ES2293735T3 - Holotoxina del colera mutante como coadyuvante. - Google Patents

Holotoxina del colera mutante como coadyuvante. Download PDF

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Abstract

Una composición antigénica que comprende un antígeno seleccionado de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico y una cantidad coadyuvante eficaz de una holotoxina mutante del cólera, en la cual la holotoxina tiene toxicidad reducida, comparada con la holotoxina del cólera de tipo salvaje y tiene una sustitución en la posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera, en la cual el residuo de ácido glutámico se sustituye por histidina; y en la cual dicha holotoxina potencia la respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado a dicho antígeno.

Description

Holotoxina del cólera mutante como coadyuvante.
Campo de la invención
Esta Invención se refiere al uso de una holotoxina mutante inmunogénica del cólera que tiene toxicidad reducida comparada con una toxina del cólera de tipo salvaje y una sustitución distinta del ácido aspártico para el ácido glutámico en posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera en forma de coadyuvante para potenciar la respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado a un antígeno seleccionado.
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario usa diversos mecanismos para atacar los patógenos. Sin embargo, no todos estos mecanismos se activan necesariamente después de la inmunización. La inmunidad protectora inducida por la inmunización depende de la capacidad de la vacuna para provocar la respuesta inmunitaria apropiada para resistir o eliminar el patógeno. Dependiendo del patógeno, este puede requerir una respuesta inmunitaria mediada por célula y/o humoral.
Se conoce una sustancia que potencia la respuesta inmunitaria cuando se administra junto con un inmunógeno o antígeno como coadyuvante.
La bacteria Gram-negativa Vibrio cholerae (V. cholerae) es el agente causante de la enfermedad gastrointestinal del cólera. La diarrea causada por V. cholerae es debida a la secreción de la toxina del cólera (CT).
CT comprende una única subunidad A (CT-A), que es responsable de la actividad enzimática de la toxina, y cinco subunidades B idénticas (CT-B), que están implicadas en la unión de la toxina a las células epiteliales intestinales, así como otras células que contienen gangliósido GM_{1} sobre su superficie. Juntas, las subunidades CT-A y CT-B comprenden una holotoxina. Se ha descrito la secuencia de CT (Entrada 1 de la Bibliografía).
CT es un complejo hexaheteromérico constituido por un polipéptido A y cinco polipéptidos B idénticos (2). Se requiere el pentámero B para unirse al gangliósido GM_{1} receptor de la superficie celular (3). La subunidad A se puede escindir proteolíticamente dentro de un único bucle unido por disulfido C187 y C199 para producir el polipéptido A1 enzimáticamente activo (4) y el polipéptido menor A2, que une el fragmento A1 al pentámero B (5). Al entrar dentro de los enterocitos, CT-A1 ADP-ribosila una proteína G reguladora (Gs\alpha), que conduce a activación constitutiva de la adenilatociclasa, mayor concentración intracelular de AMPc, y secreción de fluido y electrolitos dentro del lumen del intestino delgado (6). La actividad in vitro de ADP-ribosiltransferasa de CT se estimula mediante la presencia de proteínas accesorias denominadas ARF (7), proteínas menores de unión a GTP conocidas por estar implicadas en el tráfico vesicular dentro de la célula eucariótica.
La necesidad de procedimientos efectivos de inmunización es particularmente aguda respecto de los organismos infecciosos que causan infecciones agudas en, o consiguen entrar en el cuerpo a través de, las superficies gastrointestinal, pulmonar, nasofaríngea o genitourinaria. Estas áreas son bañadas en mucosidad, que contiene inmunoglobulinas constituidas en gran medida por IgA secretora (8, 9, 10). Este anticuerpo se deriva de numerosas células plasmáticas productoras de IgA que infiltran las regiones de la lámina propia que se extiende debajo de estas membranas mucosales (11, 12). IgA se transporta específicamente a la superficie luminal a través de la acción del componente secretor (13).
Sin embargo, los regímenes de inmunización parenteral suelen ser ineficaces en la inducción de las respuestas de IgA secretora. La inmunidad secretora se lleva a cabo la mayoría de las veces a través de la inmunización directa de tejidos linfoides asociados a la mucosa. Después de su inducción en un sitio de la mucosa, los precursores de las células plasmáticas productoras de IgA extravasan y diseminan a diversos tejidos de las mucosas donde se produce la diferenciación final a la síntesis de IgA de alta velocidad (14, 15, 16). Extensos estudios han demostrado que la viabilidad de la inmunización de la mucosa para inducir este sistema inmunitario común de las mucosas (17), pero con raras excepciones las grandes dosis de antígeno requeridas para conseguir la inmunización efectiva han hecho que este enfoque sea poco práctico para los antígenos purificados de vacunas. Entre las estrategias investigadas para solucionar este problema se encuentra el uso de coadyuvantes de la mucosa. Se sabe que CT es uno de los coadyuvantes más potentes, y que la coadministración de CT con un antígeno no relacionado da como resultado la inducción de respuestas concurrentes de anticuerpos circulantes y de la mucosa al antígeno (18). De este modo, CT puede actuar como un coadyuvante.
La Publicación Internacional de Patente Nº WO 97/29771 se refiere generalmente a una proteína inmunogénica detoxificada que comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina del cólera en la cual al menos un aminoácido se sustituye con otro aminoácido, y resume las publicaciones anteriores, que describen mutantes de la toxina del cólera en posiciones 7, 9, 11, 44, 53, 54, 61, 63, 70, 97, 104, 106, 107, 110, 112, 114, 127, 146 o 192, un doble mutante en posiciones 63 y 192 y truncación en 180. Los mutantes se caracterizan porque en forma purificada, la proteína inmunogénica detoxificada exhibe una toxicidad residual 10.000 veces inferior a su equivalente producida de manera natural. Esta publicación ejemplifica un mutante en posición 106 de CT-A, preferiblemente una mutación de prolina a serina (P a S).
La Publicación Internacional de Patente Nº WO 97/02348 se refiere a mutantes detoxificados de la toxina del cólera que demuestran dobles sustituciones de aminoácidos a serina en posición 63 (s63) y arginina en posición 192 (R192), preferiblemente lisina en posición 63 (k63) con asparagina en posición 192 (n192) o glicina en posición 192 (G192). Esta publicación resume también las referencias de la técnica anterior que describen otros mutantes de la toxina del cólera que tienen sustituciones de aminoácidos en posiciones 7, 9, 11, 44, 54, 54, 61, 63, 70, 97, 104, 106, 107, 110, 112, 114, 122, 127, 146 o 192 y una truncación en posición 180.
Yamamoto S. y col 1997 J. Exp. Med, 185 (7): 1203-1209 se refiere a dos mutantes de la subunidad A de la toxina del cólera: uno que tiene una sustitución de aminoácidos en posición 61 y el otro en posición 112.
Glineur y col, Infection and Immunity 1994 62 (10): 4176-85 se refiere a dos mutantes de la subunidad A de la toxina del cólera: uno que tiene una deleción de aminoácidos en posición 29 (se suprime el ácido glutámico producido de manera natural) y el otro mutante sustituye el ácido glutámico producido de manera natural en posición 29 con ácido aspártico (E29D). Glineur demuestra que el mutante de deleción mostraba actividad ADP-ribosiltransferasa fuertemente reducida y, ningún cambio morfológico de las células PC12, mientras el mutante E29D se mantuvo activo como CT-A de tipo salvaje.
Sería preferible usar como coadyuvante una forma de la holotoxina CT que tiene toxicidad reducida para de este modo reducir los síntomas no deseables de diarrea causados por CT de tipo salvaje. De este modo, existe una necesidad de identificar una holotoxina de CT mutante que puede potenciar la respuesta inmunitaria aunque reduciendo la toxicidad de la holotoxina de CT.
Sumario de la invención
Por lo tanto, un objeto de esta invención es la utilización de una forma mutante de la holotoxina de CT que tiene toxicidad reducida comparada con una CT de tipo salvaje como coadyuvante en una composición antigénica para potenciar la respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado a un antígeno seleccionado a partir de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico.
Los objetos de la invención se llevan a cabo con una holotoxina mutante del cólera que presenta una mutación puntual en el aminoácido 29 de la subunidad A, en la cual el residuo de ácido glutámico se sustituye por histidina. La CT mutada (también denominada CR-CRM) es útil como coadyuvante en una composición antigénica para potenciar la respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado a un antígeno seleccionado a partir de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico. La CT mutante se produce por mutagénesis sitio-dirigida del ADN que codifica la CT de tipo salvaje usando técnicas convencionales. La composición antigénica puede, además, comprender un diluyente o vehículo.
La invención se dirige también a procedimientos para incrementar la capacidad de una composición antigénica que contiene un antígeno seleccionado a partir de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico de provocar la respuesta inmunitaria de un huésped vertebrado incluyendo una cantidad coadyuvante eficaz de una holotoxina mutante de cólera, en la cual la holotoxina tiene toxicidad reducida comparada con la CT de tipo salvaje y el ácido glutámico en posición 29 de aminoácido de la subunidad A de la holotoxina del cólera se sustituye por histidina.
La invención se refiere, además, a plásmidos que contienen secuencias de ADN aislado y purificado que comprenden secuencias de ADN que codifican una holotoxina mutante inmunogénica del cólera que tiene una sustitución de histidina en posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera, y en las cuales tal secuencia de ADN se une operativamente a un promotor inducible por arabinosa, así como a células huésped apropiadas transformadas, transducidas o transfectas con tales plásmidos. La holotoxina inmunogénica mutante del cólera se produce transformando, transduciendo o transfectando una célula huésped con un plásmido descrito anteriormente y cultivando la célula huésped en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína recombinante inmunogénica detoxificada por la célula huésped.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa la capacidad de CT-CRM para unirse a gangliósido GM_{1}. Cada CT-CRM se diluyó tres veces en una concentración inicial de 3 \mug/ml y se ensayó por duplicado. La capacidad de unión se expresó como la absorbencia media a 410 nm para cada dilución.
La figura 2 representa la reducción en la colonización nasal en Log_{10} cfu medio por vía nasal en ratones inmunizados por vía intranasal (n = 10 por grupo) con pilina recombinante de meningococo (rpilina) con o sin coadyuvante CT-CRM_{E29H}, o ratones no inmunizados, donde se inoculó entonces cada grupo con la cepa bacteriana de meningococo homóloga.
La figura 3 representa la reducción en la colonización nasal en Log_{10} cfu medio por vía nasal en ratones inmunizados por vía intranasal (n = 5 por grupo) con rpilina de meningococo con o sin coadyuvante CT-CRM_{E29H}, proteína de membrana exterior de meningococo de clase 1 (Por A) con ratones no inmunizados, donde se inoculó entonces cada grupo con la cepa bacteriana de meningococo homóloga.
La figura 4 representa la reducción en la colonización nasal en Log_{10} cfu medio de la cepa de meningococo 870227 por vía nasal en ratones inmunizados por vía intranasal (n = 10 por grupo) con rpilina de meningococo, PorA de la cepa de meningococo H355, PorA de la cepa de meningococo 870227, la totalidad de las células de la cepa de meningococo 870227 inactivada por calor o KLH, cada una con el coadyuvante CT-CRM_{E29H}, donde se inoculó entonces cada grupo con la cepa bacteriana de meningococo heteróloga (870227).
La figura 5 representa la reducción en la colonización nasal en Log_{10} cfu medio de la cepa de meningococo 870227 por vía nasal en ratones inmunizados por vía subcutánea (n = 10 por grupo) con PorA de la cepa de meningococo H355, PorA con el coadyuvante CT-CRM_{E29H} o MPL^{TM}, KLH con coadyuvante MPL^{TM}, o células enteras de la cepa de meningococo 870227 inactivada por calor con MPL^{TM}, donde se inoculó entonces cada grupo con la cepa bacteriana de meningococo heteróloga (870227).
La figura 6 representa un primer ensayo de la actividad citolítica dependiente de antígeno respecto de las células diana infectadas por el virus sincicial respiratorio (RSV) como el porcentaje de lisis celular respecto de la relación inductor: objetivo.
La figura 7 representa un primer ensayo de la protección de pulmón de ratón para inocular RSV mediante inmunización con proteína F más coadyuvante, donde el valor cuantitativo del virus de pulmón se mide como Log_{10} PFU por gramo.
La figura 8 representa un segundo ensayo de la actividad citolítica dependiente de antígeno respecto de las células diana infectadas por RSV como el porcentaje de lisis celular respecto de la relación inductor: objetivo.
La figura 9 representa un segundo ensayo de la protección de pulmón de ratón para inocular RSV mediante inmunización con proteína F más coadyuvante, donde el valor cuantitativo del virus de pulmón se mide como Log_{10} PFU por gramo.
La figura 10 representa respuestas de anticuerpos de suero específicos de rotavirus en ratones BALB/c inmunizados por vía intranasal con VLP de 2/6 con o sin coadyuvante CT-CRM_{E29H}. Se inmunizaron los ratones BALB/c con 2/6-0VLP con (n=4) o sin (n=5=) CT-CRM_{E29H} y se midieron los niveles de IgG (Figura 10A), IgM (figura 10B) e IgA) (Figura 10C) específico de rotavirus. Se muestran las desviaciones estándar.
La figura 11 representa respuestas de anticuerpos de suero específicos de rotavirus en ratones BALB/c consanguíneos inmunizados con 2/6-VLP. Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c por vía oral (cuadrado, n=4) por vía intranasal (rombo, n=5) o en combinación (vía intranasal más vía oral, círculo, n=4) con 2/6-VLP más CT-CRM_{E29H} en la semana 0 y la semana 2. Se recogieron muestras de suero, y se determinaron los niveles de IgG (Figura 11A), IgM (figura 11B) e IgA (Figura 11C) en suero para cada ratón por ELISA. Se calcularon las valoraciones medias geométricas (GMT) para cada grupo y se pusieron en relación con las semanas de postinmunización.
La figura 12 representa subclases de anticuerpos IgG1 e IgG2 en ratones BALB/c. Se usaron sueros preinoculados de los ratones BALB/c inmunizados oralmente o IN, con 2/6-partículas similares a virus de rotavirus (VPL) más CT-CRM_{E29H}, para determinar subclases de IgG. Se muestran las desviaciones estándar.
La figura 13 representa respuestas de anticuerpos intestinales específicas de rotavirus en ratones BALB/c consanguíneos inmunizados con 2/6-VLP. Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c con 2/6-VLP más CT-CRM_{E29H} como se ha descrito para la figura 11, y se midieron los niveles de IgA (figura 13A) e IgG (Figura 13B) intestinal específicos de rotavirus. No se detectó IgM intestinal específico de rotavirus en ningún ratón.
La figura 14 representa la protección de los ratones BALB/c inmunizados con 2/6-VLP y los ratones CD-1 a continuación inoculados con rotavirus murino. La figura 14A describe una comparación de reducción porcentual en la presencia de antígeno (PRAS) entre los ratones inmunizados con 2/6-VLP con (n=5) o sin (n=4= CT-CRM_{E29H}. Se calculó la PRAS para cada ratón (\bullet) y la media de cada grupo (-). La figura 14B representa los grupos de ratones BALB/c inmunizados con 2/6-VLP más CT-CRN_{E29H} por diferentes vías como se ha mostrado, y se determinaron los niveles de protección tal como se ha descrito anteriormente. La figura 14C representa grupos de ratones CD-1 sin consanguinidad inmunizados con 2/6-VLP más CT-CRN_{E29H} por vía oral e intranasal como se ha descrito anteriormente. En la semana 26, se inocularon los ratones inmunizados y de control y se calculó la PRAS como se ha descrito anteriormente. En el grupo oral (n-4), un ratón murió antes de la inoculación (n=3 para protección).
Descripción detallada de la invención
En la presente memoria descriptiva se describe la utilidad de las formas mutantes de CT como coadyuvantes para composiciones antigénicas. Se generó un conjunto de clones mutantes de CT (CT-CRM) en E- coli. Los datos indican que el CT-CRN con mayores propiedades coadyuvantes es el mutante con una sustitución no conservativa de aminoácidos (ácido glutámico a histidina) en posición 29 en la subunidad A (CT-CRM_{E29H}). Los datos acumulativos demuestran que CT-CRM_{E29H} es una holotoxina y es menos tóxica que CT de tipo salvaje. De manera significativa, CT-CRM_{E29H} puede aumentar las respuestas inmunitarias de la mucosa y sistémicas después de la administración intragástrica (IG) o intranasal (IN) de antígenos dispares de vacuna. Estos antígenos de vacunas proceden de patógenos bacterianos o virales. Los resultados en los modelos murinos de Helicobacter felis, infección por rotavirus y virus sincicial respiratorio (RSV) indican que las respuestas inmunitarias facilitadas por inmunización intragástrica o intranasal con vacuna preparada con CT-CRM_{E29H} son protectoras. Los datos indican que CT-CRM_{E29H} es al menos tan activo como coadyuvante como CT de tipo salvaje. Incluso en presencia de respuestas inmunitarias anti-CT preexistentes, CT-CRM_{E29H} puede servir de coadyuvante de la mucosa.
La CT-A mutante retuvo su capacidad para unirse con CT-B para formar una holotoxina que se asemeja a CT de tipo salvaje en su coadyuvanticidad, pero muestra toxicidad reducida comparada con un CT- de tipo salvaje. Las subunidades B pueden tener sus secuencias nativas o pueden ellas mismas mutar.
El nivel reducido resultante de toxicidad proporciona una CT modificada para su uso como coadyuvante. La CT inmunogénica mutante según la presente invención muestra un resto de toxicidad reducida y coadyuvanticidad reducida, de manera que la proteína funciona como coadyuvante mientras es tolerada de manera segura por el huésped vertebrado inmunizado con la composición antigénica.
Las composiciones antigénicas de la presente invención modulan la respuesta inmunitaria mejorando la respuesta de anticuerpos del huésped vertebrado y la inmunidad mediada por células después de la administración de una composición antigénica que comprende un antígeno seleccionado entre una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico y una cantidad coadyuvante eficaz de una CT mutante, donde la CT tiene toxicidad reducida comparada con una CT de tipo salvaje y el ácido glutámico en posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera se sustituye por histidina.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "la holotoxina tiene toxicidad reducida" significa que el mutante CT-CRM, tal como el mutante CT-CRM_{E29H}, muestra una toxicidad sustancialmente inferior por unidad de proteína de toxina purificada comparado con la CT de tipo salvaje, que permite que el mutante se use como coadyuvante en una composición antigénica sin causar efectos laterales importantes.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "cantidad coadyuvante eficaz" significa una dosis del mutante CT-CRM, tal como el mutante CT-CRM_{E29H}, que es apropiada para provocar una mayor respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado. La dosificación particular dependerá de la edad, el peso y la afección médica del huésped, así como del procedimiento de administración. Los expertos en la técnica determinan fácilmente las dosis apropiadas.
Se generaron cinco CT-CRM como se describe en el siguiente Ejemplo 1 con las siguientes mutaciones en la subunidad A:
100
A continuación se evaluaron los efectos fenotípicos de estas mutaciones sobre la estructura y la función de CT.
Las variantes CT-A' R7K, E29H, E110D y E112D pudieron reunirse en la holotoxina inmunoreactiva como se determina mediante un ensayo de unión por gangliósido GM_{1} (Figura 1). Sin embargo, una parte de R11K purificada no parecía ser una holotoxina cuando se ensayó con los anticuerpos policlonales descritos en el Ejemplo 2.
Cada variante de holotoxina se ensayó en un ensayo de células tumorales suprarrenales (19) para determinar su toxicidad residual comparada con la holotoxina CT de tipo salvaje. Los resultados presentados en la Tabla 2 demostraron que CT-CRM_{E29H} y CT-B comercial (Sigma) tuvieron una toxicidad residual del 1,2%. La toxicidad residual del 1,2% asociada con CT-B comercial fue muy probablemente debida a la contaminación de la subunidad A (aproximadamente el 0,5%). La toxicidad residual de las restantes CT-CRM con mutaciones en las posiciones de aminoácidos 7, 11, 110 o 112 fueron inferiores o iguales al 0,4%.
Se sometió a ensayo CT-CRM_{E29H} en el ensayo de peso del intestino de ratón de la patente (20) para evaluar la acumulación de fluido intestinal como una medición in vivo de toxicidad. Los resultados presentados en la Tabla 3 demostraron que CT-CRM_{E29H} era significativamente menos activo en la estimulación de un aumento de la acumulación de fluido dentro del aparato intestinal de los ratones que la CT- de tipo activo.
Se comparó también cada CT-CRM con CT en un ensayo de actividad de ADP-ribosiltransferasa. Los resultados correspondieron generalmente con los generados en el ensayo de células suprarrenales Y-1 y sugerían que la mutación de la subunidad A1 daba como resultado actividad de ADP-ribosiltransferasa disminuida por las diversas CT-CRM cuando se compara con CT de tipo salvaje (Tabla 4). El mutante con la mayor actividad enzimática pareció ser CT-CRM_{E29H} Esta actividad fue aproximadamente del 10% de la de la CT de tipo salvaje.
La tripsinización a 37ºC de CT-CRM_{E29H} causó la escisión de CT-A en los fragmentos A1 y A2 de manera indistinguible del tratamiento de CT de tipo salvaje basada en los análisis Western blot. Esto proporciona, además la prueba de que la estructura de CT-CRM_{E29H} es similar a la de la CT de tipo salvaje.
Las diferencias aparentes en la actividad de CT-CRM_{E29H} en los ensayos de células tumorales suprarrenales Y-1 y de actividad de ADP-ribosilación son debidas a la activación de tripsina de la holotoxina mutante en el último ensayo. De este modo, la carencia de escisión de CT-A en las subunidades A1 y A2 debida a la actividad de proteasa reducida en E. coli contribuye a la atenuación de CT-CRM_{E29H} expresada por E-coli. Colectivamente, los datos recolectados muestran que CT-CRM_{E29H} es una holotoxina que se une a gangliósido GM_{1} y es significativamente inferior que la CT de tipo salvaje.
Se llevaron a cabo una serie de estudios para evaluar la eficacia de CT-CRM_{E29H} como coadyuvante de mucosa para composiciones que contienen antígenos bacterianos o virales identificados como candidatos a vacuna como sigue: (1) proteína P4 recombinante de Haemophilus influenzae no-tipificable (NTHi), también conocida como proteína "e" (rP4) (21), la proteína P6 de NTHi recombinante (rP6) (22), y la proteína (23) purificada y nativa de adherencia y penetración de Haemophilus influenzae (Haps); (2) proteína de Ureasa recombinante de Helicobacter pylori (rUreasa) (24); (3) Proteína de pilina de clase 1 recombinante de Grupo B de Neisseria meningitidis (25) y proteína de membrana exterior de clase 1 de grupo B de Neisseria meningitidis (26); (4) proteína de fusión nativa purificada del virus sincicial respiratorio (RSV F) (27); y (5) 2/6-partículas similares a virus de rotavirus (28).
Se comparó CT-CRM_{E29H} con otros cuatro mutantes de CT y CT de tipo salvaje como coadyuvante para las proteínas NTHi rP4 y rP6. Los resultados indicaron que las cinco CT-CRN diferentes aumentaron la capacidad de las proteínas rP4 y rP6 para provocar respuestas inmunitarias humorales sistémicas (Tablas 5 y 6). Por ejemplo, dos semanas después de la inmunización IN terciaria, las valoraciones de anticuerpos IgC anti-rp4 de los ratones inmunizados con proteínas rP4 y rP6 formuladas con CT-CRM_{E29H} o CT-CRM_{E110D} fueron 40 veces superiores a las de los ratones inmunizados con las proteínas recombinantes solamente en PBS (Tabla 5). Las valoraciones de anticuerpos de los ratones a los que se administró las proteínas recombinantes y la holotoxina CT de tipo salvaje fueron 20 veces superiores.
Las valoraciones de anticuerpos anti-rP4 de los ratones inmunizados con CT-CRM_{R11K} fueron 10 veces superiores.
Se observaron diferencias incluso más importantes cuando se examinaron los sueros para las valoraciones de anticuerpo P6 antinativos (Tabla 6). Dos semanas después de la inmunización secundaria IN las valoraciones de anticuerpos P6 antinativos de los sueros de los ratones inmunizados con vacunas formuladas con CT-CRM_{E29H} o CT-CRM_{E110D} fueron más de 30 veces superiores a las de los ratones inmunizados con rP6 más PBS. En comparación, la vacuna preparada con valoraciones de anticuerpos que fueron 90 veces superiores a los generados por formulación preparada con PBS. Las valoraciones de anticuerpos P6 antinativos de los ratones inmunizados con las preparaciones CT-CRM_{E112D,} CT-CRM_{R7K0} o CT-CRM_{R11K} sólo fueron dos o tres veces superiores a las de los receptores inmunizados con rP4 más rP6 formulados solamente con PBS.
Un examen de los anticuerpos específicos de proteína en las secreciones de mucosa dos semanas después de la inmunización terciaria indicó, además, que las CT-CRM_{0} facilitaron la generación de respuestas inmunitarias locales contra la proteína rP4. Además, las valoraciones de anticuerpos anti-rP4 fueron comparables a las inducidas por CR de tipo salvaje (Tabla 7). No se detectaron valoraciones locales de anticuerpos contra la proteína P6 nativa (datos no mostrados). De este modo, los datos cuando se toman juntos sugieren que las CT mutantes más propicias para la generación tanto de repuestas de anticuerpos sistémicos como locales contra las proteínas rP4 y rP5 fueron las CT-CRM que contenían una mutación en posición 20 o en posición 110.
Se llevo a cabo un estudio adicional para confirmar el potencial de CT-CRM_{E29H} como coadyuvante y determinar la dosis apropiada para la inmunización IN (Tabla 8). Los resultados indicaron que 1 \mug de CT-CRM_{E29H} facilitó las mayores respuestas inmunitarias humorales sistémicas y locales contra la proteína rP4. Cuando se incrementó la dosis de CT-CRM_{E29H} de 1 a 10 o 30 \mug por dosis, los datos sugirieron la disminución tanto de las respuestas inmunitarias sistémicas como de la mucosa. Por ejemplo, las valoraciones de anticuerpos IgG anti-P4 de los sueros de los ratones inmunizados con 10 \mug de CT-CRM_{E29H} fueron una séptima parte de las de los ratones inmunizados con 1 \mug de CT-CRM_{E29H} el día 48 del estudio (Tabla 8). Además, las valoraciones de anticuerpos IgA anti-P4 locales de fluidos de lavado broncoalveolares y vaginales del anterior grupo solamente fueron 1/34 parte y 1/60 parte de los del grupo anterior de ratones el día 49. Los datos indicaron que las respuestas inmunitarias humorales locales y sistémicas de los ratones inmunizados con rp4 más rP6/CT-CRM_{E29H} fueron esencialmente idénticas a las obtenidas después de la inmunización con la vacuna con el coadyuvante CT de tipo salvaje (Tabla 8).
Se estudió el efecto de la adición de CT-CRM_{E29H} sobre las respuestas de anticuerpos de suero provocadas por inmunización con la proteína Hap. La adición de CT-CRM_{E29H} ayudó a inducir una respuesta de anticuerpos de suero a la proteína Hap_{s} (Tabla 9). La respuesta inmunitaria se observó en los sueros de la semana 7; no se detectaron valoraciones de anticuerpos en los primeros sueros. Las valoraciones de ELISA anti-Hap_{s} de los sueros obtenidos aumentaron de una manera dependiente de las dosis y aumentaron aproximadamente el triple por la adición de 0,1 \mug de CT-CRM_{E29H}. Este aumento se produjo en ambos niveles de dosificación.
Se evaluó el potencial de los cinco CT-CRM diferentes para aumentar respuestas inmunitarias humorales sistémicas y locales después de la inmunización intragástrica (I) con la proteína rUreasa de H. Pylori usando un modelo de ratón (29). Los resultados fueron similares a los obtenidos con las proteínas NTHi después de la administración intranasal. Los datos indicaron que CT-CRM_{E29H} fue el mutante con el mayor potencial para aumentar respuestas inmunitarias humorales sistémicas y locales después de la inmunización IG. Las valoraciones medias geométricas de anticuerpos IgG (tabla 10) y IgA (Tabla 11) anti-rUreasa en suero provocados mediante la vacuna formulada con CT-CRM_{E29H} fueron seis y tres veces superiores, respectivamente, a las inducidas por CT-CRM_{E110D} el día 28 del estudio. Además, las valoraciones de anticuerpos IgA e IgG en suero provocadas por la vacuna formula con CT-CRM_{E29H} fueron equivalentes a las generadas por la vacuna que contenía la CT- de tipo salvaje.
De manera más significativa, la inmunización IG con la rUreasa formulada con CT-CRM_{E29H} pareció generar las mayores respuestas inmunitarias humorales locales (Tabla 12). Esto no fue evidente después del examen de los fluidos de lavado broncoalveolares. Las valoraciones de anticuerpos IgA anti-rUreasa en los fluidos de lavado broncoalveolares fueron cinco veces superiores a las provocadas por la vacuna preparada con CT-CRM_{E110D}. en comparación con la formulación de CT de tipo salvaje, las valoraciones de anticuerpos IgA anti-rUreasa fueron del 1% del nivel. Sin embargo, las valoraciones de anticuerpos IgA específicos de proteína en los fluidos de lavado vaginales del grupo inmunizado con la vacuna formulada con CT-CRM_{E29H} fueron esencialmente equivalentes a las provocadas por la vacuna preparada con CT de tipo salvaje (Tabla 12).
Hay que resaltar que los datos implican que la inmunización parenteral no provocó anticuerpos IgA específicos de rUreasa notables en los fluidos de lavado broncoalveolares cuando se comparan con los provocados en los ratones inmunizados IG con la vacuna preparada con CT-CRM_{E29H} (Tabla 12).
Por lo tanto, se llevó a cabo un segundo estudio para ensayar la eficacia de las respuestas inmunitarias generadas por la rUreasa formulada con CT-CRM_{E29H}. Los datos sugieren que CT-CRM_{E29H} es tan potente como la CT de tipo salvaje en el apoyo a la inducción de las respuestas inmunitarias protectoras contra H. felis (Tabla 13). Las valoraciones de anticuerpos IgA anti-rUreasa del grupo anterior fueron equivalentes a las del último grupo de ratones el día 28 del estudio. Las valoraciones de anticuerpos IgA específicos de proteínas en los sueros de ratones inmunizados parenteralmente con rUreasa más Stimulon^{TM} QS-21 fueron 12 veces superiores a las de los ratones inmunizados IG con la vacuna preparada con CT-CRM_{E29H}. Sin embargo, las valoraciones de anticuerpos IgA específicos de proteínas en los fluidos de lavado broncoalveolares de ratones inmunizados con CT-CRM_{E29H} fueron más de diez veces superiores a los de los ratones inmunizados parenteralmente (Tabla 13).
Los resultados sugirieron una correlación entre la inmunización IG y la capacidad de los ratones para eliminar H. Felis del tejido estomacal. Diez días después de la última inoculación, el 80% de los ratones inmunizados IG con las vacunas formuladas con CT o CT-CRM_{E29H} pudieron eliminar las bacterias que contenían ureasa de los tejidos estomacales. Por el contrario, los ratones de control sin tratamiento previo (10%), los ratones inmunizados por vía intragástrica con rUreasa más PBS solo (20%), los ratones inmunizados subcutáneamente con rUreasa mezclada con Stimulon^{TM} QS-21 (30%) parecieron tener menos capacidad para erradicar H. Felis (Tabla 13). Hay que resaltar que los datos no sugirieron una relación entre eficacia y valoraciones de anticuerpos IgA específicos de proteínas en los fluidos de lavado broncoalveolares. Las valoraciones de anticuerpos IgA específicos de proteínas en los fluidos de lavado broncoalveolares de los ratones inmunizados IG con rUreasa más CT de tipo salvaje fueron una décima parte de las de los ratones inmunizados con CT-CRM_{E29H} (Tabla 13).. Con todo se consiguió el 80% de protección con cualquier vacuna. De este modo controlar las respuestas inmunitarias humorales locales en los tejidos pulmonares puede ser de algún modo relevante para las respuestas inmunitarias protectoras que se producen en el estómago.
El Dr. Jani O'Rourke (Universidad de Nueva Gales del Sur; Comunicación personal) sugirió que los ratones C57B1/6, a diferencia de los ratones BALB/c padecen enfermedades similares a las observadas en humanos después de infección con H. Pylori. Para probar la eficacia de las respuestas inmunitarias anti-rUreasa facilitadas por CT-CRM_{E29H} para eliminar H. Pylori de los tejidos gástricos, se iniciaron una serie de estudios usando ratones C57B1/6. Los resultados sugirieron que la inmunización IG con rUreasa formulada con CT-CRM_{E29H} generaron respuestas inmunitarias humorales sistémicas y locales que fueron similares a las provocadas por rUreasa formulada con CT de tipo salvaje (Tabla 14). Las valoraciones de anticuerpos IgA anti-rUreasa de los fluidos de lavado broncoalveolares y los sueros de ratones inmunizados con vacunas preparadas con CT de tipo salvaje o CT-CRM_{E29H} el día 28 del estudio fueron indistinguibles. Las únicas diferencias fueron las valoraciones de anticuerpos IgA detectados en extractos de sedimentos fecales (Tabla 14), que fueron tres veces superiores. Hay que resaltar que las valoraciones de anticuerpos IgA específicos de proteínas en las heces de ratones inmunizados parenteralmente con rUreasa más alumbre fueron sustancialmente inferiores a las de los ratones inmunizados con formulaciones de CT-de tipo salvaje o CT-CRM_{E29H} (1/38 parte y 1/14 parte, respectivamente). De este modo, el modelo de ratón C57B1/6 parecía capaz de evaluar la capacidad de CT-CRM_{E29H} para inducir respuestas inmunitarias generadas después de la inmunización IG. Además, los datos indicaron que el modelo puede definir las funciones de las respuestas inmunitarias locales y sistémicas en la protección de las superficies de mucosas contra H. pylori.
Se ha indicado que CT está contraindicado como coadyuvante para respuestas inmunitarias de la mucosa (30, 31). La hipótesis fue que las vacunas predispuestas con CT para provocar mayores valoraciones de anticuerpos IgE, no son deseables. IgE se asocia con hipersensibilidad y reacciones alérgicas. Además, se suponía que la toxina termolábil de E. coli (LT), o LT-CRM, tenía menos potencial para provocar mayores valoraciones de anticuerpos IgE. De este modo, la conclusión fue que LT o LTCRM eran coadyuvantes de vacunas más apropiados para la generación de respuestas inmunitarias de la mucosa. Para probar esta hipótesis, se formularon vacunas compuestas de rUreasa bien con CT, LT o CT-CT-CRM_{E29H} y se probaron en ratones C57B1/6 por su capacidad para provocar anticuerpos IgE después de inmunización IG (Tabla 15). Los datos sugirieron que las vacunas preparadas con CT-CT-CRM_{E29H} o CT de tipo salvaje eran menos probables que LT de tipo salvaje para generar anticuerpos igE totales o específicos de ureasa en circulación. Además, La implicación era que las vacunas generadas con CT-CT-CRM_{E29H} eran menos probables para generar valoraciones elevados de anticuerpos IgE. Tantos los criterios de valoración total como las valoraciones de anticuerpos IgE específicos de rUreasa fueron una cuarta parte de las de los ratones inmunizados con la vacuna preparada con LT de tipo salvaje (Tabla 15). De este modo, estos datos sugieren que, al menos en una formulación de rUreasa, se prefiere CT-CT-CRM_{E29H} a LT como coadyuvante.
Sin quedar ligado a teoría alguna, el mecanismo de actividad de LT recientemente propuesto por van den Akker y col. (32) presenta una explicación más probable para la toxicidad reducida de las variantes de CT alteradas en o alrededor de E29. Después de la escisión del bucle de disulfido y la reducción de los dominios A1 y A2 de unión del enlace disulfido, el bucle constituido por los residuos 30-33 en el dominio A1 se propone cambiar de posición como consecuencia del movimiento de la hélice larga del dominio A2. Las sustituciones para E29 pueden modificar el comportamiento del bucle 30.33, dando como resultado la activación reducida de CT-A1 Igualmente se puede conseguir una potencial explicación para la toxicidad reducida de CT-Y30WAH y CT-g34GGP por los efectos sobre el bucle 30-33 que son nocivos para la activación de CT-A1. El siguiente paso en la vía de la activación propuesta es el movimiento de todo el bucle 25-36, el cual interrumpe interacciones entre R25 e Y55. CT-R25G mostró una reducción de toxicidad en mayor medida que CT-R25W, posiblemente debido a que las cadenas laterales de R25 e Y55 participan en interacciones hidrófobas, que pueden ser retenidas por CT-R25W pero no por CR-R25G. Los fenotipos de nuestras variantes concuerdan con el modelo para la activación de enterotoxinas termolábiles propuestas por van den Akker y col. (32).
Se llevó a cabo una serie de experimentos para evaluar la eficacia de CT-CT-CRM_{E29H} como coadyuvante parenteral y de la mucosa para dos vacunas candidatas del Grupo B Neisseria meningitidis. La primera candidata fue una pilina de clase 1 recombinante (rpilina) (25). La segunda candidata fue una proteína de membrana exterior de clase 1 (PorA) expresada por una cepa de meningococo mutante que no expresa la proteína de clase 2/3 (26).
Se mostró un efecto del coadyuvante de la mucosa en un primer experimento, porque se potenciaron anticuerpos IgC de suero específicos de rpilina en grupos añadidos con CT-CT-CRM_{E29H}, que se multiplican de 3 a 19 veces en comparación con las valoraciones obtenidas en ratones que reciben rpilina en solución salina (Tabla 16). El IgA de suero específicos también se incrementó 2 a 5 veces en los ratones inmunizados con rpilina proporcionada en CT-CT-CRM_{E29H} (tanto 0,1 como 1,0 \mug). Hay que resaltar que CT-CT-CRM_{E29H} (1 \mug) aumentó el IgA específico de rpilina de 3 a 10 veces en los lavados nasales, vaginales y broncoalveolares. Además, la inmunización IN con rpilina más CT-CRM_{E29H} redujo considerablemente la colonización nasal por la cepa homóloga N. meningitidis del Grupo B al nivel de detección en los ratones Swiss-Webster (Figura 2).
Se llevó a cabo un segundo experimento para demostrar que CT-CRM_{E29H} potenció la protección de rpilina contra una cepa homóloga de meningococo. Como se muestra en la Tabla 17, las valoraciones de IgG de suero de ELISA de células enteras B de meningococo se incrementaron en el grupo de rpilina más CT-CT-CRM_{E29H} al menos 4 veces comparado con la cepa homóloga, así como con las cepas heterólogas FAM18 y M982 en comparación con las valoraciones de los ratones que recibieron solamente rpilina. Como control, los ratones inmunizados con KLH más CT-CT-CRM_{E29H} no indujeron IgG de suero en ELISA de células enteras a ninguna de las cepas sometidas a ensayo. En la Tabla 18, los anticuerpos IgG e IgA específicos de rpilina aumentaron sustancialmente en el grupo de rpilina más CT-CRM_{E29H}, comparado con el grupo sin coadyuvantes. Además, CT-CRM_{E29H} como coadyuvante de la mucosa para rpilina protegió los ratones contra la colonización nasal por la cepa homóloga de meningococo del Grupo B (figura 3).
A continuación, se demostró la inmunogenicidad de PorA más CT-CRM_{E29H0} en la inmunización IN. El grupo que recibió PorA con coadyuvante CT-CRM_{E29H} generó mayores anticuerpos IgG de suero a células enteras H44/76 de N. meningitidis y generó anticuerpos específicos de PorA 7 y 14 veces superiores comparado con el grupo PorA sin coadyuvantes (Tabla 19). Sin embargo, no se pudieron detectar anticuerpos IgA de suero a PorA H44/76. Tampoco hubo anticuerpos específicos de PorA detectados en ninguna de las muestras recogidas de secreción de la mucosa (Tabla 19).
Se llevó a cabo un cuarto experimento para demostrar que CT-CRM_{E29H} potenció la protección por rpilina o PorA contra una cepa heteróloga de meningococo. Los datos, particularmente de la Tabla 20, indican que la administración IN de rpilina de clase 1 o Por A suministrada con CT-CRM_{E29H} no solamente provocó grandes valoraciones de anticuerpos de suero a antígenos y células enteras de meningococo, sino que también protegió los ratones Swiss-Webster contra la colonización nasal por una cepa heteróloga de N. meningitidis de grupo B. Específicamente, CT-CRM_{E29H} potenció la respuesta de anticuerpos de suero a rpilina de clase 1 comparado con la de un grupo sin coadyuvante. Igualmente, el grupo de rpilina de clase 1 con coadyuvante proporcionó la eliminación de las bacterias.
A continuación, se examinó la capacidad de CT-CRM_{E29H} para servir de coadyuvante para la inmunización parenteral de meningococos. Como se muestra en la figura 5, PorA H355 con coadyuvante MPL^{TM} o CT-CRM_{E29H} redujo considerablemente la colonización nasal de la cepa 870227 heteróloga de meningococos del Grupo B. En particular, los ratones inmunizados subcutáneamente con PorA H355 más CT-CRM_{E29H} tuvieron incluso colonias considerablemente menores que el grupo PorA H355 más MPL^{TM} en la nariz 24 horas después de la inoculación. Sin embargo, se detectaron actividades bactericidas en los sueros solamente procedentes de PorA y la célula entera asesinada con los coadyuvantes de los grupos inmunizados con MPL^{TM} respectivamente (Tabla 22), pero no procedente del grupo PorA más CT-CRM_{E29H}. Incluso aunque PorA con el coadyuvante CT-CRM_{E29H} no provocase actividades bactericidas homólogas similares a las del coadyuvante MPL^{TM}, fue muy eficaz en la reducción de la colonización por una cepa heteróloga de meningococos del Grupo B.
La capacidad de CT-CRM_{E29H} para aumentar las respuestas inmunitarias sistémicas y de la mucosa contra glicoproteínas del virus sincicial respiratorio (RSV) se examinó usando la proteína de fusión nativa purificada (F). Además, se investigó el impacto de los anticuerpos anti-CT preexistentes sobre la potencia de CT-CT-CRM_{E29H} como coadyuvante. Los resultados demostraron que los ratones BALB/c inmunizados IN con proteína F con el coadyuvante CT o CT-CT-CRM_{E29H} generaron valoraciones de anticuerpos IgG e IgA anti-CT sistémicos y locales (Tabla 23). Además, los datos indicaron que las valoraciones de los anticuerpos generados por la formulación que contiene CT-CRM_{E29H} fueron equivalentes a las provocadas por la formulación que contiene CT de tipo salvaje. Por ejemplo, 10 días después de la inmunización secundaria con proteína F/CT-CRM_{E29H} <(1 \mug por dosis), las valoraciones de anticuerpos IgA e IgG anti-CT de suero fueron solamente ligeramente inferiores a las de los ratones inmunizados con proteína F/CT (1 \mug por dosis). Se obtuvieron también resultados similares después del examen de los fluidos de lavado vaginales de los ratones inmunizados con proteína F preparada con 1 ó 10 \mug de CT-CRM_{E29H} (Tabla 23). Los datos sugirieron entonces que CT-CRM_{E29H} era tan inmunogénico como CT de tipo salvaje.
La pregunta de si las respuestas inmunitarias anti-CT pudiesen afectar negativamente a la inmunogenicidad del antígeno F se solucionó en un segundo experimento donde los ratones BALB/c fueron cebados primero por dos administraciones IN con CT de tipo salvaje o CT-CRM_{E29H} en sólo PBS (Tabla 24.). A continuación, se inmunizaron los ratones apropiados dos veces con proteína F mezclada con CT de tipo salvaje o CT-CRM_{E29H}. Un examen de los sueros recogidos dos semanas después de la última administración (día 56 indicó que los anticuerpos anti-CT preexistentes no tenían un impacto negativo sobre el nivel de anticuerpos IgA e IgG anti-proteína F locales o sistémicos. De hecho, los datos indicaron que los anticuerpos anti-CT preexistentes fueron beneficiosos para la generación de una mayor respuesta de anticuerpos anti-proteína F. Esto fue más evidente cuando se compararon las valoraciones de los anticuerpos anti-proteína F provocados en las superficies de la mucosa (Tabla 24). Dos semanas después de la inmunización secundaria, las valoraciones de anticuerpos IgA anti-proteína F en fluidos de lavado broncoalveolares y vaginales de ratones primero cebados con CT-CRM_{E29H} y a continuación inmunizados y a continuación inmunizados con proteína F/CT-CRM_{E29H} fueron 7 y 17 veces superiores, respectivamente, que las de los ratones sin tratamiento previo inmunizados solamente con proteína F/CT-CRM_{E29H} (Tabla 24).
En un tercer experimento, se evaluaron las respuestas inmunitarias sistémicas y de la mucosa de ratones BALB/c inmunizados IN con proteína F de RSV y CT-CRM_{E29H}, CT-B o alumbre. La tabla 25 indica las respuestas inmunitarias humorales de sueros recogidos nueve días después de la inmunización terciaria. Los ratones que habían recibido inmunizaciones que contenían proteína F y 1 ó 10 \mug de CT-CRM_{E29H} (grupos 777 y 778, respectivamente) mostraron valoraciones considerablemente elevadas para IgG, IgG1 e IgG2a cuando se compararon con ratones inmunizados con F/PBS, F/ALOH o RSV (grupos 784, 785 y 907, respectivamente). Además, las valoraciones generadas por vacunas que contienen F/CT-CRM_{E29H} (777 y 778) fueron al menos equivalentes a las estimuladas por proteína F y CTB (779 y 780).
Se recogieron fluidos de lavado broncoalveolares y fluidos de lavado vaginales y nasales de animales inmunizados una semana después de la inmunización final para llevar a cabo pruebas ELISA de anticuerpos IgG e IgA. Los datos expuestos en la Tabla 26, muestran valoraciones de grupos de cinco ratones. Los ratones inmunizados con CRM_{E29H} provocaron IgA detectable tanto en fluidos de lavado vaginal como nasal (grupos 777 y 778). No se observó IgA en BAL derivados de ratones inmunizados con CRM_{E29H} y esto representó un contraste respecto de lo observado en BAL de ratones inmunizados con RSV (grupo 907) y ratones inmunizados con F/CTB (780). Se observó IgG en todos los fluidos de lavado de la mucosa incluido los de BAL. Los niveles de IgG observados en los fluidos de lavado de ratones inmunizados con CT-CRM_{E29H} fueron comparables con los obtenidos inmunizando con CTB (grupos 779 y 780) y RSV vivo.
En un cuarto experimento, se evaluó la actividad citolítica (CTL) provocada por células de bazo estimuladas in vitro derivadas de ratones inmunizados. Los datos se presentan en la figura 6. Mientras los ratones inmunizados con RSV mostraron lisis celular específica de antígeno de aproximadamente el 60%, la actividad CTL de cada uno de los restantes ratones sigue siendo inferior al 20%. De este modo, mientras CT-CRM_{E29H} pudo inducir respuestas inmunitarias humorales tanto sistémicas como de la mucosa a la proteína F de RSV (Tablas 25 y 26), no se observaron respuestas inmunitarias mediadas por células a células diana infectadas por RSV.
En un quinto experimento se llevaron a cabo ensayos de protección viral para investigar si la administración intranasal de F/CT-CRM_{E29H} facilitaba la protección contra la inoculación de RSV vivo. Los datos se presentan en la figura 7.
El análisis estadístico por ANOVA de los resultados representados en la figura 7 es como sigue:
P < 0,05: F/PBS contra F/CT CRM_{E29H} (1 \mug y 10 \mug de CT-CRM_{E29H}), F/CTB (1 g y 10 \mug), F/ALOH.
P > 0,05: PBS/CT-CRM_{E29H} contra F/PBS
P > 0,05: F/CT-CRM_{E29H} (1 \mug y 10 \mug T-CRM_{E29H}) contra F/CTB (1 \mug y 10 \mug) contra F/AlOH.
Los ratones que recibieron vacunas IN que contienen F/CT-CRM_{E29H} o F/CTB tuvieron valoraciones virales de pulmón comparables con las obtenidas en ratones inmunizados de manera intramuscular con F/AlOH (P>0,05). Además, se observó que la inmunización intranasal con F/CT-CRM_{E29H} reduce las valoraciones de virus de pulmón por Log_{10} 1,6 y Log_{10} 1,4 comparadas con la inmunización IN con F/PBS o PBS/CT-CRM_{E29H}, respectivamente. Se reveló que las diferencias entre F/CT-CRM_{E29H} y F/PBS o PBS/CT-CRM_{E29H} son estadísticamente considerables (p<0,05).
En un sexto experimento, se evaluaron respuestas sistémicas y de la mucosa de ratones BALB/c inmunizados IN con proteína F de RSV y CT-CRM_{E29H} o alumbre. La Tabla 27 indica las respuestas inmunitarias humorales de suero recogidas dos semanas después de la inmunización terciaria. Los ratones que recibieron inmunizaciones que contenían proteína F y 1 \mug de CT-CRM_{E29H} (grupo 256) mostraron valoraciones considerablemente elevadas para IgG, IgG1 e IgG2a cuando se comparan con los ratones inmunizados con F/PBS o PBS/CT-CRM_{E29H} (grupos 250 y 257, respectivamente). No se observaron diferencias considerables en las valoraciones de IgG1 entre ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} (256) y F/AlOH (258). Sin embargo, la inmunización IN con F/CT-CRM_{E29H} (256) provocó valoraciones de IgG2a considerablemente elevadas comparadas con las observadas por inmunización con F/AlOH (258). Colectivamente, estos resultados concuerdan con los presentados en la Tabla 25. Mientras que se detectó IgA de suero en grupos de ratones que recibieron F/CT-CRM_{E29H}, las valoraciones fueron muy inferiores a las previamente observadas (16.202\pm2.031 para el grupo 777 y 444\pm1.458 para el grupo 256). Las razones para la diferencia aparente no son claras. Sin embargo, la capacidad de F/CT-CRM_{E29H} administrada IN para inducir IgA de suero concuerda tanto en los estudios como en los contrastes de manera favorable con la capacidad de F/AlOH a este respecto.
Se recogieron fluidos de lavado broncoalveolares y fluidos de lavado vaginales y nasales de animales inmunizados dos semanas después de la inmunización final para llevar a cabo pruebas ELISA de anticuerpos IgG e IgA. Los datos expuestos en la Tabla 28, muestran valoraciones de grupos de cinco ratones. De manera similar a los resultados mostrados en la Tabla 26, los ratones inmunizados con CT-CRM_{E29H} provocaron IgA detectable tanto en fluidos de lavado vaginal como nasal (grupo 256). De nuevo de manera similar a los datos presentados en la Tabla 26, no se observó IgA en BAL derivados de ratones inmunizados con CRM_{E29H}. Sin embargo, se observó IgG en todos los fluidos de lavado de la mucosa incluidos los de BAL. Los niveles de IgG observados en los fluidos de lavado de ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} fueron comparables con los obtenidos inmunizando con RSV vivo (Tabla 28, grupos 256 contra 259).
En un séptimo experimento, se evaluó la actividad citolítica (CTL) provocada por células de bazo estimuladas in vitro derivadas de ratones inmunizados. Los datos se presentan en la figura 8. Mientras los ratones inmunizados con RSV mostraron lisis celular específica de antígeno de aproximadamente el 45%, la actividad CTL de cada uno de los restantes ratones sigue siendo inferior al 10%. Los datos confirman la incapacidad de inmunización IN con F/CT-CRM_{E29H} para inducir un mecanismo de defensa inmunitaria medida por células contra células diana infectadas por RSV en la población de linfocitos esplénicos. Esto confirma la observación anterior (Figura 8).
En un octavo experimento se llevaron a cabo ensayos de protección viral adicionales para investigar si la administración IN de F/CT-CRM_{E29H} facilita la protección contra la inoculación de RSV vivo.
El análisis estadístico por ANOVA de los resultados representados en la figura 9 es como sigue:
P < 0,05: F/PBS contra F/CT-CRM_{E29H}, F/ALOH, RSV.
P < 0,05: Vírgen contra F/CT-CRM_{E29H}, F/AlOH, RSV.
P > 0,05: F/CT-CRM_{E29H} contra F/AlOH, RSV.
Similar a los resultados representados en la figura 7, los ratones que recibieron vacunas IN que contenían F/CT-CRM_{E29H} controlaron la replicación del virus en los pulmones en una medida que fue comparable estadísticamente (p > 0,05) con las llevadas a cabo en ratones inmunizados de manera intramuscular con F/AlOH o IN con RSV vivo (Log_{10} 1,99 y Log_{10} 1,94, respectivamente), La inmunización IN con F/PBS (primera barra), o los ratones no inmunizados (sin tratamiento previo) mostraron valoraciones virales de pulmón de Log_{10} 4,5 y Log_{10} 4,3_{,} respectivamente. Además, estos grupos tuvieron valoraciones de pulmón que se revelaron ser estadísticamente elevadas (p < 0,05) cuando se comparan con las valoraciones de virus obtenidas a partir de ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H,} F/AlOH o RSV vivo. Por lo tanto, los datos apoyan la conclusión de que la instilación de F/CT-CRM_{E29H} protege contra la inoculación de RSV infeccioso.
En un noveno experimento, se evaluó la respuesta de anticuerpos en suero anti-F. Los resultados mostraron que IgG anti-proteína F se incrementó considerablemente en los ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} (0,1 ó 1,0 \mug) comparado con aquellos a los que se les dio proteína F suministrada solamente en PBS (Tabla 29). Además, la proteína F con 0,1 ó 1,0 \mug del coadyuvante CRM_{E29H} fue al menos tan eficaz como F/AlOH (intramuscular) o infección experimental con RSV estimulando respuestas de IgG anti-proteína F. La magnitud de las valoraciones de anticuerpos anti-proteína F dependía de la dosis de CT-CRM_{E29H} en la formulación, de manera que las valoraciones fueron considerablemente superiores en los ratones que recibieron 1,0 \mug de CT-CRM_{E29H} que en los que recibieron 0,01 \mug. En comparación con F/PBS, tanto las valoraciones de IgG1 como IgG2a anti-proteína F aumentaron con 0,1 ó 1,0 \mug de CT-CRM_{E29H}. CT-CRM_{E29H} estimuló tanto los comportamientos inmunitarios de tipo 1 como de tipo 2. Se estimularon respuestas IgA anti-proteína F de suero considerablemente mayores por inmunización IN con F/CT-CRM_{E29H} (0,1 ó 1,0 \mug) comparado con infección experimental con RSV. Por el contrario, no se observaron anticuerpos IgA anti/proteína F de sueros en respuesta a F/PBS (IN) o la administración parenteral de F/AlOH (Tabla 29).
Las valoraciones anti-CT siguieron igualmente un modelo dependiente de dosis concordante con las valoraciones anti-proteína F (Tabla 29). Se observaron valoraciones anti-CT estadísticamente equivalentes en sueros obtenidos de ratones inmunizados con CT-CRM_{E29H} (1,0 \mug) o F/CT-CRM_{E29H} (1,0 \mug). Sin embargo, estos valores fueron considerablemente elevados comparados con F/CT-CRM_{E29H} (0,1 ó 0,01 \mug). Además, las valoraciones anti-CT en sueros de ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} (0,1 \mug) fueron estadísticamente más elevadas comparadas con las valoraciones de ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} (0,01 \mug). Por lo tanto, el efecto de coadyuvante de CT-CRM_{E29H} para respuestas de anticuerpos anti-proteína F se correlaciona (r = 0,97) con la respuesta de anticuerpos a la holotoxina mutante del cólera.
En este noveno experimento, se evaluó igualmente la inmunidad de la mucosa. Se observó IgA de la mucosa solamente en fluidos agrupados de lavado nasales (NW) de ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} (1,0 \mug) o F/CT-CRM_{E29H} (0,1 \mug) (Tabla 30). Además, los ratones que recibieron inmunizaciones IN que contenían proteína F purificada y CT-CRM_{E29H} (0,01 a 1,0 \mug) tuvieron también IgA anti-proteína F en fluidos de lavado vaginales (VW) Se observó IgG específico de proteína F en los fluidos de lavado broncoalveolares (BAL), VW y/o NW de ratones que recibieron F/CT-CRM_{E29H} (0,1 y 1,0 \mug), o F/AlOH. Por el contrario, no se detectó IgA anti-proteína F en ratones inmunizados IM con F/AlOH.
En un décimo experimento, se evaluó la inmunidad funcional en ratones inmunizados con proteína F formulada con CT-CRM_{E29H}. En presencia de complemento, se detectaron anticuerpos neutralizantes anti-RSV estadísticamente elevados en los sueros de ratones que hubiesen recibido proteína F y 0,1 ó 1,0 \mug de CT-CRM_{E29H}, F/AlOH o RSV A2, comparados con la administración de F/PBS o solamente CT-CRM_{E29H} (Tabla 31). En ausencia de complemento, no se observaron valoraciones neutralizantes detectables en ninguno de los grupos (Log_{10} < 1,3). Concordante con los datos de anticuerpos de suero y de la mucosa (Tablas 29 y 30), la inmunización con F/CT-CRM_{E29H} (0,01 \mug) no fue suficiente para generar anticuerpos neutralizantes anti-RSV.
En un undécimo experimento, se inocularon ratones inmunizados dos semanas después de la inmunización terciaria, para determinar la capacidad de F/CT-CRM_{E29H} para proteger contra una posterior infección. Los resultados demostraron que se protegieron los ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} (0,1 o 1,0 \mug) (Tabla 32). En comparación con ratones sin tratamiento previo, o los inmunizados con F/PBS o sólo CT-CRM_{E29H}, los pulmones de ratones inmunizados con proteína F y 0,1 o 1,0 \mug de CT-CRM_{E29H} tuvieron niveles de virus considerablemente reducidos. Además, se observaron niveles de virus considerablemente reducidos en los tejidos nasales de ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} (0,1 y 1,0 \mug) comparados con ratones sin tratamiento previo no inmunizados o los inmunizados con F/PBS. Por el contrario, los ratones inmunizados parenteralmente con F/AlOH mostraron valoraciones virales reducidas en tejido pulmonar comparado con los ratones inmunizados con F/PBS, pero sin reducción considerable en tejido nasal. Sobre todo, la administración IN de F/CT-CRM_{E29H} (0,1 o 1,0 \mug) fue suficiente para generar respuestas inmunitarias humorales tanto locales como sistémicas que pudieron haber contribuido a la protección de tejido respiratorio con la posterior inoculación con RSV vivo.
Los datos presentados en el Ejemplo 10 han mostrado un enfoque viable del desarrollo de una vacuna IN para proteína F de RSV. Los datos indican que la producción tanto de IgG como de IgA humorales y de la mucosa se estimula mediante la administración IN de F/CT-CRM_{E29H}. Se demostró de dos maneras que las valoraciones de anticuerpos observadas fueron considerables: en primer lugar, cada una de las valoraciones humorales y de la mucosa que se analizaron en ratones inmunizados con F/CT-CRM_{E29H} fueron similares cualitativa y cuantitativamente elevadas comparadas con los ratones inmunizados con F/PBS. En segundo lugar, las valoraciones elevadas se traducen en una respuesta inmunitaria biológicamente importante, como lo indica el nivel observado de protección mostrado en las figuras 7 y 9. La inmunización con F/CT-CRM_{E29H} potenció considerablemente la protección contra la inoculación con RSV vivo comparado con la inmunización con F/PBS o PBS/CT-CRM_{E29H}.
Colectivamente, los datos sugieren un mecanismo que implica la neutralización del virus infeccioso por inmunoglobulinas de la mucosa o humorales, que se estimulan en respuesta al protocolo de inmunización IN que contiene F/CT-CRM_{E29H}.
Se inmunizaron los ratones con otro antígeno viral, rotavirus, en forma de proteínas VP2 y VP6 expresadas de manera recombinante. Los vectores de baculovirus recombinante que expresan VP2 y VP6 de rotavirus SA11 se elaboraron tal como se ha descrito anteriormente (28); se sabe que las proteínas estructurales de rotavirus expresadas de manera recombinante se auto-ensamblan en partículas que son indistinguibles morfológicamente de los viriones. Las proteínas así expresadas se co-ensamblan en 2/6-partículas similares a virus (VLP).
Se usaron ratones BALB/c consanguíneos con una carga genética homogénea, que anticipan que todos serán sensibles a la inmunización y de este modo se aclara el perfil de las inmunoglobulinas sistémicas y de la mucosa a solamente VLP y cuando se combinan con el coadyuvante CT-CRM_{E29H}. También se usaron ratones CD-1 sin consanguinidad genéticamente heterólogos para determinar el efecto de la diversidad genética sobre los factores implicados en la inducción de la inmunidad y la protección.
Los sueros de todos los ratones BALB/c y CD-1 inmunizados, salvo para dos ratones CD-1 no sensibles inmunizados oralmente contenían anticuerpos tanto a VP2 como a VP6. Los sueros de preinmunización así como los sueros de los ratones inmunizados no detectaron antígeno viral en células Mock y/o infectadas de bacilovirus VP2-6. Los sueros inmunizados de 2/6-VPL o mAbs específicos para VP6 y VP2 expuestos a células no infectadas tampoco demostraron reactividad (datos no mostrados). La inmunogenicidad de 2/6-VPL también fue confirmada por análisis de Western blot usando sueros preinoculados e inmunizados de cada ratón contra 2/6-VLP así como la cepa SA11 de rotavirus (datos no mostrados).
Los modelos de IgG, IgM e IgA de suero específicos de rotavirus en el grupo inmunizado IN con 2/6-VLP solamente fueron similares a los del grupo inmunizado con 2/6-VPL y CT-CRM_{E29H} (figura 10). Sin embargo, los niveles de la semana 13 de los tres isótopos de anticuerpos de suero fueron considerablemente superiores en los animales que recibieron 2/6-VLP junto con CT-CRM_{E29H} (figura 10) (P=0, P=0,004, y P=0,02 para IgG, IgM e IgA, respectivamente). Esto indicó que CT-CRM_{E29H} tuvo respuestas humorales considerablemente potenciadas a 2/6VLP. La semana 13 se seleccionó como indicativa de los niveles de anticuerpos generados después de dos inmunizaciones pero antes de la inoculación.
Como se muestra en la figura 11A, los ratones BALB/c a los cuales se les dio VLP IN produjeron mayores respuestas de IgG sistémicas específicas de rotavirus que los inmunizados oralmente. Las diferencias estadísticamente significativas en las valoraciones de IgG de suero entre los dos grupos fueron evidentes en la semana 13 (P=0). Igualmente, los niveles de IgM de suero fueron superiores en el grupo IN opuesto al grupo oral cuando se analizaron los valores de preinoculación (semana 13) (P = 0) (figura 11B). Los niveles de IgM de suero alcanzaron su punto máximo la semana 2 y se redujeron la semana 4 en los grupos IN y mixto, mientras en el grupo oral, se detectaron niveles bajos pero relativamente constantes de IgM de suero a lo largo de todo el estudio. El pico de IgA de suero en animales inmunizados oralmente e IN se produjo la semana 4. No se distinguieron diferencias considerables en los niveles de IgA de suero en los tres grupos experimentales cuando se examinaron la semana 13 (figura 11C). Sobre todo, la inmunización IN produjo mayores niveles de respuestas IgG e IgM sistémicas que la inmunización oral. La inducción de niveles considerablemente elevados de IgG e IgM en el grupo IN apoyan el concepto de que la inmunización IN puede ser la vía preferida para la administración de futuras vacunas candidatas (33). De este modo, la inmunización IN que conduce a fuertes respuestas neutralizantes sistémicas podría ser eficaz contra patógenos virales que penetran en barreras de la mucosa.
Se observó tanto IgG1 como IgG2 en el suero de los ratones BALB/c inmunizados IN y oralmente (figura 12). El grupo IN tuvo niveles estadísticamente considerablemente mayores de ambas subclases de IgG comparadas con el grupo oral (IgG1, P=0,005; IgG2a, P=0,5). Sin embargo, no hubo diferencias considerables entre las subclases en cada grupo. Estos datos confirman la utilidad de la inmunización IN para la inducción eficaz de ambas vías T auxiliares (TH-1 y TH-2).
Los niveles de pico de IgA fecal para los tres grupos experimentales se produjo cuatro semanas después de la primera inmunización (figura 13A), que coincide temporalmente con el tiempo en el cual los niveles de IgA de suero fueron máximos en animales inmunizados oralmente e IN (Figura 11C). No se observaron diferencias estadísticamente considerables entre los tres protocolos de inmunización cuando se examinaron los niveles IgA fecales de preinoculación (figura 13A). Los niveles IgG fecal también fueron máximos la semana 4 (Figura 13B); sin embargo, el grupo IN tuvo niveles de IgG más significativos la semana 13 comparados con los grupos oral o mixto (P=0, P=0,002, respectivamente). En general, todos los ratones inmunizados con 2/6-VLP produjeron IgG, IgM e IgA de suero, así como IgC e IgA fecales. No se detectó IgM fecal en ninguno de los animales.
Todos los ratones CD-1 que recibieron 2/6-VLP IN (n=4) y dos de cuatro ratones inmunizados oralmente produjeron respuestas de anticuerpos específicos de rotavirus (datos no mostrados). Para determinar el perfil de respuestas de anticuerpos más precisamente, se analizaron muestras de suero y de heces semanalmente durante 26 semanas. El modelo de inducción de anticuerpos de suero y de heces en ratones CD-1 fue similar al de los ratones BALB/c (Figuras 11 y 13).
En los ratones BALB/c, dos inmunizaciones IN con 2/6-VLP y CT-CRM_{E29H} se revelaron protectoras (PRAS=
98,7%), en contraste con la inmunización IN con sólo 2/6-VLP (PRAS=39%) (P=0,007) (figura 14A). La inmunización mixta, IN seguida de inmunización oral, protegió los ratones en una medida similar a los grupos oral e IN, indicando que en los ratones BALB/c la inmunización mixta también fue eficaz. Esto demostró el aumento considerable de respuestas inmunitarias protectoras debido a CT-CRM_{E29H}. Los ratones BALB/c en los tres grupos de inmunización mostraron una protección casi total a partir de la inoculación. PRAS fue del 99,6%, el 98,8% y el 98,8% para los grupos oral, IN y mixto, respectivamente (figura 14B). El grupo de control no inmunizado mostró antígeno considerablemente más viral que los tres grupos inmunizados (P=0). No hubo diferencias considerables entre los valores PRAS para los tres grupos inmunizados.
La inmunización IN indujo tanto respuestas sistémicas como de la mucosa en todos los ratones CD-1 inmunizados y protegió a estos animales (PRAS=97,9%) (Figura 14C). Solamente dos de cuatro ratones CD-1 inmunizados oralmente mostraron respuestas de anticuerpos sistémicos y de la mucosa y protección (2 de 3, PRAS del 65,8%) (figura 14C); por el contrario, todos los ratones BALB/c inmunizados oralmente mostraron respuestas de la mucosa y sistémicas y se protegieron. Especialmente, el ratón CD-1 que no produjo una respuesta inmunitaria no estuvo protegido contra infección, mientras que si estuvieron protegidos los ratones inmunosensibles (figura 14C). Un ratón en el grupo oral, sin respuesta de anticuerpos a inmunización, murió antes de la inoculación. Se emplearon dos ratones CD-1 como controles para reducir el número de muestras en el análisis de respuestas de anticuerpos. Sin embargo, los análisis estadísticos mostraron claramente que los resultados de protección fueron significativos (P=0, al 95% del nivel de confianza). El experimento de inmunización oral se repitió con los ratones CD-1 en las mismas condiciones, salvo que los animales fueron inoculados la semana 13 en lugar de la semana 26. Al utilizar cuatro ratones en los grupos inmunizados y cinco ratones como controles, se observó un nivel de protección similar (PRAS=71,2%) (datos no mostrados). Tomados juntos, estos resultados apoyan los recientemente publicados por O'Neal y col. (35, 35), que sugieren que en los ratones CD-1 la inmunización intranasal es más eficaz que la
inmunización oral.
A la vista de esta utilidad demostrada de CT-CRM_{E29H} como coadyuvante de vacuna, la producción de cantidades apropiadas de este material es deseable. Al usar pIIB29H (descrita en el ejemplo1), se hicieron diversos intentos de expresar CT-CRM_{E29H} en E. coli. El rendimiento resultante de la holotoxina de CT-CRM_{E29H} purificada fue de aproximadamente 50 \mug por litro de medio de cultivo. Los intentos iniciales para incrementar el rendimiento de CT-CRM_{E29H} por modificaciones al plásmido original, pIIB29H, para crear plásmido pX2492 (véase Ejemplo 1), mostró un efecto mínimo o nulo. Se llevó a cabo un incremento moderado en el rendimiento a través de la coexpresión de pIIB29H, y los derivados, con Vibrio cholerae Dsba y E. coli RpoH. La coexpresión y las modificaciones de purificación aumentaron el rendimiento de CT-CRM_{E29H} en aproximadamente 2 mg por litro.
Para incrementar la expresión de CT-CRM_{E29H}, se sustituyó el promotor inducible por lactosa con un promotor inducible por arabinosa (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), que se unió operativamente a la secuencia de ADN que codifica CT-CRM_{E29H}. Durante la clonación se determinó que el plásmido pIIB29H contenía un gen ctxA de la cepa 569B de Vibrio cholerae, unido a un gen ctxB de la cepa 2125 de V.c. La alineación en cruz de estos genes indicó siete sustituciones básicas entre los dos genes ctxB y un único cambio básico entre los genes ctxA. Diversas de estas sustituciones condujeron a cambios de aminoácidos en las subunidades maduras. De especial relevancia es la sustitución entre los genes ctxA que conduce a un cambio de aminoácidos dentro de la parte A-2, o el dominio del conjunto de holotoxinas de la subunidad A. No se supo si la heterogeneidad entre estos genes tuvo un impacto negativo sobre la expresión de toxinas o el conjunto de holotoxinas; sin embargo, se pensó preferible desde un punto de vista evolucionario que ambos genes de la subunidad de toxinas fuesen originarios de la misma fuente. Así pues, tanto los genes ctxA como ctxB utilizados en la construcción del sistema inducible por arabinosa son originarios de la cepa 569B de Vibrio cholerae. Se describe la construcción del plásmido pPX7490 en el ejemplo 12. La producción de CT-CRM_{E29H} a partir de pPX7490 es de aproximadamente 30 mg de material purificado por litro de
cultivo.
La invención se refiere, además, a plásmidos que contienen secuencias de ADN aislado y purificado que comprenden secuencias de ADN que codifican una holotoxina de cólera mutante e inmunogénica que tiene una sustitución diferente del ácido aspártico para el ácido glutámico en posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera, y en la cual tal secuencia de ADN se une operativamente a un promotor inducible por arabinosa, así como a células huésped apropiadas transformadas, transducidas o transfectadas con tales plásmidos por técnicas convencionales.
Se usan diversos sistemas vectores plasmídicos de células huésped para expresar la holotoxina del cólera inmunogénica mutante. El sistema vector, que preferiblemente incluye el promotor inducible por arabinosa, es compatible con la célula huésped usada. Las células huésped apropiadas incluyen bacterias transformadas con ADN plasmídico, ADN cosmídico o ADN bacteriófago; virus tales como el virus vaccinia y adenovirus; levaduras tales como células Pichia; células de insecto tales como las células Sf9 o Sf21; o líneas celulares de mamíferos tales como células de ovario de hámster chino; así como otros organismos convencionales.
Se pueden usar diversos elementos convencionales de transcripción y translación para el sistema vector de células huésped. El ADN que incluye la CT-CRM_{E29H} se inserta dentro de un sistema de expresión, y el promotor (preferiblemente el promotor inducible por arabinosa) y otros elementos de control están ligados en sitios específicos dentro del vector, de manera que cuando el vector plasmídico se inserta dentro de una célula huésped (por transformación, transducción o transfección, dependiente del sistema vector de células huésped usado), el ADN que codifica la CT-CRM_{E29H} se expresa mediante la célula huésped.
La holotoxina del cólera inmunogénica mutante se produce transformando, transduciendo o transfectando una célula huésped con un plásmido descrito anteriormente y cultivando la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína detoxificada recombinante inmunogénica por la célula huésped.
Aunque se ejemplifica esta invención mediante un mutante de CT-CRM_{E29H} que tiene una histidina en el aminoácido 29, otras mutaciones no conservadoras se encuentran también dentro del alcance de esta invención. El ácido glutámico es una molécula ácida (cargada negativamente). Por lo tanto, una mutación no conservadora será una en la cual se hace una sustitución a un aminoácido distinto del ácido aspártico, que también es una molécula ácida. Los aminoácidos alternativos apropiados incluyen los aminoácidos lisina y arginina que, como la histidina, son moléculas básicas (cargadas positivamente). Los aminoácidos alternativos apropiados incluyen, además, los aminoácidos con grupos funcionales no-polares tales como alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptfano y valina, y los aminoácidos con grupos funcionales polares no cargados tales como asparagina, cisteina, glutamina, glicina, serina, treonina y tirosina.
Una cantidad eficaz de la holotoxina mutante del cólera, en la cual la holotoxina tiene toxicidad reducida comparada con una holotoxina del cólera de tipo salvaje y tiene una sustitución distinta del ácido aspártico para el ácido glutámico en posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera, en combinación con un antígeno seleccionado a partir de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico, se usa para preparar una composición antigénica, en la cual dicha holotoxina potencia la respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado a dicho antígeno.
Las composiciones antigénicas de esta invención comprenden igualmente CT-CRM_{E29H} que contienen al menos una mutación adicional en una posición distinta del residuo de aminoácido 29. El documento de Solicitud Internacional WO 93/13202 (36) describe una serie de mutaciones en la subunidad A que sirve para reducir la toxicidad de la holotoxina del cólera. Estas mutaciones incluyen hacer sustituciones para la arginina en el aminoácido 7, el ácido aspártico en posición 9, la arginina en posición 11, la histidina en posición 44, la valina en posición 53, la arginina en posición 44, la valina en posición 53, la arginina en posición 63, la histidina en posición 70, la valina en posición 97, la tirosina en posición 104, la prolina en posición 106, la histidina en posición 107, el ácido glutámico en posición 110, el ácido glutámico en posición 112, la serina en posición 114, el triptofano en posición 127, la arginina en posición 146 y la arginina en posición 192. La secuencia nucleotídica que codifica la subunidad A de la holotoxina del cólera se expone en el documento de Solicitud Internacional WO 93/13202. El documento de Solicitud Internacional WO 98/42375 (37) describe la realización de una sustitución para la serina en el aminoácido 109 en la subunidad A, que sirve para reducir la toxicidad de la holotoxina del cólera. Por lo tanto, usando técnicas convencionales, se generan mutaciones en una o más de estas posiciones adicionales.
Las composiciones antigénicas de esta invención se administran a un vertebrado humano o no humano por una variedad de vías, que incluyen, pero no se limitan a, intranasal, oral, vaginal rectal, parenteral, intradérmica, transdérmica (véase, por ejemplo, Solicitud Internacional WO 98/20734 (38)), intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intravenosa y intraarterial. La cantidad del componente o componentes de antígeno de la composición antigénica variará dependiendo de la identidad del antígeno, así como de la edad, el peso y la afección médica del huésped, así como del procedimiento de administración. De nuevo, los expertos en la técnica determinan fácilmente las dosis apropiadas. Se prefiere, aunque no se requiere, que el antígeno y la CT mutante sean administrados al mismo tiempo. El número de dosis y el régimen de dosis para la composición antigénica también son fácilmente determinados por expertos en la técnica. La protección se puede conferir mediante una única dosis de la composición antigénica, o puede requerir la administración de diversas dosis, además de dosis de refuerzo en los últimos tiempos para mantener la protección. En algunos casos, la propiedad de coadyuvante de la CT mutante puede reducir el número de dosis necesarias o el curso temporal del régimen de dosificación.
Las composiciones antigénicas de esta invención pueden comprender, también coadyuvantes, además de CT-CRM_{E29H}. Los ejemplos de tales coadyuvantes incluyen, pero no se limitan a, Stimulon^{TM} QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Farmingham, MA); NPL^{TM} (monofosofrillípido A 3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio e IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Ma). Las composiciones antigénicas se pueden también mezclar con diluyentes inmunológicamente aceptables o vehículos de una manera convencional.
La holotoxina del cólera inmunogénica mutante de esta invención es apropiada para su uso como coadyuvante en composiciones antigénicas que contienen una gran variedad de antígenos a partir de una gran variedad de microorganismos patogénicos, que incluyen pero no se limitan a bacterias, virus, hongos u organismos parasíticos que infectan los humanos y los vertebrados no humanos. El antígeno puede comprender una célula entera o un virus, o uno o más sacáridos, proteínas, subunidades o fragmentos de proteína, poli- u oligonucleótidos, u otros componentes macromoleculares. Si se desea, las composiciones antigénicas pueden contener más de un antígeno del mismo o diferentes microorganismos patogénicos.
Las vacunas bacterianas deseables que incluyen los mutantes CT-CRM como coadyuvante incluyen los dirigidos a la prevención y/o tratamiento de enfermedad causada por, sin limitación, Haemophilus influenzae, (tanto tipificable como no-tipificable), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetan, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropenumoniae y Micoplasma gallisepticum
Las vacunas virales deseables que incluyen los mutantes de CT-CRM como coadyuvante incluyen los dirigidos a la prevención y/o el tratamiento de enfermedad causada por, sin limitación, virus sincicial respiratorio, virus parainfluenza tipos 1-3, virus influenza, virus de Herpes simplex, citomegalovirus humano, virus de inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, papilomavirus humano, poliovirus, rotavirus, calicivirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubéola, adenovirus, virus de la rabia, virus del moquillo canino, coronavirus, parvovirus, virus de la rinotraqueitis canina'' virus de la leucemia felina, virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino, virus de artritis equina y diversos virus de encefalitis.
Las vacunas deseables contra patógenos fúngicos que incluyen los mutantes CT-CRM como coadyuvante incluyen las dirigidas a la prevención y/o el tratamiento de enfermedad causada por, sin limitación, Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus e Histoplasma.
Las vacunas deseables contra parásitos que incluyen los mutantes CT-CRM como coadyuvante incluyen las dirigidas a la prevención y/o el tratamiento de enfermedad causada por, sin limitación, Leshmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii y Pneumocystis carinii.
Los mutantes CT-CRM también son apropiados para su inclusión como coadyuvante en vacunas polinucleotídicas (también conocidas como vacunas de ADN). Tales vacunas pueden, además, incluir facilitar agentes tales como bupivicaina (véase la patente de los Estados Unidos Número 5.593.972.
Se comparó CT-CRM_{E29H} con CT de tipo salvaje como un coadyuvante para la administración de ADN plasmídico (ADNp) que codifica la glicoproteína D de longitud total del virus del herpes simplex (HSV de tipo 2 (gD2), formulada con bupivicaina (40). Los resultados indicaron que los ratones BALB/c que recibieron CT-CRM_{E29H} junto con vacuna de ADNp para HSV-2 por vía intradérmica generaron una respuesta celular media superior a los que recibieron la vacuna ADNp HSV gD2 en si por la vía intradérmica (Tabla 34). Además, la respuesta media de anticuerpos de suero para ratones que recibieron la vacuna de ADNp HSV gD2 junto con CT-CRM_{E29H} fue aproximadamente del mismo nivel que el observado para los ratones que recibieron la vacuna de ADNp HSV gD2 sin coadyuvante
(Tabla 35).
Igualmente, la vacuna ADNp HSV gD2 generó una respuesta de anticuerpos específicos de gD2 en muestras de lavado vaginal a niveles que se pudiesen comparar con las observadas después de la administración de la vacuna sin coadyuvante por vías intradérmica o intramuscular (Tabla 36).
Los ratones inmunizados con la vacuna ADNp HSv gD2 con el coadyuvante CT-CRM_{E29H} o CT y administrada por la vía intradérmica generó niveles sustancialmente superiores de gama interferón a los de los ratones que recibieron la vacuna de ADNp HSV-gD2 sin coadyuvante (Tabla 37). Los ratones que recibieron CT-CRM_{E29H} también generaron IL-5.
De este modo, CT-CRM_{E29H} potenció las respuestas de gamma interferón y proliferativas cuando se administró con una vacuna de ADN plasmídico contre HSV.
Con el fin de que esta invención se pueda entender mejor, se pueden establecer las siguientes muestras. Los ejemplos tienen carácter ilustrativo únicamente y no están constituidos para limitar el alcance de la invención.
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Ejemplos Ejemplo 1 Expresión de los Mutantes CT Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento.
E. coli (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), y TX1, un derivado resistente a ácido nalidixico de TG1, que lleva FTc, lacI^{q} a partir de azul de XL1 (Stratagene, LaJolla, CA; (41)) y CJ236 (FTc, lacI^{q} (Bio-Rad, Hercules, CA) donde se usaron como huéspedes para clonar plásmidos recombinantes y expresión de proteínas mutadas. Las cepas que contienen plásmidos se mantuvieron sobre placas de agar LB con antibióticos como se requiere (ampicilina, 50 \mug/ml); canamicina 25 \mug/ml; tetraciclina 10 \mug/ml). Un operón de CT completo de V. Cholerae 0395 se subclonó dentro del vector fagómido pSKII^{-} bajo el control del promotor lac, para crear el plásmido inducible por IPTG designado Pmgj67 (42).
Mutagénesis del gen ctxA
El procedimiento de Kunkel (43) se usó para seleccionar mutantes derivados de oligonucleótidos creados en el plásmido pMGJ67. Los oligonucleótidos usados para generar los cinco CRM mutantes se describen en la Tabla 1.
TABLA 1 Secuencia de Oligonucleótidos Introducidos en ctxA
1
2
En resumen, cada oligonucleótido de hebra simple se fosforiló y se usó para dirigir la síntesis de la segunda hebra sobre un ADN de plantilla de hebra simple que contiene uracilo rescatado de la cepa E. coli dut ung CJ236 (F'Tc, pMGJ67). Después de la ligación y la transformación de las cepas ung^{+} TX1, el ADN de hebra simple se rescató de los transformantes Amp^{R} y se secuenció por el procedimiento de terminación de cadena dideoxi (44).
Construcción del plásmido que codifica CT-CRT_{E29H}
El plásmido que codifica CR-CRM_{E29H} se designa pIIB29H. El plásmido contiene el policistrón de genes de V. cholerae ctxA y ctxB que codifican CT. El gen ctxA en este plásmido se mutagenizó como se ha descrito anteriormente para codificar una histidina en la posición 29 de aminoácido de CT-A. El policistrón de tipo salvaje también se modificó retirando el promotor inducible por ToxR nativo y sustituyéndolo con un promotor inducible por lactosa. Además, las regiones que codifican las secuencias de señales ctxA y ctxB se sustituyeron con la región que codifica las secuencias de señal de E. coli LT (conductor LTIIb-B) para promover la secreción de CR-CRM_{E29H}. A continuación el plásmido pIIB29H sed modificó en un intento de incrementar la expresión de CR-CRM_{E29H}. El plásmido resultante, designado pPX2492, contenía secuencias sintéticas de Shine Dalgarno corriente arriba de cada uno de ctxA y ctxB Los dos genes se separan genéticamente en pPX2492, a diferencia de en V. cholerae donde los genes se solapan. Los dos genes también tienen la secuencia directora LTIIb-B corriente arriba de cada uno.
Expresión de alelos mutantes de ctxA
La producción de cada holotoxina variante se ensayó en 5 ml de cultivos de medio TB (45) en matraces Erlenmeyer de 125 ml a 37ºC revolviendo (250 rpm). Se indujeron las células en fase logarítmica (A_{600} = 0,8-1,0) mediante la adición de IPTG a 0,4 mM, seguido de cultivo durante una noche. Se añadió polimixina B a 1 mg/ml, seguido de incubación durante 10 minutos a 37ºC. Las células se eliminaron por centrifugación, y se ensayaron los sobrenadantes para determinar las concentraciones de holotoxina y pentámero B como se describe a continuación.
Específicamente, la producción de incrementar la expresión de CR-CRM_{E29H}. El plásmido resultante, designado pX en E. coli implica la co-expresión de los genes rpoH de E. coli y dsbA de V. cholerae. Estos productos génicos participan en la maduración conformacional tanto de las subunidad A como de la subunidad B de CT.
Ejemplo 2 El ensayo de unión a GM1 para holotoxina intacta
Los CR-CRM se examinaron en un radioinmunoensayo (42) en fase sólida dependiente de gangliósido GM_{1} para determinar si la holotoxina intacta estaba presente después de la purificación. Se uso un ensayo inmunoabsorbente inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) donde los micropocillos de placa ELISA se cubrieron durante una noche a 4ºC con gangliósido GM_{1} (10 \mug/ml). Después, se añadieron los siguientes reactivos en secuencia con un intervalo de una incubación de una hora a temperatura ambiente: CR-CRM (valorada a partir de 3 \mug (ml a 0,00137 \mug/ml), 100 \mul de sueros anti-CT-A de conejo (1:1.000), y anticuerpo de cabra anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina (1:2.000). Para visualizar la reacción, se añadió 100 \mul de fosfato de p-nitrofenilo a 1\mug/ml en dietanolamina y se incubó durante 30 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 100 \mul de NaOH 2N y se leyó inmediatamente mediante autoreader de Microelisa. Cuando se comparó con la CT de tipo salvaje, los datos indicaron que las CT-CRM con sustituciones de aminoácidos en posiciones 7, 29, 110 o 112 eran holotoxinas intactas (figura 1). Los resultados implicaron, sin embargo, que una parte de CR-CRM_{R11K} no parecía ser una holotoxina.
Ejemplo 3 Ensayo de células suprarrenales Y-1 para toxicidad residual de CT-CRM
Las CT-CRM mutantes se compararon varias veces con holotoxina de tipo salvaje para toxicidad en el ensayo de células tumorales suprarrenales Y-1 de ratón. Las células suprarrenales Y-1 (ATCC CLL-79) se cultivaron en placas de fondo plano de 96 pocillos, a una concentración de 10^{4} células por pocillo. Después, se añadieron tres veces diluciones en serie de CT-CRM a las células tumorales y se incubaron a 37ºC (CO_{2} al 5%) durante 18 horas. Las células se examinaron a continuación bajo microscopia óptica para probar la toxicidad (envoltura celular). Se definió el valor cuantitativo de criterio de valoración como la concentración mínima de toxina requerida para proporcionar más del 50% de la envoltura celular. El porcentaje de toxicidad residual se calcula usando el valor cuantitativo de criterio de valoración de CT de tipo salvaje dividido por el valor cuantitativo provocado por CT-CRM multiplicado por 100. La Tabla 2 representa la toxicidad residual de diversas holotoxinas mutantes purificadas ensayadas en el ensayo de células suprarrenales Y-1.
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TABLA 2 La toxicidad para células suprarrenales Y-1
3 
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Ejemplo 4 Ensayo de peso de intestino de los ratones de la patente
En este ensayo, se administró 10 \mug de CT de tipo salvaje o CT-CRM_{E29H} por vía intragástrica a cada grupo de ratones BALB/c (tres ratones por grupo). Se retiraron los intestinos con cuidado tres horas más tarde y se pesaron. Los resultados se presentan en la Tabla 3. Los datos se presentan como la relación ponderal media de intestino/animal muerto por grupo
TABLA 3 Toxicidad de CR-CRM_{E29H}
4 
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Ejemplo 5 El ensayo de ADP-ribosiltransferasa
Se midió la NAD^{+}: actividad de agmatina ADP-ribosiltransferasa como la liberación de [carbonil-^{14}C] nicotinamida de NAD^{+} radiomarcado. En breve, CT y CR-CRM se activaron con tripsina y se incubaron durante 30 minutos a 30ºC con 50 mM de glicina/20 mM de ditiotreitol en tampón TEAN (Tris^{TM}/EDTA/azida sódica (cloruro sódico) pH 8,0). Después, se añadieron los siguientes materiales a la reacción: 0,1 mg de inhibidor de la tripsina de soja, 50 mM de fosfato potásico, 10 mM de agmatina, 20 mM de ditiotreitol, 10 mM de cloruro magnésico, 100 \muM de GTP, 3 mM de dimiristoilfosfatidil-colina, colato al 0,2%, 0,03 mg de ovalbumina, 100 \muM [adenina-U-^{14}C]NAD (Dupont NEN^{TM}, Boston, MA) y agua a un volumen final de 300 \mul. Después de la incubación durante 90 minutos a 30ºC, se aplicaron 100 \mul de muestras a columnas (0,64 x 5 cm) de AG1-X2) (Bio-Rad) que se lavaron cinco veces con 1,0 ml de H_{2}O destilada/desionizada. Los eluados que contienen [^{14}C]ADP-ribosilagmatina se recogieron para radioensayo. La recuperación media de ^{14}C en el eluado se expresa como porcentaje de lo aplicado a la columna. Los resultados se presentan en la Tabla 4.
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TABLA 4 NAD:Actividad de Agmatina ADP-Ribosiltransferasa
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Ejemplo 6 Las respuestas inmunitarias de ratones BALB/c inmunizados con proteínas de membrana exteriores de P4 y P6 recombinantes (r) de Haemophilus influenza no tipificable (THi)
En un primer experimento, se inmunizaron cinco ratones BALB/c por grupo por vía intranasal los días 0, 21 y 35 más una dosis de 10 \mul que contiene 5 \mug o 10 \mug de rP6, más 1 \mug del coadyuvante como se indica en las Tablas 5 y 6 (un grupo no recibió coadyuvante). Se determinaron las valoraciones de anticuerpos IgG por ELISA en muestras agrupadas recogidas en la Tabla 5. Se determinaron por separado Los valores cuantitativos de anticuerpos IgG anti-rP6 sobre muestras agrupadas recogidas los días 0, 21, 35 y 48 y los resultados se muestran en la Tabla 6. La respuestas de anticuerpos de la mucosa a rP4 también se midieron dos semanas después de la última inmunización (día 49). La Tabla 7 indica las valoraciones de IgA e IgG de fluidos de lavado broncoalveolares y vaginales, respectivamente.
En un segundo experimento, se inmunizaron cinco ratones BALB/c por grupo por vía intranasal los días 0, 21 y 35 con una dosis de 30 \mul que contiene 5 \mug de rP4 o 10 \mug de rp6 más dosis ascendientes de CT-CRM_{E29H} como se indica en la Tabla 8 (otros grupos recibieron cada uno CT o CT-B; un grupo no recibió coadyuvante). Se determinaron las valoraciones de anticuerpos IgA e IgG anti-rp4 en suero por ELISA sobre muestras agrupadas recogidas los días 21, 35 y 48 y los resultados se muestran en la Tabla 8. Se determinaron también las valoraciones de IgA e IgG de fluidos de lavado broncoalveolares y vaginales el día 49 y se muestran en la Tabla 8.
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TABLA 5 Las respuestas inmunitarias sistémicas humorales de ratones BALB/c inmunizados^{a} con proteínas^{b} P4 y P6 recombinantes formuladas con holotoxinas mutantes del cólera 
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TABLA 6 Las respuestas inmunitarias sistémicas humorales de ratones BALB/c inmunizados^{a} con proteínas^{b} P4 y P6 recombinantes formuladas con holotoxinas mutantes del cólera 
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TABLA 7 Las respuestas de anticuerpos de la mucosa de ratones BALB/c inmunizados^{a} con proteínas^{b} P4 y P6 recombinantes formuladas con holotoxinas mutantes del cólera 
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Ejemplo 7 Las respuestas inmunitarias de ratones BALB/c inmunizados con proteína Haps nativas de NTHi
La cepa de NTHi P8660295 (46) se obtuvo del Dr. Charles Brinton, de la Universidad de Pittsburg. Se obtuvo a partir de la nasofaringe de un niño con otitis media inducida por NHTi. La cepa TN106 de NTH1 (47) se obtuvo por el Dr. Eric Hansen, de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center en Dalas. Se derivó un mutante resistente de estreptomicina de TN106 por selección sobre placas BHI-XV que contienen 100 \mug/ml de estreptomicina (Sigman, St. Louis, MO). Este mutante fue pasado dos veces en la nasofaringe de ratones Balb/c y se congeló como cepa TN106-P2.
La proteína Hap_{s} de la cepa P860295 de NTHi se purificó como sigue. La cepa P860295 de NTHi se cultivó en el medio BHI-XV durante 18 horas a 35ºC con aireación. Las células bacterianas se peletizaron por centrifugación, 10k x g a 4ºC, y se descartaron. El sobrenadante se llevó a una saturación del 60% con (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido, mantenido a temperatura ambiente durante 2-3 horas, y el precipitado se recogió por centrifugación. El precipitado se disolvió en 50 mM de tampón fosfato sódico, pH 5,8, 1 mM de EDTA, 50 mM de NaCl (Tampón 1), y se dializa a 4ºC contra el tampón anterior. Una columna de CM Sepharose^{TM} de volumen de lecho de 10 ml (Pharmacia, Piscataway, NJ) se equilibró con Tampón 1, y se cargó 30 ml del material soluble anterior en la columna a un caudal de 1 ml/min. La columna se lavó con Tampón 1 hasta que el OD_{280} alcance la línea base. Se descartó el material inutilizado. Las proteínas de unión se eluyeron a partir de la resina usando un gradiente de tres etapas: (1) tampón fosfato sódico, pH 7,0, 1 mM de EDTA, 50 mM de NaCl; (2) tampón fosfato sódico, pH 8,0, 1 mM de EDTA, 50 mM de NaCl y (3) tampón fosfato sódico, pH 8,0, 0,5 M de NaCl, 1 mM de EDTA. Las proteínas eluidas en cada etapa se agruparon y se guardaron para su análisis. El análisis SDS-PAGE de las reservas indicaron que la proteína Hap_{s} se eluyeron en las etapas 2 y 3 del gradiente. Estas reservas contenían HAP_{s} muy purificado y se combinaron.
A continuación se inmunizaron IN ratones Balb/c hembra (diez por grupo) de seis semanas de vida con Hap_{s} purificado a partir de la cepa P860295 de NTHi. La proteína Hap_{s} se diluyó en D-PBS a 5 o 15 \mug/40 \mug con o sin CT-CRM_{E29H}. Allí donde se uso, la CT-CRM_{E29H} se uso a una dosificación de 0,1 \mug/ratón. Las formulaciones de control que contenían CT-CRM_{E29H} en D-PBS, D-PBS solo y TN106.Pe fijado en formalina (la cepa de inoculación con NTHi) también se administraron a los ratones en volúmenes de 40 \mul.
Antes de la inmunización IN, se anestesiaron los ratones y a continuación se inmunizaron por inoculación intranasal de 20 \mul/fosa nasal de una pipeta. Se posicionó la pipeta para que la punta tocase la abertura de la fosa nasal y se introdujo automáticamente la formulación en la fosa nasal durante la respiración. Los ratones se colocaron en una posición supina de manera que las narices no tocasen nada después de la administración de la formulación o la inoculación. Se inmunizó a los ratones las semanas 0, 1, 3 y 5. Los sueros se retiraron la semana 7. Los resultados se muestran en la Tabla 9.
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TABLA 9 Respuesta inmunitaria sistémica humoral en ratones Balb/c después de inmunización intranasal con Hap_{s} mezclado con o sin CT-CRM_{E29H}
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Ejemplo 8 Las respuestas inmunitarias de ratones BALB/c y C57B1/6 inmunizados con la proteína (r) ureasa recombinante de Helicobacter pylori
En un primer experimento, se inmunizaron cinco ratones BALB/c por grupo como sigue: se inmunizaron siete grupo por vía intragástrica los días 0, 2, 14 y 16 con 100 \mug de rUreasa más 10 \mug del coadyuvantes como se indica en las Tablas 10-12. Se inmunizó un grupo con 10 \mug de rUreasa por vía subcutánea en el trasero; se inmunizó otro grupo con 10 \mug de rUreasa por vía subcutánea en el cuello; ambos grupos recibieron también 20 \mug de Stimulon^{TM} QS-21 como coadyuvante los días 0 y 16. Las valoraciones de anticuerpos anti-rUreasa se determinaron por Elisa en muestras agrupadas recogidas el día 28. Los resultados de IgG se muestran en la Tabla 10 y los resultados de IgA se muestran en la Tabla 11. Las respuestas de anticuerpos de la mucosa a rUreasa también se midieron el día 29. La Tabla 12 indica las valoraciones de IgA e IgG de fluidos de lavados broncoalveolares y vaginales, respectivamente.
En un segundo experimento, se evaluó la capacidad de la rUreasa más el coadyuvante para proteger los ratones contra una inoculación con H. Felis. Se inmunizaron diez ratones BABL/c por grupo como sigue: se inmunizaron dos grupos por vía intragástrica los días 0, 2, 14 y 16 con 100 \mug de rUreasa más 10 \mug del coadyuvante como se indica en la Tabla 13. un grupo de control recibió PBS en lugar de rUreasa más 10 \mug de coadyuvante. Se inmunizó un grupo por vía subcutánea los días 0 y 16 con 10 \mug de rUreasa más 20 \mug de Stimulon^{TM} QS-21. Se determinaron las valoraciones de anticuerpos anti-rUreasa por ELISA sobre muestras agrupadas recogidas el día 28. También se inocularon los ratones con tres dosis de 108 H. felis los días 29, 31 y 34 y se sometieron a ensayo de protección el día 44. Se evaluó la protección por la prueba rápida de ureasa. En la prueba rápida de ureasa, se incubó medio estómago a 37ºC durante cinco horas en 0,5 ml del medio de prueba de ureasa que contenía el 2% de urea y rojo de fenol, un indicador de pH, a 7 \mug/ml. La actividad ureasa genera amoniaco y bicarbonato a partir de urea elevando de este modo el pH e induciendo un cambio colorimétrico de la solución con una mayor absorbencia a 550 nm. Se midió el nivel de actividad ureasa por análisis espectrofotométrico. El ensayo se considero positivo para H. felis cuando el significado de los valores de absorbencia fueron dos desviaciones estándar por encima de los obtenidos para los tejidos gástricos de ratones no infectados. Los resultados se muestran en la Tabla 13.
En un tercer experimento, se inmunizaron dos grupos de ratones C57BL/6 (cinco por grupo) por vía intragástrica los días 0, 2, 14 y 16 con 100 \mug de rUreasa más 10 \mug del coadyuvante como se indica en la Tabla 14. Se inmunizó un tercer grupo por vía subcutánea los días 0 y 16 con 10 \mug de rUreasa más 100 \mug de alumbre. Se inmunizó un cuarto grupo por vía intragástrica los días 0, 2, 14 y 16 con 100 \mug de rUreasa, pero sin coadyuvante. Se determinaron las valoraciones de anticuerpos anti-rUreasa por ELISA sobre muestras agrupadas recogidas los días 28. La Tabla 14 expone las valoraciones de IgA e IgG de sueros, fluido de lavado broncoalveolar, extracto de sedimento fecal y fluido de lavado vaginal, respectivamente.
En un cuarto experimento, se inmunizaron cinco ratones C57BL/6 como sigue: Se inmunizaron tres grupos de ratones por vía intragástrica los días 0, 2, 14 y 16 con 100 \mug de rUreasa más 10 \mug del coadyuvante como se indica en la Tabla 15; un cuarto grupo no recibió coadyuvante. Se determinaron las valoraciones de anticuerpos anti-rUreasa por ELISA sobre muestras agrupadas recogidas el día 29. Los resultados de IgA e IgG se muestran en la Tabla 15. La Tabla 15 también presenta las valoraciones de IgE (PCA) y totales de IgE. PCA indica que se determinaron las valoraciones de anticuerpos IgE por reacción pasiva de anafilaxis cutánea. Se llevó a cabo el PCA sobre ratas hembra Sprague-Dawley. Se sedaron las ratas con quetamina/xilazina, se rasuraron, y se les inyecto por vía intradérmica 0,1 ml de sueros (diluido cuatro veces en serie) de los ratones C57Bl/6 inmunizados con rUreasa formulada con CT-LT, o CT-CRM_{E29H}. Se sedaron las ratas 48 a 60 horas más tarde y a continuación se les inyecto (0,1 ml) por vía intravenosa en la vena de la cola 2 \mug de rUreasa en PBS que contiene el 1% de azul de Evan.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA 10 El efecto de CT-CRM sobre la generación de valoraciones de anticuerpos IgG anti-Ureasa sistémicos en ratones BALB/c
12
120
TABLA 11 El efecto de CT-CRM sobre la generación de valoraciones de anticuerpos IgA anti-Ureasa sistémicos en ratones BALB/c
13
130
TABLA 12 El efecto de CT-CRM sobre la generación de valoraciones de anticuerpos IgA anti-Ureasa en las secreciones de la mucosa de ratones BALB/c
14
TABLA 13 La generación de respuestas inmunitarias protectoras en ratones BALB/c inmunizados con ureasa recombinante formulada con CT o CT-CRM_{E29H}
15
16
TABLA 15 La generación de anticuerpos IgE específicos de ureasa en la circulación de ratones C57Bl/6 inmunizados con ureasa recombinante preparada con CT;LT o CT-CRM_{E29H}
18
Ejemplo 9 Las respuestas inmunitarias de ratones Swiss-Webster inmunizados con pilina recombinante de clase 1 y proteína de membrana exterior de clase 1 de Nesseria meningitidis
En un primer experimento, se inmunizaron IN ratones Swiss-Webster de 6-8 semanas de vida (15 por grupo) (10 \mul) las semanas 0, 2 y 5 con 5 \mug de pilina recombinante de clase 1 (rpilina) formulada con CT-CRM_{E29H} (0,1 o 1 \mug/ratón). Se recogieron muestras de suero, fluidos de lavado broncoalveolares (BAW), fluidos de lavado nasales (NW) y fluidos de lavado vaginales (VW) de cinco ratones en cada grupo para la determinación de anticuerpo de IgA e IgG de suero y de la mucosa específicos a pilina de N. meningitidis por ELISA en la semana 4. Los resultados se presentan en la Tabla 16. Los diez ratones restantes en cada grupo inmunizado se inocularon IN en paralelo con 2 x 10^{7} CFU ( de la cepa homóloga H355P^{+}.p2IR de N. Meningitidis (impuesta dos veces a ratas jóvenes) en la semana 4. Se determinó la recuperación de N. meningitidis de Grupo B del tejido nasal 24 horas después de la inoculación por cultivo cuantitativo, como se muestra en la figura 2.
En un segundo experimento, la protección de rpilina formulada con CT-CRM_{E29H} contra una cepa homóloga de meningococo se comparó con la de CT-CRM_{E29H} mezclada con una proteína no relacionada, KLH. Se inmunizaron IN (volumen de 10 \mul) grupos de cinco ratones Swiss-Webster (seis semanas de vida) con 5 \mug de rpilina con o sin CT-CRM_{E29H} (0,1 \mug), o con PorA H355 con CT-CRM_{E29H} (0,1 \mug) en las semanas 0, 2 y 3. Los grupos de control no estaban inmunizados (grupo virgen) o se inmunizaron IN con KLH (5 \mug) más CT-CRM_{E29H} (0,1 \mug). Las valoraciones de criterios de valoración se determinaron por Elisa específica de antígeno y células enteras sobre muestras agrupadas de suero recogidas las semanas 4 antes de la inoculación con 1 x 10^{7} CFU de la cepa H355P^{+} de meningococo. Los resultados se presentan en las Tablas 17 y 18.
En un tercer experimento, se evaluó la inmunogenicidad de PorA de meningococo formulada con CT-CRM_{E29H} para inmunización IN. Se inmunizaron IN cinco ratones Swiss-Webster por grupo las semanas 0, 2 y 3 con 20 \mug/dosis de Por A de la cepa H44/76 de meningococo con o sin CT-CRM_{E29H} (1\mug/dosis) como se indica en la Tabla 19. Se ensayaron las valoraciones de anticuerpos de H44/76 anti-PorA y ELISA de células enteras para IgG en muestras agrupadas de sueros y de la mucosa recogidas la semana 4 del experimento. Los resultados se presentan en la Tabla 19.
En un cuarto experimento, se evaluó la capacidad de rpilina y PorA con coadyuvante CT-CRM_{E29H} para proteger ratones contra la inoculación de una cepa heteróloga de meningococos. Se inmunizaron IN (volumen de 10 \mug) diez ratones Swiss-Webster por grupo con 5 \mug de rpilina, PorA de la cepa H355 o PorA de la cepa 870227, formulada con CT-CRM_{E29H} (0,1 \mug) las semanas 0, 2 y 3. Los grupos de control fueron células enteras termoinactivadas de la cepa 870227 de meningococos o KLH (5 \mug) más CT-CRM_{E29H} (0,1 \mug). Se determinaron las valoraciones de IgG e IgA por Elisa específico de antígeno y células enteras sobre muestras de sueros recogidas las semanas 4 antes de la inoculación con la cepa 870227. Los resultados se presentan en las Tablas 20 y 21. Se determinó la recuperación bacteriana del tejido nasal por cultivo cuantitativo 24 horas después de la inoculación con la cepa 870227 y se expresó como Log_{10} CFU \pm desviación estándar. Los resultados se muestran en la figura 4.
Se llevó a cabo un quinto experimento para examinar el potencial de CT-CRM_{E29H} como coadyuvante para inmunización parenteral. Se inmunizaron por vía subcutánea grupos de 10 ratones hembra Swiss-Webster, de 5-6 semanas de vida con 5 \mug de PorA H355 formulada con CT-CRM_{E29H} (10 \mug) o MPL^{TM} (100 \mug) las semanas 0 y 4. Los grupos de control se inmunizaron por vía subcutánea con células enteras termoinactivadas desde la cepa 870227 de meningococos o KLH (5 \mug) más MPLTM (100 \mug). Se inocularon IN ratones con 1,2 x 107 CFU de la cepa 870227 de meningococos la semana 6. Veinticuatro horas después de la inoculación, se sacrificaron los ratones y los tejidos nasales se homogeneizaron y depositaron en un medio selectivo. Se contaron las colonias después de la incubación a 37ºC durante una noche y se expresaron con Log10 CFU \pm desviación estándar. Los resultados de este experimento se presentan en la Tabla 22 y la figura 5.
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TABLA 16 Efectos coadyuvantes de CT-CRM_{E29H} sobre respuestas inmunitarias sistémicas y de la mucosa a rpilina de N. meningitidis (Clase I H44/76) en ratones Swiss-Webster
19
TABLA 17 E efecto de CT-CRM_{E29H} sobre la respuesta inmunitaria a antígenos de meningococos en ratones Swiss-Webster
20 
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TABLA 18 E efecto de CT-CRM_{E29H} sobre la respuesta inmunitaria a antígenos de meningococos en ratones Swiss-Webster
22
TABLA 19 Respuestas inmunitarias de ratones Swiss-Webster inmunizados por vía intranasal con CT-CRM_{E29H} y PorA de meningococos
23
TABLA 20 Respuestas inmunitarias de ratones Swiss-Webster de ratones inmunizadas por vía intranasal con PorA de meningococos heterólogo y homólogo y rPilina con CT-CRM_{E29H}
24
TABLA 21 Respuestas inmunitarias de ratones Swiss-Webster de ratones inmunizadas por vía intranasal con PorA de meningococos heterólogo y homólogo y rPilina con CT-CRM_{ E29H}
25
TABLA 22 Actividad bacteriana N. meningitidis de sueros de ratones inmunizados por vía subcutánea con PorA con CT-CR_{E29H} o MPL^{TM} 
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26 
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Ejemplo 10 Las respuestas inmunitarias de ratones BALB/c inmunizados con la Glicoproteína de fusión (F) nativa purificada del virus sincicial respiratorio (RSV)
En un primer experimento, se inmunizaron ratones B ABL/c de 6-8 semanas de vida por vía intranasal (10 \mul) las semanas 0 y 14 con \mug de proteína nativa purificada formuladas con CT-CRM_{E29H} (1 \mug o 10 \mug/ratón), CT de tipo salvaje (1 \mug/ratón), CT-B (1 \mug o 10 \mug/ratón) o sin coadyuvante. Se ensayaron anticuerpos IgG e IgA de criterios de valoración, por ELISA, el día 24 del experimento. Las valoraciones se obtuvieron a partir de sueros, fluidos de lavado broncoalveolares y vaginales. Los resultados se presentan en la Tabla 23.
En un segundo experimento, se preinmunizaron por vía intranasal (50 \mul) ratones BALB/c de 6-8 semanas de vida (5 ratones/grupo) con CT de tipo salvaje (1 \mug/ratón) o CT-CRM_{E29H} (1 \mu/ratón) los días 0 y 14. Los grupos de control no se preinmunizaron. Después. Los días 28 y 32, todos los ratones se inmunizaron por vía intranasal con 3 \mug de proteína F formulada con las mismas cantidades de CT- o CT-CRM_{E29H}. Las valoraciones de anticuerpos de criterios de valoración por ELISA sobre muestras agrupadas recogidas los días 56 (sueros) y 57 (fluidos de lavado broncoalveolares y vaginales). Los resultados se presentan en la Tabla 24.
En un tercer experimento, se inmunizaron por vía intranasal (IN) ratones BALB/c de hembra sin tratamiento previo (6-8 semanas de vida, 5 ratones por grupo) las semanas 0, 1 y 2 con proteína (F) de fusión nativa de RSV A2. Se prepararon inmunizaciones formulando proteína F (3 \mug/ratón) con CT-CRM_{E29H} (1 \mug o 10 \mug/ratón), CT-B (1 \mug o 10 \mug/ratón) o alumbre (100 \mug/ratón). La vacuna se administró por vía intranasal permitiendo que los ratones anestesiados aspiren la vacuna dispuesta en la punta de la fosa nasal. Le volumen total por dosis fue de 10 \mul por ratón (en la Tabla 25), las semanas 0, 1 y 2. Los ratones de control recibieron inmunización primaria intramuscular que contenía F/AlOH o recibieron inmunizaciones primarias y secundarias de RSV A2 vivo, administradas por vía intranasal. Se ensayaron respuestas inmunitarias sistémicas y humorales, por ELISA, nueve días (para las Tablas 25 y 26) después de la inmunización terciaria. También se recogieron fluidos de lavado broncoalveolares, vaginales y nasales y se utilizaron en la caracterización de respuestas de anticuerpos de la mucosa. Se usaron bazos de ratones inmunizados para ensayar actividad de células asesinas dependiente de antígeno contra células diana infectadas por RSV. Se inoculó una segunda cohorte de ratones, que habían recibido un programa idéntico de inmunización, con RSV vivo. A continuación se analizó la protección de los compartimentos del pulmón dentro de esta cohorte 4 días después de la inoculación por determinación de placas de virus en tejido pulmonar homogeneizado recogido. Se llevaron a cabo análisis estadísticos usando ANOVA. Los resultados se presentan en la Tablas
25 y 26.
En un cuarto experimento, se inmunizaron por vía intranasal ratones BALB/c las semanas 0, 1 y 2 con proteína F de RSV purificado (3 \mu/ratón) en combinación con CT-CRM_{E29H} (1 \mug o 10 \mu/ratón), CTB (1 \mug o 10 \mug/ratón) o PBS. Como control, los ratones también recibieron por administración intranasal RSV o por administración intramuscular F/AlOH. Se aislaron esplenocitos nueve días después de la inmunización final y se estimularon in vitro con células estimuladoras infectadas con RSV singénico. Después de seis días en cultivo, se determino actividad de células asesinas dependientes de antígeno por cuantificación de ^{51}Cromo liberado por célula diana infectada por RSV. Los resultados se presentan en la figura 6.
En un quinto experimento, un ensayo de protección viral, se aislaron los compartimentos pulmonares de ratones inmunizados cuatro días después de la inoculación con RSV vivo, se homogeneizaron, y se llevó a cabo una cuantificación del virus infeccioso. Se inmunizaron por vía intranasal ratones BALB/c con vacunas que contenían proteína F purificada de RSV y CT-CRM_{E29H}, CTB ó PBS. Igualmente se inmunizaron grupos de ratones por vía intramuscular con F/AlOH como control. Ocho días después de la inmunización final (tres semanas después de la vacuna F/AlOH) se inocularon ratones con RSV vivo. Cuatro días más tarde, se extirparon tejidos pulmonares y se utilizaron en la cuantificación de virus infeccioso. Los resultados se presentan en la figura 7.
En un sexto experimento, se inmunizaron por vía intranasal (IN) ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de vida, 5 ratones por grupo) las semanas 0, 1 y 2 con proteína (F) de fusión nativa purificada de RSV 2. Se prepararon inmunizaciones formulando proteína F (3 \mug/ratón) con CT-CRM_{E29H} (1 \mug \mug/ratón) o alumbre (100\mug/ratón). La vacuna se administró por vía intranasal permitiendo que los ratones anestesiados aspirasen la vacuna dispuesta en la punta de la fosa nasal. Le volumen total por dosis fue de 5 \mul por ratón (en la Tabla 27), las semanas 0, 1 y 2. Los ratones de control recibieron inmunización primaria intramuscular que contenía F/AlOH o recibieron inmunizaciones primarias y secundarias de RSV A2 vivo, administradas por vía intranasal. Se ensayaron respuestas inmunitarias sistémicas y humorales, por ELISA, dos semanas (para las Tablas 27 y 28) después de la inmunización terciaria. También se recogieron fluidos de lavado broncoalveolares, vaginales y nasales y se utilizaron en la caracterización de respuestas de anticuerpos de la mucosa. Se usaron bazos de ratones inmunizados para ensayar actividad de células asesinas dependiente de antígeno contra células diana infectadas por RSV compatible con MHC. Se inoculó una segunda cohorte de ratones, que habían recibido un programa idéntico de inmunización, con RSV vivo. A continuación se analizó la protección de los compartimentos del pulmón dentro de esta cohorte 4 días después de la inoculación por determinación de placas de virus en tejido pulmonar homogeneizado recogido. Se llevaron a cabo análisis estadísticos usando ANOVA. Los resultados se presentan en la Tablas 27 y 28.
En un séptimo experimento, se utilizó de nuevo el protocolo del cuarto experimento para determinar actividad CTL dependiente de antígeno a células diana infectadas por RSV. Los resultados se presentan en la figura 8.
En un octavo experimento, otro ensayo de protección viral, se inmunizaron por vía intranasal ratones BALB/c (5 ratones por grupo) con formulaciones que contenían proteína F de RSV purificada, con o sin CT-CRM_{E29H}, Igualmente se inmunizaron grupos de ratones por vía intramuscular con F/AlOH y se dejaron sin inmunizar (sin tratamiento previo) como control. Dos semanas después de la inmunización final (cuatro semanas después de la administración de F/AlOH) se inocularon todos los grupos con RSV vivo. Cuatro días más tarde, se extirparon tejidos pulmonares y se utilizaron en la cuantificación de virus infeccioso. Los resultados se presentan en la figura 9.
En un noveno experimento, se empleó un protocolo de tres dosis para investigar la respuesta de coadyuvante de CT-CRM_{E29H} más en detalle. Se inmunizaron IN grupos de cinco ratones BALB/c las semanas 0, 1 y 2 con proteína F (3 \mug), mezclada con 0,01, 0,1 ó 1,0 \mug de CT-CRM_{E29H}- Los ratones de control cebados el día 0 con F/AlOH (intramuscular) o RSV A2 (IN). Se administraron anticuerpos de sueros dos semanas después de la inmunización terciaria. Los resultados se presentan en la Tabla 29. Se presentan los datos como las valoraciones (\pm 1 SD) medias geométricas log_{10}. Los resultados similares se obtuvieron en dos estudios separados.
Después de la inmunización IN con F/CT-CRM_{E29H}, los ratones del noveno experimento se ensayaron también para sus respuestas de anticuerpos locales a proteína F. Se tomaron muestras de fluido de lavado de la mucosa de ratones sacrificados dos semanas después de la inmunización terciaria y se analizaron para IgG e IgA específicos de antiproteína F por ELISA. Los resultados se presentan en la Tabla 30. Los datos se presentan como el log_{10} del valor cuantitativo de criterios de valoración media geométrica que dio como resultado un OD_{410} de 0,03. Se obtuvieron resultados similares en dos estudios separados.
En un décimo experimento, para investigar la capacidad funcional de las respuestas inmunitarias humorales inducidas por inmunización con F/CT-CRM_{E29H} se ensayaron sueros en un ensayo de reducción de placas para valoraciones de anticuerpos neutralizantes a RSV A2. Los resultados se presentan en la Tabla 31. Las valoraciones (log_{10}) neutralizantes medias geométricas se determinaron sobre sueros individuales (cinco ratones por grupo) en presencia (+C') y ausencia (-C') del 5% de suero de conejillo de indias como fuente complementaria. Los resultados similares se obtuvieron en dios estudios separados.
En un undécimo experimento, los ratones (cinco ratones por grupo) recibieron inmunizaciones IN de proteína F formulada con 0,01, 0,1 ó 1 \mug de CT-CRM_{E29H} los días 0, 7 y 14. Los ratones de control se inmunizaron con F/AlOH (intramuscular) o RSV A2 (IN). Los ratones inmunizados fueron inoculados dos semanas más tardes con inmunización terciaria, para determinar la capacidad de F/CT-CRM_{E29H} para proteger contra una posterior infección. Cuatro días después de la infección se determinaron los niveles de virus en tejidos de nariz y pulmón homogeneizados de ratones individuales. Los resultados se presentan en la Tabla 32. Los datos se presentan como valor cuantitativo de virus media geométrica por gr. de tejido (\pm 1 desviación estándar).
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(Tabla pasa a página siguiente)
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27 
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28
TABLA 25 Respuestas inmunitarias sistémicas de ratones BALB/c inmunizadas por vía intranasal con proteína F de RSV y CT-CRM_{E29H}
29
Para IgC total:
p<0,05: 777 a 780 contra 784; 780 contra 779; 777 a 780 contra 785; 777, 778, 780 contra 907 8770 contra 907 p= 0,7)
p<0,05: 778 contra 777 (p = 0,125):
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Para IgG1:
p< 0,05: 777 a 780 contra 784; 777 a 780 contra 907; 777 a 780 contra 785
p<0,05: 781 a 780 contra 907
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Para IgG2a:
p<:0,05: 777 a 780 contra 784
TABLA 26 Respuestas inmunitarias de la mucosa de ratones BALB/c inmunizadas por vía intranasal con proteína F de RSV y CT-CRM_{E29H}
30
TABLA 27 Respuestas inmunitarias sistémicas de ratones BALB/c inmunizadas por vía intranasal con proteína F de RSV y CT-CRM_{E29H}
31
Para IgC total:
p<0,05: 256 contra 250 y 257
p<0,05: 256 contra 258 y 259
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Para IgG1:
p< 0,05: 256 contra 250 y 257
p<0,05: 256 contra 258
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Para IgG2a:
p<0,05: 256 contra 250, 257 y 258
p<0,05: 256 CONTRA 259
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Para IgG2:
p<0,05: 256 contra 259
TABLA 28 Respuestas inmunitarias de la mucosa de ratones BALB/c inmunizadas por vía intranasal con proteína F de RSV y CT-CRM_{E29H}
32
33
TABLA 30 Anticuerpos de proteína anti-F en fluidos de la mucosa de ratones inmunizados con proteína F formuladas con CT-CRM_{E29H}
34 
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TABLA 31 Generación de anticuerpos neutralizantes anti-RSV sistémicos después de inmunización IN con proteína F formulada con CT-CRM_{E29H}
35
TABLA 32 Infectividad de virus de tejido pulmonar y nasal después inmunización IN con proteína F formulada y CT-CRM_{E29H}
36 
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Ejemplo 11 Las respuestas inmunitarias de ratones inmunizados con Rotavirus Partículas similares a virus recombinantes
Se mantuvieron células de Spodoptera frugiperda (Df-9) (American Culture Collection, Manassas, VA) en un medio sin suero SF-900 II (Gibco-BRL, Grand Island, NY). Las células Sf9 se coinfectaron con construcciones de baculovirus recombinante que expresan los genes VP2 y VP6 de la cepa SA11 de rotavirus Simian (32).
Las 2/6VLP administradas se purificaron a partir del medio de cultivo de estas células Sf9 infectadas como sigue. Las células se clarificaron por centrifugación a 830 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se aclararon los sobrenadantes por centrifugación a 8000 x g durante 30 minutos. Las VLP se purificaron a partir de los sobrenadantes por centrifugación dos veces al 35% de sacarosa en tampón TNC (10 mM de Tris, 140 mM de NaCl, 10 mM de CaCl_{2}, pH 8,0) a 96500 x g durante dos horas, a continuación se suspendieron en tampón TNC y se almacenaron a 4ºC. Las VLP purificadas se analizaron por SDS-PAGE, seguido de tinción de plata y azul brillante Coomasie para determinar la pureza, análisis Western blot para analizar la composición de las proteínas, microscopia electrónica para determinar la integridad de las partículas y ensayo de proteínas de BCA para medir la concentración total de proteínas.
La tinción de azul brillante Coomassie, de plata y el análisis Western blot de 2/6-VLP purificadas confirmaron la presencia de proteínas VP2 y VP6, así como su pureza e inmunoreactividad con anticuerpos monoclonales específicos. La pureza de las VLP se estimó en aproximadamente el 95% de las intensidades de banda sobre los geles. Además, el análisis de microscopía electrónica de 2/6-VPL purificadas confirmó su integridad morfológica (datos no mostrado).
Los ratones se inmunizaron como sigue. Los ratones BALB/c y CD-1 utilizados en este estudio se adquirieron en Charles River Laboratories (Storeridge, NY), criados en un entorno libre de rotavirus. Se inmunizaron ratones BALB/c de cuatro semanas de vida dos veces la semana 0 y la semana 2, oralmente (n=4=) o IN (n-5, n=4), con 100 y 10 \mug de 2/6 VLP, respectivamente; cada dosis se formuló con 10 \mug de CT-CRN_{E29H}. Un tercer grupo de ratones BALB/s (n=4= recibió 2/6 VLP con CT-CRN_{E29H} IN, seguido de una inmunización oral de refuerzo (es decir, grupo mixto). Los ratones de control en este experimento se inmunizaron con CT-CRN_{E29H} (n=10), 1 x tampón TNC (n = 5= o 2/6 VLP más 1 X tampón TNC (n = 5). Se inmunizó IN cada ratón con 20 \mul de inóculo, 2 \mu a la vez, alternando las fosas nasales con intervalos de un minuto. Se recogieron muestras de suero y fecales de todos los animales las semanas 0, 1 m 2 m 4 m 6 m 8 m 10, 13 y se determinaron por ELISA los niveles de anticuerpos IgG, IgM e IgA de sueros específicos de rotavirus producidos, así como IgG e IgA fecales. Los resultados de anticuerpos de suero se presentan en las figuras 10 y 11; los resultados de anticuerpos fecales se presentan en la figura 13. Las muestras de suero de la semana 13 se usaron para determinar las subclases IgG1 e IgG2a. Los resultados de las subclases de anticuerpos se presentan en la figura 12.
Las diluciones de sueros de preinmunización diluidos a 1:100 y 1:2 de muestras de deposiciones de preinmunización no mostraron reactividad en ELISA. Los sueros y deposiciones de los grupos de control que recibieron solamente Tampón TNC o CT-CRN_{E29H} se analizaron en paralelo. Los grupos de control no mostraron anticuerpo fecales o de suero específicos de rotavirus a lo largo de todo el estudio.
Se inmunizaron ratones CD-1 de cuatro semanas de vida tres veces oralmente (n=4) o IN (n=4) las semanas 0, 2 y 13 como anteriormente usando CT-CRN_{E29H} como coadyuvante. Un grupo de control (n = 2) recibió solamente CT-CRN_{E29H}. Se recogieron muestras de sueros y deposiciones las semanas 0-9, 11-14, 26-28 y se determinaron los niveles de anticuerpos fecales y de sueros específicos de rotavirus.
Para la detección y la cuantificación de IgG, IgM e IgA en muestras de deposiciones y sueros, se cubrieron placas de microvaloración de cloruro de polivinilo de 96 pocillo (Dynex Technologies, Chantilly, VA) con un suero de rotavirus anti-SA11 de conejillo de Indias diluido en tampón fosfato salino (PBS) y se incubó a 37ºC durante cuatro horas, o una noche a temperatura ambiente. A continuación las placas se bloquearon con BLOTTO al 5% (5%p/v de leche en polvo desnatada en PBS) a 37% durante cuatro horas. Se diluyeron muestras de deposiciones suspendidas a 1:1 en BLOTTO al 1% y se añadieron a las placas. La placas, a continuación, se incubaron durante una noche a 4ºC, después de cual se lavaron tres veces con tampón TNC más Tween^{TM} 20 al 0,0% (TNC-T). Se diluyó suero hiperinmune de rotavirus anti-rhesus de conejo en BLOTTO al 1% más suero normal de conejillo de Indias al 2,5% (NGPS) y se añadió a las placas durante una hora a 37ºC. A continuación, las placas se lavaron tres veces con TNC-T. Se diluyó IgG, IgM e IgA de cabra anti-conejo conjugado con la peroxidasa de rábano picante (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) en BLOTTO al 1% y NGPS al 2,5% y se añadió a las placas, que se incubaron durante una hora a 37ºC. A continuación las placas se lavaron cuatro veces con TNC-T. Se añadió sustrato de TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories), y las reacciones de color producidas se dejaron que se desarrollasen durante siete minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con la adición de ácido fosfórico 1 m. Se determino el OD a 450 nm usando un lector de microplaca (BIO-TEK Instrument, Winooski, VT). Las mediciones de 0,1 por encima del blanco se consideraron significativas. Se diluyó el stock de virus SA11 en BLOTTO al 1% y se añadió a las placas que a continuación se incubaron durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron tres veces con TNC-T, a continuación, se aplicaron las muestras de deposiciones diluidas al 1:1 en BLOTTO al 1% o muestras de sueros diluidas en serie en BLOTTO al 1%. Como control negativos, los duplicados de muestras de deposiciones se añadieron a un pocillo sin recubrimiento de anticuerpos anti-SA11.Las placas se incubaron durante dos horas a 37ºC y a continuación se lavaron tres veces con TNC-T. Se diluyeron IgG, IgM e IgA de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa en BLOTTO al 1% más NGPS al 2,5% y se añadieron a los pocillos; igualmente se diluyeron los anticuerpos IgA+IgG+IgM(H+L) cabra anti-conejo conjugados con peroxidasa para la detección de anticuerpos de preinmunización. Las placas se incubaron durante una hora a 38ºC y a continuación se lavaron cuatro veces con TNC-T. Las placas se desarrollaron como se ha descrito anteriormente para el ELISA de detección de antígeno. El protocolo ELISA usado para determinar las subclases IgG es una modificación del protocolo descrito que IgG1 e IgG2a de rata (monoclonal) anti-ratón marcado HRP como los anticuerpos secundarios (Biosource International, Camarillo, CA).
Un ensayo inmunohistoquímico, descrito por Ishida y col. (49), se modificó y se usó para detectar anticuerpos VP2 y ÇVP6 anti-rotavirales en el suero de ratones inmunizados con 2/6-VLP. En breve, las células Sf9 de fase logarítmica inicial en matraces agitadores se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos a una densidad de 2,5 x 10^{4} células/pocillo y a continuación se incubaron durante una hora a temperatura ambiente (RT).A continuación, las células se infectaron con baculovirus recombinantes que codifican los genes VP2 y VP6 a una multiplicidad de infección de 10, y se dejo que se desarrollase la infección a 28ºC durante tres días. A continuación se desecho el medio de cultivo, se secaron las placas en un horno de vacío a temperatura ambiente durante una hora y se fijó con formalina al 10% (solución de formaldehído al 37% que contenía metanol al 10-15%; Sigma) en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% (Sigma) en tampón TNC a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Cada conjunto de células infectadas que expresan la proteína de rotavirus designada se expuso a suero de preinoculación o postinmunización de cada uno de los ratones BALB/c o CD-1, seguido por la inmunotinción. Las muestras de suero de ratón se diluyeron en serie en PBS con FCS al 5%. Las muestras se añadieron a los pocillos y se incubaron las placas a 37ºC durante dos horas. A continuación las placas se lavaron cuatro veces con PBS. Se añadió anticuerpo de IgG, IgM o IgA de cabra anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Kirkegaard & Perry Laboratories) en PBS con FCS al 5% y se incubó a 37ºC durante una hora. Las células teñidas se detectaron con sustrato de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) (Sigma) después de lavar los pocillos dos veces con PBS. Se usaron células Sf9 no infectadas, el suero de ratones no inmunizados, y los sueros de preinmunización de ratones inmunizados como controles negativos. Se usaron anticuerpos monoclonales contra VP6 (7D9, 5E6) y VP2 (BP2) como controles positivos (50).
Se inocularon los animales no inmunizados y los inmunizados con 2/6-VLP por cebado con 10 SD_{50} de rotavirus murino EDIM de tipo salvaje (51) la semana 26 (ratones CD-1) o la semana 13 (ratones BALB/s). La valoración de la cepa EDIM se determinó como dosis portadora 50 (SD_{50}), la dosis requirió inducir la presencia del virus fecal en el 50% de los ratones adultos. El virus incubado activado por tripsina (100 \mul) se administró después de la administración de 100 \mu de solución de bicarbonato sódico al 4% para neutralizar la acidez gástrica. Los virus se diluyeron en el medio M199 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y se activaron con 10 \mul de stock de tripsina (1 mg/ml) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) por ml de solución de stock de virus. Después de la inoculación, se recogieron las muestras de deposición de todos los animales durante 9 días.
La presencia de antígeno de rotavirus en muestras fecales se midió por ELISA y se expresó como valores densidad óptica (OD) neta, es decir OD de la muestra fecal postinoculación menos OD de la muestra preinoculación de los mismos ratones. Se determino el área bajo la curva de presencia para cada animal y se calculó la reducción porcentual en presencia de antígeno (PRAS) para cada animal respecto del área medio del grupo de control. A continuación se calculo la PRAS para cada grupo inmunizado. Solo se consideraron protectores los niveles de PRAs superiores al 50%. Los resultados se presentan en la figura 14.
Se llevaron a cabo análisis estadísticos con la versión 8.0 de SPSS para Windows (SPSS, Ins., Chicago, IL.) Se usaron pruebas de t para comparar valores de valoración media geométrica de preinoculación y para comparar la PRAS entre grupos. Se consideraron hasta tres dígitos después de la coma para calcular los valores de P (0,000 = 0)
Ejemplo 12 Aumentar la expresión de CT-CRN_{E29H} a través de la utilización de un promotor inducible por arabinosa
La construcción del sistema inducible por arabinosa fue como sigue: Se sintetizaron iniciadores de PCR para amplificar la toxina que codifica bicistron a partir de pIIB29H.
Iniciador #1, NheI directo CT29: 5'
TTTTTTGGGCTATGGAGGAAAAGATG AGC-3' (SEQ ID NO: 6); 
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Iniciador \cdot2, Hindi inverso CT29: 5'
GCAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC-3' (SEQ ID NO: 6);
El fragmento PCR de codificación de ctxA y ctxB de CT-CRM_{E29H} se clonó en pBAD18-Cm usando los sitios de endonucleasa NheI y Hindi, dando como resultado la construcción pCT18. El gen ctxB (V. cholerae 2125) de pCT18 se eliminó usando CLAI e HinIII y se sustituyó con un fragmento similar de plásmido pMGJ142 que se mostró para codificar un gen ctxB de la cepa 569B de V. Cholerae. La construcción resultante, pPX7490 codificó los genes ctxA y ctxB de CT-CRM_{E29H} bajo control del promotor de arabinosa, y tiene la secuencia conductora LTII-B.
Los protocolos para la expresión a gran escala y la purificación de CT-CRM_{E29H} se desarrollaron y son como sigue: se usaron matraces Fernbach acanalados 3L de 1 litro por matraz de medio de cultivo (por litro: 10 g de proteína de soja, 12,5 g de extracto de levadura; 5 g de cloruro sódico; 3,3 g de fosfato sódico monobásico; 13,1 de fosfato sódico dibásico). Para la preparación del stock de inicio, se añadieron 20 \mug/ml de cloramfenicol y 20 ml de glucosa estéril al 50% a un matraz (concentración final de glucosa del 1%). A continuación el matraz se inoculó con 300 \mul de DH5\alpha transformado con pPX7490, se congelo el stock a -70ºC. El matraz se incubó a 37ºC removiendo a 200 rpm durante una noche. Todo el medio de cultivo destinado s ser usado el día siguiente se precalentó removiendo durante una noche a 37ºC a 200 rpm. El día siguiente, se realizó una dilución de 1:40 del cultivo de la noche en medio de crecimiento de proteína de soja, suplementado con 20 \mug/ml de cloramfenicol y 10 ml de glicerol estéril (concentración final de glicerol del 1%) como fuente de carbono. Este cultivo sobrecreció a 37ºC a un OD_{600} de 4,5-5,5 en matraces Fernbach (o mayor en un birreactor). A continuación se indujo el cultivo con 20 ml de L-arabinosa (concentración final del 0,5%) y se dejó incubar durante tres horas más. Después de un periodo de inducción de tres horas, la mayoría de la toxina se asoció a las células. Las células se cosecharon por centrifugación y el sedimento se volvió a suspender en 10 mM de NaPO_{4}, 1 mM de EDTA (pH 7,0) también al 9% del volumen de cultivo original. La suspensión celular se interrumpió mecánicamente mediante un microfluidizador y se centrífugo durante 10 minutos a 8500 x g para eliminar los restos celulares. El lisado celular (sobrenadante) se clarificó más a 42.000 rpm durante una hora en un rotor 45Ti, 160.000xg_{AV}. El lisado celular se cargó sobre una columna de carboximetil (CM) Sepharose^{TM} (Pharmacia) equilibrada con 10 mM de NaPO_{4} (pH 7,0). Se usaron aproximadamente 300 ml de CM-Sepharose^{TM} por 10 litros de volumen de cultivo. El lisado celular se cargo en la columna a la velocidad de 0,102 cm/min. (2 ml/min). La columna se lavó a fondo con 10-15 volúmenes de columna de 10 mM de NaPO_{4} (pH 7,0) a 0,255 cm/min (5 ml/min) para eliminar los contaminantes. La holotoxina CT-CRM_{E29H} se eluyó con cuatro volúmenes de columna de 10 mM de NaPO_{4} (pH 8,3) a 0,255 cm/min. El eluado que contiene CT-CRM_{E29H} se cambió con tampón por filtración o se dializó sobre PBS, y a continuación se almacenó a 4ºC.
Ejemplo 13 Las respuestas inmunitarias de ratones BALB/c inmunizados con ADN plasmídico que codifica la glicoproteína D del virus del herpes simplex de tipo 2 de longitud completa
Se inmunizaron ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas de vida con ADN plasmídico (ADNp) que codifica la glicoproteína D del virus del herpes simples de tipo (gD2) de longitud completa (el plásmido que contiene el gen gD2 se describe en Pachuk y col. (40), que se incorpora al presente documento por referencia), formulada con bupivacaina al 0,25%, y con el coadyuvante CT- de tipo salvaje, CT-CRM_{E29H} o sin coadyuvante. A los animales se les proporcionó una inmunización secundaria tres semanas después de la primaria y fueron sacrificados dos semanas después de la última inyección. El protocolo para inmunización fue cono sigue:
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TABLA 33
37
Se llevó a cabo un ensayo de proliferación como sigue: se cultivaron 1x10^{5} células de bazo en presencia o ausencia de 200 ng/ml de proteína de gD2 en medio de RPMI completo con FCS al 10%. Después de cuatro días de incubación a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5%, se impulsaron los cultivos durante una noche con ^{3}[H], La incorporación de ^{3}[H] se midió sobre un contador beta. Los recuentos se indicaron como SI (Índice de estimulación =recuentos en presencia de estimulación de antígeno dividido por recuentos en ausencia de estimulación de antígeno). Los resultados se presentan en la Tabla 34.
Se llevó a cabo un ELISA para medir la respuesta humoral específica de antígeno en sueros y fluidos de lavado vaginales. En breve, se cubrieron placas (maxisorb, Nunc) de fondo plano de 96 pocillos durante una noche a 4ºC con proteína gD2 purificada a una concentración de 0,4 \mugs/ml. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon con BSA al 4% durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron 50 microlitros (dilución de 1:100) de muestras de suero o 50 \mul de muestras de fluido de lavado vaginal, la placa se lavó con PBS cinco veces, y se añadió una dilución de 1:3000 de anti-ratón IG conjugado con peroxidasa (Sigma, ST.Louis, MO) y las placas se incubaron durante una hora. Las placas se lavaron con PBS antes de añadir el sustrato 3,3'-5,5'-tetrametilbencidina (TMD)-H_{2}O_{2} (Biotecx, Houston, TX) Se dejo que el color se desarrollase durante 30 minutos antes de la lectura a 450 nm sobre un lector de microplacas E_{max} (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los resultados se presentan en la Tabla 35 (sueros) y Tabla 36 (fluidos de lavado vaginales).
Se midieron las citoquinas usando un ELISA estándar como se ha descrito anteriormente. Las placas se cubrieron apropiadamente para capturar IL-5 o interferón gamma a partir de los sobrenadantes de cultivos estimulados por gD2 de 24 o 72 horas de vida, respectivamente. Los resultados se presentan en la Tabla 37.
TABLA 34 Respuesta de proliferación celular específica de gD2 (SI) después de la administración de ADNp para HSV gD2 con CT o CT-CRM_{E29H} 
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38 
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TABLA 35 Respuesta humoral específica de gD2 (ng/ml)) después de la administración de ADNp HSV gD2 con CT o CT-CRM_{E29H} en sueros 
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39
TABLA 36 Respuesta humoral específica de gD2 (ng/ml)) después de la administración de ADNp HSV gD2 con CT o CT-CRM_{E29H} en fluidos de lavado vaginales
40 
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TABLA 37 Perfil de ELISA de citoquina específica de gD2 (pg/ml)
41
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<120> Holotoxina mutante del cólera como coadyuvante
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<130> 33383-00 PCT
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<140> 60/102,430
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<141> 30-09-1998
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<160> 7
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<170> PatenIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Vibrio cholerae 
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aagttatata aggcagattc 
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gcaggtcgaa gcttgcatgt ttggc 
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Claims (10)

1. Una composición antigénica que comprende un antígeno seleccionado de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico y una cantidad coadyuvante eficaz de una holotoxina mutante del cólera, en la cual la holotoxina tiene toxicidad reducida, comparada con la holotoxina del cólera de tipo salvaje y tiene una sustitución en la posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera, en la cual el residuo de ácido glutámico se sustituye por histidina; y en la cual dicha holotoxina potencia la respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado a dicho antígeno.
2. La composición antigénica según la reivindicación 1, en la cual el antígeno seleccionado es la proteína de membrana exterior P4 recombinante de Haemophilus influenzae no-tipificable, la proteína de membrana exterior P6 recombinante de Haemophilus influenzae no-tipificable, la proteína de ureasa recombinante de Helicobacter pylori, o la proteína de fusión del virus sincicial respiratorio.
3. La composición antigénica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende, además, un diluyente o vehículo.
4. La composición antigénica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la cual se realiza al menos una mutación adicional a la subunidad A de la holotoxina del cólera en una posición distinta del aminoácido 29, en la cual dicha mutación incluye sustituir arginina en posición 7, ácido aspártico en posición 9, arginina en posición 11, histidina en posición 44, valina en posición 61, serina en posición 63, histidina en posición 70, valina en posición 97, tirosina en posición 104, prolina en posición 106, histidina en posición 107, serina en posición 109, ácido glutámico en posición 110, ácido glutámico en posición 112, serina en posición 114, triptofano en posición 127, arginina en posición 146 o arginina en posición 192.
5. El uso de una composición antigénica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la preparación de un medicamento, en el cual dicha composición contiene, además, un antígeno seleccionado a partir de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico, y en el cual dicho antígeno provoca una respuesta inmunitaria de un huésped vertebrado.
6. Un uso según la reivindicación 5, en el cual el antígeno seleccionado en la composición antigénica es la proteína de membrana exterior P4 recombinante de Haemophilus influenzae no-tipificable, la proteína de membrana exterior P6 recombinante de Haemophilus influenzae no-tipificable, la proteína purificada nativa de adherencia y penetración de Haemophilus influenzae (Haps); la proteína de ureasa recombinante de Helicobacter pylori, la rpilina de clase 1 recombinante de Grupo B de Neisseria meningitidis, la proteína de PorA de clase 1 de Grupo B de Neisseria meningitidis, La proteína de fusión del virus sincicial respiratorio, 2/6 partículas similares a virus de rotavirus o la glicoproteína D (gD2) de tipo 2 del virus del herpes simples (HSV).
7. Un plásmido que contiene una secuencia de ADN asilado y purificado que comprende una secuencia de ADN que codifica una holotoxina mutante inmunogénica del cólera que tiene una sustitución de histidina en posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera, en el cual el residuo de ácido glutámico se sustituye por histidina; y en el cual la secuencia de ADN se une operativamente a un promotor inducible por arabinosa.
8. Una célula huésped transformada, transducida o transfectada con el plásmido de la reivindicación 7.
9. Un procedimiento para producir una holotoxina mutante del cólera, en el cual la holotoxina del cólera tiene toxicidad reducida comparado con una holotoxina del cólera de tipo salvaje y tiene una sustitución en posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera, en el cual el residuo de ácido glutámico se sustituye por histidina; y que comprende transformar transducir o transfectar una célula huésped con el plásmido de la reivindicación 7 y cultivar la célula huésped en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína recombinante inmunogénica detoxificada por la célula huésped.
10. Un uso de una cantidad coadyuvante eficaz de una holotoxina mutante del cólera, en el cual la holotoxina tiene una sustitución en posición 29 de la subunidad A de la holotoxina del cólera, en el cual el residuo de ácido glutámico se sustituye por histidina, en combinación con un antígeno seleccionado a partir de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénico, para preparar una composición antigénica, en el cual dicha holotoxina potencia la respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado a dicho antígeno.
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