizados con la CT-CRME29H son comparables a aquellos obtenidos por la inmunización con CTB (grupos 779 y 780) y el RSV vivo .

En un cuarto experimento, la actividad citolitica (CTL) obtenida por células de bazo estimuladas i n vi t ro derivadas de ratones inmunizado se analizaron. Los datos se presentan en la Figura 6. En tanto que los ratones inmunizados por RSV muestran una célula lisis especifica antigena de aproximadamente el 60%, la actividad CTL de cada uno de los restantes ratones queda debajo del 20%. De esta manera, en tanto que la CT-CRME29H es hábil para inducir tanto las respuestas inmunes sistémicas y mucosales humorales para la proteina F RSV (Tablas 25 y 26), las respuestas inmunes mediadas por la célula para las células objetivo infectadas con RSV no se observa .

En un quinto experimento, el ensayo de protección viral se ejecuta con objeto de investigar si la liberación intranasal de la F/CT-CRME29H facilita la protección contra el estimulo a RSV vivo. Los datos se presentan en la Figura 7.

El análisis estadístico por ANOVA de los resultados descritos en la Figura 7 es como sigue: p < 0.05: F/PBS contra F/CT-CRME29H (1 µg y 10 µg CT-CRME29H) . F/CTB (1 µg y 10 µg) , F/ALOH. p > 0.05: PB/CT-CRME29H contra F/PBS p < 0.05: F/CT-CRME29H (i µg y 10 µg CT-CRME29H) contra F/CTB (1 µg y 10 µg ) contra F/ALOH.

Los ratones que recibieron las vacunas IN conteniendo la F/CT-CRME29H o la F/CTB tuvieron concentraciones virales en el pulmón comparables con aquellas ejecutadas en ratones inmunizados intramuscularmente con la F/ALOH (p>0.05) .

Adicionalmente, la inmunización intranasal con la F/CT-CRME29H se observa para reducir las concentraciones de virus en el pulmón por Logio 1.6 y Logio 1.4 comparado con la inmunización IN con la F/PBS o la PBS/CT-CRME29H. respecti amente. Las diferencias entre la F/CT-CRME29H y la F/PBS o la PBS/CT-CRME29H se encuentran que son estadísticamente significantes (p<0.05) .

En un sexto experimento, se evaluaron las respuestas inmunes sistémicas mucosales de los ratones BALB/c inmunizados IN con la proteina F de RSV y la CT-CRME29H o alumbre. La Tabla 27 muestra las respuestas inmunes humorales del suero colectado dos semanas después de la inmunización terciaria. Los ratones que recibieron las inmunizaciones que contenían la proteina F y 1 µg de la CT-CRME29H (grupo 256) exhiben concentraciones significativamente elevadas para el IgG, IgGl e IgG2 cuando se compara con ratones inmunizados con la F/PBS o la PBS /CT-CRME29H (grupos 250 y 257, respectivamente) . No se observan diferencias significantes en las concentraciones de IgGl entre el ratón inmunizado con la F/CT-CRME29H (256) y la F/ALOH (258) . Sin embargo, la inmunización IN con la F/CT-CRME29H (256) obtiene concentraciones de IgG2a significativamente elevadas comparadas con aquellas observadas por la inmunización con la F/ALOH (258) . De manera colectiva, estos resultados están de acuerdo con aquellos presentados en la Tabla 25. En tanto que el suero IgA se detecta en grupos de ratones que recibieron la F/CT-CRME2gH , las concentraciones son mucho menores que las previamente observadas (16,20212,031 para el grupo 777 y 444±1458 para el grupo 256) . Las razones para la aparente diferencia no son claras. Sin embargo la habilidad de la F/CT-CRME29H liberada IN para inducir el suero IgA es consistente en ambos estudios y contrasta favorablemente con la capacidad de la F/ALOH a este respecto.

Los lavados de fluidos broncoalveolar, vaginal y nasal se colectaron de los animales inmunizados dos semanas después de la inmunización final con objeto de ejecutar un ensayo ELISA de anticuerpos IgG e IgA. Los datos, colocados en la Tabla 28, muestran las concentraciones del conjunto de cinco ratones. Similarmente a los resultados mostrados en la Tabla 26, los ratones inmunizados con la CT-CRME29H producen un IgA detectable tanto en los lavados vaginales y nasales (grupo 256) . Nuevamente de manera similar a los datos presentados en la Tabla 26, no se observa IgA en el BAL derivado de los ratones inmunizados con la CT-CRME29H. Sin embargo, se observa IgG en todos los lavados mucosales incluidos los del BAL. Los niveles de IgG observados en los lavados de los ratones inmunizados con la F/CT-CRME29H son al menos - comparables con aquellos obtenidos por la inmunización con RSV vivo (Tabla 28, grupo 256 contra 259) .

En un séptimo experimento, se evalúa la actividad citolitica (CTL) producida por las células del bazo estimuladas i n vi t ro derivadas de los ratones inmunizados. Los datos se presentan en la Figura 8. En tanto que los ratones inmunizados con RSV muestran una célula lisis especifica antigena de aproximadamente el 45%, la actividad CTL de cada uno de los restantes ratones queda debajo del 10%. Los datos confirman que la inmunización IN con la F/CT-CRME29H no es hábil para inducir un mecanismo de defensa inmune mediado por la célula contra células objetivo infectadas con RSV en la población linfosita del bazo. Esto confirma la observación previa (Figura En un octavo experimento, se ejecutó un ensayo de protección viral adicional con objeto de investigar si la liberación IN de la F/CT-CRME29H facilita la protección con el estimulo de RSV vivo. Las estadísticas por el análisis ANOVA de los resultados descritos en la Figura 9 son como s igue p < 0.05: F/PBS contra F/CT-CRME29H, F/ALOH, RSV p < 0.05: simple contra F/CT-CRME29H , F/ALOH, RSV p < 0.05: F/CT-CRME29H contra F/ALOH, RSV, Similarmente a los resultados descritos en la Figura 7, los ratones que recibe vacunas IN contienen la replicación del virus controlado por F/CT-CRME29H en los pulmones para un extensión que es estadísticamente comparable (p > 0.05) a la que se ejecuta ratones inmunizados intramuscularmente con la F/ALOH o IN con RSV vivo (Logio 1.87 contra Logio 1.99 y Logio 1.94, respectivamente) . La inmunización IN con la F/PBS (primera barra), o los ratones no inmunizados (simples) exhiben concentraciones virales en el pulmón de Logio 4.5 y Logio 4.3, respectivamente. Adicionalmente, estos grupos tienen concentraciones de virus en el pulmón que se encuentran para ser estadísticamente elevadas (p < 0.05) cuando se compara con las concentraciones de virus obtenidas de ratones inmunizados con la F/CT-CRME29H, la F/ALOH, o el RSV vivo. Por lo tanto, los datos soportan la conclusión de que la instalación IN de la F/CT-CRME29-H protege contra un estimulo al RSV infeccioso .

En un noveno experimento, se evalúa la respuesta del anticuerpo anti suero F. Los resultados muestran que el IgG anti proteina F se incrementa significativamente en ratones inmunizados con (0.1 ó 1.0 µg) comparado con aquellos a los que se les da proteina F liberada solamente en PBS (Tabla 29) . Además, el coadyuvante de proteina F ya sea con 0.1 ó 1.0 µg de la CT-CRME29H fue al menos tan efectivo como tanto la F/ALOH (intramuscularmente) o la infección experimental con RSV en las respuestas estimulantes a la anti proteina F de IgG. La magnitud de las concentraciones de anticuerpo anti proteina F dependen de la dosis de la CT-CRME29H en la formulación, de tal manera que en las concentraciones son significativamente mayores en ratones que reciben 1.0 µg de la CT-CRME29H contra 0.01 µg . En comparación con la F/PBS, ambas concentraciones anti proteina F de IgGl e IgG2a se aumentan ya sea con 0.1 ó 1.0 µg de la CT-CRME29H. La CT-CRME29H estimula los comportamientos tanto del tipo 1 y el tipo 2 inmune. Las respuestas del suero anti proteina F de IgA significativamente mayores se estimulan por la inmunización IN con la F/CT-CRME 9H (0.1 ó 1.0 µg) comparado con la infección experimental con el RSV. En contraste, no se observan anticuerpos del suero de la anti proteina F IgA en la respuesta a la F/PBS (IN) o la administración parenteral de la F/ALOH (Tabla 29) .

Las concentraciones anti CT también siguen un patrón dependiente de las dosis consistente con las concentraciones de anti proteina F (Tabla 29) . Se observa concentraciones anti CT estadísticamente equivalentes en el suero obtenido de los ratones inmunizados ya sea con la CT-CRME29H (1.0 µg) o la F/CT-CRME29H d-0 µg ) . Sin embargo, estas concentraciones son significativamente elevadas comparadas con la F/CT-CRME29H (0.1 ó 0.01 µg) . Además, las concentraciones anti CT en los sueros de ratones inmunizados con la F/CT-CRME29H (0.1 µg) son más pesados estadísticamente comparados con las concentraciones de ratones inmunizados con la F/CT-CRME29H (0.01 µg) . Por lo tanto el efecto coadyuvante de la CT-CRME29H para la respuesta del anticuerpo anti proteina F está correlacionado (r = 0.97) con la respuesta del anticuerpo a la holotoxina de cólera mutante.

En este noveno experimento, se evalúa también la inmunidad mucosal. Se observa IgA mucosal sólo en los lavados nasales (NW) en conjuntos de ratones inmunizados ya sea con la F/CT-CRME29H (1.0 µg) o la F/CT-CRME29H (0.1 µg) (Tabla 30) . Además, los ratones que reciben inmunizaciones IN conteniendo la proteina F purificada y la CT-CRME29H (0.01 a 1.0 µg) también tienen un IgA anti proteina F en los lavados vaginales (VW) . Se observa IgG especifico de proteina F en los lavados broncoalveolares (BAL), VW y/o NW de los ratones que recibieron la F/CT-CRME29H (0.1 y 1.0 µg), o la F/ALOH. En contraste, no se detecta IgA de anti proteina F en los ratones inmunizados IM con la F/ALOH.

En un décimo experimento, se evaluó la inmunidad funcional en ratones inmunizados con la proteina F formulada con la CT-CRME29H. En presencia del complemento, se detectaron anticuerpos neutralizantes anti RSV estadísticamente pesados en los sueros de ratones que recibieron la proteina F y ya sea 0.1 ó 1.0 µg de la CT-CRME29H, la F/ALOH o el RSV A2, comparado con la administración de la F/PBS o la CT-CRME29H solamente (Tabla 31) . En ausencia del complemento, no se observó concentraciones neutralizantes detectables en ninguno de los grupos (loglO < 1.3) . De manera consistente con los datos del suero y el anticuerpo mucosal (Tablas 29 y 30), la inmunización con la F/CT-CRME29H (0.01 µg) no fue suficiente para generar anticuerpos neutralizantes anti RSV.

En un onceavo experimento, se estimuló a los ratones inmunizados dos semanas después de la inmunización terciaria, con objeto de determinar la habilidad de la F/CT-CRME29H para proteger contra una infección subsecuente. Los resultados demuestran que los ratones inmunizados con la F/CT-CRME29H (0.1 ó 1.0 µg) estuvieron protegidos (Tabla 32) . En comparación con los ratones simples, u aquellos inmunizados con la F/PBS o la CT-CRME29H solamente, los pulmones de los ratones inmunizados con la proteina F y ya sea 0.1 ó 1.0 µg de la CT-CRME29H tuvieron niveles de virus significativamente reducidos. Además, se observaron niveles de virus significativamente reducidos en los tejidos nasales de ratones inmunizados con la F/CT-CRME29H (0.1 y 1.0 µg) comparado con los ratón simples no inmunizados o aquellos inmunizados con la F/PBS. En contraste, los ratones inmunizados parenteralmente con la F/ALOH exhiben concentraciones virales reducidas en el tejido del pulmón comparado con los ratones inmunizados con la F/PBS, pero no una reducción significante en el tejido nasal. En general, la administración IN de la F/CT-CRME29H (0.1 ó 1.0 µg) fue suficiente para generar ambas respuestas inmune humoral sistémica y local que pueden contribuir a la protección del tejido respiratorio contra un estimulo a RSV vivo subsecuente.

Los datos presentados en el Ejemplo 10 ilustran un acercamiento viable al desarrollo de una vacuna IN para la proteina F RSV. Los datos indican que la producción tanto de IgG e IgA humoral y mucosal se estimula por la liberación IN de la F/CT-CRME29H . Las concentraciones de anticuerpo observadas fueron significantes para demostrarse de dos maneras: la primera, cada una de las concentraciones de anticuerpo humoral y mucosal que se analizaron de los ratones inmunizados con la F/CT-CRME29H fueron cualitativamente similares y cuantitativamente elevadas comparadas con los ratones inmunizados con la F/PBS. Segundo, las concentraciones elevadas se tradujeron en una respuesta inmune biológicamente relevante, como se indica en el nivel observado de protección exhibido en las Figura 7 y 9. La inmunización con la F/CT-CRME 9H aumenta significativamente la protección contra el estimulo a RSV vivo comparado con la inmunización por la F/PBS o la PBS /CT-CRME29H .

De manera colectiva, los datos sugieren un mecanismo que involucra la neutralización de un virus infeccioso ya sea por inmunoglobinas mucosales o humorales, que se estimulan en respuesta al protocolo de inmunización IN que contiene la F/CT-CRME29H .

Los ratones se inmunizaron con otro antigeno viral, rotavirus, en la forma de proteinas VP2 y VP6 expresadas recombinantemente. Los vectores de baculovirus recombinantes que expresan la VP2 y VP6 del rotavirus SA11 se construyeron como se describe previamente (28); se conoce que las proteinas estructurales del rotavirus expresado recombinantemente se ensamblan por si mismas en partículas que son morfogénicament e indistinguibles de los viriones. Las proteinas asi expresadas se co-ensamblan en partículas similares al virus 2/6 (VLP) .

Los ratones BALB/c endógamos con una columna genética homogénea se usaron, anticipando que todos estos deberán responder a la inmunización y de esta manera clarificar el perfil de las inmunoglobinas sistémicas y mucosales para las VLP solas y cuando se combinan con el coadyuvante CT-CRME29H- LOS ratones CD-1 exógamos genéticamente heterogéneos también se usaron para determinar el efecto de la diversidad genética en los factores que involucran la inducción de la inmunidad y protección .

Los sueros de todos los ratones inmunizados BALB/c y CD-1, excepto por dos ratones CD-1 oralmente inmunizados sin respuesta, contenían anticuerpos de tanto la VP2 y VP6. Los sueros de pre inmunización asi como los sueros de los ratones no inmunizados no detectaron un antigeno viral en las células infectadas por baculovirus VP2-6 y/o su imitación. Los sueros inmunizados de 2/6-VLP o mAb específicos para la VP6 y VP2 expuestos a células no infectadas tampoco demostraron una reactividad (datos no mostrados) . La inmunogenicidad de la 2/6-VLP también se confirma por el análisis de mancha Western usando sueros inmunizados y previamente estimulados de cada uno de los ratones contra 2/6-VLP asi como cepas SA11 de rotavirus (datos no mostrados) .

Los patrones del suero especifico de rotavirus IgG, IgM e IgA en el grupo inmunizado IN con 2/6-VLP solamente, fueron similares a aquellos en el grupo inmunizado con 2/6-VLP y la CT-CRME29H (Figura 10) . Sin embargo, los niveles de la semana 13 de los tres isotipos de anticuerpo de suero fueron significativamente mayores en los animales que recibieron las 2/6-VLP junto con la CT-CRME29H (Figura 10) (P= 0.004, y P= 0.02 para la IgM e IgA respectivamente) . Esto indica que la CT-CRME29H aumenta significativamente las respuestas humorales para las 2/6-VLP. La semana 13 se selecciona como un indicativo de los niveles del anticuerpo generados después de dos inmunizaciones pero antes del estimulo.

Como se muestra en la Figura HA, los ratones BALB/c que se le da IN las VLP, produce una respuesta IgG sistémica especifica al rotavirus mayor que aquellos inmunizados oralmente. Las diferencias estadísticamente significantes en las concentraciones del suero IgG entre los dos grupos, fueron evidentes a las 13 semanas (P=0) . De manera similar, los niveles de IgM de suero fueron mayores en el grupo IN contrario al grupo oral cuando los valores previos al estimulo (semana 13) se analizaron (P=0) (Figura 11B) . Los puntos más altos de los niveles del suero IgM para la semana 2 y más bajos para la semana 4 en grupos mezclados e IN, tanto en el grupo oral, pero a niveles relativamente constantes de suero IgM, se detectaron a través del estudio. El punto más alto del suero IgA en animales inmunizados oralmente IN ocurrió en la semana 4. No se distinguen diferencias significantes en los niveles de suero IgA de los tres grupos experimentales cuando se examina en la semana 13 (Figura 11C) . En general la inmunización IN genera niveles mayores de respuestas sistémicas IgG e IgM que la inmunización oral. La inducción de niveles significativamente mayores de IgG e IgM en el grupo IN soporta el concepto de que la inmunización IN puede ser la ruta preferida para la administración de futuros candidatos a vacuna (33) . De esta manera, la inmunización IN lleva a respuestas neutralizantes sistémicas fuertes que serán efectivas contra patógenos virales que penetran barreras mucosales.

Tanto el IgGl e IgG2a se encuentran en el suero de ratones BALB/c- inmunizados IN y oralmente (Figura 12) . El grupo IN tiene niveles estadísticamente significativamente mayores tanto de las subclases IgG comparadas con el grupo oral (IgGl, P=0.005; IgG2a, P=0.05) . Sin embargo, no son diferencias significativas entre la subclases dentro de cada grupo. Estos datos confirman la utilidad de la inmunización IN para la inducción efectiva de ambas vias T auxiliares (TH-1 y TH-2) .

El nivel más alto de IgA fecal para los tres grupos experimentales ocurre cuatro semanas después de la primera inmunización (Figura 13A), coincidiendo temporalmente con el tiempo al cuál los niveles del suero IgA son el máximo en animales inmunizados oralmente e IN (Figura 11C) . No se encuentran diferencias estadísticamente significantes entre los tres protocolos de inmunización cuando se examinan los niveles fecales de IgA antes del estimulo (Figura 13A) . El IgG fecal también tiene su máximo en la semana 4 (Figura 13B); sin embargo, el grupo IN tiene significativamente más IgG a la semana 13 comparado con los grupos oral o mezclado (P=0 y P=0.002, respectivamente) . En general, todos los ratones inmunizados con 2/6-VLP producen suero IgG, IgM e IgA, asi como IgG e IgA fecal. No se detecta IgM fecal en ninguno de los animales.

Todos los ratones CD-1 recibieron las 2/6-VLP por IN (n= 4) y dos de los cuatro ratones inmunizados oralmente produjeron una respuesta al anticuerpo del rotavirus especifico (datos no mostrados) . Para determinar el perfil de la respuesta al anticuerpo más precisamente, se analizaron muestras de suero y fecales semanalmente durante 26 semanas. El patrón de inducción de los anticuerpos de suero y fecales en los ratones CD-1 fue similar a aquellos en los ratones BALB/c (Figura 11 y 13) .

En los ratones BALB/c, dos inmunizaciones IN con 2/6-VLP y la CT-CRME29H proporcionaron una protección ( PRAS = 98.7 % ) , en contraste con la inmunización IN solamente con las 2/6-VLP (PRAS=39%) (P=0.007) (Figura 14A) . La inmunización mezclada, inmunización IN seguida por oral, protege al ratones por una extensión similar a los grupos orales e IN, indicando que en los ratones BALB/c las inmunizaciones mezcladas también fueron efectivas. Esto demuestra el argumento significante en las respuestas inmunes protectoras debido a la CT-CRME29H- LOS ratones BALB/c en los tres grupos de inmunización mostraron una protección casi completa para el estimulo. El PRAS fue de 99.6%, 98.8% y 98.8% para los grupos oral, IN y mezclado, respectivamente (Figura 14B) . El grupo de control no inmunizado se despojó significativamente de más antigeno viral que los tres grupos inmunizados (P= 0) . Esto no significa diferencias entre los valores PRAS para los tres grupos inmunizados.

La inmunización IN induce tanto las respuestas sistémica y mucosal en todos los ratones CD-1 inmunizados y la protección de estos animales (PRAS=97..9%) (Figura 14C). Solo dos de los cuatro ratones CD-1 inmunizados oralmente mostraron respuestas y protección al anticuerpo sistémica y mucosal (2 de 3, PRAS 65.8%) (Figura 14C); en contraste, todos los ratones BALB/c inmunizados oralmente muestran respuestas sistémicas y mucosales y están protegidos. De manera notable, los ratones CD-1 que no produjeron una respuesta inmune no estuvieron protegidos de una infección, mientras que los ratones que tuvieron una respuesta inmune estuvieron protegidos (Figura 14C) . Un ratón en el grupo oral, que no tuvo respuesta al anticuerpo para la inmunización, murió antes del estimulo. Dos ratones CD-1 se usaron como controles para reducir el número de muestras en los análisis de respuesta al anticuerpo. Sin embargo, el análisis estadístico muestra claramente que los resultados de la protección fueron significantes (P=0, a un nivel de confidencia del 95%) . El experimento de inmunización oral se repitió con ratones CD-1 bajo las mismas condiciones, excepto que los animales se estimularon en la semana 13 en lugar de la 26. Usando 4 ratones en los grupos inmunizados y cinco ratones como controles, se observó un nivel de protección similar ( PRASS= 71.2 % ) (datos no mostrados) . Tomados juntos, estos resultados soportan aquellos que se ha publicado recientemente por O Neal y colaboradores, (34, 35), que sugiere que la inmunización intranasal de los ratones CD-1 es más efectiva que la inmunización oral.

En vista de esta utilidad demostrada de la CT-CRME29H como un coadyuvante de vacuna, la producción de cantidades apropiadas de este material es deseable. Usando pIIB29H (descrito en el Ejemplo 1), se elaboran varios intentos para expresar la CT-CRME29H en E . col i . El rendimiento resultante de la holotoxina de CT-CRME29H purificada fue de aproximadamente 50 µg por litro de medio cultivado. Los intentos iniciales para incrementar el rendimiento de la CT-CRME29H por medio de modificaciones al plásmido original, pIIB29H, para crear el plásmido pPX22492 (ver ejemplo 1), mostraron poco o ningún efecto. Un incremento moderado en el rendimiento se ejecutó a travé-s de la co-expresión de pIIB29H, y derivados con Vibri o chol era e DsbA y E . col i RpoH. La coexpresión y las modificaciones de purificación incrementaron el rendimiento de la CT-CRME29H hasta aproximadamente 2 mg por litro.

Con objeto de incrementar la expresión de la CT-CRME29H. el promotor inducible de lactosa se reemplazó con un promotor inducible de arabinosa (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) , que se enlazó operativamente a la secuencia del ADN que codifica la CT-CRME29H. Durante la clonación, se determinó que el plásmido pIIB29H contenia un ctxA de la cepa de Vibri o ch ol ea re 569B, enlazado a un gen ctxB de la cepa V. c . 2125. La alineación cruzada de estos genes indican siete substituciones base entre los dos ctxB y un cambio de base simple entre los genes ctxA. Varias de estas substituciones bases llevan a cambios en el aminoácido en las sub-unidades maduras. Es de notarse en especial, la substitución entre los genes ctxA que llevan a un cambio en el aminoácido dentro de la porción A-2, o el dominio que ensambla la holotoxina de la sub-unidad A. No se conoce que la heterogeneidad entre estos genes tenga- un impacto negativo o una expresión de toxina o ensamble de holotoxina; sin embargo, se intenta preferir, desde un punto de vista evolucionarlo, que ambos genes de sub-unidad de toxina se originen en la misma fuente. Como tales, ambos de los genes ctxA y ctxB usados en la construcción del sistema inducible de arabinosa se originan del Vibri o ch ol ea re cepa 569B. La construcción del plásmido pPX7490 se describe en el Ejemplo 12. La producción de la CT-CRME29H a partir de la pPX7490 es de aproximadamente 30 mg de material purificado por litro de cultivo.

La invención además se refiere a plásmidos que contienen secuencias ADN aisladas y purificadas que comprenden secuencias ADN que codifican una holotoxina de cólera mutante inmunogénica que tiene una substitución diferente a la del ácido aspártico para el ácido glutámico en la posición 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera, y en donde tal secuencia de ADN se enlaza operativamente a un promotor inducible de arabinosa, asi como a células huésped apropiadamente transformadas, transducidas o trasfectadas con tales plásmidos por técnicas convencionales .

Una variedad de sistemas vectores plásmido-célula huésped se usan para expresar la holotoxina de cólera mutante inmunogénica. El sistema vector, que preferiblemente incluye el promotor inducible de arabinosa, es compatible con la célula huésped usada. Las células huésped apropiadas incluyen bacterias trasformadas con ADN plásmido, ADN cósmido o ADN bacteriófago; virus tales como virus de vacuna y adenovirus; levaduras tales como células Pichia; células de insecto tales como células S f 9 o S f21 ; o lineas de células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino; asi como otros organismos convencionales.

Una variedad de elementos de trascripción y translación convencionales puede usarse para los sistemas de vector de célula huésped. El ADN que codifica la CT-CRME29H se inserta en un sistema de expresión, y el promotor (preferiblemente el promotor inducible por arabinosa) y otros elementos de control se enlazan en sitios específicos dentro del vector, para que cuando el vector de plásmido se inserte en la célula huésped (por transformación, transducción o transfección, dependiendo del sistema vector de célula de huésped usado) , el ADN que codifica a la CT-CRM se expresa por la célula huésped.

La holotoxina de cólera mutante inmugénica se produce por transformación, transducción o t rans fect ación de una célula huésped con un plásmido como se describe anteriormente y cultivando la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteina des toxif icada humonogénica recombinante por la célula huésped.

No obstante que esta invención se ejemplifica por una CT-CRM mutante que tiene una histidina en el aminoácido 29, otras mutaciones no conservadoras del residuo del ácido glutámico de tipo silvestre también están dentro del alcance de esta invención. El ácido glutámico es una molécula acida (cargada negativamente) . Por lo tanto una mutación no conservadora podrá ser una en la cual se hace una substitución al aminoácido diferente al ácido aspártico que también es una molécula acida. Los aminoácidos alternativos apropiados inclu-yen los aminoácidos de licina y argimina, que, similarmente a la histilina, son moléculas básicas (cargadas positivamente) . Los aminoácidos alternativos apropiados además incluyen los aminoácido con grupos funcionales no polares tales como alanina, isoleucina, laucina, metionina, fenilalanina, prolina, tritofan y valina, y los aminoácidos con grupos funcionales polares no cargados tales como asparagina, cisteina, glutamina, glicina, serina, treonina y tirosina.

Una cantidad efectiva de holotoxina de cólera mutante en donde la holotoxina tiene una toxicidad reducida comparada con una toxina de cólera de tipo silvestre tiene una substitución diferente a la del ácido aspártico para el ácido glutámico en la posición 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera en combinación con un antigeno seleccionado de una bacteria patogénica, virus, hongo o parásito, se usa para preparar una composición antigénica, en donde dicha holotoxina aumenta la respuesta inmune en un huésped vertebrado para dicho antigeno.

Las composiciones antigénicas de esta invención también comprenden la CT-CRM que contiene al menos una mutación adicional en otra posición diferente a la del residuo aminoácido 29. La solicitud internacional WO 93/13202 (36), que se incorpora en la presente para referencia, describe una serie de mutaciones en la sub-unidad A que sirven para reducir la toxicidad de la holtoxina de cólera. Estas mutaciones incluyen elaborar substituciones para la argimina en el aminoácido 7, el ácido aspártico en la posición 9, la argimina en la posición 11, la histidina en la posición 44, la valina en la posición 53, la arginina en la posición 54, la serina en la posición 61, la serina en la posición 63, la histidina en la posición 70, la valina en la posición 97, la tirosina en la posición 104, la prolina en la posición 106, la histidina con la posición 107, el ácido glutámico en la posición 110, ácido glutámico en la posición 112, la serina en la posición 114, la triptofan en la posición 127, la arginina en la posición 146 y la arginina en la posición 192. La secuencia nucleótida que codifica la sub-unidad A de la holotoxina de cólera se coloca en la solicitud internacional WO 93/13-202. La solicitud internacional WO 98/42375 (37) , que se incorpora para la presente para referencia, describe elaborar una substitución para la serina en el aminoácido 109 en la subunidad A, lo que sirve la reducir la toxicidad de la holotoxina de cólera. Por lo tanto, usando técnicas convencionales, se generan mutaciones en uno o más de estas posiciones adicionales.

Las composiciones antigénicas de esta invención se administran en un vertebrado humano o no humano por una variedad de rutas, incluyendo, pero no limitándose a, intranasal, oral, vaginal,, rectal, parenteral, intradermal, transdermal (ver, por ejemplo, Solicitud Internacional WO 98/20734 (38), que se incorpora en la presente para referencia), intramuscular, int raperitonal , subcutánea, intravenosa e int raarterial . La cantidad de componente antigeno o componentes de la composición antigénica variará dependiendo de la identidad del antigeno, asi como de la edad, peso y condición médica del huésped, asi como el método de la administración. Nuevamente, las dosis apropiadas serán fácilmente determinadas por personas hábiles en la técnica. Es preferible, no obstante que no se requiere, que el antigeno y la CT mutante se administren al mismo tiempo. El número de dosis y el régimen dosis para la composición antigénica también se determinarán fácilmente por personas hábiles en la técnica. La protección puede conferirse por una dosis simple en la composición antigena, o puede requerirse la administración de varias dosis, además de una dosis auxiliar al último momento para mantener la protección. En algunos casos, la propiedad coadyuvante de la CT mutante puede reducir el número de dosis necesarias o el curso de tiempo del régimen de dosis.

Las composiciones antigénicas de esta invención pueden comprender coadyuvantes adicionales además de la CT-CRME29H- LOS ejemplos de tales coadyuvantes incluyen pero no se limitan a, Stimulon® QS-21 (Aquila Biopharmaceut icals , Inc., Framingham, MA), MPL® (lipido A de la monofosforil 3-0 -deacilatado ; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio e IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA). Las composiciones antigénicas también pueden mezclarse con diluy-entes imunológicamente aceptables o portadores de una manera convencional.

La holotoxina de cólera mutante inmunogénica de esta invención es apropiada para usarse como un coadyuvante en composiciones antigénicas que contienen un amplia variedad de antigenos a partir de una amplia variedad de microorganismos patogénicos incluyendo, pero no limitándose a, aquellos de bacterias, virus, hongos, o microorganismos parásitos que infectan a los vertebrados humanos y no humanos. El antigeno puede comprender una célula completa o virus, o uno o más sacáridos, proteinas, sub-unidades de proteinas o fragmentos, poli- u oligonucleot idos , u otros componentes macromoleculares. Si se desea, las composiciones antigénicas pueden contener más de un antigeno de los mismos o diferentes microorganismos patogénicos.

Las vacunas bacteriales deseables incluyen los mutantes de la CT-CRM como un coadyuvante incluyendo a aquellos que se dirigen a la prevención y/o tratamiento de enfermedades causadas por, sin limitación, Haemophilus influ-enzae (tanto típica y no típica) Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis , Streptococcus pneumoniae , Streptococcus pyogenes , Streptococcus agalactiae , Streptococcus faecalis , Hel icobacter pylori, Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Chlamydia trachomatis , chlamydia pneumoniae , Chlamudia psittaci , Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium , Salmonella choleraesuis , Escherichia coli, Shigella , Vibrio cholerae , Corynebacterium diphtheriae , Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex , Proteus mirabilis , Proteus vulgar is , Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans , Borrelia burgdorferi, Pausteurella haemolytica , Pasteurella multocida , Actinobacillus pleuropneumoniae y Mycoplasma gallisepticu .

Las vacunas virales deseables incluyen los mutantes de la CT-CRM como un coadyuvante que incluyen aquellos dirigidos a la prevención y/o tratamiento de enfermedades causados por, sin limitación, virus respiratorio sincilial, virus de la parainfluencia de los tipos 1-3, virus de la influ-encia, viris del herpes simple, citomegalovirus humano, virus de la inmunoeficiencia humana, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, papilomavirus humano, poliovirus, rotavirus, calicivirus, virus Measles, virus Mups, virus Rubella, adenovirus, virus de la rabia, virus de enfermedad canina, coronavirus, parvovirus, virus rinot racheilit i s infeccioso, virus de leucemia felina, virus de peritonitis infecciosa felina, virus de enfermedad bursal infecciosa de las aves, virus de la enfermedad Newcastle, virus de la enfermedad Marek, virus del síndrome reproductivo y respiratorio del porcino, virus de la arteritis equina y varios virus de encefalitis.

Las vacunas deseables contra hongos patógenos incluyen los mutantes de la CT-CRM como un coadyuvante incluido aquellos dirigidos a la prevención y/o tratamiento de enfermedades causadas por, sin limitación, Aspergí 1 1 i s , Blastomyces , Candids , Coccidiodes , Cryptococcus y Hi s top la sma .

Las vacunas deseables contra parásitos incluyen los mutantes de la CT-CRM como un coadyuvante incluido aquellos dirigidos a la prevención y/o tratamiento de las enfermedades causadas por, sin limitación, Leishmania major, Ascaris , Trichuris , Giardía , Schistoma , Cryptosporidium , Trichomonas , Toxoplasma gondii y Pneumcystis carinii .

Los mutantes de la CT-CRM también son apropiados para incluirse como un coadyuvante en vacunas pol inucleot idas (también conocidas como vacunas ADN) . Tales vacunas pueden incluir además agentes facilitantes tales como bupivacaina (ver Patente U.S. Número 5,593,972 (39), que se incorpora en la presente para la referencia) .

La CT-CRME gH se compara con la CT de tipo silvestre como un coadyuvante para la administración de un plásmido ADN (pADN) que codifica la longitud completa de la glicoproteina D del virus de herpes simple (HSV) del tipo 2 (gD2) formulado con bupivicaina (40). Los resultados indican que los ratones BALB/c que recibieron la CT-CRME29H junto con la vacuna pDAN para la HSV-2 por la ruta intradermal, generaron una respuesta celular promedio mayor que aquellos recibieron la vacuna pADN HSV gD2 para si mismos por la ruta intradermal (Tabla 34) . Además, la respuesta al anticuerpo promedio en el suero para los ratones que recibieron la vacuna pDNA HSV gD2 junto con la CT-CRME29H fue de aproximadamente el mismo nivel como aquellos vistos para los ratones que recibieron la vacuna pDNA HSV gD2 sin un coadyuvante (Tabla 35) .

De manera similar, la vacuna pDNA HSV gD2 genera una respuesta al anticuerpo especifico gD2 en muestras de lavado vaginal a niveles que son comparables con aquellos observados después de liberar una vacuna de no coadyuvante por rutas int radermales o intramusculares (Tabla 36) .

Los ratones inmunizados con el coadyuvante de vacuna pDNA HSV gD2 con la CT-CRME29H o CT y liberada por la ruta intradermal, generaron niveles substancialmente mayores de gamma interferon que los ratones que recibieron la vacuna pDNA HSV gD2 sin un coadyuvante (Tabla 37). Los ratones que recibieron la CT-CRME29H también generaron IL-5.

De esta manera la CT-CRME29H aumenta las respuestas del gamma interferon y proliferativas cuando se administran con una vacuna de plásmido de ADN contra HSV.

Con objeto de que esta invención se entienda mejor, se colocan los siguientes ejemplos. Los ejemplos están para propósito de ilustración únicamente y no se construyen como limitantes del alcance de la invención.

Ej emplos Ejemplo 1 Expresión de CT Mutantes Cepas bacteriales, plásmidos y condiciones de crecimiento .

Se usaron la E . col i TGl (Amersham- Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , y TX1, un derivado resistente al ácido nalidixico de TGl, portando FTc, -laclq de XLl (Stratagene, LaJolla, CA; (41)9 y CJ236 (FTc, laclq) (Bio-Rad, Hercules, CA) como huéspedes para clonar plásmidos recombinantes y la expresión de proteinas mutantes. Las cepas que contenían los plásmidos se mantuvieron en charolas agar LB con antibióticos como se requería (ampicilina, 50 ug/ml; canamicina 25 ug /ml; tetraciclina 10 ug/ml). Se sub-clonó una CT operon completa de V. ch ol era e 0395 en el vector fagémido pSKII", bajo el control del promotor l a c , para crear el plásmido inducible por IPTG designado pMGJ67 (42) .

Mutagénesis del gen ctxA El método de Kunkel (43) se usó para seleccionar los mutantes derivados de oligonucleótidos creados en el plásmido pMGJ67.

Los oligonucleótidos usados para generar los cinco CT-CRM mutantes se describen en la Tabla 1.

Tabla 1 Secuencia de oligonucleot idos introducidos en el ctxA Las bases alteradas están subrayadas; N=ninguna base; K=T o G.

Brevemente, cada uno de los oligonucleótidos formados en un cordón simple se fosforilató y se usó para dirigir una segunda síntesis formada en cordón en un templato de ADN formado en un cordón simple conteniendo uracil rescatado del E . col i cepa dut ung CJ236 (F'Tc, pMGJ67) . Después de la ligación y la transformación de la cepa ung TX1, el ADN formado en cordón simple se rescató de los transformantes AmpR y se secuenció por el método de terminación de cadena dideoxi (44) .

Construcción del plásmido que codifica la CT- CRME29H El plásmido que codifica la CT-CRME29H se designa pIIB29H. El plásmido contiene el policistron de los genes ctxA y ctxB de V. Chol ea re que codifican la CT. El gen ctxA en este plásmido se mutagenisa como se describe anteriormente para codificar una histidina en un aminoácido de la posición 29 de la CT-A. El policistron de tipo silvestre también se altera removiendo el promotor inducible de ToxR nativo y remplazándolo con un promotor inducible de lactosa. Adicionalmente, las regiones que codifican las secuencias de señal ctxA y ctxB se remplazan con la región que codifica la señal de secuencia de E . col i LT (lider LTIIb-B) con objeto de promover la secreción de la CT-CRME29H- El plásmido pIIB29H se modifica entonces en un intento para incrementar la expresión de la CT-CRME29H. El plásmido resultante, designado pPX2492, contiene las secuencias Shine Dalgarno sintéticas corriente arriba de cada uno de los ctxA y ctxB. Los dos genes se separan genéticamente en pPX2492, diferente a la de V. ch ol ea re , donde los genes se omiten. Los dos genes también tienen la secuencia lider LTIIb-B corriente arriba de cada uno de ellos .

Expresión de los alelos ctxA mutantes La producción de cada uno de las variantes de holotoxina se prueba en cultivos de 5 ml de medio TB (45) en matraces Erlenmeyer de 125 ml a 37°C con agitación (200 rpm) . Las células de fase logarítmica (A6oo = 0.8-1.0) se inducen por la adición de IPTG hasta 0.4 mM, seguido por el crecimiento durante la noche. Se agrega la polimixina B hasta 1 mg/ml, seguido por la incubación durante 10 minutos a 37°C. La célula se remueve por centrifugación, y los sobrenadantes se evalúan para determinar las concentraciones de holotoxina y pentámero B como se describe anteriormente .

De manera especifica, la producción de la CT-CRME29H en E . col i involucra la co-expresión de los genes rpoH de E . col i y dsbA de V. chol ea re . Estos genes producen una participación en la maduración -conformacional de ambas de las sub-unidades A y B de la CT.

Ejemplo 2 El ensayo de enlace GMl para la holotoxina intacta Las CT-CRM se examinaron en un radioinmunoensayo de fase sólida dependiente de la gangliosida G i (42) para determinar si la holotoxina intacta se presenta después de la purificación. Un ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) se usó donde charolas ELISA con micropozos se recubrieron durante la noche a 4°C con gangliosida GMi (10 ug/ml). Posteriormente, se agregaron los siguientes reactivos en secuencia con intervalos de una hora de incubación a temperatura ambiente: CT-CRM (concentración desde 3 µg/ml a 0.00137 µg/ml), 100 µl de suero anti-CT-A de conejo (1:1,000), un anticuerpo anticonejo de gota conjugada de fosfato alcalino (1:2,000). Para visualizar la reacción, se agregó 100 µl de fosfato de p-nitrofenilo a 1 µg/ml en dietanolamina y se incubó por 30 minutos. La reacción se detuvo agregando 100 µl de NaOH 2 N y se leyó inmediatamente por un autolector Microelisa. Cuando se compara la CT de tipo silvestre, los datos indican que la CT-CRME29H con substituciones de aminoácido en las posiciones 7, 29, 110, o 112 son holotoxinas intactas (Figura 1) . Los resultados implican, sin embargo, que una porción de la CT-CRMRnk purificada no aparece para ser una holotoxina.

Ejemplo 3 Ensayo de célula Adrenal Y-l para toxicidad residual de las CT-CRM Las CT-CRM mutantes se comparan varias veces con la holotoxina de tipo silvestre para la toxicidad en el ensayo de célula de tumor adrenal Y-l de ratones. Las células adrenales Y-l (ATCC CCL-79) se sellaron en charolas de fondo plano de 96 pozos a una concentración de 104 células por pozo. Posteriormente, se agregaron diluciones de tres veces en serie de CT-CRM a las células de tumor y se incubaron a 37°C (C02 al 5%) por 18 horas. Las células se examinaron entonces por microscopia luminosa para evidenciar la toxicidad (célula circundante) . La concentración del punto final se definió como la concentración minima requerida para dar más del 50% de células circundantes. El porcentaje de toxicidad residual se calcula usando la concentración de punto final de la CT de tipo silvestre dividida por la concentración obtenida por la CT-CRM multiplicada por 100. La Tabla 2 describe la toxicidad residual de varias holotoxinas mutantes purificadas probadas en el ensayo de célula adrenal Y-l.

Tabla 2 La toxicidad de las células adrenales Y-l Ensayo de célula adrenal Y-l CT-CRM % de toxicidad residual E112D 0.13 E112D 0.13 RllK 0.04 R7K 0.04 E110D 0.13 E110D 0.40 E29H 1.20 CT-B 1.20 CT 100.00 Ejemplo 4 Ensayo del peso del intestino de ratones de patente En este ensayo, se administraron 10 µg de CT de tipo silvestre o CT-CRME29H int ragast ricamente a cada uno de los grupos de ratones BALB/c (tres ratones por grupo) . Los intestinos se removieron cuidadosamente tres horas después y se pesaron. Los resultados se presentan en la Tabla 3. Los datos se presentan como medio de relación de intestino/carcasa de peso por grupo.

Tabla 3 Toxicidad de CT-CRME29H p < 0.05 comparado con el control de CT tipo silvestre, p > 0.05 comparado con PBS.

Ejemplo 5 Ensayo de ADP-ribosiltransferasa Se midió la actividad de NAD+ : agmat ina ADP-ribosilt ransferasa como la liberación de nicotilamina [carbonil-1 C] de NAD+ radioetiquetado. De manera breve, la CT y la CT-CRME29H se activaron con tripsina y se incubaron por 30 minutos a 30°C con 50 mM de glicina/20 mM de ditiotreitol en solución amortiguadora TEAN (Tris®/EDTA/azida de sodio/cloruro de sodio) (pH 8.0) . Posteriormente, se agregaron los siguientes materiales a la reacción: 0.1 mg de inhibidor de tripsina de soya, 50 mM de fosfato de potasio, 10 mM agmatina, 20 mM de ditiotreitol, 10 mM de cloruro de magnesio, 100 uM de GTP, 3 mM dimiristoilfosfat idil colina, colato al 0.2%, 0.03 mg de ovalbumina, 100 uM [ adenina-U-14C ] NAD (DuPont NEN®, Boston, MA) y agua hasta un volumen final de 300 µl . Después de la incubación por 90 minutos a 30°C, se aplicaron muestras de 100 µl a las columnas (0.64 X 5 cm) de AG1-X2 (Bio-Rad) que se lavaron cinco veces con 1.0 ml de H20 destilada/desionizada. Los evaluados conteniendo [ 14C] ADP-ribosilagmatina se colectaron por radioensayo. Los medios recuperados de 14C en el eluato se expresan como el porcentaje del que se aplica en la columna. Los resultados se presentan en la- Tabla 4.

Tabla 4 Actividad de NAD:agmatina ADP-Ribos iltranferasa Coadyuvante ADP- % de la ribosilagmat ina actividad de la formada ribosilación (nmol/hr/ug de proteina ) CT, 10 ug 57.1 100 E29H, 10UG 6.7 11.7 E110D, 10UG 0.4 0.7 E112D, 10UG 0.9 1.6 R7K, 10UG 0.4 0.7 RllK, 10UG 0.4 0.7 Ejemplo 6 Las respuestas inmunes de los ratones BALB/c inmunizados con las proteinas de membrana exterior P4 y P6 (r) recombinante de Haemophilus influenzae no típica (NTHi) En un primer experimento, se inmunizaron intranasalmente cinco ratones BALB/c por grupo en los dias 0, 21 y 35 con una dosis de 10 ul conteniendo 5 µg de rP4 ó 10 µg RP6, más 1 µg del coadyuvante como se indica en las Tablas 5 y 6 (un grupo no recibió el coadyuvante) . Las concentraciones de anticuerpo IgG anti-rP4 se determinaron por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas en los dias 0, 21, 35 y 48 y los resultados se muestran en la Tabla 5. Las concentraciones de anticuerpo IgG anti-rP6 se determinan de manera separada por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas en los dias 0, 21, 35 y 48 y los resultados se muestran en la Tabla 6. Las respuestas del anticuerpo mucosal para el rP4 también se miden 2 semanas después de la última inmunización (dia 49) . La Tabla 7 coloca las concentraciones de IgA e IgG de los lavados nasales, broncoalveolares y vaginales, respectivamente.

En un segundo experimento, cinco ratones BALB/c por grupo se inmunizaron intranasalmente los dias 0, 21, y 35 con una dosis de 30 µl conteniendo 5 µg de rP4 ó 10 µg de rP6, más dosis ascendentes de la CT-CRME29H como se indica en la Tabla 8 (otros grupos recibieron cada uno la CT o CT-B; un grupo no recibió coadyuvante). Las concentraciones de anticuerpo IgA e IgG de suero anti-rP4 se determinaron por ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas los dias 21, 35 y 48 y los resultados se muestran en la Tabla 8. Las concentraciones IgA e IgG de lavados broncoalveolares y vaginales en el dia 49 también se determinaron y se muestran en la Tabla 8.

Tabla 5 Respuestas inmune humorales sistémicas de ratones BALB/c inmunizados3 con proteínas13 recombinantes P4 y P6 formuladas con holotoxina de cólera mutante. 3 Los ratones se inmunizaron intranasalmente (IN, volumen de 10 ul) los dias 0, 21 y 35. b Las proteinas recombinantes P4 y P6 se administraron a 5 y 10 ug por dosis respectivamente . c Las concentraciones de anticuerpo IgG de anti- recombinante P4 se determinaron por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas a los tiempos descritos. Fueron cinco ratones por grupo. d La CT y la CT mutantes se administraron a 1 ug por dosis .

Tabla 6 Las respuestas inmune humorales y sistémicas de ratones BALB/c inmunizados3 con proteinab P4 y P6 recombinantes formuladas con holotoxinas de cólera mutante .

Los ratones se inmunizaron intranasalmente (IN, volumen de 10 ul) los dias 0, 21 y 35. b Proteinas P4 y P6 recombinantes se administraron a 5 y 10 ug por dosis respectivamente . c Concentraciones de anticuerpo IgG de anti P6 recombinante se determinaron por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas a los tiempos indicados. Se usaron cinco ratones por grupo. d La CT y la CT mutantes se administraron a 1 ug por dosis .

Tabla 7 Las respuestas del anticuerpo mucosal de ratones BALB/c inmunizados3 con proteínas13 recombinantes P4 y P6 formuladas con holotoxina de cólera mutante. a Los ratones se inmunizaron intranasalmente (IN, volumen de 10 ul) los dias 0, 21 y 35. b las proteinas P4 y P6 recombinantes se administraron a 5 y 10 ug por dosis respectivamente . c Concentraciones de anticuerpo IgG e IgA anti-P4 recombinante se determinaron por ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas dos semanas después de la último inmunización (dia 49) . Se usaron cinco ratones por grupo. d NW, BAW , y VW denotan lavado nasal, lavado broncoalveolar, y lavado vaginal, respectivamente. e La CT y la CT mutante se administraron a 1 ug por dosis .

Tabla 8 El efecto de dosis ascendentes de la CT- CRME29H en la generación de respuestas inmunes local y sistémica contra las proteinas P4 y P6 recombinantes de Haemophilus Influenzae Concentraciones de anticuerpo anti P4 recombinante nota' 3 Los ratones se inmunizaron intranasalmente (IN, volumen de 30 ul) los dias 0, 21 y 35 con proteina P4 (5 ug) y P6 (10 ug) recombinante. Las concentraciones de anticuerpo IgG e IgA anti P4 recombinante se determinaron por ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas a los tiempos indicados. Se usaron cinco ratones por grupo. b BAW y VW denota lavado broncoalveolar, y lavado vaginal respectivamente.

Ejemplo 7 Las respuestas inmunes de los ratones BALB/c inmunizados con la proteina Haps de NTHi Una cepa NTHi P860295 (46) se obtuvo del Dr . Charles Brinton, Universidad de Pittsburgh. Se obtuvo de la nasofaringe de un niño con NTHi inducida por el medio otitis. Las cepa NTHi TN106 (47) se obtuvo del Dr. Eric Hansen, Universidad de Texas Southwestern Medical Center en Dallas. La estreptomicina resistente mutante de TN106 se derivó por la selección en charolas de BHI-XV conteniendo 100 µg/ml de estreptomicina (Sigma, San Luis, MO) . Este mutante se pasó dos veces en la nasofaringe de los ratones BALB/c y se congeló como la cepa TN106.P2.

La proteina Haps de la cepa NTHi P860295 se purificó como sigue. La cepa NTHi P860295 se cultivó en un medio BHI-XV por 18 horas a 35°C con aireación. Las células variables se formaron en pelotillas por centrifugación, 10K x g a 4°C, y se descargaron. El sobrenadante se condujo a una saturación del 60% con (NH4)2S04, manteniendo a temperatura ambiente por 2-3 horas, y el precipitado se colectó por centrifugación. El precipitado se disolvió en 50 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 5.8, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl (solución amortiguadora 1), y se dealizó a 4°C contra la solución amortiguadora anterior. Una columna Sepharose® CM de 10 ml de volumen de cama (Pharmacia, Piscataway, NJ) se equilibro con la solución amortiguadora 1, y 30 ml de material soluble anterior se cargó en la columna a una relación de flujo de 1 ml/minuto. La columna se lavó con solución de amortiguadora 1 hasta que el OD28o alcanzó la linea base. El material caldo se descartó. Se eluyeron las proteinas enlazadas de la resina usando un gradiente de tres pasos: (1) solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 7.0 1 mM EDTA, 50 mM NaCl; (2) solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 8.0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl; y (3) solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 8.0, 0.5 M de NaCl, ImM de EDTA. Las proteinas que se eluyeron en cada un de los pasos, se agruparon y se guardaron para el análisis. El análisis SDS-PAGE (48) de los grupos indicó que la proteina Haps se eluyó en los pasos de gradiente 2 y 3. Estos grupos contenían Haps altamente purificada y se combinaron.

Ratones hembra Balb/c, de seis semanas de edad, (diez por grupo) se inmunizaron entonces IN con la Haps purificada de la cepa NTHi P860295. La proteina Haps se diluyó en D-PBS hasta 5 o 15 µg/40 µl con o sin la CT-CRME29H. Donde la CT-CRME29H se usó a una dosis de 0.1 µg/ratones. Las formulaciones de control conteniendo la CT-CRME29H en D-PBS, D-PBS solo y formalina fijada a la TN106.P2 (la cepa de estimulo de NTHi) también se administraron al ratones en volúmenes de 40 µl .

Antes de la inmunización IN, los ratones se anestesiaron y entonces se inmunizaron por inoculación intranasal de 20 µl /ventanilla de la nariz de una pipeta. La pipeta se mantuvo para que la punta tocara la abertura de la ventanilla de la nariz y la formulación se vertiera automáticamente en la ventanilla de la nariz durante la inhalación. Los ratones se colocaron en una posición supina para que las narices no tocaran nada después de la administración de la formulación o del estimulo. Los ratones se inmunizaron en la semana 0, 1, 3 y 5. El suero se vació en la semana 7. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Respuesta inmune humoral sistémica en ratones Balb/c después de la inmunización intranasal con Haps mezclada con o sin CT-CRME 9H Ejemplo 8 Las respuestas inmunes de los ratones BALB/c y C57B1/6 inmunizados con la proteina de Ureasa recombinante (r) de Helicobacter pilori En un primer experimento, cinco ratones BALB/c por grupo se inmunizaron como sigue: Siete grupos se inmunizaron int ragast ricamente los dias 0, 2, 14 y 16 con 100 µg de rUreasa más 10 µg del coadyuvante como se indica en las Tablas 10-12. Un grupo se inmunizó con 10 µg de rUreasa subcutáneamente en las ancas; otro grupo se inmunizó con 10 µg de rUreasa subcutáneamente en el cuello; ambos grupos también recibieron 20 µg de Stimulon© QS-21 como un coadyuvante los dias 0 y 16. Las concentraciones de anticuerpo anti-rUreasa se determinaron por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas el dia 28. Los resultados de IgG se muestran en la Tabla 10 y los resultados se muestran en la Tabla 11. Las respuestas del anticuerpo mucosal a la rUreasa también se midieron el dia 29. La Tabla 12 coloca las concentraciones de IgA e IgG para los lavados broncoalveolares y vaginales, respectivamente.

En un segundo experimento, se evalúa la habilidad de la rUreasa más el coadyuvante para proteger a los ratones contra un estimulo con H . fel i s . Diez ratones BALB/c por grupo se inmunizaron como sigue: Dos grupos se inmunizaron intragast ricamente los dias 0, 2, 14 y 16 con 100 µg de rUreasa más 10 µg del coadyuvante como se indica en la Tabla 13; un grupo de control recibió PBS en lugar de rUreasa más 10 µg de coadyuvante. Un grupo se inmunizó subcutáneamente los dias 0 y 16 con 10 µg de rUreasa más 20 µg de Stimulón® QS-21. Las concentraciones del anticuerpo anti-rUreasa se determinaron por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas el dia 28. Los ratones también se estimularon con tres dosis de H . fel i s 108 los dias 29, 31 y 34 y entonces se evaluaron para la protección el dia 44. Se evaluó la protección por la prueba de ureasa. En la prueba de ureasa, la mitad del estomago se incubó a 37°C por cinco horas en 0.5 ml del medio de prueba de ureasa conteniendo 2% de urea y fenol rojo, un indicador de pH, a 7 µg/ml. La actividad de ureasa generó amonio y bicarbonato de urea, de esta manera elevando el pH e induciendo un cambio calorimétrico de la solución con una alta absorbencia a 550 nm. El nivel de la actividad de ureasa se midió por el análisis espectrofotométrico. La prueba se consideró positiva para H . fel i s cuando el significado de los valores de absorbencia fue de dos desviaciones estándar arriba de aquella que se obtiene para los tejidos gástricos de ratones no infectados. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

En un tercer experimento dos grupos de ratones C57BL/6 (cinco por grupo) se inmunizaron gástricamente los dias 0, 2, 14 y 16 con 100 µg de rUreasa más 10 µg del coadyuvante como se indica en la Tabla 14. Un tercer grupo se inmunizó subcutáneamente los 0 y 16 con 10 µg de rUreasa más 100 µg de alumbre. Un cuarto grupo se inmunizó gástricamente los dias 0, 2, 14 y 16 con 100 µg de rUreasa, pero sin coadyuvante. Las concentraciones de anticuerpo anti-rUreasa se determinaron por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas el dia 28. La Tabla 14 coloca las concentraciones de IgA e IgG de los sueros, lavado broncoalveolar, extracto de pelotillas fecales y lavado vaginal, re spect ivamente .

En un cuarto experimento, cinco ratones C57BL/6 por grupo se inmunizaron como sigue: Tres grupos de ratones se inmunizaron IG los dias 0, 2, 14 y 16 con 100 µg de rUreasa, más 10 µg del coadyuvante como se indica en la Tabla 15; un cuarto grupo no recibió coadyuvante. Las concentraciones de anticuerpo anti-rUreasa se determinaron por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas el dia 29. Los resultados de IgA e IgG se muestran en la Tabla 15. La Tabla 15 también presenta las concentraciones de IgE (PCA) e IgE total. PCA denota que las concentraciones de anticuerpo de IgE se determinan por la reacción de la 'anafilaxis cutánea pasiva. La PCA se ejecuta en ratas Sprague-Dawley hembras. Las ratas son sedadas con setamina/xilazina , rasuradas, e inyectadas intradermalmente con 0.1 ml de sueros (diluidos en serie cuatro veces) de ratones C57B1/6 inmunizados con rUreasa formulada ya sea con CT, LT, o CT-CRME29H. Las ratas son sedadas 48 hasta 60 horas después y entonces se inyectan intravenosamente (0.1 ml ) por medio de la vena del rabo con 2 µg de rUreasa en PBS conteniendo un tinte azul al 1% Evan.

Tabla 10 El efecto de la CT-CRM en la generación de concentraciones de anticuerpo IgG anti-ureasa sistémicas en ratones BALB/c Las concentraciones del anticuerpo anti-ureasa recombinante de medio geométrico se determinan por el ensayo ELISA en muestras de suero colectadas el dia 28. Fueron cinco ratones por grupo. b Los ratones se inmunizaron con 10 µg rUreasa subcutáneamente (SC) en las ancas (R), o en el cuello (N) los dias 0 y 16. Los ratones inmunizados int ragast ricamente (IG) recibieron 100 µg de rUreasa los dias 0, 2, 14 y 16. Los coadyuvantes fueron ya sea Stimulon® QS-21 (20 µg) , CT (10 µg), o CT mutantes (10 µg) .

Tabla 11 El efecto de las CT-CRM en la generación de concentraciones de anticuerpo IgA anti-Ureasa sistémicas en ratones BALB/c Concentraciones de anticuerpo IgA anti-Ureasa recombinante' Coadyuvante Ruta Medio SE CT IG 2, 529 584 E29H IG 1, 013 426 R7K IG 82 15 RllK IG 153 39 E110D IG 351 137 E112D IG 232 93 CT-B IG 455 280 QS-21 SC-R 5, 675 562 QS-21 SC-N 4, 793 528 Las concentraciones de anticuerpo IgA anti-ureasa recombinante de medio geométrico se determinaron por el ensayo ELISA en muestras de suero colectadas el dia 28. Fueron cinco ratones por grupo . b Los ratones se inmunizaron con 10 µg de rUreasa subcutáneamente (SC) en las ancas (R), o en el cuello (N) los dias 0 y 16. Los ratones inmunizados intragastricamente (IG) recibieron 100 µg de rUreasa los dias 0, 2, 14 y 16. Los coadyuvantes fueron ya sea Stimulon® QS-21 (20 µg) , CT (10 µg), o derivados de CT (10 µg).

Tabla 12 El efecto de las CT-CRM en la generación de concentraciones de anticuerpo IgA anti-Ureasa en las secreciones mucosales de los ratones BALB/c Las concentraciones de anticuerpo IgG e IgA anti-rUreasa se determinaron por el ensayo ELISA en muestras agrupadas el dia 29. Fueron cinco ratones por grupo. b BAW y VW denotan lavados broncoalveolares y lavados vaginales respectivamente. c Los ratones se inmunizaron con 10 µg de rUreasa subcutáneamente (SC) en las ancas (R), o en el cuello (N) los dias 0 y 16. Los ratones se inmunizados intragástricamente (IG) recibiendo 100 ug de rUreasa los dias 0, 2, 14 y 16. Los coadyuvantes fueron ya sea Stimulon® QS-21 (20 µg) , CT (10 µg), o derivados de CT (10 µg) .

Tabla 13 La generación de respuestas inmunes protectoras en ratones BALB/c inmunizados con Ureasa recombinante formulada con la CT o la CT-CRME29H Las concentraciones de anticuerpo IgA anti- rUreasa recombinante se determinaron por ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas el dia 28. Fueron diez ratones por grupo. b Los ratones se inmunizaron intragástricamente (IG) los dias 0, 2, 14 y 16 con 100 µg de Ureasa por dosis. Los ratones de control se inyectaron subcutáneamente (SC) los dias 0 y 16 con 10 µg de rUreasa por dosis. 0 La rUreasa se formuló ya sea con 10 µg de la CT o CT-CRM por dosis, o se mezcló con 20 µg de Stimulon® QS-21 por dosis. d BAW denota lavado broncoalveolar. e los ratones se estimularon con 3 dosis de H . fel i s 108 los dias 29, 31 y 34 y se evaluaron para su protección el dia 44. La protección se evaluó por la prueba de ureasa rápida.

Tabla 14 Los efectos de CT-CRME29H en la respuesta inmune la ureasa recombinante en ratones C57BL/6 El punto final de llaass ccoonncceennttrraaciones de anticuerpo aannttii--rUreasa scee eterminaron por el ensayo ELLIISSAA eenn mmuuestras de suero agrupadas c~o" lect adas el ia 28. Fueron cinco ratones por garruupooo.. B BAAWW,, FFPP,, yy VVWW ddeennoottaann llaavvaaddoo bbrroonncoal veolare, extracto de pelotillas fecales, y lllaaavvvaaadddooo v?vaaayggiJinnaall rreessppeeccttiivvaammeennttee.. ee LLooss rraattoonneeesss ssseee iinnmmuunniizzaarroonn ccoonn 1100 uugg <de rUreasa subcutáneamente (S CC)) llooss ddiiaass 0 y 16. Los ratones se inmunizaron gástricamente (IG) recibiendo 1.00 .u.g_ ddee rUreasa los dias 0, 2, 4 y 16. Los coadyuvantes fueron ya sea alumbre (100 ug), CT (10 ug) , o CT-CRME29H.

Tabla 15 La generación de anticuerpo IgE de ureasa especifica en la circulación de los ratones C57B1/6 inmunizados con ureasa recombinante preparada ya sea con CT, LT, o CT-CRME29H. Concentraciones de anticuerpo anti- rUreasa' Coadyuvante IgA IgG IgE Total (PCA) ° IgEd Ninguna 732 30, 591 < 4 ND CT 2, 504 496, 373 32 1591 CT-CRME29H 4, 039 477, 098 16 888 LT 5,251 670, 807 64 3589 El punto final de las concentraciones de anticuerpo IgA e IgG se determinaron por el ensayo ELISA en muestras de suero agrupadas colectadas el dia 28. Fueron cinco ratones por grupo. b Los ratones se inmunizaron intragástricamente (IG) con 100 µg de rUreasa los dias 0, 2, 14 y 16.

Los coadyuvantes fueron 10 µg de CT, o CT-CRME2gH o LT. c PCA denotan las concentraciones de anticuerpo IgE se determinaron por reacción de anafilaxis cutánea pasiva. La PCA se ejecuta en ratas Sprague Dawley hembras. Las ratas fueron sedadas con cetamina/xilazina, rasuradas e inyectadas intradermalmente con 0.1 ml de suero (diluido en serie 4 veces) de ratones C57B1/6 inmunizados con rUreasa formulada ya sea con CT, LT, o CT-CRME29H. Las ratas se sedaron 48 hasta 60 horas después y entonces se inyectaron (0.1 ml) intravenosamente por medio de la vena del rabo con 2 µg de ureasa en PBS conteniendo tinte azul Evan al 1%. d Los números están en ng/ml. ND denota no detectado .

Ejemplo 9 Respuestas inmunes de ratones Swiss-Webster inmunizados con la proteina de membrana exterior de clase 1 y pilina de clase 1 recombinante de Nei sseri a men in gi t i di s .

En un primer experimento, ratones Swiss-Webster de 6-8 semanas de edad (15 por grupo) se inmunizaron IN (10 µl) en la semanas 0, 2 y 3 con 5 µg de pilina de clase 1 recombinante purificada (rpilina) formulada con la CT-CRME29H (0.1 o 1 µg/ratones). Muestras de suero, lavados broncoalveolares (BAW), lavados nasales (NW) y lavados vaginales (VW) se colectaron de cinco ratones en cada uno de los grupos para determinar los anticuerpos IgA e IgG de suero y mucosales específicos para la N. meningitidis de pilina por el ensayo ELISA a la semana 4. Los resultados se presentan en la Tabla 16. Los siguientes diez ratones en cada uno de los grupos inmunizados en paralelo se estimularon IN con 2 x 107 CFU de la cepa homologa de N. meningitidis H355P+.p2lR (pasada a través de ratas infantes 2 veces) en la semana 4. La recuperación del grupo B de N. meningitidis del tejido nasal 24 horas después del estimulo se determinó por el cultivo cuantitativo, como se muestra en la Figura 2.

En un segundo experimento, la protección de la rpilina formulada con la CT-CRME29H contra una cepa meningococcal homologa se comparó a la de la CT-CRME29H mezclada con una proteina no relacionada, KLH. Grupos de cinco ratones Swiss-Webster (seis semanas de edad) se inmunizaron I? (10 µl de volumen) con 5 µg de rpilina con o sin CT-CRME29H, (0.1 µg) o con PorA H355 con CT-CRME29H (0.1 µg ) en la semana 0, 2, y 3. Los grupos de control ya sea que fueron no inmunizados (grupo simple) o inmunizados IN con KLH (5 µg) más la CT-CRME29H (0.1 ug) . El punto final de las concentraciones de anticuerpo se determinó por la célula completa y ensayo de antigeno especifico ELISA en muestras de suero agrupadas colectadas en la semana 4 antes del estimulo con 1 x 107 CFU de cepa meningococcal H355P+. Los resultados se presentan en las Tablas 17 y 18.

En un tercer experimento, la inmunogenicidad de la PorA meningococcal formula con la CT-CRME29H para la inmunización IN se evaluó. Cinco ratones Swiss- Webster por grupo se inmunizaron IN en la semana 0, 2, y 3 con 20 µg/dosis de PorA de cepa meningococcal H44/76 con o sin la CT-CRME29H (1 µg/dosis) como se indica en la Tabla 19. Las concentraciones de anticuerpo anti-PorA H44/76 y de célula completa de ensayo ELISA para IgG se evaluaron en suero agrupado en muestras mucosales colectadas en la semana 4 del experimento. Los resultados se presentan en la Tabla 19.

En un cuarto experimento, se evalúa la habilidad de la rpilina y el coadyuvante PorA con la CT-CRME29H para proteger a los ratones contra el estimulo a una cepa heteróloga de meningococci . Diez ratones , Swiss-webster por grupo se inmunizaron IN (10 µl de volumen) con 5 µg ya sea de rpilina, PorA de la cepa H355, o PorA de la cepa 870227, formulada con la CT-CRME29H (0.1 µg) en la semana 0, 2 y 3. Los grupos de control fueron ya sea cepa meningococcal inactivada por calor 870227 de células completas o KLH (5 µg) más CT-CRME29H (0.1 ug) . El punto final de las concentraciones de IgG e IgA se determinó por la célula completa y el ensayo ELISA especifico del antigeno en muestras de suero agrupadas colectadas en la semana 4 antes del enfrentamiento de la cepa 870227. Los resultados se presentan en la Tabla 20 y 21. La recuperación bacterial del tejido nasal se determinó por cultivo cuantitativo 24 horas después del estimulo con la cepa 870227 y se expresó como Logio CFU ± desviación estándar. Los resultados se muestran en la Figura .

Un quinto experimento se condujo para examinar la CT-CRME29H como un coadyuvante para la inmunización parenteral. Grupos de diez ratones hembra Swiss-Webster , de 5-6 semanas de edad se inmunizaron subcutáneamente con 5 µg de PorA H355 formulada ya sea con la CT-CRME29H (10 µg) o MPL® (100 µg) en la semana "0 y 4. Los grupos de control se inmunizaron subcutáneamente con células completas 870227 meningococcales inactivadas por calor o KLH (5 µg) más MLP® (100 µg) . Los ratones se estimularon IN con 1.2 x 107 CFU de cepa meningococcal 870227 en la semana 6. Veinticuatro horas después del estimulo, los ratones se sacrificaron y los tejidos nasales se homogeni zaron y se sembraron en un medio selectivo. Las colonias se contaron después de la incubación a 37°C durante la noche y se expresaron como Logio CFU ± desviación estándar. Los resultados de este experimento se presentan en la Tabla 22 y en la Figura 5.

Tabla 16 Efectos coadyuvantes de la CT-CRME29H en las respuestas inmunes sistémicas y mucosales para rpirina de N. m eni ngi ti di s rPilin (Clase I H44/76) en ratones Swiss-Webster.

Tabla 17 El efecto de la CT-CRME29H en la respuesta inmune para antigeno meningococales en ratones Swiss- Webster .

Total de suero IgG de ensayo ELISA de célula completa B meningococal * Representa la semana 0 de muestras agrupadas para todos los grupos Tabla 18 El efecto de la CT-CRME29H en la respuesta inmune a los antigenos meningococales en ratones Swiss- Webster .

Concentraciones de anticuerpo anti-rpilina y anti-porA de ensayo ELISA en muestras agrupadas rpilina Clase I OMP H355 Grupo Suero IgG Suero IgA Suero IgG Suero I gA Sem 4 Sem 4 Sem 4 Sem 4 5µg rpilina 8, 840 < 50 < 50 < 50 5µg rpilina + 0.1 µg 149, 221 860 120 < 50 CT-CRME29H 5µg porA H355 + < 50 < 50 13, 795 60 0.1 µg CT-CRME29H 5µg KLH + 0.1 µg < 50 < 50 < 50 < 50 CT-CRME29H Tabla 19 Respuestas inmune de ratones Swiss-Webster inmunizados int ranasal ente con PorA y CT-CRME29H Concentraciones de anticuerpo anti-PorA H44/76 ND = Sin datos WCE = Célula completa de ensayo ELISA para la cepa H44/76 5 PorA = PorA H44/76 especifica de ensayo ELISA Tabla 20 Respuestas inmunes de ratones Swiss-Webster inmunizados intranasalmente con PorA y rpilina meningococal heteróloga y homologa con la CT- CRME29H Concentración* de IgG por ensayo ELISA en ratones inmunizado con Ensayo Suero 5ug KLH 5ug 5ug porA 5ug porA 25ug HI C de en la + 0. lug rpi 1 ina + H355 + 870227 870227 antígeno semana CT-CRME25« 0. lug 0. lug + 0. lug + 0. lug CT-CRME29H CT-CRME29H CT-CRME29H CT-CRME29H C <100 <100 <100 <100 <100 870227 350 13, 376 7, 088 24, 815 74, 930 WC 257 257 257 257 257 H355P 310 3, 687 5, 140 3, 930 5, 933 rpilin 146 146 146 146 146 585 1, 999, 530 <100 <100 <100 PorA <100 <100 <100 <100 <100 H355 <100 673 29, 770 19, 009 463 PorA <100 <100 <100 <100 <100 870227 <100 <100 10, 020 23, 045 5, 935 jas concentraciones a la semana 0 son agrupadas para todos los grupos. WC = Célula completa Hl = Inactivado por calor Tabla 21 Respuestas inmunes de ratones Swiss-Webster inmunizados intranasalmente con PorA y rpilina heteróloga y homologa meningococcal con CT-CRME29H Concentraciones a la semana 0 son agrupadas para todos los grupos. WC = Célula completa Hl = Inactivado por calor ND = Sin datos Tabla 22 Actividad bactericida de la -V. meningitidis a partir del suero del ratón inmunizado subcutáneamente con PorA con CT-CRME29H O MPL® *nd = no dado complemento usado:UR4-97 humana Ejemplo 10 Respuestas inmunes de los ratones BALN/c inmuni zados con la Gicoproteina de fusión nativa purificada (F) de virus Sinticilial Respiratorio RSV : En un primer ejemplo, se inmunizaron intranasalmente ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad (5 rat ones /grupo ) (10 µl) en la semana 0 y 14 con 3 µg de proteina nativa purificada formulada con la CT-CRME29H (1 µg o 10 µg/ratón), CT de tipo silvestre (1 µg/ratón), CT-B (1 µg o 10 µg/ratón) o sin coadyuvante. El punto final de las concentraciones de anticuerpo IgG e IgA se evaluó por ensayo ELISA, el dia 24 de experimento. Las concentraciones se obtuvieron de los sueros, lavado broncoalveolar y lavados vaginales. Los resultados se presentan en la Tabla 23.

En un segundo experimento, ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad (5 ratones /grupo ) se pre-inmunizaron intranasalmente (50 µl) ya sea con la CT de tipo silvestre (1 µg/ratón) o la CT-CRME29H (1 µg/ratón), los dias 0 y 14. Los grupos de control no se pre-inmuní zaron . Posteriormente, en los dias 28 y 42, todos los ratones se inmunizaron intranasalmente con 3 µg de proteina F formulada con las mismas cantidades de CT o CT-CRME29H. El punto final de las concentraciones de anticuerpo se determinó por el ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas el dia 56 (sueros) y 57 (fluidos de lavado broncoalveolares y vaginales). Los resultados se presentan en la Tabla 24.

En un tercer experimento, ratones BALB/c hembras simples (6-8 semanas, 5 ratón/grupo) se inmunizaron intranasalmente (IN) en la semana 0, 1 y 2 con proteina de fusión (F) nativa purificada de la RSV A2. Las inmunizaciones se prepararon por la formulación de proteina F (3 µg/ratón) con CT-CRME29H (1 µg o 10 µg/ratón), CT-B (1 µg ó 10 µg/ratón) o alumbre (100 µg/ratón) . Las vacunas se administraron intranasalmente permitiendo anestesiar al ratón para que respirara en la vacuna colocada en la punta de la ventanilla de la nariz. El volumen total por dosis fue de 10 µl por ratón (en la Tabla 25), en la semana 0, 1 y 2. El ratón de control recibió una inmunización primaria intramuscular conteniendo F/ALOH, o recibió inmunizaciones primaria y secundaria de RSV A2, liberada intranasalmente. Las respuestas inmunes humorales sistémicas se evaluaron por ensayo ELISA, nueve dias (para las Tablas 25 y 26) después de la inmunización terciaria. El lavado broncoalveolar, lavados vaginal y nasal también se colectaron y se utilizaron en la caracterización de la respuesta del anticuerpo mucosal. Se usaron bazos del ratón inmunizado para evaluar la actividad eliminadora de célula dependiente del antigeno contra las células objetivo infectadas con RSV comparable con MHC. Una segunda serie de ratones, que también recibieron un itinerario de inmunización idéntico se estimularon con RSV vivo. La protección de los compartimentos del pulmón dentro de esta serie se analizó subsecuentemente a los 4 dias después del estimulo determinando las placas de virus en el tejido de pulmón homogenizado colectado. Los análisis estadísticos se elaboraron usando ANOVA. Los resultados se presentan en las Tablas 25 y 26.

En un cuarto experimento, ratones BALB/c se inmunizaron intranasalmente en la semana 0, 1 y 2 con proteina RSV F (3 µg/ratón) en combinación con la CT-CRME29H (1 µg o 10 µg/ratón), CTB (1 µg ó 10 µg/ratón) o PBS. Como un control, los ratones también recibieron una liberación intranasal de RSV o una liberación intramuscular de F/ALOH. Los esplenocitos se aislaron 9 dias después de la inmunización final y se estimularon en vivo con células estimulantes infectadas con RSV singénicas. Después de 6 dias en cultivo, la actividad eliminadora de la célula dependiente del antigeno se determinó por la cuantificación de 51Cromio liberado por las células objetivo infectadas con RSV. Los resultados se presentan en la Figura 6.

En un quinto experimento, un ensayo de protección viral, los compartimientos del pulmón de ratones inmunizados se aislaron 4 dias después del estimulo con RSV vivo, homogenizado, y la cuantificación de la infección del virus se ejecutó. Los ratones BALB/c se inmunizaron intranasalmente con vacunas que contenían la proteina F purificada de la RSV y ya sea la CT-CRME2gH, CTB o PBS. También se inmunizaron grupos de ratones intramuscularmente con F/ALOH como un control. Ocho dias después de la inmunización final (tres semanas posteriores a la vacuna con F/ALOH), los ratones se estimularon con RSV vivo. Cuatro dias después, los tejidos pulmonares se recogieron y se utilizaron en la cuantificación de la infección por virus. Los resultados se presentan en la Figura 7.

En un sexto experimento, los ratones BALB/c hembras simples (6-8 semanas, 5 ratón/grupo) se inmunizaron intranasalmente (IN) en la semana 0, 1 y 2 con proteina de fusión (F) nativa purificada de la RSV A2. Se prepararon inmunizaciones formulando la proteina F (3 µg/ratón) con CT-CRME29H (1 µg/ratón) o alumbre (100 µg/ratón). La vacuna se administró intranasalmente permitiendo anestesiar al ratón para respirar en el lugar de la vacuna en la punta de la ventanilla de la nariz. El volumen total por dosis fue de 5 µl por ratón (en la Tabla 27), en las semanas 0, 1 y 2. Los ratones de control recibieron una inmunización primaria intramuscular conteniendo F/ALOH, o recibiendo inmunizaciones primarias y secundarias de RSV A2 vivo, liberada intranasalmente. Las respuestas inmunes humorales sistémicas se evaluaron por ensayo ELISA, dos semanas después de la inmunización terciaria (para las Tablas 27 y 28) . También se colectaron lavados broncoalveolares, vaginales y nasales y se utilizaron en la caracterización de respuestas de anticuerpo mucosal. Los bazos del ratón inmunizados se usaron para evaluar la actividad de la célula eliminada dependiente del antigeno contra las células objetivo infectadas con RSV comparables a la MHC. Una segunda serie de ratones, que recibieron un itinerario de inmunización idéntico, se estimularon con RSV vivo. La protección de los compartimentos del pulmón dentro de esta serie se analizó subsecuentemente a los 4 dias después del estimulo para determinar las placas de virus en el tejido de pulmón homogéneo colectado. Los análisis estadísticos se ejecutaron usando ANOVA. Los resultados se presentan en las Tablas 27 y 28.

En un séptimo experimento, el protocolo del cuarto experimento se utilizó nuevamente para determinar la actividad CTL dependiente del antigeno para células objetivo infectadas con RSV. Los resultados se presentan en la Figura 8.

En un octavo experimento, otro ensayo de protección viral, ratones BALB/c (5 rat ones /grupo ) se inmunizaron intranasalmente con formulaciones que contenían la proteina F de RSV purificada, con o sin CT-CRME29H- LOS grupos de ratones también se inmunizaron intramuscularmente con F/ALOH y se dejaron no inmunizados (simple) como un control. Dos semanas después de la inmunización final (cuatro semanas después de la administración de la F/ALOA) , todos grupos se enfrentaron con RSV.

Cuatro dias después, los tejidos pulmonares se recogieron y se utilizaron en la cuantificación de la infección por virus. Los resultados se presentan en la Figura 9.

En un noveno experimento, un protocolo de tres dosis se empleó para investigar la respuesta al coadyuvante de la CT-CRME29H con más detalle. Grupos de cinco ratones BALB/c se inmunizaron IN (5 µl) en la semana 0, 1 y 2 con la proteina F (3 µg), mezclada ya sea con 0.01, 0.1 ó 1.0 µg de la CT-CRME29H. Se cebaron ratones de control al dia 0 con F/ALOH (intramuscular) o RSV A2 (IN) . Las concentraciones de anticuerpo de suero se determinaron dos semanas después de la inmunización terciaria. Los resultados se presentan en la Tabla 29. Los datos se presentan en la concentración de anticuerpo de medio geométrico de Logio (± 1 SD) . Se obtienen resultados similares en dos estudios separados.

Después de la inmunización IN con la F/CT-CRME29H, los ratones en el noveno experimento también se probaron para sus respuestas del anticuerpo local a la proteina F. Se tomaron muestras de lavado mucosal de los ratones sacrificados dos semanas después de la inmunización terciaria y se analizaron para el IgG e IgA especifico de anti-proteina F por el ensayo ELISA. Los resultados se presentan en la Tabla 30. Los datos se presentan como la concentración de punto final de medio geométrico Logio que resulta en un OD4?0 de 0.03. Se obtienen resultados similares en el estudios separados.

En un décimo experimento, con objeto de investigar la capacidad funcional de las respuestas inmunes humorales inducidas por la inmunización por F/CT-CRME2gH se probaron sueros en un ensayo de reducción de placas para neutralizar las concentraciones de anticuerpo para el RSV A2. Los resultados se presentan en la Tabla 31. El significado geométrico neutralizante de las concentraciones de anticuerpo (Log10) se determinó en un suero individual (5 ratones por grupo) en presencia (+C) y en ausencia (-C) de un suero de conejillo de india al 5% como una fuente complementaria. Se obtiene resultados similares en dos estudios separados.

En un onceavo experimento, ratones (cinco ratones por grupo) recibieron inmunizaciones IN de proteina F formulada con 0.01, 0.1 ó 1 µg de la CT-CRME29H los dias 0, 7 y 14. Se inmunizaron ratones de control con F/ALOH (intramuscular) o RSV A2 (IN) . Los ratones inmunizados se estimularon dos semanas después de la inmunización terciaria, con objeto de determinar de la habilidad de la F/CT-CRME29H para proteger contra una infección subsecuente. Cuatro dias después de la infección, se determinó los niveles de virus en tejidos de nariz y pulmón homogeni zados de cada uno de los ratones. Los resultados se presentan en la Tabla 32. Los datos se presentan como la concentración de virus de medio geométrico por g de tejido (± 1 desviación estándar) .

Tabla 23 La generación de anticuerpo de toxina anti-cólera en ratones BALB/c después de la inmunización intranasal ya sea con CT, CT-B, o CT-CRME29H Concentraciones de anticuerpo de toxina anti cólera a El punto final de las concentraciones de anticuerpo se determinó en muestras agrupadas colectadas el dia 24 del estudio. BAW y VW denota lavado broncoalveolar y lavado vaginal respectivamente. Fueron cinco ratones por grupo . los ratones se inmunizaron intranasalmente (10 ul) los dias 0 y 14 con 3 ug de proteina F nativa mezclada con la cantidad indicada ya sea de CT de tipo silvestre, CT-B comercial, o CT-CRME29H. 0 ND = Sin datos Tabla 24 El efecto de los anticuerpos de toxina anti-cólera previamente existentes en la inmunogenicidad de la proteina de fusión de los virus sintilial respiratorios formulados ya sea con CT o CT-CRME29H Concentraciones de anticuerpo anti proteina de fusión1 El punto final de las concentraciones de anticuerpo se determinó por ensayo ELISA en muestras agrupadas colectadas los dias 56 (suero) y 57 (broncoalveolar (BAW) y vaginal (VW)). Fueron cinco ratones por grupo. Los ratones se inmunizaron previamente (intranasalmente, 50 ul ya sea con CT de tipo silvestre (1 ug) o CT-CRME29H (1 ug) los dias 0 y 14. Posteriormente los dias 28 y 42, todos los ratones se inmunizaron (intranasalmente, 50 ul) con 3 ug de proteina F formuladas con las mismas cantidades (1 ug) ya sea de CT de tipo silvestre o CT-CRME29H. El punto final de las concentraciones de anticuerpo anti-CT de los ratones previamente inmunizados ya sea con CT de tipo salvaje o CT-CRME29H y una inmunización subsecuente con proteina F, fue mayor que 1,000,000 el dia 42.

Tabla 25 Respuestas inmune sistémicas de ratones BALB/c inmunizados intranasalmente con proteina F de RSV y CT-CRME29H Concentraciones de anticuerpo anti F Grupo Inmunógeno IgG IgGl IgG2a IgA 776 10 ug E29H < 100 < 100 < 100 < 100 777 3ugF 126,463 62,344 4,899 16,202 1 ug E29H +/- +/- +/- +/- 32,646 27,002 1,027 2,031 ------ "üg" 2?T7?2"3 ?~5~~"?~? T97425 ?TT oß" 10 ug E29H +/- +/- +/- +/- 75, 688 29, 659 13,508 10, 909 779 3Ü"gF TT ? 2 ",~902 TT23S 7~,"?*76~ 1 ug CTB +/- +/- +/- +/- 32, 987 14, 985 3, 658 614 TdO 3ugF 2 ,~?T6"~T?'6 2T5 ??T5?2 TT767 10 ug CTB +/- +/- +/- +/- 110,154 34,596 11,016 7,246 784 3ugF 2, 171 521 PBS + /- + /- < 100 < 100 1, 921 743 785 3ugF |23,303 5,519 lOOug ALOH +/- +/- < 1000 < 100 16, 994 2, 348 907 RSV A2 52,749 6,252 8, 718 4, 284 +/- +/- +/- +/- 23, 557 4, 286 2,826 2,350 Para el total de IgG: p <0.05: 777 para 780 contra 784; 780 contra 779; 777 para 780 contra 785; 777, 778, 780 contra 907 (779 contra 907 p=0.7) p >0.05: 778 contra 777 (p=0.125); Para el total IgG: p <0.05: 777 para 780 contra 784; 777 para 780 contra 907; 777 para 780 contra 785 p >0.05: 781 para 780 contra 907 Para el total IgG: p >0.05: 777 para 780 contra 784 Tabla 26 Respuestas inmunes mucosales de ratones BALB/c inmunizados intranasalmente con proteina F de RSV y CT-CRME29H Concentraciones de anticuerpo anti F Colecciones Colecciones Colecciones BAL VW NW Grupo Inmunógeno IgG IgA IgG IgA IgG IgA 776 10 ug <25 <25 <25 <25 <25 <25 E29H 3ug F 777 + 1 ug 463 <25 253 2855 <25 237 E29H 3ug F 778 + 10 ug 370 <25 239 848 491 242 E29H 3ug F 779 + 1 ug 137 <25 298 426 77 272 CTB 3ug F 780 + 10 ug 1109 226 903 3574 512 372 CTB 3ug F 784 PBS <25 <25 <25 78 <25 <25 3ug F 785 + 100 ug <25 <25 <25 <25 <25 <25 ALOH 907 RSV A2 2870 1126 167 738 172 170 Tabla 27 Respuestas inmunes sistémicas de ratones BALB/c inmunizados intranasalmente con proteina F de RSV y CT-CRME29H Concentraciones de anticuerpo anti F Grupo Inmunógeno IgG IgA IgG IgA 776 3 ug F < 100 < 100 < 100 < 100 PBS 3Üg~~F 3?578 8 7 dT d 0~ ?7 ?8 4 4~~ 777 1 ug E29H +/- +/- +/- +/- 131,746 40,870 16475 1,458 778 1 ug E29H < 100 < 100 < 100 < 100 3ug F 121, 551 63,595 428 779 100 ug + /- +/- +/- < 100 ALOH 52, 023 27, 491 4, 205 112,451 8,871 9,953 224 780 RSV A2 +/- +/- +/- +/- 50,247 5,206 4,924 344 Para el total de IgG: p <0.05: 256 contra 250 y 257 p >0.05: 256 contra 258 y 259 Para el total IgGl: p <0.05: 256 contra 250 y 257 p >0.05: 256 contra 258 Para el total IgG2a: p <0.05: 256 contra 250, 257 y 25! p >0.05: 256 contra 259 Para el total IgGA: p >0.05: 256 contra 259 Tabla 28 Respuestas inmunes mucosales de ratones BALB/c inmunizados intranasalmente con proteina F de RSV y CT-CRME29H Concentraciones de anticuerpo anti F Colecciones Colecciones Colecciones BAL VW NW Grupo Inmunógeno IgG IgA IgG IgA IgG IgA 3 µgF <25 <25 <25 <25 <25 <25 250 PBS 3µg F 826 <25 1,195 3,730 554 875 256 1 µg E29H 257 1 UG E29H <25 <25 <25 <25 <25 <25 3µg F 258 100 µg 706 <25 577 108 148 <25 ALOH 259 RSV A2 347 <25 172 1,449 305 <25 Tabla 29 Respuestas al anticuerpo del suero anti proteina F inducidas después de la inmunización con proteina F y CT-CRME29H ap < 0.05 comparado a F/PBS o F/CT-E29H (0.01 ug) , bp < 0.05 comparado a F/CT-E29H (0.1 ug) O F/ALOH. cp > 0.05 comparado a F/CT-E29H (0.1 y 0.01 ug) y F/PBS p > 0.05 comparado a CT-E29H (1.0 ug) . dp < 0.05 comparado a F/PBS y F/CT-E29H (0 01 ug) . ep > 0.05 comparado a F/PBS. fp < 0.05 comparado a F/CT-E29H (0.1 o 1.0 ug) . gND= No dado Tabla 30 Anticuerpos anti proteina F en los fluidos mucosales de los ratones inmunizados con proteinas F formulada con CT-CRME29H Tabla 31 Generación de anticuerpos neutralizantes anti-RSV sistémicos después de la inmunización IN con proteinas F formulada con CT-CRME29H Tabla 32 Porcentaje de infección con virus del tejido de pulmón y nasal después de la inmunización IN con proteina F y CT-CRME29H. ap < 0.05 comparado al F/PBS, F/CT-CRME29H (0.01 µg) , CT-CRME29H o simple, p > 0.05 comparado a F/A10H o RSV A2. bp > 0.05 comparado a F/CT-CRME29H (0.1 µg) . cp < 0.05 comparado al F/ CT-CRME29H (0.01 µg) , F/PBS, CT-CRME29H o simple, p > 0.05 comparado a F/ CT-CRME29H (0.1 µg) , F/AIOH o RSV A2. dp < 0.05 comparado al F/PBS, F/CT-CRME29H (0.01 µg) , CT-CRME29H o simple, p > 0.05 comparado a F/ CT-CRME29H (1 µg) . F/AIOH o RSVA2.

Ejemplo 11 Respuestas inmunes de los ratones inmunizados con partículas similares al virus recombinante del rotavirus .

Células Spodoptera frugiperda (Sf-9) (American Type Culture Collection, Manassas, VA), se mantuvieron en un medio libre de suero Sf-900 II (Gibco-BRL, Grand Island, NY) . Células Sf-9 se coinfectaron con constructores de baculovirus recombinantes que expresan los genes VP2 y VP6 de la cepa de rotavirus de simio SA11 (32) .

Las 2/6-VLP liberadas se purificaron del medio de crecimiento de estas células Sf9 infectadas como sigue. Las células se clarificaron por centrifugación a 830 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se clarificaron entonces además por centrifugación a 8000 x g durante 30 minutos. Las VLP se purificaron de los sobrenadantes por centrifugación dos veces a través de sacarosa al 35% en solución amortiguadora de TNC (10 mM Tris, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2/. pH 8.0) a 96500 x g durante 2 horas, y entonces se suspendieron en solución amortiguadora de TNC y se almacenaron a 4°C. Las VLP purificadas se analizaron por SDS-PAGE, seguido por coloración plata y azul brillante Commassie para determinar la pureza, el análisis de mancha Western para analizar la composición de la proteina, microscopia de electrón para determinar la integridad de las partículas, y ensayo de proteina BCA para medir la concentración de proteina.

La coloración plata azul brillante Commassie y el análisis de mancha Western de la 2/6-VLP purificada confirmó la presencia de proteinas VP2 y VP6, asi como su pureza y su inmunoreactividad con anticuerpos monoclonales específicos. La pureza de las VLP se estimó para ser de alrededor del 95% a partir de las intensidades de la banda de los geles. Además, el análisis microscópico de electrón de estas 2/6-VLP purificadas confirmo su integridad morfológica (datos no mostrados) .

Los ratones se inmunizaron como sigue. Ratones BALB/c y CD-1 usados en este estudio se adquirieron de Charles River Laboratories (Storeridge, NY), se criaron en un ambiente libre de rotavirus. Ratones BALB/c de cuatro semanas de edad se inmunizaron dos veces en la semana 0 y 2, ya sea oralmente (n=4) o IN (n=5, n=4), con 100 y 10 µg de 2/6-VLP respectivamente; cada una de las dosis se formuló con 10 µg de CT-CRME29H- Un tercer grupo de ratones BALB/c (n=4) recibió las 2/6-VLP con CT-CRME29H por IN, seguido por una inmunización auxiliar oral (esto es, mezcla de grupo) . Los ratones de control en este experimento se inmunizaron con CT-CRME29H (n=10), solución amortiguadora IX TNC (n=5) o 2/6-VLP más solución amortiguadora IX TNC (n=5) . Cada uno de los ratones se inmunizó IN con 20 µl de inoculo, 2 µl cada vez, en cavidades nasales alternativas a intervalos de un minuto. Muestras de suero y fecales se colectaron de todos los animales en la semana 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 13 y los niveles de anticuerpos IgG, IgM, e IgA de suero especifico de rotavirus producido, asi como los IgG e IgA fecales se determinaron por ensayo ELISA. Los resultados del anticuerpo en el suero se presentan en las Figuras 10 y 11; los resultados del anticuerpo fecal se presentan en la Figura 13. Se usaron muestras de suero de la semana 13 para determinar las subclases de IgGl e IgG2A. Los resultados de la subclase de anticuerpos se presentas en la Figura 12.

Muestras de suero de pre-inmunización diluido al 1:100 y de materias fecales de pre-inmunización con diluciones al 1:2 no mostraron reactividad en el ensayo de ELISA. Los sueros y materias fecales de los controles solo recibieron solución amortiguadora de TLC o CT-CRME29H analizándose en paralelo. Los grupos de control no mostraron anticuerpos de suero o fecales específicos para rotavirus durante el estudio.

Ratones CD-1 de cuatro semanas de edad se inmunizaron tres veces oralmente (n=4) o IN (n=4) en las semanas 0, 2 y 13 como anteriormente, usando la CT-CRME29H como el coadyuvante. Un grupo de control (n=2) solamente recibió CT-CRME29H. Se colectaron muestras de suero y materias fecales en las semanas 0-9, 11-14, 26-28 y los niveles de anticuerpos de suero y fecales específicos para rotavirus se determinaron.

Para la detección y cuantificación de IgG, IgM e IgA en muestras de materia fecal y suero, se recubrieron charolas microt ituladas de cloruro de polivinilo de 96 pozos (Dynex Technologies, Chantilly, VA) con suero de rotavirus anti-SAll de conejillo de indias diluido en solución amortiguadora salina de fosfato (PBS) y se incubó a 37°C por 4 horas, o durante la noche a temperatura ambiente. Las charolas se bloquearon entonces con BLOTTO al 5% (leche en polvo libre de grasa al 5% p/v en PBS) a 37°C durante 2 horas. Muestras de material fecal suspendida se diluyeron 1:1 en BLOTTO al 1% y se agregaron a las charolas. Las charolas se incubaron entonces durante la noche a 4°C, después de lo cual estas se lavaron tres veces con solución amortiguadora TNC más Tween™ 20 al 0.05% (TNC-T). Se diluyó suero hiperinmune anti-factor de rotavirus de conejo en BLOTTO al 1% más suero de conejillo de indias normal al 2.5% (NGPS) y se agregó a las charolas durante 1 hora a 37°C. Las charolas se lavaron entonces tres veces con YNC-T. Se diluyó IgG, IgM e IgA de peroxidasa de rábano picante de gota conjugada anti-conejo (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) en BLOTTO al 1% más NGPS al 2.5% y se agregó a las charolas, que se incubaron por 1 hora a 37°C. Las charolas se lavaron entonces por cuatro veces con TNC-T. Se agregó substrato de TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories), y las reacciones del color producidas se permitieron desarrollarse durante 7 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por la adición de ácido fosfórico ÍM. El OD se determinó a 450 mM usando un lector de microcharola (BIO-TEK instrument, Winooski, VT ) . Las mediciones de 0.1 arriba del blanco se consideraron significantes. Se diluyó virus de almacenamiento SA11 de BLOTTO al 1% y se agregó a las charolas, entonces se incubaron durante la noche a 4°C. Las charolas se lavaron tres veces con TNC-T; posteriormente, muestras de materia fecal se diluyeron 1:1 en BLOTTO al 1% o muestras de suero se diluyeron en serie en BLOTTO al 1% y se aplicaron. Como un control negativo, duplicados de muestra de material fecal se agregaron a un pozo sin recubrimiento de anticuerpo anti-SAll. Las charolas se incubaron por 2 horas a 37°C y entonces se lavaron tres veces con TNC-T. Se diluyó IgG, IgM e IgA de peroxidasa de gota conjugada anti-ratón en BLOTTO al 1% más NGPS al 2.5% y se agregó a los pozos; similarmente se diluyó anticuerpos IgA+IgG+IgM (H+L) de peroxidasa de gota conjugada anti-ratón y se agregaron a los pozos para la detección del anticuerpo previo a la inmunización. Las charolas se incubaron por 1 hora a 37°C y entonces se lavaron 4 veces con TNC-T. Las charolas se desarrollaron como se describe anteriormente para la detección del antigeno por el ensayo ELISA. El protocolo ELISA usado para determinar las subclases de IgG fue una modificación del protocolo descrito que emplea IgGl e IgG2a de rata etiquetada GRP (monoclonal) anti-ratón como los anticuerpos secundarios (Biosource International, Camarillo, CA) .

Un ensayo inmunohistoquimico , descrito por Ishida y colaboradores (49), se modificó y se usó para detectar anticuerpos VP2 y VP6 ant i-rotavirus en el suero del ratón inmunizado con 2/6-VLP. Brevemente, células Sf9 de fase log previas en matraces se sembraron en charolas de cultivo de tejido de 96 pozos a una densidad de 2.5 x 104 células/pozo y entonces se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. De manera subsecuente, las células se infectaron con baculovirus recombinantes que codifican los genes VP2 o VP6 a una multiplicidad de infección de 10, y la infección se permitió que procediera a 28°C por tres dias. El medio de cultivo se descartó entonces, las charolas se secaron en un horno al vacio a temperatura ambiente durante 1 hora y se fijaron con formalina al 10% (solución de formaldehido al 37% conteniendo metanol al 10-15%; Sigma) en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se permeabi 1 i zaron de manera subsecuente con Tritón X-100 al 1% (Sigma) en solución amortiguadora de TNC a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Cada uno del juego de células infectadas que expresaron la proteina de rotavirus designada se expusieron al suero de pre-enfrentamiento o posterior a la inmunización de cada uno de los ratones BALB/c o CD-1, seguido por una inmuno colocación. Las muestras de suero de ratón se diluyeron en serie en PBS con FCS al 5%. Las muestras se agregaron a los pozos y las charolas se incubaron a 37°C durante dos horas. Las charolas se lavaron entonces cuatro veces con PBS. Se agregó anticuerpo IgG, IgM o IgA de peroxidasa de rábano picante de gota etiquetada anti-ratón (Kikergaard & Perry Laboratories) en PBS con FCS al 5%, y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Las células con color se detectaron con substrato de 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) (Sigma) después de lavar los pozos dos veces con PBS. Células Sf9 no infectadas, suero del ratón no inmunizado, y suero previo a la inmunización del ratón inmunizado se usaron como controles negativos. Anticuerpos monoclonales contra la VP6 (7D9, 5E6) y VP2 (BP2) se usaron como controles positivos (50) .

Animales no inmunizados y aquellos inmunizados con la 2/6-VLP se estimularon por alimentación con sonda con IOSD50 del rotavirus EDIM de murina de tipo silvestre (51) en la semana 26 (ratones CD-1) o en la semana 13 (ratones BALB/c) . Las concentraciones de la cepa EDIM se determinaron como dosis de derramamiento 50 (SD50), la dosis requerida para inducir el derramamiento viral fecal en el 50% de los ratones adultos. El virus de estimulación activado por tripsina (100 µl) se administró siguiendo la administración oral de 100 µl de una solución de bicarbonato de sodio al 4% para neutralizar la acidez gástrica. Los virus se diluyeron en un medio M199 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y se activaron con 10 µl de solución concentrada de tripsina (1 mg/ml) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) por ml de solución concentrada viral. Después del enfrentamiento, se colectaron muestras de materia fecal de todos los animales durante nueve dias.

El derramamiento del antigeno de rotavirus en muestras fecales se midió por el ensayo ELISA y se expreso como los valores de densidad óptica netos (OD), esto es, los OD de las muestras fecales posteriores al enfrentamiento menos el OD de la muestra previa al enfrentamiento del mismo ratón. El área bajo la curva de derramamiento para cada uno de los animales se determino y el porcentaje de reducción en el derramamiento de antigeno (PRAS) para cada uno de los animales se calculó comparando el área bajo la curva de cada uno de los animales al área de medio del grupo de control. El medio PRAS se calculó entonces para cada uno de los grupos inmunizados. Solo niveles PRAS de arriba del 50% se consideraron protectores. Los resultados se presentan en la Figura 14.

Se ejecutaron análisis estadísticos con SPSS de la versión 8.0 para Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Pruebas t independientes se usaron para comparar los valores de concentración de medio geométrico previos a la estimulación y para comparar el PRAS entre los grupos. Hasta tres dígitos después del punto decimal se considera para calcular los valores P (0.000=0).

Ejemplo 12 Incremento de la expresión de la CT-CRME29H a través del uso de un promotor inducible de arabinosa .

La constricción de un sistema inducible de arabinosa fue como sigue: cebadores PCR se sintetizaron para amplificar la toxina que codifica la bicistrona de PIIB29H. Cebador #1, CT29 delantero Nhel: 5'- TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATG AGC-3' (SEQ ID NO: 6) ; Cebador #2, CT29 inverso HindIII: 5'- GCAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC-3' (SEQ ID NO:7). El fragmento PCR que codifica el ctxA y el ctxB de la CT-CRME29H se clonó en pBAD18-Cm usando sitios endonucleasa Nhel y HindIII, resultando en la construcción de pCTld. El gen ctxB { V. ch ol era e 2125) de la pCT18 se removió usando Clal y HindIII y se reemplazó con un fragmento similar del plásmido pMGJ142 que se muestra para codificar un gen ctxB de la cepa V. chol era e 569B. La construcción resultante, pPX7490, codifica los genes ctxA y ctxB de la CT-CRME29H. cepa 569B bajo el control del promotor de arabinosa y tiene una secuencia lider LTIIb-B.

Los protocolos para la expresión a gran escala y purificación de la CT-CRME29H se desarrollan y son como sigue: se usaron matraces Fernbach de 3 litros en forma de rizo, con 1 litro por matraz de medio de crecimiento Hy-Soy (por litro: 10 gramos de Hy-Soy; extracto de levadura 12.5; cloruro de sodio 5 g; fosfato de sodio, monobásico 3.3 g; fosfato de sodio, dibásico 13.1 g) . Para la preparación de solución concentrada de inicio, se agregó 20 µg/ml de cloranfenicol y 20 ml de glucosa al 50% estéril a un matraz (concentración de glucosa final al 1%). El matraz se inoculó entonces con 300 µl de DH5a transformado con pPX7490, solución concentrada congelada a -70°C. El matraz se incubó a 37°C con agitación a 200 rpm durante la noche. Todo el medio de crecimiento a usarse al siguiente dia se entibió previamente por agitación durante la noche a 37°C a 200 rpm. Al dia siguiente, se elaboró una dilución 1:40 del cultivo durante la noche en un medio de crecimiento Hy-Soy, suplementado con 20 µg/ml de cloranfenicol y 10 ml de glicerol estéril (concentración final de glicerol al 1%) como una fuente de carbón. Este cultivo creció a 37°C hasta un OD6oo de 4.5-5.5 en matraces Fernbach (o más grande en un bioreactor) . El cultivo se indujo entonces con 20 ml de L-arabinosa (concentración final de 0.5%) y se permitió que se incubara por 3 horas adicionales. Después de un periodo de inducción de 3 horas, la mayoría de la toxina estuvo asociada con la célula. Las células se recogieron por centrifugación, las pelotillas se volvieron a suspender en 10 mM de NaP04, 1 mM de EDTA (pH 7.0) solución amortiguadora al 9% del volumen del cultivo original. La suspensión de célula se rompió mecánicamente a través de un microfluidisador y se centrifugo por 10 minutos a 8500 x g para remover los escombros celulares. La lisata celular (sobrenadante) se clarificó adicionalmente a 42,000 rpm por 1 hora en un rotor 45Ti, 16,000 x gAV. La célula lisata clarificada se llenó en una columna de carboximetil (CM) -cefarosa™ (Pharmacia) equilibrada con 10 mM de NaP04 (pH 7.0) . Se usó aproximadamente 300 ml de CM-Sepharosa™ por 10 litros de volumen de cultivo. La célula lisata se llenó en la columna a una relación de 0.102 cm/minuto (2 ml/minuto) . La columna se lavó extensivamente con 10-15 volúmenes de 10 mM NaP04 (pH 7.0) a 0.255 cm/minuto (5 ml/minuto) para remover los contaminantes. La holotoxina de CT-CRME29H se eluyó con 4 volúmenes de columna de 10 mM de NaP04 (pH 8.3) a 0.255 cm/minuto. La CT-CRME29H- conteniendo el eluido se intercambió en solución amortiguadora por filtración o diálisis contra PBS, y entonces se almacenó a 4°C.

Ejemplo 13 Respuestas inmunes de los ratones de BALB/c inmunizados con plasmido de ADN que codifica la longitud completa de la glicoproteina D del virus del Herpes simple de tipo 2.

Ratones BALB/c hembras de seis hasta ocho semanas de edad se inmunizaron con el plasmido ADN (pADN) que codifica la longitud completa de la glicoproteina D del virus del herpes simple de tipo 2 (gD2) (el pásmido conteniendo el gen gD2 descrito en Pachuk y colaboradores, (40), que se incorpora en la presente para referencia), formulado con bupivacaina al 0.25%, y un coadyuvante con la CT de tipo silvestre, CT-CRME29H o sin coadyuvante. Los animales se les dio una inmunización secundaria tres semanas después de la primera y la eutanasia dos semanas después de la última inyección. El protocolo para la inmunización fue como sigue.

Tabla 33 024 = pADN inducido por el gen gD2; 023 = columna pADN sin el gen gD2 insertado. ID = intradermal; IM = intramuscular. Grupo 4 sirve como un control positivo; grupo 5 sirve como un control negativo.

Se condujo un ensayo de proliferación como sigue: células de bazo 1X105 se cultivaron en presencia o ausencia de 200 ng/ml de proteina gD2 en un medio RPMI completado con FCS al 10%. Después de 4 dias de incubación a 37°C en presencia de C02 al 5%, los cultivos se pulsaron durante la noche con 3[H]. La incorporación de 3[H] se midió en un contador beta. Las cuentas se reportan como SI (Índice de estimulación = cuentas en presencia de una estimulación de antígeno dividida por las cuentas en ausencia de una estimulación de antigeeno) . Los resultados se presentan en la Tabla 34.

Se llevó a cabo un ensayo ELISA para medir la respuesta inmoral especifica del antígeno en suero y lavados vaginales. De manera breve, charolas de fondo plano de 96 pozos (Maxisorb, Nunc) se recubrieron durante la noche a 4°C con proteina gD2 purificada a una concentración de 0.4 µgs/ml. Las charolas se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon con BSA al 4% por 1 hora a temperatura ambiente. 50 microlitros (dilución 1:100) de muestras de suero ó 50 µl de muestra de lavado vaginal se agregaron a la charola. Después de la incubación por 1 hora para el suero y durante la noche a 4°C para el lavado vaginal, las charolas se lavaron con PBS cinco veces, y se agregó Ig de peroxidasa conjugada anti-ratón a una dilución de 1:3000 (Sigma, San Luis MO) y las charolas se incubaron por 1 hora. Las charolas se lavaron con PBS antes de agregar el substrato 3, 3', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMD)-H202 (Biotecx, Houston, TX) . Se permitió que se desarrollara el color por 30 minutos antes de leer a 450 mM en un lector de microcharola Emax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Los resultados se presentan en la Tabla 35 (suero) y Tabla 36 (lavados vaginales) .

Se midió las citoquinas usando un ensayo ELISA estándar como se describe anteriormente. Se recubrieron de manera apropiada charolas para capturar tanto la IL-5 o el interferon gamma de los sobrenadantes de cultivos estimulados por gD2 de 24 horas ó 72 horas de edad respectivamente. Los resultados se presentan en la Tabla 37.

Tabla 34 Respuesta de proliferación celular especifica de gD2 (SI) después de la administración de pADN para gD2 HSV con CT o CT-CRME29H- Tabla 35 Respuesta humoral especifica de gD2 (ng/ml) después de la administración de pADN gD2 HSV con CT o CT-CRME29H en suero.

Tabla 36 Respuestas humorales especificas gD2 (ng/ml) después de la administración de pADN gD2 HSV con CT o CT-CRME29H en lavados vaginales.

Tabla 37 Perfil del ensayo ELISA citoquino especifico de gD2 (pg/ml) Bibliografía 1. Mekalanos, J.J., y colaboradores, Nature , 306, 551-557 (1983) . 2. Gilí, D.M., Biochemistry, 15, 1242-1248 (1976). 3. Cuatrecasas, P., Biochemistry, 12 , 3558-3566 (1973) . 4. Kassis, S., y colaboradores, J. Biol . Chem. , 257, 12148-12152 (1982). 5. Mekalanos, J.J., y colaboradores, J. Biol . Chem. , 254, 5855-5861 (1979). 6. Gilí, D.M., and Meren, R., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 75, 3050-3054 (1978) . 7. Welsh, C.F., y colaboradores "ADP-Ribosylation Factors: A Family of Guanine Nucleotide-Binding Proteins that Activate Cholera Toxin and Regúlate Vesicular Transport", páginas 257-280 en Handbook of Natural Toxins: Bacterial Toxine and Virulence Factors in Disease Vol. 8 (Moss, JJ , y colaboradores, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY (1995) ) . 8. Hanson, L.A., Intl. Arch. Allergy Appl. Imptunol. , 18, 241-267 (1961). 9. Tomasi, T.B., and Zigelbaum, S., JJ Clin . Invest. , 42', 1552-1560 ((1963). 10. Tomasi, T.B., y colaboradores, J . Expt 1. Med . , 121, 101-124 (1965) . 11. Brandtzaeg, P., and Baklein, K., Scand . J . Gastroenterol . , 11, (Suppl. 36), 1-45 (1976). 12. Brandtzaeg, P., "Immune Functions of Human Nasal Mucosa and Tonsils in Health and Disease", página 28 et seq. In Immunology of the Lung and Upper Respiratory Tract ( Bienenstock, JJ , Ed., McGraw-Hill, New York, NY (1984)). 13. Solari, R., and Kraehenbuhl, J-P, Immunol . Today, 6_, 17-20 (1985). 14. Crabbe, P.A., y colaboradores, J. Expt 1. Med. , 130, 723-744 (1969) . 15. Bazin, H., y colaboradores., J. Immunol . , 105 , 1049-1051 (1970) . 16. Craig, S.W., and Cebra, J.J., J. Exptl . Med. , 134, 188-200 (1971) . 17. Mestecky, J., y colaboradores, J . Clin . Invest. , 61, 731-737 (1978) . 18. Elmon, C.O., and Ealding, W., J. Immunol . , 132, 2736-2741 (1984) . 19. Maneval, D.R., y coOlaboradores , J . Tissue Cult. Methods, 6_, 85-90 (1981) . 20. Guidry, J.J. y colaboradores, Infect . Immun . , 65, 4943-4950 (1997) . 21. Patente de Estados Unidos numero 5,601,831. 22. Patente de Estados Unidos numero 5,108,744. 23. Solicitud de Patente internacional numero WO 96/05858. 24. Hu, L.T., y colaboradores, Infect . Immun . , 60 , 2657-2666 (1992) . 25. solicitud de Patente Internacional numero PCT/US99/09486, presentado el 29 de Abril de 1999. 26. Solicitud de Patente Europea numero 449,958. 27. Walsh, E.E., y colaboradores, Infect . Immun . , 43, 756-758 (1984) . 28. Crawford, S.E., y colaboradores, J. Virology, 68, 5945-5952 (1994) . 29. Lee, A.J., y colaboradores, Gastroenterology, 112, 1386-1397 (1997) . 30. Snider, D.P., y colaboradores, J. Immunol. 153, 647-657 (1994) . 31. Tamurs, S.Y., y colaboradores, Vaccine, 12 , 1238-1240 (1994) . 32. Van der Akker, F., y colaboradores, Structure, 4_, 665-678 (1996) . 33. Rudin A., y colaboradores, Infect . Immun . , 66, 3390-3396 (1998) . 34. O'Neal, C.N., y colaboradores, J. Virology, 71, 8707-8717 (1997) . 35. O'Neal C.M., y colaboradores, J. Virology, 72 , 3390-3393 (1998) . 36. Solicitud de Patente Internacional numero WO 93/13202. 37. Solicitud de Patente Internacional numero WO 98/42375. 38. Solicitud de Patente Internacional numero WO 98/20734. 39. Patente de Estados Unidos numero 5,593,972. 40. Pachuk, C., y colaboradores, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 59, 1024-1031 (1997) . 41. Jobling, M.G., and Holmes, R.K., Infect . Immun. , 60, 4915-4924 (1992) . 42. Jobling, M.G., and Holmes, R.K., Mol . Microbiol . , 5, 1755-1767 (1991) . 43. Kunkel, T.A., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 82, 488-492 (1985) . 44. Sanger, F., y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977) . 45. Tartof, K.D., and Hobbs, C.A., Focus, 9 , 12 (1987) . 46. Karasic, R., y colaboradores, Ped . Inf . Dis . J. , 6 (Suppl, ) , S62-65 (1988) . 47. Hansen, E.J. y colaboradores, Infect . Immun . , 56, 182-190 (1988) . 48. Lae mli, 'U.K., Nature (London) , 227, 680-685 (1970) . 49. Ishida, S.I., y colaboradores, J. Clin . Microbiol . , 34, 1694-1700 (1996) .. 50. Burns J.W., y colaboradores, Science, 272 , 104-107 ( 1996) . 51. McNeal, N.M., and Ward, E.L., Virology, 211, 474-480 (1995) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

LISTADO DE SECUENCIA <110> American Cyanamid Coppany <120> Holotoxina de cólera mutante como un coadyuvante <130> 33383-00 PCT <1.0> 60/102,430 <141> 1998-09-30 <160> "> <170> Pa-centln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Vibrio cholerae <400> 1 aagttatata aggcagattc 20 <210> 2 <211> 18 <212> ADN <213> Vibrio cholerae <400> 2 cagattctaa acctcctg 18 <210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Vibrio cholerae <400> 3 gacagagtna gtactttgac cg 22 <210> 4 <211> 22 <212> ADN :213> Vibrio cholerae <400> 4 cagatgakca agakgtttct ge 22 <210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Vibrio cholerae <400> 5 cagatgakca agakgtttct ge <210> 6 <211> 32 <212> ADN <213> Vibrio cholerae <400> 6 ttttttgggc tagcatggag gaaaagatga ge <210> 7 <211> 26 <212> ADN <213> Vibrio cholerae <400> 7 26 gcaggtcgaa gcttgcatgt ttgggc

Claims

Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. Una composición antigénica que comprende un antigeno seleccionado de una bacteria patogénica, virus, hongo, o parásito y una cantidad coadyuvante efectiva de una holotoxina de cólera mutante, caracterizada porque la holotoxina tiene una toxicidad reducida comparada con una holotoxina de cólera de tipo silvestre y tiene una substitución en la posición 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera, en donde el residuo del ácido glutámico se reemplaza por un aminoácido diferente al ácido aspártico, y en donde la holotoxina aumenta la respuesta inmune en un huésped vertebrado para el antigeno.

2. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada por que el aminoácido en la posición 29 es histidina.

3. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antigeno se selecciona de proteina de membrana exterior P4 de Haemophilus influenzae, la proteina de membrana exterior P6 de Haemophilus influenzae, la proteina de penetración y adherencia de Haemophilus influenzae (Haps), la proteina de ureaza de Helicobacter Pylory, la pilina de clase 1 recombinante de grupo B de Neisseria Meningitidis (rpilina), la proteina de membrana exterior de clase 1 de grupo B de Neisseria Meningitidis (PorA), la proteina de fusión de virus sintilial respiratorio, una particula similar al virus de rotavirus o al virus del herpe simple (HSV) de tipo 2 de glicoproteina D (gD2) .

4. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada por que además comprende un diluyente o portador.

5. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada por que al menos una mutación adicional se hace a la subunidad A de la holotoxina de cólera en una posición diferente a la del aminoácido 29.

6. Un método para incrementar la habilidad de una composición antigénica que contienen un antigeno seleccionado de una bacteria patogénica, virus, hongo o parásito para obtener la respuesta inmune de un huésped vertebrado, caracterizado porque comprende administrar a dicho huésped una composición antigénica de conformidad con la reivindicación 1.

7. el método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque al antigeno seleccionado en la composición antigénica es proteina de membrana exterior P4 de Haemophilus influenzae, la proteina de membrana exterior P6 de Haemophilus influenzae, la proteina de penetración y adherencia de Haemophilus influenzae (Haps), la proteina de ureaza de Helicobacter Pylory, la pilina de clase 1 recombinante de grupo B de Neisseria Meningitidis (rpilina), la proteina de membrana exterior de clase 1 de grupo B de Neisseria Meningitidis (PorA), la proteina de fusión de virus sintilial respiratorio, una particula similar al virus de rotavirus o al virus del herpe simple (HSV) de tipo 2 de glicoproteina D (gD2) .

8. Un plásmido que contiene una secuencia ADN aislada y purificada, caracterizada porque comprende una secuencia ADN que codifica una holotoxina de cólera mutante inmunogénica que tiene una substitución en la posición 29 de la subunidad A de la holotoxina de cólera, en donde el residuo de ácido glutámico se reemplaza por un aminoácido diferente al ácido aspártico, y en donde la secuencia ADN se enlaza operativamente a un promotor inducible de arabinosa.

9. Una célula huésped transformada, trasducida o transfectada con el plásmido de conformidad con la reivindicación 8.

10. Un método para producir una holotoxina de cólera mutante inmunogénica, caracterizado porque la holotoxina de cólera tiene una toxicidad reducida comparada con una holotoxina de cólera de tipo silvestre y tiene una substitución en la posición 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera, en donde el residuo del ácido glutámico se reemplaza por un aminoácido diferente al ácido aspártico, y que comprende transformar, trasducir o transfectar una célula huésped con el plásmido de conformidad con la reivindicación 8 y cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteina destoxi ficada inmunogenica recombinante por la célula huésped.

11. El uso de una cantidad coadyuvante efectiva de una holotoxina de cólera mutante, en donde la holotoxina tienen una toxicidad reducida comparada con una holotoxina de cólera de tipo silvestre y tiene una substitución en la posición 29 de la sub-unidad A de la holotoxina de cólera, en donde el residuo del ácido glutámico se reemplaza por un aminoácido diferente al ácido aspártico, en combinación con un antigeno seleccionado de una bacteria patogénica, virus, hongo o parásito, para preparar una composición antigénica en donde dicha holotoxina aumenta la respuesta inmune en un huésped vertebrado para el antigeno .