KR20010085859A - 보조제로서 돌연변이체 콜레라 홀로톡신 - Google Patents

보조제로서 돌연변이체 콜레라 홀로톡신 Download PDF

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Abstract

글루탐산 잔기가 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환되는, A 서브유닛의 아미노산 29에 점 돌연변이를 특징으로 하는 돌연변이체 콜레라 홀로톡신은 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충으로부터 선택된 항원에 대한 척추동물 숙주의 면역반응을 증강시키기 위한 항원 조성물에 보조제로서 유용하다. 돌연변이체 콜레라 홀로톡신은 아미노산 29 이외의 위치에서 A 서브유닛에 적어도 하나의 추가 돌연변이를 함유할 수 있다. 항원 조성물은 돌연변이체 콜레라 홀로톡신 외에 제 2 보조제를 포함할 수 있다.

Description

보조제로서 돌연변이체 콜레라 홀로톡신{MUTANT CHOLERA HOLOTOXIN AS AN ADJUVANT}
면역계는 병원체 공격에 다양한 메커니즘을 이용한다. 그러나, 이들 메커니즘 전부가 면역 후에 필수적으로 활성화되지는 않는다. 면역에 의해 유발된 보호성 면역은 병원체에 저항하거나 이를 제거하기 위한 적당한 면역반응을 도출하는 백신의 능력에 좌우된다. 병원체에 따라, 이는 세포-매개성 및/또는 체액성 면역반응을 요할 수 있다.
면역원 또는 항원과 투여될 때 면역반응을 증강시키는 물질은 보조제(adjuvant)로서 알려져 있다.
그램 음성균인 비브리오 콜레라는 위장 질환 콜레라의 병원체이다. 비브리오 콜레라가 일으킨 설사는 콜레라 톡신(CT)의 분비에 기인한다.
CT는 톡신의 효소활성을 담당하는 하나의 A 서브유닛(CT-A)과, 장의 상피세포, 및 표면에 강글리오사이드 GM1을 함유하는 타 세포에의 톡신 결합에 연루되는 5개의 동일한 B 서브유닛을 포함한다. CT-A와 CT-B 서브유닛은 함께 홀로톡신을 구성한다. CT의 서열은 기재되어 있다(참조문헌 1).
CT a는 하나의 A 폴리펩타이드와 5개의 동일한 B 폴리펩타이드로 이루어진 헥사헤테로머 복합체이다(2). B 펜타머는 세포 표면 수용체 강글리오사이드 GM1과의 결합에 요구된다(3). A 서브유닛은 C187과 C199 사이의 단일 디설파이드-결합 루프 내에서 단백질분해 절단되어 효소 활성 A1 폴리펩타이드(4)와, 단편 A1을 B 펜타머(5)와 연결하는 소형 폴리펩타이드 A2를 생성할 수 있다. 엔테로사이트로 들어가면, CT-A1은 조절 G-단백질(Gsα)를 ADP-리보실화하여, 아데실레이트 사이클라제의 구조적 활성화, cAMP의 증가된 세포내 농도, 및 소장의 루멘 중으로 유체와 전해질의 분배가 유도된다(6). 시험관내에서, CT의 ADP-리보실 트랜스퍼라제 활성은 진핵세포 내에서 소장 트래피킹에 관여하는 것으로 알려진 소형 GTP-결합 단백질인 ARS(7)로 불리는 액세서리 단백질의 존재에 의해 촉진된다.
유효한 면역절차에 대한 필요성은 신체에서 급성 감염을 일으키거나, 신체 전체, 위장, 폐, 비인두 또는 성뇨기 표면으로의 유입을 획득하는 감염 유기체와 관련하여 특히 절실하다. 이러한 지역은 대부분 분비성 IgA로 구성되는 면역글로불린을 함유하는 점막에 베이딩(bathed) 되어 있다(8,9,10). 이러한 항체는 이들 점막 아래 놓인 고유층에 침윤하는 다수의 IgA-생성 혈장세포에서 유도된다(11,12). IgA는 분비성분의 작용을 통해 루멘 표면으로 특이적으로 수송된다(13).
그러나, 비경구 면역법은 분비성 IgA 반응 유도에 일반적으로 비효과적이다. 분비성 면역은 점막-결합 림프조직의 직접 면역을 통해 가장 일반적으로 달성된다. 하나의 점막 부위에서 이들의 유도 뒤에, IgA-생성 혈장세포의 전구체는 관외일출하여 고율 IgA 합성으로의 최종 분화가 일어나는 다양한 점막 조직으로 전파된다(14,15,16). 광범위한 연구에 따르면 유효한 면역 달성에 대용량의 항원이 요구되는 드문 경우를 제외하고는 점막 면역의 이러한 공통적인 점막 면역계(17) 유도 가능성은 이러한 연구를 정제된 백신 항원에 대해 비실용적이게 한다. 이러한 문제점 극복을 위해 조사된 전략으로는 점막 보조제의 사용이다. CT가 가장 유망한 보조제 중 하나이며, CT를 비관련 항원과 함께 투여하면 그 항원에 대해 동시 순환하는 점막성 항체 반응이 유도됨이 알려져 있다. 따라서, CT는 보조제로서 작용할 수 있다.
야생형 CT가 일으키는 바람직하지 않은 설사 증상을 감소시키도록 독성이 감소된 CT 홀로톡신 형태를 보조제로서 사용하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, CT 홀로톡신의 독성을 감소시키면서 면역반응을 증강시킬 수 있는 돌연변이체 CT 홀로톡신을 동정할 필요가 있다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 목적은 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충으로부터의 선택된 항원에 대한 척추동물 숙주에서의 면역반응을 증강시키기 위하여 항원 조성물에 보조제로서 야생형 CT에 비해 독성이 감소된 CT 홀로톡신의 돌연변이체형을 사용하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적은 A 서브유닛의 아미노산 29에서 점 돌연변이를 특징으로 하는 돌연변이체 콜레라 홀로톡신으로 달성되며, 여기에서 글루탐산 잔기는 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환된다. 본 발명의 특정 양태에서, 아미노산 29는 히스티딘이다. 돌연변이 CT(CT-CRM으로도 언급)는 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충으로부터의 선택된 항원에 대한 척추동물 숙주에서의 면역반응을 증강시키기 위해 항원 조성물에 보조제로서 유용하다. 돌연변이체 CT는 통상의 기술을 사용하여 야생형 CT를 암호화하는 DNA의 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 생성된다. 항원 조성물은 희석제나 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 야생형 CT에 비해 독성이 감소되고 콜레라 홀로톡신의 A 서브유닛의 아미노산 위치 29의 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로, 특히 히스티딘으로 치환되는 유효 보조량의 돌연변이체 콜레라 홀로톡신을 포함시킴에 의한, 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충으로부터의 선택 항원을 함유하는 항원 조성물의 척추동물 숙주의 면역반응 도출능을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 콜레라 홀로톡신의 A 서브유닛의 위치 29의 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환된 면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신을 암호화하고, 아라비노스 유도성 프로모터에 작동적으로 연결되는 DNA 서열을 포함하는 분리정제된 DNA 서열을 함유하는 플라스미드, 및 이러한 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 적당한 숙주세포에 관한 것이다. 면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신은 숙주세포를 전술한 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는형질감염시킨 다음 숙주세포를 이에 의한 재조합 면역원성 독성제거된 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 배양함으로써 생산된다.
본 발명은 야생형 콜레라 톡신에 비해 독성이 감소된 면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신의 용도 및 선택 항원에 대한 척추동물 숙주의 면역반응을 증강시키기 위한 보조제로서 콜레라 홀로톡신 A 서브유닛의 29 위치에서 글루탐산의 아스파트산 이외의 아미노산에 의한 치환에 관한 것이다.
도 1은 강글리오사이드 GM1에 CT-CRM의 결합능을 도시한다. 각각의 CT-CRM은 3 ㎍의 초기농도에서 3배 희석되어 이중 시험된다. 결합능은 각각의 희석에 대해 410 nm에서의 평균 흡광도로 나타내었다.
도 2는 CT-CRME29H보조제의 존재 또는 부재하에 메닌고코커스 재조합 필린(rpilin)으로 비내 면역시킨 마우스에서(n = 그룹 당 10), 또는 무면역 마우스에서 코 하나에 대한 평균 Log10cfu로 나타낸 코에서의 콜로니화 감소를 도시하며, 여기에서 각각의 그룹은 이어서 동족 메닌고코커스 스트레인으로 챌린지시킨다.
도 3은 CT-CRME29H보조제의 존재 또는 부재하에 메닌고코커스 rpilin, 메닌고코커스 클래스 1 외막 단백질(PorA)과 CT-CRME29H보조제, KLH와 CT-CRME29H보조제로 비내 면역시킨 마우스에서(n = 그룹 당 10), 또는 무면역 마우스에서 코 하나에 대한 평균 Log10cfu로 나타낸 코에서의 콜로니화 감소를 도시하며, 여기에서 각각의 그룹은 이어서 동족 메닌고코커스 스트레인으로 챌린지시킨다.
도 4는 메닌고코커스 rpilin, 메닌고코커스 스트레인 H355로부터의 PorA, 메닌고코커스 스트레인 870227로부터의 PorA, 각각이 CT-CRME29H보조제 처리된 열-불활성 메닌고코커스 스트레인 870227 전세포 또는 KLH로 비내 면역시킨마우스에서(n = 그룹 당 10) 코 하나에 대한 메닌고코커스 스트레인 870227의 평균 Log10cfu로 나타낸 코에서의 콜로니화 감소를 도시하며, 여기에서 각각의 그룹은 이어서 동족 메닌고코커스 스트레인(870227)으로 챌린지시킨다.
도 5는 메닌고코커스 스트레인 H355로부터의 PorA과 CT-CRME29H또는 MPLTM보조제, KLH와 MPLTM보조제, 또는 열-불활성 메닌고코커스 스트레인 870227 전세포와 MPLTM보조제로 피하 면역시킨 마우스에서(n = 그룹 당 10) 코 하나에 대한 메닌고코커스 스트레인 870227의 평균 Log10cfu로 나타낸 코에서의 콜로니화 감소를 도시하며, 여기에서 각각의 그룹은 이어서 이종 메닌고코커스 스트레인(870227)으로 챌린지시킨다.
도 6은 세포 용해 대 작동세포 비의 %로 나타낸 호흡기 합포체 바이러스(RSV)-감염 표적세포에 대한 항원-의존성 세포용해 활성의 1차 분석을 도시한다.
도 7은 F 단백질+보조제로 면역시킴에 의한 RSV 챌린지에 대한 마우스 폐의 보호의 1차 분석을 도시하며, 여기에서 폐 바이러스 역가는 그램 당 Log10PFU로 측정된다.
도 8은 세포 용해 대 작동세포:표적세포 비의 %로 나타낸 RSV-감염 표적세포에 대한 항원-의존성 세포용해 활성의 2차 분석을 도시한다.
도 9는 F 단백질+보조제로 면역시킴에 의한 RSV 챌린지에 대한 마우스 폐의보호의 2차 분석을 도시하며, 여기에서 폐 바이러스 역가는 그램 당 Log10PFU로 측정된다.
도 10은 CT-CRME29H존재 또는 부재하에 2/6-VLP로 비내 면역시킨 BALB/c 마우스에서의 로타바이러스-특이성 혈청 항체 반응을 도시한다. BALB/c 마우스는 CT-CRME29H존재(n = 4) 또는 부재하에(n = 5) 2/6-VLP로 비내 면역시키며 로타바이러스-특이성 IgG(도 10a), IgM(도 10b) 및 IgA(도 10c)의 수준을 측정한다. 표준편차를 나타내었다.
도 11은 2/6-VLP로 면역시킨 BALB/c 근친교배 마우스에서의 로타바이러스-특이성 혈청 항체 반응을 도시한다. BALB/c 마우스 그룹을 0 주 및 2주째에서 2/6-VLP+CT-CRME29H로 경구 투여(사각형, n = 4), 비내 투여(다이아몬드, n = 5) 또는 병행 투여하여(비내+경구, 원, n = 4) 면역시킨다. 혈청 샘플을 표시된 주에서 각 그룹내 개별 마우스로부터 수집하며, 혈청 IgG(도 11a), IgM(도 11b) 및 IgA(도 11c)의 수준을 각각의 마우스에 대해 ELISA로 측정한다. 기하 평균 역가(GMT)를 각 그룹에 대해 계산하고 면역후의 해당 주에 대해 작도한다.
도 12는 BALB/c 마우스에서의 IgG1 및 IgG2a 항체 서브클래스를 도시한다. 로타바이러스 2/6-바이러스-유사 입자(VLP)+CT-CRME29H로 경구 투여 또는 비내 투여로 면역시킨 BALB/c 마우스의 예비 챌린지 혈청을 IgG 서브클래스의 결정에 사용한다. 표준편차를 나타내었다.
도 13은 2/6-VLP로 면역시킨 근친교배 BALB/c 마우스에서의 로타바이러스-특이성 장 항체반응을 도시한다. BALB/c 마우스 그룹을 도 11에 대해 기술한 바와 같이 2/6-VLP+CT-CRME29H로 면역시키고, 로타바이러스-특이성 장 IgA(EH 13a) 및 IgG(도 13b)의 수준을 측정한다. 어떤 마우스에서도 로타바이러스-특이성 장 IgM이 검출되지 않았다.
도 14는 나중에 쥐 로타바이러스로 챌린지시킨 2/6-VLP 면역 BALB/c 및 CD-1 마우스의 보호를 도시한다. 도 14a는 CT-CRME29H존재(n = 5) 또는 부재하에(n = 4) 2/6-VLP로 면역시킨 마우스 간의 항원 탈락의 % 감소(PRAS)의 비교를 도시한다. 각각의 마우스에 대한 PRAS(ㆍ) 및 각 그룹의 평균(-)을 계산하였다. 도 14b는 도시한 바와 같이 상이한 경로에 의해 2/6-VLP+CT-CRME29H로 면역시킨 BALB/c 마우스의 그룹을 도시하며, 보호수준은 전술한 바와 같이 측정하였다. 도 14c는 전술한 바와 같이 2/6-VLP+CT-CRME29H로 경구 투여 및 비내 투여 면역시킨 이계교배 CD-1 마우스 그룹을 도시한다. 26주째에, 면역 및 대조군 마우스를 전술한 바와 같이 챌린지시키고 PRAS를 산정한다. 경구 투여 그룹(n = 4)에서, 챌린지(보호에 대해 n = 3) 전에 1 마리의 마우스가 죽었다.
항원 조성물에 대한 보조제로서 CT의 돌연변이체 형태의 사용이 본원에서 기술된다. 이.콜라이내 돌연변이체 CT 클론(CT-CRM) 세트를 생성시킨다. 데이터는 보조성이 우수한 CT-CRM은 A 서브유닛의 위치 29에 비보존성 아미노산 치환(글루탐산에서 히스티딘으로)이 일어난 돌연변이체(CT-CRME29H)임을 시사한다. 누적 데이터는 CT-CRME29H이 홀로톡신이고 야생형 CT보다 독성이 약함을 보여준다. 중요한 것은, CT-CRME29H이 이종 백신 항원의 위내 투여(IG) 또는 비내 투여(IN) 뒤에 점막 및 전신 면역반응을 증강시킬 수 있다는 점이다. 이들 백신 항원은 세균 또는 바이러스 병원체 기원이다. 헬리코박터 펠리스, 로타바이러스 및 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 감염의 쥐 모델에서의 결과는 CT-CRME29H-제조 백신으로 위내 또는 비내 투여 면역시킴으로써 촉진된 면역반응이 보호성임을 시사한다. 데이터는 CT-CRME29H가 보조제로서 적어도 야생형 CT만큼 활성임을 시사한다. 심지어는 앞서 존재하는 안티-CT 면역반응의 존재하에서 조차도 CT-CRME29H은 점막 보조제로서 작용할 수 있다.
돌연변이체 CT-A는 자체의 보조성에 있어서 야생형 CT를 닮은 홀로톡신 형성을 위한 CT-B와의 조립능을 보유하지만, 야생형 CT에 비해 감소된 독성을 보인다. B 서브유닛은 자신의 천연서열을 보유하거나 자체 돌연변이될 수 있다.
생성되는 독성의 감소 수준은 보조제로서 사용하기 위한 변형된 CT를 제공한다. 본 발명에 따른 면역원성 돌연변이체 CT는 감소된 독성과 보유된 보조성의 균형을 보이게 되어, 단백질은 항원 조성물로 면역된 척추동물 숙주에 의해 안전하게 용인되면서 보조제로서 기능하게 된다.
본 발명의 항원 조성물은 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충으로부터의 선택된 항원과, 야생형 CT에 비해 독성이 감소되고 콜레라 홀로톡신의 A 서브유닛의 위치 29의 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환되는 유효 보조량의 돌연변이체 CT를 포함하는 항원 조성물의 투여 후에 척추동물 숙주의 항체반응 및 세포-매개성 면역을 향상시킴으로써 면역반응을 조절한다. 본 발명의 특정 양태에서, 아미노산 29는 히스티딘이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "홀로톡신이 감소된 독성을 지닌다"는 말은 CT-CRME29H돌연변이체와 같은 CT-CRM 돌연변이체가 야생형 CT에 비해 정제된 톡신 단백질 단위 당 상당히 더 낮은 독성을 보여, 돌연변이체로 하여금 심각한 부작용을 일으킴이 없이 항원 조성물에 보조제로서 사용될 수 있게 됨을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유효 보조량"이란 용어는 척추동물 숙주에서 증가된 면역반응을 도출하기에 적당한, CT-CRME29H돌연변이체와 같은 CT-CRM 돌연변이체의 용량을 의미한다. 특정 용량은 숙주의 연령, 체중과 의학적인 상태, 및 투여방법에 좌우된다. 적정 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
A 서브유닛에 다음과 같이 돌연변이된 5종의 CT-CRM을 실시예 1에서 기술한 바와 같이 생성시킨다:
아미노산 천연 돌연변이체 약어
7 아르기닌 라이신 CT-CRMR7K
11 아르기닌 라이신 CT-CRMR11K
29 글루탐산 히스티딘 CT-CRME29H
110 글루탐산 아스파트산 CT-CRME110D
112 글루탐산 아스파트산 CT-CRME112D
이어서, CT의 구조와 기능에 미치는 이들 돌연변이체의 표현형 효과가 평가된다.
변이체 CT-A의 R7K, E29H, E110D 및 E112D는 강글리오사이드 GM1결합분석에 의해 측정되는 바와 같이 면역반응성 홀로톡신으로 조립될 수 있다(도 1). 그러나, 실시예 2에서 기술되는 폴리클로날 항체로 시험할 때 정제된 R11K의 일부는 홀로톡신인 것으로 보이지 않았다.
각각의 홀로톡신 변이체를 Y-1 부신 종양세포 분석(19)으로 시험하여 야생형 CT 홀로톡신과 비교한 이의 잔류 독성을 측정한다. 표 2에 제시한 결과는 CT-CRME29H과 시판 CT-B(Sigma)가 1.2% 잔류 독성을 지니고 있음을 보여준다. 시판 CT-B와 관련한 1.2% 잔류독성은 오염 A 서브유닛에 기인할 가능성이 가장 크다(대략 0.5%). 아미노산 위치 7, 11, 110, 또는 112에서 돌연변이된 나머지 CT-CRM의 잔류독성은 0.4% 이하였다.
CT-CRME29H을 독성의 생체내 측정으로서 장액 축적을 평가하기 위한 페이턴트 마우스 내장 중량 분석법(20)으로 시험한다. 표 3에 제시한 결과는 CT-CRME29H가 야생형 CT에서보다는 마우스 장관 중으로 유체 축적의 증가를 증가시킴에 있어 상당히 덜 활성임을 보여준다.
또한, 각각의 CT-CRM을 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성 분석으로 CT와 비교한다. 결과는 Y-1 부신 세포 분석에서 생성된 것들과 대체로 일치하였으며 A1 서브유닛에서의 돌연변이가 야생형 CT에 비하여 각종 CT-CRM에 비해 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 감소시킴을 시사한다(표 4). 최대 효소 활성을 지닌 돌연변이체는 CT-CRME29H인 것으로 보인다. 이러한 활성은 야생형 CT의 대략 10%이다.
37℃에서 CT-CRME29H의 트립신 처리는 웨스턴 블롯 분석시 야생형 CT의 처리와 구별할 수 없는 방식으로 CT-A를 단편 A1과 A2로 절단한다. 이러한 점은 CT-CRME29H의 구조가 야생형 CT의 것과 유사하다는 추가의 증거를 제공한다.
Y-1 부신 종양 세포와 ADP-리보실화 활성 분석에서 CT-CRME29H의 활성의 외관상 차이는 후자의 분석에서 돌연변이체 홀로톡신의 트립신 활성화에 기인한다. 따라서, 이.콜라이내 감소된 프로테아제 활성에 기인한 A1 및 A2 서브유닛으로의 CT-A 절단의 결핍은 이.콜라이-발현 CT-CRME29H의 감쇠에 기여한다. 종합하면, 축적 데이터는 CT-CRME29H이 강글리오사이드 GM1에 결합하고 야생형 CT보다 상당히 덜 유독함을 보여준다.
다음과 같이 백신 후보로 확인된 세균 또는 바이러스 항원을 함유하는 조성물을 위한 점막 보조제로서 CT-CRME29H의 효능을 평가하기 위하여 일련의 연구가 수행되었다: (1) 단백질 "e"로도 알려져 있는 분류 불가능한 헤모필루스인플루엔자(NTHi) 재조합 P4 단백질(rP4)(21), 재조합 NTHi P6 단백질(rP6)(22), 및 정제된 천연 헤모필루스 인플루엔자 부착 및 침투(Hap) 단백질(23); (2) 헬리코박터 파이로리 재조합 우레아제 단백질(rUrease)(24); (3) 나이세리아 메닌자이티디스 그룹 B 재조합 클래스 1 필린(25) 및 나이세리아 메닌자이티디스 그룹 B 클래스 1 외막 단백질(26); (4) 호흡기 합포체 바이러스 정제된 천연 융합 단백질(RSV F)(27); 및 (5) 로타바이러스의 2/6-바이러스-유사 입자(28).
CT-CRME29H를 NTHi rP4와 rP6 단백질에 대한 보조제로서 4종의 다른 CT 돌연변이체 및 야생형 CT와 비교한다. 결과는 5종의 상이한 CT-CRM이 rP4와 rP6 단백질의 전신 체액성 면성 반응 도출능을 증강시킴을 시사한다(표 5와 6). 예를 들면, 3차 비내 투여 면역 2주 후에 CT-CRME29H또는 CT-CRME110D로 제형된 rP4 및 rP6 단백질로 면역시킨 마우스의 안티-rP4 IgG 항체 역가는 PBS 중의 재조합 단백질만으로 면역시킨 마우스의 것보다 40배 더 크다(표 5). 재조합 단백질+야생형 CT 홀로톡신을 투여한 마우스의 항체 역가는 20배로 상승하였다. CT-CRMR11K로 면역된 마우스의 안티-rP4 항체 역가는 10배 상승하였다.
한층 더 현격한 차이는 혈청이 안티-천연 P6 항체 역가에 대해 검사될 때 관찰된다(표 6). 2차 비내 투여 면역 2주 후에 CT-CRME29H또는 CT-CRME110D제형 백신으로 면역시킨 마우스의 혈청 안티-천연 P6 항체 역가는 rP6+PBS로 면역시킨 마우스의 것보다 30배 이상 더 크다. 비교시, 야생형 CT로 제조한 백신은 PBS 제조 제형으로 생긴 것보다 90배 더 큰 안티-쳔연 P6 항체 역가를 도출하였다. CT-CRME112D, CT-CRMR7K, 또는 CT-CRMR11K제제로 면역된 마우스의 안티-천연 P6 항체 역가는 PBS만으로 제형된 rP5+rP6로 면역된 수용체의 것보다 단지 2 내지 4배 더 컸을 뿐이다.
3차 면역 2주 후 점막 분비물에서 단백질-특이성 항체를 검사한 결과 CT-CRM이 rP4 단백질에 대한 국소 면역반응의 생성을 촉진함을 또한 시사한다. 아울러, 안티-rP4 항체 역가는 야생형 CT에 의해 유도된 것에 필적하였다(표 7). 국소 항체 역가는 천연 P6 단백질에 대해 검출되지 않았다(데이터 나타내지 않음). 따라서, 데이터를 종합해 볼 때 rP4 및 rP6 단백질에 대한 전신 및 국소 항체 반응 모두를 생성하는 가장 순조로운 돌연변이체 CT는 위치 29 또는 110에서 돌연변이가 있는 CT-CRM임을 암시한다.
보조제로서 CT-CRME29H의 잠재성을 확인하고 IN 면역에 대한 적정 용량을 결정하기 위하여 부수적인 연구가 실행되었다(표 8).
결과는 1 ㎍의 CT-CRME29H가 rP4 단백질에 대해 최대 전신 및 국소 체액성 면역반응을 촉진함을 시사한다. CT-CRME29H의 용량이 용량 당 1에서 10 또는 30 ㎍로 증가될 때, 데이터는 전신 및 점막 면역반응 모두가 감소되었음을 시사한다. 예를 들면, 10 ㎍ CT-CRME29H로 면역시킨 마우스의 혈청 안티-P4 IgG 항체 역가는 연구 48일째에서 1 ㎍ CT-CRME29H으로 면역시킨 마우스의 1/7이었다, 또한, 기관지폐포 및 질 세척액으로부터의 국소 안티-P4 IgA 항체 역가는 49일째에서 마우스의 후자 그룹의 것의 1/34 및 1/16이었다. 데이터는 rP4+rP6/CT-CRME29H으로 면역시킨 마우스의 국소 및 전신 체액성 면역반응이 야생형 CT 보조제 처리 백신으로 면역시킨 후 달성된 것과 본질적으로 동일함을 시사한다(표 8).
Hap 단백질로 면역시켜 도출된 혈청항체 반응에 미치는 CT-CRME29H의 첨가 효과를 검사한다. CT-CRME29H의 첨가는 Hap 단백질에 대한 혈청 항체 반응의 유도를 돕는다(표 9). 면역반응은 7주째 혈청에서 보이고; 초기 혈청에서는 항체 역가가 검출되지 않았다. 면역시킨 마우스에서 수득한 혈청의 안티-Hap ELISA 역가를 표 9에 나타내었다. 반응은 용량 의존식으로 증가하였고 0.1 ㎍ CT-CRME29H의 첨가에 의해 대략 3배 증강되었다. 이러한 증강은 두 용량 수준 모두에서 발생하였다.
헬리코박터 파이로리의 rUrease 단백질로 위장내(IG) 면역시킨 후 5종의 상이한 CT-CRM의 전신 및 국소 체액성 면역반응의 증강능을 마우스 모델을 사용하여 평가한다(29). 결과는 비내 투여 후 NTHi 단백질로 수득한 것들과 유사하였다. 데이터는 CT-CRME29H가 IG 면역 후 전신 및 국소 체액성 면역반응의 증강에 최대 능력을 지닌 돌연변이체임을 시사한다. CT-CRME29H제형 백신에 의해 도출된 기하평균 혈청 안티-rUrease IgG(표 10) 및 IgA(표 11) 항체 역가는 연구 28일째에 CT-CRME110D로 유도된 것들보다 각각 6배 및 3배 더 크다. 또한, CT-CRME29H로 도출된 혈청 IgG 및 IgA 항체 역가는 야생형 CT 함유 백신으로 생성된 것에 상당하였다.
가장 중요하게는, CT-CRME29H로 제형된 rUrease에 의한 IG 면역은 최대 국소 체액성 면역반응을 생성하는 것으로 보인다(표 12). 이러한 사실은 기관지폐포 세척액의 검사 후에 가장 명백하다. 기관지폐포 세척액에서 안티-rUrease IgA 항체 역가는 CT-CRME110D제조 백신에 의해 도출된 것보다 5배 크다. 야생형 CT 제형에 비해, 안티-rUrease IgA 항체 역가는 1/5 수준이었다. 그러나, CT-CRME29H제형 백신으로 면역시킨 그룹의 질 세척액에서 단백질-특이성 IgA 항체 역가는 야생형 CT 제조 백신으로 도출된 것들에 본질적으로 상당하였다.
데이터는 비경구 면역은 CT-CRME29H제조 백신으로 IG 면역시킨 마우스에서 도출된 것과 비교하여 기관지폐포 세척액에서 현저한 rUrease-특이성 IgA 항체를 도출하지 않았음을 의미한다는 점이 주목할 만 하였다.
따라서, CT-CRME29H로 제형된 rUrease에 의해 생성된 면역반응의 효능을 시험하기 위하여 2차 연구를 수행하였다. 데이터는 CT-CRME29H이 헬리코박터 펠리스에 대한 보호성 면역반응의 유도를 지원함에 있어 야생형 CT만큼 효능이 있음을 시사한다(표 13). 전자 그룹의 혈청 안티-rUrease IgA 항체 역가는 연구 28일째에 마우스의 후자 그룹의 것과 대등하였다. rUrease+StimulonTMQS-21로 비경구 면역된 마우스의 혈청내 단백질-특이성 IgA 항체 역가는 CT-CRME29H로 제조된 백신으로 IG 면역된 마우스의 것보다 12배 컸다. 그러나, CT-CRME29H로 면역된 마우스의 기관지폐포세척액내 단백질 특이성 IgA 항체 역가는 비경구 면역 마우스의 것보다 10배 이상 컸다(표 13).
결과는 IG 면역과 마우스의 위 조직으로부터 헬리코박터 펠리스의 제거능 간의 상관관계를 암시한다. 최종 챌린지 10일 후, CT 또는 CT-CRME29H로 제형된 백신으로 IG 면역된 마우스의 80%가 위 조직으로부터 우레아제-함유 세균을 제거할 수 있었다. 이와는 대조적으로, 순수(naive) 대조군 마우스(10%), rUrease+PBS만으로 IG 면역시킨 마우스(20%), 또는 StimulonTMQS-21과 혼합된 rUrease로 피하 면역시킨 마우스는 헬리코박터 펠리스를 근절시키는 능력이 적은 것으로 보인다(표 13). 데이터는 효능과 기관지폐포 세척액내 단백질-특이성 IgA 항체 역가의 상관관계를 암시하지 않음이 주목할 만하다. rUrease+야생형 CT로 IG 면역시킨 마우스의 기관지폐포 세척액내 단백질-특이성 IgA 항체 역가는 CT-CRME29H로 면역시킨 마우스의 역가의 1/10이었다(표 13). 어느 백신으로도 여전히 80% 보호가 달성되었다. 따라서, 폐 조직내 국소 체액성 면역반응을 모니터링하는 것은 위에서 발생하는 보호성 면역반응과는 거의 관련이 없을 수 있다.
BALB/c 마우스와는 달리 C57B1/6 마우스가 헬리코박터 파이로리 감염 후 인간에서 관찰된 것과 유사한 질환을 겪음이 Jani O'Rourke 박사(뉴 사우스 웨일즈 대학: 개인적인 통화)에 의해 제시되었다. 위 조직으로부터 헬리코박터 파이로리를 제거하기 위한 CT-CRME29H로 촉진된 안티-rUrease 면역반응의 효능을 시험하기 위하여, 별도의 일련의 연구를 C57B1/6 마우스를 사용하여 착수하였다. 결과는 CT-CRME29H로 제형된 rUrease로 IG 면역이 야생형 CT로 제형된 rUrease로 도출된 것들과 유사한 전신 및 국소 체액성 면역반응을 생성함을 시사한다(표 14). 연구 28일째에 야생형 CT 또는 CT-CRME29H제조 백신으로 면역시킨 마우스의 혈청 및 기관지폐포 및 질 세척액 안티-rUrease IgA 항체 역가는 식별불능이었다. 유일한 불일치는 CT-CRME29H제조 백신으로 면역시킨 마우스로부터의 배설물 펠릿의 추출물에서 검출된 IgA 항체 역가였으며(표 14), 3배 더 컸다. rUrease+알룸으로 비경구 면역시킨 마우스 배설물내 단백질-특이성 IgA 항체 역가는 야생형 CT 또는 CT-CRME29H로 IG 면역시킨 마우스의 것보다 상당히 낮았다(각각 1/38 및 1/14). 따라서, C57B1/6 마우스 모델은 IG 면역 후에 생성된 보조제 면역반응에 대한 CT-CRME29H의 능력을 평가할 수 있는 것으로 보인다. 더욱이, 데이터는 모델이 헬리코박터 파이로리로부터 점막 표면의 보호에 있어서 국소 및 전신 면역반응의 역할을 규정할 수 있음을 시사한다.
CT는 점막 면역반응에 대한 보조제로 금기되어 있음이 보고되었다(30,31). 가설은 CT가 백신을 바람직하지 않은 증가된 IgE 항체 역가를 도출하는 경향이 있다는 것이다. IgE는 과민성과 앨러지 반응과 연관되어 있다. 또한, 이.콜라이의 열-불안정 톡신(LT), 또는 LT-CRM이 증가된 IgE 항체 역가를 도출하는 잠재성이 적다는 것이 암시되었다. 따라서, 결론은 LT 또는 LT-CRM이 점막 면역반응 생성에 더 적당한 백신 보조제이다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, rUrease로 이루어진 백신에 CT, LT, 또는 CT-CRME29H를 처방하여 IG 면역 후 IgE 항체 도출능에 대해C57B1/6 마우스에서 시험한다(표 15). 데이터는 CT-CRME29H또는 야생형 CT로 제조한 백신이 순환중인 전체 또는 우레아제-특이성 IgE 항체를 야생형 LT보다 덜 생성하는 것 같다는 것을 암시한다. 사실, CT-CRME29H로 제형된 백신이 상승된 IgE 항체 역가를 덜 생성할 가능성이 있음을 암시한다. 종점 전체 및 rUrease-특이성 IgE 항체 역가는 야생형 LT로 제조한 백신으로 면역시킨 마우스의 것의 1/4이었다(표 15). 따라서, 이들 데이터는 적어도 rUrease 제형에서 만큼은, CT-CRME29H이 보조제로서 LT보다 바람직함을 시사한다.
이론에 구애됨이 없이, van den Akker 등(32)에 의해 최근에 제시된 LT 활성의 메커니즘은 E29에서 또는 주위에서 변형된 CT 변이체의 감소된 독성에 대한 가장 신빙성 있는 설명을 제시한다. 디설파이드 루프의 절단 및 도메인 A1과 A2를 연결하는 디설파이드 결합의 환원 후, A1 도메인내 잔기 30-33으로 구성되는 루프가 도메인 A2의 긴 나선의 이동 결과로 위치를 변화시키는 것으로 제안되고 있다. E29에 대한 치환은 루프 30-33의 행동을 변화시킬 수 있으며, 이에 따라 CT-A1의 활성 감소가 일어난다. CT-Y30WAH 및 CT-G34GGP의 감소된 독성에 대한 가능한 설명은 CT-A1의 활성화에 유해한 30-33 루프에 대한 영향에 의해 설명될 수 있다. 제안된 활성화 경로에서 다음 단계는 R25와 Y55 간의 상호작용을 붕괴하는 완전한 25-36 루프의 이동이다. CT-R25G는 CT-R25W보다 더 큰 정도로 독성의 감소를 보여주며, 아마도 CT-R25G가 아닌 CT-R25W에 의해 보유될 수 있는 R25 및 Y55의 측쇄가 소수성 상호작용에 참여하기 때문인 것으로 보인다. 본 출원인의 변이체의 표현형은 van den Akker 등(32)에 의해 제안된 열-불안정 엔테로톡신의 활성화에 대한 모델과 일치한다(32).
일련의 실험을 수행하여 나이세리아 메닌자이티디스 그룹 B로부터의 두 백신 후보자에 대한 점막 및 비경구 보조제로서 CT-CRME29H의 효능을 평가한다. 1차 후보는 재조합 클래스 1 필린이다(rpilin)(25). 2차 후보는 클래스 2/3 단백질을 발현하지 않은 돌연변이체 메닌고코커스 스트레인에 의해 발현된 클래스 1 외막 단백질(PorA)이다(26).
생리식염수 중의 rpilin을 투여한 마우스에서 수득된 역가와 비교하여 3 내지 19배 증가한 CT-CRME29H첨가 그룹에서 rpilin-특이성 혈청 IgG 항체가 증강되었다는 점에서, 점막 보조제 효과는 1차 실험에서 나타났다(표 16). 특이적 혈청 IgA도 CT-CRME29H로 전달된 rpilin으로 면역시킨 마우스에서 2 내지 5배 증가시켰다(둘 모두 0.1 및 1.0 ㎍에서). CT-CRME29H(1 ㎍)가 비강, 질, 및 기관지폐포 세척물에서 rpilin-특이성 IgA를 3 내지 10배 증가시켰음이 주목할 만하다. 또한, rpilin+CT-CRME29H에 의한 IN 면역은 그룹 B 나이세리아 메닌자이티디스 동족 스트레인에 의한 비강 콜로니화를 스위스-웹스터 마우스에서의 검출수준으로 현저히 감소시켰다(도 2).
CT-CRME29H이 동족 메닌고코커스 스트레인에 대해 rpilin의 보호를 증강시킴을 입증하기 위해 2차 실험을 수행하였다. 표 17에 나타낸 바와 같이, 메닌고코커스 B 전세포 ELISA의 혈청 IgG 역가가 rpilin만을 투여한 마우스로부터의 역가와 비교시 동족 스트레인, 및 이종 스트레인 FAM18과 M982에 비해 rpilin+CT-CRME29H그룹에서 적어도 4배 증가하였다. 대조군으로서, KLM+CT-CRME29H으로 면역시킨 마우스는 시험된 임의 스트레인에 대한 전세포 ELISA에서 혈청 IgG를 유도하지 않았다. 표 18에서, rpilin-특이성 IgG 및 IgA 항체는 보조제 비처리 그룹에 비해서, rpilin+CT-CRME29H그룹에서 상당히 증가하였다. 더욱이, rpilin에 대한 점막 보조제로서 CT-CRME29H은 동족 그룹 메닌고코커스 스트레인에 의한 비강 콜로니에 대해 마우스를 보호하였다(도 3).
이어서, IN 면역으로 PorA+CT-CRME29H의 면역원성이 설명된다. rpilin+CT-CRME29H으로 보조제 처리된 PorA를 투여받는 그룹은 나이세리아 메닌자이티디스 H44/76 전세포에 대한 증가된 혈청 IgG 항체를 생성하였고 보조제 비처리 PorA 그룹에 비해 7 및 14배 더 높은 PorA-특이성 항체를 생성하였다(표 19). 그러나, PorA H44/76에 대한 혈청 IgA 항체는 검출불가였다. 수집된 점막 분비 샘플 어느 것에서도 PorA-특이 항체 역시 검출되지 않았다(표 19).
CT-CRME29H가 이종 메닌고코커스 스트레인에 대해 rpilin 또는 PorA에 의한 보호를 증강시킴을 증명하기 위하여 4차 실험을 수행하였다. 특히 표 20으로부터의 데이터는 CT-CRME29H와 전달된 클래스 1 rpilin 또는 PorA의 IN 투여가 항원 및 메닌고코커스 전세포에 대한 높은 혈청 항체 역가를 도출하였을 뿐만 아니라, 그룹 B나이세리아 메닌자이티디스의 이종 스트레인에 의한 비강 콜로니화에 대해 스위스-웹스터 마우스를 보호하였다. 구체적으로는, CT-CRME29H는 보조제 비처리 그룹의 것에 비해 클래스 1 rpilin에 대한 혈청 항체반응을 증강시켰다. 이와 유사하게, 보조제 처리 클래스 1 rpilin 그룹은 세균의 증강된 비강 제거를 제공하였다.
이어서, 메닌고코커스 비경구 면역을 위한 보조제로서 CT-CRME29H의 작용능을 검사한다. 도 5에 나타낸 바와 같이, MPLTM또는 CT-CRME29H로 보조제 처리한 PorA H355는 그룹 B 메닌고코커스 이종 스트레인 870227의 비강 콜로니화를 현저히 감소시켰다. 특히, PorA H355+CT-CRME29H로 피하 면역된 마우스는 코에 챌린지한지 24시간 후 PorA H355+MPLTM그룹보다 콜로니 수가 한층 더 적었다. 그러나, 살균활성은 MPLTM면역 그룹으로 보조제 처리한 PorA 및 열 사멸시킨 전세포로부터의 혈청에서만 검출되었고(표 22), PorA+CT-CRME29H로부터는 검출되지 않았다. CT-CRME29H로 보조제 처리한 PorA가 MPLTM보조제의 것과 유사한 동종의 살균활성을 보이지는 않았지만, 이종 그룹 B 메닌고코커스 스트레인에 의한 콜로니화의 감소에는 매우 효능이 있었다.
호흡기 합포체 바이러스(RSV) 당단백질에 대한 전신 및 점막 면역반응을 증대시키는 CT-CRME29H의 능력을 정제된 천연 융합(F) 단백질을 사용하여 검사한다. 또한, 보조제로서 CT-CRME29H의 효능에 미치는 앞서 존재하는 안티-CT 항체의 영향을 조사하였다. 결과는 CT 또는 CT-CRME29H로 보조제 처리한 F 단백질로 IN 면역시킨 BALB/c 마우스가 전신 및 국소 안티-CT IgG 및 IgA 항체 역가를 생성함을 증명하여 준다(표 23). 더욱이, 데이터는 CT-CRME29H함유 제형에 의해 생성된 항체 역가가 야생형 CT 함유 제형에 의해 도출된 것에 상당함을 시사한다 예를 들면, F 단백질/CT-CRME29H(1 ㎍/용량)으로 2차 면역 10일 후, 혈청 안티-CT IgA 및 IgG 항체 역가는 F 단백질/CT(1 ㎍/용량)로 면역시킨 마우스의 것보다 단지 약간 낮았다. 이와 유사한 결과는 1 내지 10 ㎍ CT-CRME29H으로 제조한 F 단백질로 면역시킨 마우스로부터의 질 세척액의 검사 후에도 수득된다(표 23). 따라서, 데이터는 CT-CRME29H가 야생형 CT만큼 면역원성임을 시사한다.
안티-CT 면역반응이 F 항원의 면역원성에 악영향을 미칠 수 있는지는 BALB/c 마우스를 야생형 CT 또는 PBS 중의 CT-CRME29H만으로 두번 IN 투여하여 우선 프라이밍시키는 2차 실험으로 착수한다(표 24). 이어서, 적당한 마우스를 야생형 CT 또는 CT-CRME29H와 혼합한 F 단백질로 2회 면역시킨다. 최종 투여(56일째 되는 날) 2주 후에 수집한 혈청 검사결과 앞서 존재하는 안티-CT 항체는 국소 또는 전신 안티-F 단백질 IgA 및 IgG 항체의 수준에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 사실, 데이터는 앞서 존재하는 안티-CT 항체가 증대된 안티-F 단백질 항체반응의 생성에 유익함을 시사한다. 이는 점막 표면에 도출된 안티-F 단백질 항체 역가를 비교하였을 때 가장 자명하다(표 24). 2차 면역 2주 후에, CT-CRME29H로 1차 프라이밍한 다음 F 단백질/CT-CRME29H로 면역시킨 마우스의 기관지폐포 및 질 세척액에서의 안티-F 단백질 IgA 항체 역가는 F 단백질/CT-CRME29H만으로 면역시킨 순수한 마우스의 것보다 각각 7배 및 17배 더 컸다(표 24).
3차 실험에서, RSV F 단백질 및 CT-CRME29H, CT-B 또는 알룸으로 IN 면역시킨 BALB/c 마우스의 전신 및 점막 면역반응을 평가한다. 표 25에 3차 면역 9일 후 수집된 혈청의 체액성 면역반응을 기재하였다. F 단백질 및 1 또는 10 ㎍의 CT-CRME29H를 함유하는 면역을 받은 마우스(각각 그룹 777 및 778)는 F/PBS, F/AlOH 또는 RSV로 면역시킨 마우스(각각, 그룹 784, 785 및 907)에 비해 IgG, IgG1 및 IgG2a에 대해 현저히 상승한 역가를 나타내었다. 아울러, F/CT-CRME29H함유 백신에 의해 생성된 역가(777 및 778)는 F 단백질 및 CTB에 의해 촉진된 것(779 및 780)과 적어도 대등하였다.
IgG 및 IgA 항체 ELISA를 실행하기 위하여 최종 면역 1주 후에 면역 동물로부터 기관지폐포 세포액, 질 및 비강 세척액을 수집한다. 표 26에 기재된 데이터는 5 마리의 마우스의 풀로부터의 역가를 보여준다. CT-CRME29H로 면역된 마우스는 질 및 비강 세척액(그룹 777 및 778) 모두에서 검출가능한 IgA를 도출하였다. CT-CRME29H로 면역시킨 마우스로부터 유도된 BALB에서는 IgA가 나타나지 않았으며 이는 RSV 면역 마우스(그룹 907) 및 F/CTB 면역 마우스(780)의 BAL에서 발견된 것과 대치된다. IgG는 BAL로부터의 것을 포함한 모든 점막 세척물에서 발견되었다. CT-CRME29H면역 마우스로부터의 세척액에서 발견된 IgG의 수준은 CTB로(그룹 779 및 780) 및 간 RSV로 면역시킴으로써 수득한 것들에 필적하였다.
4차 실험에서, 면역 마우스로부터 유래된 시험관내 자극된 비장 세포에 의해 도출된 세포용해(CTL) 활성을 평가한다. 데이터는 도 6에 제시하였다. RSV-면역 마우스가 대략 60%의 항원-특이성 세포 용해를 보인 반면에, 나머지 마우스 각각의 CTL 활성은 20% 이하로 남았다. 따라서, CT-CRME29H은 RSV F 단백질에 대한 전신 및 점막 체액성 면역반응 모두를 유도할 수 있는 반면에(표 25 및 26), RSV-감염 표적세포에 대한 세포-매개성 면역반응은 관찰되지 않았다.
5차 실험에서, 바이러스 보호 분석을 실행하여 F/CT-CRME29H의 비내 전달이 생존 RSV 챌린지에 대한 보호를 촉진하는지 여부를 조사한다. 데이터를 도 7에 제시하였다.
도 7에 나타낸 결과의 ANOVA에 의한 통계학적 분석은 다음과 같다:
p ＜ 0.05: F/PBS 대 F/CT-CRME29H(1 ㎍ 및 10 ㎍ CT-CRME29H), F/CTB(1 ㎍ 및 10 ㎍), F/AlOH.
p ＞ 0.05: PBS/CT-CRME29H대 F/PBS
p ＞ 0.05: F/CT-CRME29H(1 ㎍ 및 10 ㎍ CT-CRME29H) 대 F/CTB(1 ㎍ 및 10 ㎍) 대 F/AlOH.
F/CT-CRME29H또는 F/CTB를 함유하는 백신을 IN 투여한 마우스는 F/AlOH로 근육내 면역시킨 마우스에서 달성된 것에 필적하는 폐 바이러스 역가를 지녔다(p ＞ 0.05). 또한, F/CT-CRME29H으로 비내 면역시키면 각각 F/PBS 또는 PBS/CT-CRME29H로 수행한 IN 면역에 비해 폐 바이러스 역가를 Log101.6 및 Log101.4까지 감소시키는 것으로 나타났다. F/CT-CRME29H와 F/PBS 또는 PBS/CT-CRME29H간의 차이는 통계학적으로 유의한 것으로 나타났다(p ＜ 0.05).
6차 실험에서, RSV F 단백질 및 CT-CRME29H또는 알룸으로 IN 면역시킨 BALB/c 마우스의 전신 및 점막 면역반응을 평가한다. 표 27은 3차 면역 2주 후 수집한 혈청의 체액성 면역반응을 기재한다. F 단백질 및 1 ㎍의 CT-CRME29H를 함유하는 면역을 받은 마우스(그룹 256)는 F/PBS 또는 PBS/CT-CRME29H으로 면역시킨 마우스(각각 그룹 250 및 257)에 비해 IgG, IgG1 및 IgG2a에 대한 현저히 상승된 역가를 나타내었다. F/CT-CRME29H(256) 및 F/AlOH(258)로 면역시킨 마우스 간의 IgG1 역가에서 유의차는 관찰되지 않았다. 그러나, F/CT-CRME29H(256)에 의한 IN 면역은 F/AlOH(258)에 의한 면역에 의해 나타난 것에 비해 현저히 상승된 IgG2a 역가를 도출하였다. 종합하면, 이러한 결과는 표 25에 제시된 것과 일치한다. 혈청 IgA는 F/CT-CRME29H를 투여한 마우스 그룹에서는 검출되는 반면에, 역가는 앞서 관찰된 것보다 훨씬 낮았다(그룹 777의 경우에 16,202±2,031 및 그룹 256의 경우에 444±1,458). 외관상차이에 대한 이유는 분명하지 않다. 그럼에도 불구하고, IN 전달된 F/CT-CRME29H의 혈청 IgA 유도능은 두 연구 모두와 일치하며 이와 관련하여 F/AlOH와는 우호적으로 대비된다.
IgG 및 IgA 항체 ELISA를 수행하기 위하여 최종 면역 2주 후 면역 동물로부터 기관지폐포 세척액, 질 및 비강 세척액을 수집한다. 표 28에 기재한 데이터는 5 마리 마우스의 풀로부터의 역가를 보여준다. 표 26에 나타낸 결과와 유사하게, CT-CRME29H로 면역시킨 마우스는 질 및 비강 세척물(그룹 256) 모두에서 검출가능한 IgA를 도출하였다. 표 26에 제시된 데이터와 유사하게, IgA는 CT-CRME29H로 면역시킨 마우스로부터 유도된 BAL에서는 발견되지 않았다. 그러나, IgG는 BAL로부터의 것을 포함한 점막 세척액 모두에서 발견되었다. F/CT-CRME29H-면역 마우스로부터의 세척액에서 관찰되는 IgG의 수준은 생 RSV로 면역시킴으로써 수득된 것에 적어도 필적하였다(표 28, 그룹 256 대 259).
7차 실험에서, 면역 마우스로부터 유래된 시험관내 자극된 비장세포에 의해 도출된 세포용해(CTL) 활성을 평가한다. 데이터를 도 8에 제시하였다. RSV-면역 마우스가 대략 45%의 항원-특이성 세포 용해를 보인 반면에, 나머지 마우스 각각의 CTL 활성은 10% 이하로 남았다. 데이터는 F/CT-CRME29H에 의한 IN 면역이 비장 림프구 집단에서 RSV-감염 표적세포에 대한 세포-매개성 면역 방어 메커니즘을 유도할 수 없음을 확인시켜 준다. 이러한 사실은 선행 관찰을 확인시켜 준다(도 8).
8차 실험에서, F/CT-CRME29H의 IN 전달이 생 RSV 챌린지에 대해 보호를 촉진하는지 여부를 조사하기 위하여 부가의 바이러스 보호 분석을 수행하였다.
도 9에 나타낸 결과의 ANOVA에 의한 통계학적 분석은 다음과 같다:
p ＜ 0.05: F/PBS 대 F/CT-CRME29H, F/AlOH, RSV.
p ＜ 0.05: 순수 대 F/CT-CRME29H, F/AlOH, RSV.
p ＞ 0.05: F/CT-CRME29H대 F/AlOH, RSV.
도 7에 제시된 결과와 유사하게, F/CT-CRME29H를 함유하는 IN 백신을 투여한 마우스는 F/AlOH로 근육내 면역시키거나 생 RSV로 IN 면역시킨 마우스에서 달성된 것과 통계학적으로 필적하는(p ＞ 0.05) 정도로 폐에서 바이러스 복제를 통제하였다(각각 Log101.87 대 Log101.99 및 Log101.94). F/PBS(첫번째 바)로 IN 면역시키거나, 무면역 마우스(순수)는 각각 Log104.5 및 Log104.3의 폐 바이러스 역가를 나타내었다. 또한, 이들 그룹은 F/CT-CRME29H, F/AlOH 또는 생 RSV로 면역시킨 마우스로부터 수득된 바이러스 역가에 비해 통계학적으로 상승된(p ＜ 0.05) 것으로 나타난 폐 바이러스 역가를 지녔다. 따라서, 데이터는 F/CT-CRME29H의 IN 적하가 감염성 RSV 챌린지에 대해 보호함을 지지한다.
9차 실험에서, 안티-F 혈청 항체반응을 평가한다. 결과는 안티-F단백질 IgG가 PBS만으로 전달된 F 단백질에 주어진 것에 비해 F/CT-CRME29H(0.1 또는 1.0 ㎍)로면역시킨 마우스에서 현저히 증가함을 보여주었다(표 29). 또한, 0.1 또는 1.0 ㎍ F/CT-CRME29H으로 보조제 처리한 F 단백질은 안티-F 단백질 IgG 반응을 촉진함에 있어서 F/AlOH(근육내) 또는 RSV에 의한 실험적인 감염으로서 적어도 유효하였다. 안티-F 단백질 항체 역가의 크기는 제형내 F/CT-CRME29H의 용량에 의존하여, 역가는 1.0 ㎍ F/CT-CRME29H대 0.01 ㎍를 투여한 마우스에서 보다 현저히 더 크다. F/PBS와 비교시, 안티-F 단백질 IgG1 및 IgG2a 역가 모두는 0.1 또는 1.0 ㎍ F/CT-CRME29H로 증대되었다. CT-CRME29H은 유형 1 및 유형 2 면역 구획 모두를 촉진하였다. 현저히 더 높은 혈청 안티-F 단백질 IgA 반응이 RSV에 의한 실험적인 감염에 비해 F/CT-CRME29H(0.1 또는 1.0 ㎍)에 의한 IN 면역으로 촉진되었다. 이와는 대조적으로, 혈청 IgA 안티-F 단백질 항체는 F/PBS(IN) 또는 F/AlOH의 비경구 투여에 대해 관찰되지 않았다(표 29).
안티-CT 역가는 또한 안티-F 단백질 역가와 일치하는 용량-의존 패턴을 따랐다(표 29). CT-CRME29H(0.01 ㎍) 또는 F/CT-CRME29H(1.0 ㎍)으로 면역된 마우스로부터 수득된 혈청에서 통계학적으로 동등한 안티-CT 역가가 관찰되었다. 그러나, 이들 역가는 F/CT-CRME29H(0.1 또는 0.01 ㎍)에 비해 상당히 상승하였다. 또한, F/CT-CRME29H(0.1 ㎍)으로 면역된 마우스 혈청내 안티-CT 역가는 F/CT-CRME29H(0.01 ㎍)로 면역시킨 마우스로부터의 역가에 비해 통계학적으로 증대되었다. 따라서, 안티-F단백질 항체에 대한 CT-CRME29H의 보조제 효과는 돌연변이체 콜레라 홀로톡신에 대한 항체 반응과 상관관계가 있다(r = 0.97).
9차 실험에서, 점막 면역을 평가한다. 점막 IgA는 F/CT-CRME29H(1.0 ㎍) 또는 F/CT-CRME29H(0.1 ㎍)로 면역시킨 마우스로부터 모은 비강 세척액에서만 관찰되었다(표 30). 또한, 정제된 F 단백질 및 CT-CRME29H(0.01 또는 1.0 ㎍)을 함유하는 IN 면역을 받은 마우스는 질 세척액(VW)에 안티-F 단백질 IgA를 함유하였다. F 단백질-특이성 IgG는 F/CT-CRME29H(0.1 또는 0.01 ㎍) 또는 F/AlOH를 투여한 마우스의 기관지폐포 세척액(BAL), VW 및/또는 NW에서 관찰되었다. 이와는 대조적으로, 안티-F 단백질 IgA는 F/AlOH로 IM 면역시킨 마우스에서 검출되지 않았다.
10차 실험에서, F/CT-CRME29H로 제형된 F 단백질로 면역시킨 마우스에서의 기능성 면역을 평가한다. 보체의 존재하에서, 통계학적으로 증대된 안티-RSV 중화 항체는, F/PBS 또는 CT-CRME29H단독 투여에 비해 F 단백질 및 CT-CRME29H0.1 또는 1.0 ㎍, F/AlOH 또는 RSV A2를 투여한 마우스 혈청에서 검출되었다(표 31). 보체의 부재하에서는, 어느 그룹에서도 검출가능한 중화 역가가 관찰되지 않았다(log10＜ 1.3). 혈청 및 점막 항체 데이터(표 29 및 30)와 일치되게, F/CT-CRME29H(0.01 ㎍)에 의한 면역은 안티-RSV 중화 항체를 생성하기에 충분하지 않았다.
11차 실험에서, 면역 마우스를 3차 면역 2주 후에 챌린지시켜, 후속 감염에대한 F/CT-CRME29H보호능을 측정한다. 결과는 F/CT-CRME29H(0.1 또는 1.0 ㎍)으로 면역시킨 마우스가 보호되었음을 증명한다(표 32). 순수 마우스, 또는 F/PBS 또는 CT-CRME29H단독으로 면역시킨 것들과 비교하여, F 단백질 및 CT-CRME29H0.1 또는 1.0 ㎍으로 면역시킨 마우스의 폐는 바이러스 수준이 현저히 감소하였다. 또한, 무면역의 순수한 마우스 또는 F/PBS로 면역시킨 마우스에 비하여 F/CT-CRME29H(0.1 및 1.0 ㎍)으로 면역시킨 마우스의 비강 조직에서는 현저히 감소된 바이러스 수준이 관찰되었다. 이와는 대조적으로, F/AlOH로 비경구 면역시킨 마우스는 F/PBS 면역 마우스에 비해 폐 조직에서 감소된 바이러스 역가를 보였지만, 비강 조직에서는 유의한 감소가 없었다. 종합하면, F/CT-CRME29H(0.1 또는 1.0 ㎍)의 IN 투여는 후속 RSV 챌린지에 대한 호흡기 조직의 보호에 기여할 수 있는 국소 및 전신 체액성 면역반응 모두를 생성하기에 충분하다.
실시예 11에 제시된 데이터는 RSV F 단백질에 대한 IN 백신의 개발에 대한 가능한 연구를 설명한다. 데이터는 체액성 및 점막 IgG 및 IgA 모두의 생산이 F/CT-CRME29H의 IN 전달에 의해 촉진됨을 시사한다. 관찰된 항체 역가가 유의하다는 점은 두 방법으로 증명된다: 첫째, F/CT-CRME29H로 면역된 마우스에서 분석된 각각의 체액성 및 점막 항체 역가는 F/PBS로 면역된 마우스와 비교하여 정성적으로 유사하고 정량적으로 상승되었다. 둘째, 상승된 역가는 도 7과 9에 나타낸 관찰된 보호 수준에 의해 표시되는 바와 같이, 생물학적으로 유관한 면역반응으로 해석된다.F/CT-CRME29H에 의한 면역은 F/PBS 또는 PBS/CT-CRME29H에 의한 면역에 비해 생 RSV 챌린지에 대해 보호를 현저히 증강시킨다.
종합하면, 데이터는 F/CT-CRME29H를 함유하는 IN 면역 프로토콜에 반응하여 촉진되는, 점막 또는 체액성 면역글로불린에 의한 감염성 바이러스의 중화를 수반하는 메커니즘을 제시한다.
마우스를 재조합 발현된 VP2 및 VP6 단백질 형태의 다른 바이러스 항원, 로타바이러스로 면역시킨다. SA11 로타바이러스 VP2 및 VP6를 발현하는 재조합 배큘로바이러스 벡터를 전술한 바와 같이 작제한다(28); 재조합 발현된 로타바이러스 구조 단백질이 비리온과 형태학적으로 식별 불가능한 입자로 자가 조립됨이 공지되어 있다. 발현된 단백질은 2/6-바이러스-유사 입자(VLP)로 공-조립된다.
균질한 유전 배경을 갖는 근친교배 BALB/c 마우스를 사용하며, 이들은 모두 면역화에 반응성이 되고 따라서 VLP 단독에 대해 및 CT-CRME29H보조제와 배합될 때 전신 및 점막 면역글로불린의 프로필을 명확하게 할 것으로 기대된다. 유전적으로 이질성인 이계교배 CD-1 마우스를 사용하여 면역과 보호의 유도에 관여된 요인에 미치는 유전자 전달의 효과를 측정한다.
두 비반응성 경구 면역 CD-1 마우스를 제외한 모든 면역된 BALB/c 및 CD-1 마우스의 혈청은 VP2 및 VP6 모두에 대한 항체를 함유하였다. 예비 면역 혈청 및 무면역 마우스의 혈청은 모방 또는 VP2-6 배큘로바이러스 감염 세포에서 바이러스 항원을 검출하지 못하였다. 비감염 세포에 노출된 VP6 및 VP2에 특이성을 보이는2/6-VLP 면역 혈청 또는 mAb는 또한 반응성을 입증하지 못하였다(데이터 나타내지 않음). 2/6-VLP의 면역원성은 또한 2/6-VLP 및 로타바이러스의 SA11 스트레인에 대해 각각의 마우스로부터의 예비 챌린지되고 면역된 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된다(데이터 나타내지 않음).
2/6-VLP 단독으로 IN 면역된 그룹내 로타바이러스-특이성 혈청 IgG, IgM 및 IgA의 패턴은 2/6-VLP 및 CT-CRME29H으로 면역된 그룹에서의 것들과 유사하였다(도 10). 그러나, 3종의 혈청 항체 동위형의 13주째 수준은 CT-CRME29H과 함께 2/6-VLP를 투여한 동물에서 현저히 더 높았다(도 10)(IgG, IgM 및 IgA에 대해 각각 P = 0, P = 0.004, 및 P = 0.02). 이는 CT-CRME29H이 2/6-VLP에 대한 체액성 반응을 현저히 증강시켰다. 13주째에 챌린지에 앞서 2번의 면역 뒤에 생성된 항체 수준의 지표로서 선택된다.
도 11a에 도시된 바와 같이, VLP를 IN 투여한 BALB/c 마우스는 경구 면역된 것들보다 특이적인 전신 IgG 반응을 생성하였다. 두 그룹 간의 혈청 IgG 역가의 통계학적 유의차는 13주째에서 명백하였다(P = 0). 이와 유사하게, 혈청 IgM 수준은 예비 챌린지(13주) 값이 분석될 때 경구 그룹과는 반대로 IN 그룹에서 더 높았다(P = 0)(도 11b). IN 및 혼합 그룹에서 혈청 IgM 수준은 2주까지 피크를 이루고 4주까지는 감소한 반면에, 경구 그룹의 경우에 혈청 IgM의 작지만 비교적 일정한 수준이 연구 내내 검출되었다. 경구 및 IN 면역 동물에서 피크 혈청 IgA는 4주째에 발생하였다. 13주째에 검사하였을 때 3개 실험 그룹을 구별짓는 혈청 IgA 수준의 어떠한유의차도 없었다(도 11c). 결국, IN 면역은 경구 면역보다 전신 IgG 및 IgM 반응의 더 높은 수준을 생성하였다. IN 그룹내 IgG 및 IgM의 현저히 높은 수준의 유도는 IN 면역이 미래 백신 후보의 투여를 위한 바람직한 경로일 수 있다는 개념을 지지한다(33). 따라서, 강력한 전신 중화 반응을 이끄는 IN 면역은 점막 장벽을 침투하는 바이러스 병원체에 대해 효과적일 수 있다.
IgG1 및 IgG2a 양자 모두는 IN 및 경구 면역된 BALB/c 마우스의 혈청에서 발견된다(도 12). IN 그룹은 경구 그룹에 비해 두 IgG 서브클래스의 통계학적으로 현저히 더 높은 수준을 지닌다(IgG1, P = 0.005; IgG2a, P = 0.05). 그러나, 각 그룹의 서브클래스 간에 유의차는 없었다. 이러한 데이터는 두 T-헬퍼 경로의 효과적인 유도를 위한 IN 면역의 유용성을 확인시켜 준다(TH-1 및 TH-2).
모든 3개의 실험 그룹에 대한 배설물 IgA의 피크 수준은 1차 면역 4주 후에 발생하며(도 13a), 이는 혈청 IgA 수준이 경구 및 IN 면역 동물에서 최대인 시기와 일시적으로 일치한다(도 11c). 예비 챌린지 배설물 IgA 수준이 검사될 때 세 면역 프로토콜 간에는 통계학적 유의차가 발견되지 않았다(도 13a). 배설물 IgG 또한 4주째에 최대였으며(도 13b); 그러나, IN 그룹은 경구 또는 혼합 그룹에 비해 13주째에서 현저히 더 많은 IgG를 함유하였다(각각 P = 0 및 P = 0.002). 일반적으로, 2/6-VLP 면역된 마우스는 혈청 IgG, IgM 및 IgA, 및 배설물 IgG 및 IgA를 생성하였다. 어떤 동물에서도 배설물 IgM이 검출되지 않았다.
2/6-VLP IN(n =4)을 투여받는 모든 CD-1 마우스 및 경구 면역된 4 마리 마우스 중 두 마리는 로타바이러스-특이성 항체 반응을 생성하였다(데이터 나타내지 않음). 항체반응의 프로필을 더욱 정확하게 결정하기 위하여, 혈청 및 배설물 샘플을 26주 동안 주마다 분석하였다. CD-1 마우스내 혈청 및 배설물 항체의 유도 패턴은 BALB/c 마우스에서의 것과 유사하였다(도 11 및 13).
BALB/c 마우스에서, 2/6-VLP 및 CT-CRME29H에 의한 두 IN 면역은 2/6-VLP 단독으로 IN 면역시킨 경우(PRAS = 39%)와는 대조적으로 보호성인 것으로 증명되었다(PRAS = 98.7%)(P = 0.007)(도 14a). IN 뒤에 경구 면역이 따르는 혼합 면역은 마우스를 경구 및 IN 그룹과 유사한 정도로 마우스를 보호하였으며, 이는 BALB/c 마우스에서는 혼합 면역도 유효함을 시사한다. 이는 CT-CRME29H에 기인한 보호성 면역반응의 상당한 증대를 입증한다. 세 면역 그룹 모두에서 BALB/c 마우스는 챌린지로부터 거의 완전한 보호를 보여주었다. PRAS는 경구, IN 및 혼합 그룹에 대해 각각 99.6%, 98.8% 및 98.8%였다(도 14b). 비면역 대조군은 세 면역 그룹보다 현저히 더 많은 바이러스 항원을 탈락시켰다(P = 0). 세 면역 그룹에 대한 PRAS 값 간에는 유의차가 없었다.
IN 면역은 모든 면역 CD-1 마우스에서 전신 및 점막 반응을 유도하였고 이들 동물을 보호하였다(PRAS=97.9%)(도 14c). 4 마리의 경구 면역 CD-1 마우스 중 둘만이 전신 및 점막 항체 반응과 보호(3 마리 중 둘, PRAS 65.8%)를 나타내었고(도 14c); 이와 반대로, 모든 경구 면역 BALB/c 마우스가 점막 및 전신 반응을 나타내었으며 보호되었다. 주목할 것은, 면역반응을 일으키지 않은 CD-1 마우스는 감염으로부터 보호되지 않았고, 반면에 면역-반응성 마우스는 보호되었다(도 14c). 면역에 대한 항체가 없는 경구 그룹 중의 한 마리 마우스는 챌린지 전에 죽었다. 항체 반응의 분석에서 샘플 수를 줄이기 위하여 CD-1 마우스를 대조군으로 사용하였다. 그러나, 통계학적 분석 결과 보호 결과는 유의한 것으로 명백히 나타났다(P = 0, 95% 신뢰구간). 경구 면역 실험을 동일 조건하에 CD-1 마우스로 반복하되, 26주째가 아닌 13주째에 챌린지시킨다. 면역 그룹 중의 4 마리의 마우스 및 대조군으로 5 마리의 마우스를 사용하여, 유사한 보호수준이 관찰되었다(PRAS = 71.2%)(데이터는 나타내지 않았음). 종합하면, 이들 결과는 O Neal 등에 의해 최근에 발표된 결과를 지지하며, 이는 CD-1 마우스 비내 면역이 경구 면역보다 더 효과적임을 암시한다.
백신 보조제로서 CT-CRME29H의 이러한 입증된 유용성에 비추어, 이 물질의 적당량의 생산이 요망된다. pIIB29H(실시예 1에서 기술)을 사용하여, 이.콜라이에서의 CT-CRME29H발현을 수차례 시도하였다. 정제된 CT-CRME29H홀로톡신의 생성 수율은 배양배지 리터 당 대략 50 ㎍이었다. 플라스미드 pPX2492(실시예 1 참조)를 생성하기 위한 최초 플라스미드 pIIB29H에의 변형을 통해 CT-CRME29H수율을 증가시키려는 초기의 시도는 거의 또는 전혀 효과가 없는 것으로 나타났다. 수율의 적당한 증가는 pIIB29H, 및 유도체를 비브리오 콜레라 DsbA 및 이.콜라이 RpoH와 함께 발현시킴으로써 달성되었다. 동시발현 및 정제 변형은 CT-CRME29H의 수율을 리터 당 대략 2 mg으로 증가시켰다.
CT-CRME29H발현을 증가시키기 위하여, 락토스 유도성 프로모터를, CT-CRME29H를 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결되는 아라비노스 유도성 프로모터(Invitrogen Corporation, 미국 캘리포니아 칼스배드 소재)로 대치한다. 클로닝 중에, 플라스미드 pIIB29H는 비브리오 콜레라 스트레인 2125로부터의 ctxB 유전자에 연결된, 비브리오 콜레라 스트레인 569B로부터의 ctxA 유전자를 함유한 것으로 측정되었다. 이러한 유전자의 교차 정렬은 두 ctxB 유전자 간의 7 염기 치환 및 ctxA 유전자 간의 단일 염기 변화를 나타낸다. 이들 염기 치환의 몇몇은 성숙 서브유닛의 아미노산 변화를 일으킨다. 특히 주목할 것은 A-2 부분, 또는 A 서브유닛의 홀로톡신 조립체 도메인 내에 아미노산 변화를 일으키는 ctxA 유전자 간의 치환이다. 이들 유전자 간의 이질성이 톡신 발현 또는 홀로톡신 조립체에 부정적인 영향을 미치는지 여부는 알려져 있지 않지만; 진화론적 입장에서 보면 두 독소 서브유닛 유전자가 동일 기원이라는 것이 바람직하게 생각된다. 따라서, 아라비노스 유도성 시스템의 작제에 사용된 ctxA와 ctxB 유전자 모두 비브리오 콜레라 스트레인 569B로부터 기원한다. 플라스미드 pPX7490의 작제는 실시예 12에 기재되어 있다. pPX7490으로부터 CT-CRME29H의 생산은 배양액 리터 당 정제물 대략 30 mg이다.
본 발명은 또한, 콜레라 홀로톡신의 A 서브유닛의 위치 29에서 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환된 면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리 정제된 DNA(여기에서, 이러한 DNA 서열은 아라비노스 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된다)를 함유하는 플라스미드, 및 통상적인 기술에 의해 그러한 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 적당한 숙주세포에 관한 것이다.
다양한 숙주세포-플라스미드 벡터 시스템이 면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신의 발현에 사용된다. 바람직하게는 아라비노스 유도성 프로모터를 포함하는 벡터 시스템은 사용되는 숙주세포와 상용성이다. 적당한 숙주세포는 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA 또는 박테리오파지 DNA로 형질전환된 세균; 백시니아 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스; 피치아 세포와 같은 효모; Sf9 또는 Sf21 같은 곤충세포; 또는 차이니스 햄스터 난소세포와 같은 포유동물 세포주; 및 기타 통상의 유기체를 포함한다.
다양한 통상의 전사 및 해독 요소가 숙주세포-벡터 시스템에 사용될 수 있다. CT-CRM을 암호화하는 DNA를 발현 시스템 중으로 삽입시키고, 프로모터(바람직하게는, 아라비노스 유도성 프로모터) 및 다른 조절 성분을 벡터 안의 특정 부위에 연결시키면, 플라스미드 벡터가(사용되는 숙주세포-벡터 시스템에 따라, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해) 숙주세포 중으로 삽입될 때, CT-CRM을 암호화하는 DNA는 숙주세포에 의해 발현되게 된다.
면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신은 숙주세포를 전술한 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시킨 다음 숙주세포를 이에 의한 재조합 면역원성 독성제거 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 발현시킴으로써 생성된다.
비록, 본 발명이 아미노산 29에 히스티딘을 갖는 CT-CRM 돌연변이체로 예를 들었지만, 야생형 글루탐산 잔기의 다른 비보존성 돌연변이도 본 발명의 범위 안에 들어온다. 글루탐산은 산성(음전하) 분자이다. 따라서, 비보존성 돌연변이는 산성분자인 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환되는 것이 될 것이다. 적당한 대안의 아미노산으로는 히스티딘 처럼 염기성(양전하) 분자인 아미노산 라이신 및 아르기닌이 포함된다. 적당한 대안의 아미노산으로는 추가로 알라닌, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판 및 발린과 같은 비극성 작용그룹이 달린 아미노산, 및 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신 같은 비전하 극성 작용그룹이 달린 아미노산이 포함된다.
홀로톡신이 야생형 콜레라 홀로톡신에 비해 감소된 독성을 갖고 콜레라 홀로톡신의 A 서브유닛의 위치 29에서 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환된 돌연변이체 콜레라 홀로톡신 유효량과, 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생물 중에서 선택된 항원이 함께 항원 조성물의 제조에 사용되며, 여기에서 홀로톡신은 척추동물 숙주에서 항원에 대한 면역반응을 증강시킨다.
본 발명의 항원 조성물은 또한 아미노산 잔기 29 이외의 위치에서 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 함유하는 CT-CRM을 포함한다. 본원에서 참조로 인용되는 국제출원 WO 93/13202(36)은 콜레라 홀로톡신의 독성을 감소시키는 작용을 하는 A 서브유닛에 일련의 돌연변이를 기재하고 있다. 이러한 돌연변이는 아미노산 7에서의 아르기닌, 위치 9에서의 아스파트산, 위치 11에서의 아르기닌, 위치 44에서의 히스티딘, 위치 53에서의 발린, 위치 54에서의 아르기닌, 위치 61에서의 세린, 위치 63에서의 세린, 위치 70에서의 히스티딘, 위치 97에서의 발린, 위치 104에서의 타이로신, 위치 106에서의 프롤린, 위치 107에서의 히스티딘, 위치 110에서의 글루탐산, 위치 112에서의 글루탐산, 위치 114에서의 세린, 위치 127에서의 트립토판,위치 146에서의 아르기닌 및 위치 192에서의 아르기닌을 치환시킴을 포함한다. 콜레라 홀로톡신의 A 서브유닛을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 국제출원 WO 93/13202에 기재되어 있다. 본원에서 참조로 인용되는 국제출원 98/42375(37)는 A 서브유닛에서 아미노산 109에서 세린을 치환시키는 것을 기재하고 있으며, 이는 콜레라 홀로톡신의 독성을 감소시키는 작용을 한다. 따라서, 통상의 기술을 사용하여, 이들 추가 위치의 하나 이상에서 돌연변이를 생성시킨다.
본 발명의 항원 조성물을 비내, 경구, 질, 직장, 비경구, 피내, 경피(예를 들면, 본원에서 참조로 인용되는 국제출원 WO 98/20734(38)), 근육내, 복막내, 피하, 정맥내 및 동맥내 경로를 포함한(이에 한정되지 않음) 다양한 경로에 의해 인간 또는 비-인간 척추동물에 투여한다. 항원 조성물의 항원 성분의 양은 항원의 동질성, 및 숙주의 연령, 체중과 의학적 상태, 및 투여방법에 따라 변동하게 된다. 또한, 적정 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 요구되는 것은 아니지만, 항원 및 돌연변이체 CT는 동시에 투여되는 것이 바람직하다. 투여 횟수와 항원 조성물에 대한 용량 양생법 또한 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 보호는 항원 조성물의 1회 용량으로 부여될 수 있거나, 수 차례의 투여를 요할 수도 있으며, 아울러 보호를 유지하기 위하여 나중에 부스터 용량이 필요할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 돌연변이체 CT의 보조제 특성은 필요되는 투여횟수와 용량 양생법의 시간 경과를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 항원 조성물은 CT-CRME29H외에도 추가의 보조제를 포함할 수 있다. 이러한 보조제의 예로는 StimulonTMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., 미국 매사추세츠 프래밍햄 소재), MPLTM(3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., 미국 몬태나 해밀턴 소재), 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 및 IL-12(Genetics Institute, 미국 매사추세츠 캠브리지 소재)가 포함되며 이에 한정되지 않는다. 항원 조성물은 또한, 통상의 방법으로 면역학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 혼합된다.
본 발명의 면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신은 인간 및 비-인간 척추동물을 감염시키는 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 미생물로부터의 것들을 포함한(이에 한정되지 않음) 광범위의 병원성 미생물로부터의 광범위 항원을 함유하는 항원 조성물에 보조제로 사용하기에 적합하다. 항원은 전세포 또는 바이러스, 또는 하나 이상의 사카라이드, 단백질, 단백질 서브유닛 또는 단편, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 또는 기타 거대분자 성분을 포함할 수 있다. 필요에 따라, 항원 조성물은 동일하거나 상이한 병원성 미생물로부터의 하나 이상의 항원을 함유할 수 있다.
보조제로서 CT-CRM 돌연변이체를 포함하는 바람직한 세균 백신은 제한 없이, 헤모필루스 인플루엔자(분류 가능한 및 분류 불가능한 것 모두), 헤모필루스 솜너스, 모락셀라 카타할리스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 파이로진스, 스트렙토코커스 아갈락티애, 스트렙토코커스 피칼리스, 헬리코박터 파이로리, 나이세리아 메닌자이티디스, 나이세리아 코노레아, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 뉴모니애, 클라미디아 시타시, 보르데텔라 퍼투시스, 살모넬라 티파이, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 콜레라수이스, 이.콜라이, 시겔라, 비브리오 콜레라, 코린박테리움 디프테리아, 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 마이코박테리움 애비움, 마이코박테리움 인트러셀룰라레 컴플렉스, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 스태필로코커스 아우레우스, 클로스트리디움 테타니, 렙토스피라 인터로간스, 보렐리아 버그도페리, 파스퇴렐라 헤몰리티카, 파스퇴렐라 물토시다, 액티노바실러스 플루로뉴모니애 및 마이코플라즈마 갈리셉티쿰에 의해 야기된 질환의 에방 및/또는 치료에 관한 것들을 포함한다.
보조제로서 CT-CRM 돌연변이체를 포함하는 바람직한 바이러스 백신은 제한 없이, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 유형 1-3, 인플루엔자 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 파필로마바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스, 칼리시바이러스, 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 루벨라 바이러스, 아데노바이러스, 광견병 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 코로나바이러스, 파보바이러스, 감염성 리노트라케이티스 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 조류 감염성 점액낭병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 마렉병 바이러스, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스, 말 동맥염 바이러스 및 각종 뇌염 바이러스에 의해 야기된 질환의 에방/및 치료에 관한 것들을 포함한다.
보조제로서 CT-CRM 돌연변이체를 포함하는 진균 병원균에 대한 바람직한 백신은 제한 없이, 아스퍼질리스, 블라스토마이시즈, 캔디다, 콕시디오이즈, 크립토코커스 및 히스토플라즈마에 의해 야기된 질환의 예방 및/또는 치료에 관한 것들을 포함한다.
보조제로서 CT-CRM 돌연변이체를 포함하는 기생충에 대한 바람직한 백신은 제한 없이 레슈마니아 메이저, 아스카리스, 트리츄리스, 기아디아, 스키스토조마, 크립토스포리디움, 트리코모나스, 톡소플라즈마 곤다이 및 뉴모시스티스 카리나이에 관한 것들을 포함한다.
CT-CRM 돌연변이체는 또한, 폴리뉴클레오타이드 백신(DNA 백신으로도 알려져 있음)에 보조제로서 포함시키기에 적당하다. 이러한 백신은 부피비카인 같은 촉진제를 추가로 포함할 수 있다(본원에서 참조로 인용되는 US 특허 No. 5,593,972(99) 참조).
CT-CRME29H를 부피비카인으로 제형된, 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 유형 2의 완전한 길이의 당단백질 D(gD2)를 암호화하는 플라스미드 DNA(pDNA)의 투여를 위한 보조제로서 야생형 CT와 비교한다(40). 결과는 피내 경로에 의해 HSV-2를 위한 pDNA 백신과 함께 CT-CRME29H를 투여한 BALB/c 마우스가 피내 경로에 의해 pDNA HSV gD2 백신 그 자체를 투여한 것들보다 더 높은 평균 세포 반응을 생성하였음을 나타낸다(표 34). 또한, CT-CRME29H과 함께 pDNA HSV gD2 백신을 투여한 마우스에 대한 혈청내 평균 항체 반응은 보조제 없이 pDNA HSV gD2 백신을 투여한 마우스에 대해 나타난 것과 대략 동일 수준이었다(표 35).
이와 마찬가지로, pDNA HSV gD2 백신은 피내 또는 근육내 경로에 의한 비-보조제 처리 백신의 전달 뒤에 나타난 것들에 필적하는 수준으로 질 세척 샘플에서 gD2-특이성 항체 반응을 생성하였다(표 36).
CT-CRME29H또는 CT로 보조제 처리하고 피내 경로로 전달된 pDNA HSV gD2 백신으로 면역시킨 마우스는 보조제 없이 pDNA HSV-gD2 백신을 투여한 마우스보다 상당히 더 높은 수준의 감마 인터페론을 생성하였다(표 37). CT-CRME29H를 투여한 마우스는 또한 IL-5를 생성하였다.
따라서, CT-CRME29H는 HSV에 대한 플라스미드 DNA 백신으로 투여시 증식 및 감마 인터페론 반응을 증강시켰다.
본 발명을 좀더 잘 이해할 수 있도록, 하기 실시예를 기재한다. 실시예는 설명에 불과할 뿐, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
CT 돌연변이체의 발현
세균 스트레인, 플라스미드 및 증식조건
XL1 블루(Stratagene, 미국 캘리포니아 라졸라 소재;(41)) 및 CJ236(FTc, lacIq)(Bio-Rad, 미국 캘리포니아 허큘리즈 소재)를 운반하는, 이.콜라이 TG1(Amersham-Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지 피스캣어웨이 소재), 및 TX1, 즉 TG1의 날리딕신산-내성 유도체를 재조합 플라스미드의 클로닝 및 돌연변이 단백질발현을 위한 숙주로 사용한다. 플라스미드-함유 스트레인을 필요에 따라 항생물질(앰피실린, 50 ㎍/ml; 카나마이신 25 ㎍/ml; 테트라사이클린 10 ㎍/ml)을 함유한 LB 아가 플레이트 상에서 유지시킨다. 비브리오 콜레라 0395로부터의 완전한 CT 오페론을 플라스미드 벡터 pSKII-중으로, lac 프로모터의 제어하에 서브클로닝하여 pMGJ67로 명명된 IPTG 유도성 플라스미드를 생성시킨다(42).
ctxA 유전자의 돌연변이 유발
Kunkel의 방법(43)을 사용하여 플라스미드 pMGJ67에 생성된 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이체를 선별한다. 5종의 돌연변이체 CT-CRM 생성에 사용된 올리고뉴클레오타이드를 표 1에 기재하였다.
표 1
ctxA 중으로 도입된 올리고뉴크레오타이드의 서열
a변형된 염기는 밑줄; N = 임의 염기; K = T 또는 G
간단히 설명하면, 각각의 일본쇄 올리고뉴클레오타이드를 인산화하여 이.콜라이 dut unq 스트레인 CJ236(F'Tc, pMGJ67)로부터 구제된 우라실-함유 일본쇄 DNA주형 상에서의 직접 제 2 본쇄 합성에 사용한다. 연결하여 unq+스트레인 TX1의 형질전환을 한 뒤에, AmpR형질전환체로부터 일본쇄 DNA를 구제하고 디데옥시 쇄 종결법에 의해 서열분석하다(44).
CT-CRM E29H 를 암호화하는 플라스미드의 작제
CT-CRME29H를 암호화하는 플라스미드를 pIIB29H로 명명한다. 플라스미드는 CT를 암호화하는 비브리오 콜레라 유전자 ctxA 및 ctxB의 폴리시스트론을 함유한다. 이 플라스미드내 ctxA 유전자는 CT-A의 아미노산 위치 29의 히스티딘을 암호화하도록 전술한 바와 같이 돌연변이 유발시킨다. 야생형 폴리시스트론을 또한 천연 ToxR 유도성 프로모터를 제거하고 락토스 유도성 프로모터로 대치함으로써 변형시킨다. 아울러, ctxA와 ctxB 및 시그널 서열을 암호화하는 영역을 이.콜라이의 시그널 서열-암호화 영역(LTIIb-B 리더)으로 대치하여 CT-CRME29H의 분비를 촉진시킨다. 이어서, CT-CRME29H의 발현을 증가시키기 위한 일환으로 플라스미드 pIIB29H를 변형시킨다. pPX2492로 명명된 생성되는 플라스미드는 ctxA 및 ctxB 각각의 상류에 합성 샤인 달가노 서열을 함유한다. 두 유전자는 유전자가 중첩하는 비브리오 콜레라에서와는 달리 pPX2492에서는 유전적으로 분리된다. 두 유전자는 또한 각각의 상류에 LTIIb-B 리더 서열을 갖는다.
돌연변이체 ctxA 대립유전자의 발현
각각의 변이체 홀로톡신의 생성을 37℃에서 진탕하에(200 rpm) 125 ml 들이삼각 플라스크내 TB 배지(45) 5 ml 배양액에서 시험한다. IPTG를 0.4 mM이 되게 첨가하여 밤새 증식시켜 대수기 세포(A600= 0.8-1.0)를 유도한다. 폴리믹신 B를 1 mg/ml가 되게 가한 다음, 37℃에서 10분간 배양한다. 후술하는 바와 같이 세포를 원심분리 제거하고, 상등액을 분석하여 홀로톡신과 B 펜타머의 농도를 측정한다.
구체적으로는, 이.콜라이내 CT-CRME29H의 생성은 이.콜라이로부터의 유전자 rpoH 및 비브리오 콜레라로부터의 dsbA의 동시발현을 수반한다. 이들 유전자 산물은 CT의 A 및 B 서브유닛 모두의 형태적 성숙에 관여한다.
실시예 2
온전한 홀로톡신에 대한 GM1 결합분석
CT-CRM을 강글리오사이드 GM1-의존성 고체상 방사면역분석(42)으로 검사하여 온전한 홀로톡신이 정제 후에도 정제하는지 여부를 측정한다. ELISA 플레이트 마이크로웰을 밤새 4℃에서 강글리오사이드 GM1(10 ㎕/ml)로 코팅시킨 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)이 사용된다. 이어서, 하기의 시약을 실온에서 1시간 배양 간격으로 순서대로 가한다: CT-CRM(3 ㎍/ml에서 0.00137 ㎍/ml로 적정), 100 ㎕/ml의 토끼 안티-CT-A 혈청(1:1,000), 및 알칼라인 포스파타제 접합 염소 안티-토끼 항체(1:2,000). 반응을 가시화하기 위하여, 디에탄올아민 중 1 ㎍/ml의 100 ㎕/ml p-니트로페닐 포스파타제를 가하고 30분간 배양한다. 2 N NaOH 100 ㎕를 가하여 반응을 정지시키고 즉시 마이크로엘리사 자동판독기로 판독한다. 야생형 CT에 비하여, 데이터는 위치 7, 29, 110, 또는 112에 아미노산 치환이 있는 CT-CRM이 온전한홀로톡신임을 시사한다(도 1). 그러나, 결과는 정제된 CT-CRMR11K의 부분은 홀로톡신인 것으로 보이지 않음을 암시한다.
실시예 3
CT-CRM의 잔류 독성에 대한 Y-1 부신 세포 분석
돌연변이체 CT-CRM을 마우스 Y-1 부신 종양세포 분석에서 독성에 대한 야생형 홀로톡신과 수 차례 비교한다. Y-1 부신 세포(ATCC CCL-79)를 웰 당 104세포의 농도로 96-웰 평저 플레이트에 시딩한다. 이어서, CT-CRM의 3배 희석액을 종양세포에 가하고 37℃에서(5% CO2) 18시간 배양한다. 이어서, 세포를 광학현미경으로 독성의 증거에 대해 검사한다(세포 라운딩). 종점 역가는 50% 이상의 세포 라운딩 생성에 필요한 독성의 최소 농도로서 정의된다. 잔류 독성의 %는 CT-CRM에 의해 도출된 역가로 나누어 100을 곱한 야생형 CT의 종점 역가를 이용하여 계산된다. 표 2는 Y-1 부신 세포 분석에서 시험된 수 종의 정제된 돌연변이체 홀로톡신의 잔류 독성을 나타낸다.
표 2
Y-1 부신 세포에 대한 독성
실시예 4
페이턴트 마우스 내장 중량 분석
본 분석에서, 10 ㎍의 야생형 CT 또는 CT-CRME29H를 BALB/c 마우스의 각 그룹(그룹 당 3 마리)에 위장내 투여한다. 장을 3시간 후에 조심스럽게 적출하여 칭량한다. 표 3에 결과를 나타내었다. 데이터는 그룹 당 평균 내장/사체 중량비로 제시하였다.
표 3
CT-CRME29H의 독성
분석 CT CT-CRME29H PBS
마우스 내장 중량(내장/사체 비) 0.13±0.01 0.09±0.01a 0.08±0.007
ap ＜ 0.05, 야생형 CT 대조군과 비교, p ＞ 0.05, PBS와 비교
실시예 5
ADP-리보실트랜스퍼라제 분석
NAD+:아그마틴 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 방사표지 NAD+로부터 [카보닐-14C] 니코틴아미드의 방출로서 측정한다. 간단히 말하면, CT 및 CT-CRM을 트립신 활성화시키고 TEAN 완충제(트리스TM/EDTA/나트륨 아자이드/나트륨 클로라이드)(pH 8.0) 중 50 mM 글라이신/20 mM 디티오트레이톨로 30℃에서 30분간 배양한다. 이어서, 하기 물질을 반응에 첨가한다: 0.1 mg의 대두 트립신 억제제, 50 mM 칼륨 포스페이트, 10 mM 아그마틴, 20 mM 디티오트레이톨, 10 mM 마그네슘 클로라이드, 100 μM GTP, 3 mM 디미리스토일포스파티딜-클로라이드, 0.2% 콜레이트, 0.03 mg의 난알부민, 100 μM [아데노신-U-14C]NAD(DuPont NENTM, 미국 매사추세츠 보스턴 소재) 및 최종 용적 300 ㎕가 되게 하는 양의 물. [14C]ADP-리보실아그마틴을 함유하는 용출액을 방사분석을 위해 수집한다. 용출액 중의14C의 평균 회수율은 칼럼에 적용된 것의 %로서 표시한다. 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4
NAD:아그마틴 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성
실시예 6
분류 불가능한 헤모필루스 인플루엔자(NTHi)의 재조합 (r) P4 및 P6 외막 단백질로 면역시킨 BALB/c 마우스의 면역반응
1차 실험에서, 그룹 당 5 마리의 BALB/c 마우스를, 표 5와 6에 표시된 바와 같이 5 ㎍ rP4 또는 10 ㎍ rP6 + 1 ㎍의 보조제를 함유하는 10 ㎕로 0일, 21일 및 35일째에 비내 면역시킨다(한 그룹은 보조제를 투여하지 않았다). 안티-rP4 IgG 항체 역가를 0, 21, 35 및 48일째 되는 날에 수집하여 모은 샘플에서 ELISA로 측정하고 결과를 표 5에 나타내었다. 안티-rP6 IgG 항체 역가를 0, 21, 35 및 48일째 되는 날에 수집하여 모든 샘플에 대하여 ELISA로 별도로 측정하고 결과를 표 6에 나타내었다. rP4에 대한 점막 항체 반응을 최종 면역 2주 후에 측정하였다(49일째 되는 날). 표 7에 각각 비강, 기관지폐포 및 질 세척액으로부터의 IgA 및 IgG 역가를실었다.
2차 실험에서, 그룹 당 5 마리의 BALB/c 마우스를 0, 21 및 35일째 되는 날에, 표 8에 표시된 바와 같이 5 ㎍ rP4 또는 10 ㎍ rP6 + 중가하는 용량의 CT-CRME29H를 함유하는 30 ㎕ 용량으로 비내 면역시킨다(타 그룹 각각은 CT 또는 CT-B를 투여하며; 한 그룹은 보조제를 투여하지 않았다). 혈청 안티-rP4 IgA 및 IgG 항체 역가를 21, 35 및 48일째 되는 날에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정하고 결과를 표 8에 나타내었다. 또한 49일째 되는 날에 기관지폐포 및 질 세척액으로부터의 IgA 및 IgG 역가를 측정하여 표 8에 나타내었다.
표 5
돌연변이체 콜레라 홀로톡신으로 제형된 재조합 P4 및 P6 단백질b로 면역시킨aBALB/c 마우스의 전신 체액성 면역반응
a마우스는 0, 21 및 35일째 되는 날에 비내 면역된다(IN, 10 ㎕ 용적).
b재조합 P4 및 P6 단백질은 각각 용량 당 5 및 10 ㎍으로 투여된다.
c안티-재조합 P4 IgG 항체 역가는 표시된 시간에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정하였다. 그룹 당 5 마리.
dCT 및 CT 돌연변이체를 용량 당 1 ㎍으로 투여한다.
표 6
돌연변이체 콜레라 홀로톡신으로 제형된 재조합 P4 및 P6 단백질b로 면역시킨aBALB/c 마우스의 전신 체액성 면역반응
a마우스는 0, 21 및 35일째 되는 날에 비내 면역된다(IN, 10 ㎕ 용적).
b재조합 P4 및 P6 단백질은 각각 용량 당 5 및 10 ㎍으로 투여된다.
c안티-재조합 P4 IgG 항체 역가는 표시된 시간에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리.
dCT 및 CT 돌연변이체를 용량 당 1 ㎍으로 투여한다.
표 7
돌연변이체 콜레라 홀로톡신으로 제형된 재조합 P4 및 P6 단백질b로 면역시킨aBALB/c 마우스의 점막 항체 반응
a마우스는 0, 21 및 35일째 되는 날에 비내 면역된다(IN, 10 ㎕ 용적).
b재조합 P4 및 P6 단백질은 각각 용량 당 5 및 10 ㎍으로 투여된다.
c안티-재조합 P4 IgG 및 IgA 항체 역가는 최종 면역 2주 후(49일째 되는 날) 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리.
dNW, BAW, 및 VW는 각각 비강 세척액, 기관지폐포 세척액, 및 질 세척액을나타낸다.
eCT 및 CT 돌연변이체를 용량 당 1 ㎍으로 투여한다.
표 8
헤모필루스 인플루엔자의 재조합 P4 및 P6 단백질에 대한 국소 및 전신 면역반응의 생성에 미치는 CT-CRME29H의 상승하는 용량의 효과
안티-재조합 P4 항체 역가a
a마우스를 0, 21 및 35일째 되는 날에 재조합 P4(5 ㎍) 및 P6(10 ㎍) 단백질로 비내 면역시킨다(IN, 30 ㎍ 용적). 안티-재조합 P4 IgG 및 IgA 항체 역가는 표시된 시간에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리.
bBAW 및 VW는 각각 기관지폐포 세척액, 및 질 세척액을 나타낸다.
실시예 7
NTHi의 천연 Hap 단백질로 면역시킨 BALB/c 마우스의 면역반응
NTHi 스트레인 P860295(46)를 피츠버그 대학의 챨스 브린턴 박사로부터 입수한다. 이는 NTHi 유도된 중이염이 있는 유아의 인두로부터 수득된다. NTHi 스트레인 TN106(47)은 에릭 한슨 박사(미국 댈러스 소재 University of Texas Southwestern Medical Center)로부터 입수한다. TN106의 스트렙토마이신 내성 돌연변이체는 스트렙토마이신(Sigma, 미국 미주리 세인트 루이스 소재) 100 ㎍/ml를 함유하는 BHI-XV 플레이트 상에서 선별에 의해 유도된다. 이 돌연변이체는 Balb/c 마우스의 인두에서 2회 계대시키고 스트레인 TN106.P2로서 동결시킨다.
NTHi 스트레인 P860295로부터의 Hap 단백질은 다음과 같이 정제한다. NTHi 스트레인 P860295를 통기하에 35℃에서 18시간 동안 BHI-XV 배지에서 증식시킨다. 세균 세포를 10K x g, 4℃에서 원심분리로 펠릿화하여 버린다. 상등액을 고체 (NH4)2SO4로 60% 포화시키고, 실온에서 2 내지 3시간 유지시킨 다음, 침전물을 원심분리로 수집한다. 침전물을 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 5.8, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl(완충제 1)에 용해시키고, 상기 완충제에 대해 4℃에서 투석한다. 10 mM 베드 용적 CM SepharoseTM칼럼(Pharmacia, 미국 뉴저지 피스캣어웨이 소재)을 완충제 1로 평형시키고, 상기 가용성 물질 30 ml을 분 당 1 ml의 유속으로 칼럼에 로딩한다. 칼럼을 OD280이 기저치에 도달할 때까지 완충제 1로 세척한다. 낙하-통과 물질을 버린다. 결합된 단백질은 3 단계 구배를 이용하여 수지로부터 용출시킨다: (1)나트륨 포스페이트 완충제, pH 7.0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl; (2) 나트륨 포스페이트 완충제, pH 8.0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl; 및 (3) 나트륨 포스페이트 완충제, pH 8.0, 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA. 각각의 단계에서 용출된 단백질을 모아 분석 후에 보관한다. 풀의 SDS-PAGE(48) 분석은 Hap 단백질이 구배 단계 2와 3에서 용출됨을 나타낸다. 이들 풀은 고순도 Hap를 함유하며 합한다.
6주령 Balb/c 마우스 암컷(그룹 당 10 마리)을 NTHi 스트레인 P860295로부터 정제한 Hap로 IN 면역시킨다. Hap 단백질을 CT-CRME29H의 존재 또는 부재하에 D-PBS에 5 또는 15 ㎍/40 ㎕로 희석시킨다. 사용할 경우, CT-CRME29H를 0.1 ㎍/마우스의 용량으로 사용한다. D-PBS 중의 CT-CRME29H, D-PBS 단독 및 포르말린 고정된 TN106.P2(NTHi 챌린지 스트레인)를 함유하는 대조 제형도 마우스에 40 ㎕ 용적으로 투여한다.
IN 면역에 앞서, 마우스를 마취시킨 다음에 피펫으로부터 콧구멍 당 20 ㎕을 비내 접종하여 면역시킨다. 피펫을 팁이 콧구멍의 개구부에 닿도록 유지시키고 제형을 호흡을 하는 동안 콧구멍 중으로 자동적으로 드로잉시킨다. 마우스를 뒤로 누운 자세로 배치하여 제형의 투여나 챌린지 후 코에 어떤 것도 닿지 않도록 한다. 마우스를 0, 1, 3 및 5주째에 면역시킨다. 결과를 표 9에 나타내었다.
표 9
CT-CRME29H와 또는 없이 혼합된 Hap로 비내 면역 후 Balb/c 마우스에서의 전신 체액성 면역반응
실시예 8
헬리코박터 파이로리의 재조합 (r) 우레아제 단백질로 면역된 BALB/c 및 C57B1/6 마우스의 면역반응
1차 실험에서, 그룹 당 5 마리의 BALB/c 마우스를 다음과 같이 면역시킨다: 7 그룹을 0, 2, 14 및 16일째 되는 날에 표 10-12에 표시한 바와 같이 100 ㎍ rUrease+10 ㎍ 보조제로 위장내 면역시킨다. 한 그룹은 둔부에 10 ㎍ rUrease로 피하 면역시키고; 다른 한 그룹은 목 부분에 10 ㎍ rUrease로 피하 면역시키며; 양 그룹 모두 0 및 16일째에 보조제로서 20 ㎍의 StimulonTMQS-21을 투여한다. 안티-rUrease 항체 역가를 28일째에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. IgG 결과를 표 10에 나타내고 IgA 결과를 표 11에 나타내었다. rUrease에 대한 점막 항체 반응을 29일째에 측정한다. 표 12에 각각 기관지폐포 및 질 세척액으로부터의 IgA 및 IgG 역가를 나타내었다.
2차 실험에서, 헬리코박터 펠리스에 의한 챌린지에 대한 rUrease+보조제의 마우스 보호능을 평가한다. 그룹 당 10 마리 BALB/c 마우스를 다음과 같이 면역시킨다: 두 그룹은 표 13에 표시된 바와 같이 0, 2, 14 및 16일째에 100 ㎍ rUrease+10 ㎍ 보조제로 위장내 면역시키며; 대조군은 rUrease+10 ㎍ 보조제 대신 PBS를 투여한다. 하나의 그룹은 0 및 16일째에 10 ㎍ rUrease+20 10 ㎍ StimulonTMQS-21로 피하 면역시킨다. 안티-rUrease 항체 역가를 28일째에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 마우스를 또한 108헬리코박터 펠리스 3회 용량으로 29, 31 및 34일째에 챌린지하고 44일째에 보호에 대해 평가한다. 보호는 고속 우레아제 시험으로 평가한다. 고속 우레아제 시험에서, 위장의 1/2을 37℃에서 5시간 동안 2% 우레아와 페놀 레드, pH 지시약, 7 ㎍/ml를 함유하는 우레아제 시험 배지에서 배양한다. 우레아제 활성은 암모늄 및 비카보네이트를 우레아로부터 생성하여, pH가 상승하고 550 nm에서 흡광도가 더 높은 용액의 비색 변화를 유도한다. 우레아제 활성의 수준은 분광분석법으로 측정한다. 시험은 흡광도의 평균이 비-감염 마우스의 위장 조직에 대해 수득된 것보다 2 표준 편차일 때 헬리코박터 펠리스에 대해 양성인 것으로 생각된다. 결과를 표 13에 나타내었다.
3차 실험에서, C57BL/6 마우스의 두 그룹(그룹 당 5 마리)을 0, 2, 14 및 16일째에 표 14에 표시된 바와 같이 100 ㎍ rUrease+10 ㎍ 보조제로 위장내 면역시킨다. 제 3 그룹은 0 및 16일째에 10 ㎍ rUrease+100 ㎍ 알룸으로 피하 면역시킨다. 제 4 그룹은 0, 2, 14 및 16일째에 보조제 없이 100 ㎍ rUrease로 위장내 면역시킨다. 안티-rUrease 항체 역가를 28일째에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 표 14에 혈청, 기관지폐포 세척액, 배설물 펠릿 추출물 및 질 세척액 각각으로부터의 IgA 및 IgG 역가를 기재하였다.
4차 실험에서, 그룹 당 5 마리의 C57BL/6 마우스를 다음과 같이 면역시킨다: 마우스의 3 그룹을 0, 2, 14 및 16일째에 표 15에 표시된 바와 같이 100 ㎍ rUrease+10 ㎍ 보조제로 면역시키며; 제 4 그룹은 보조제를 투여하지 않는다. 안티-rUrease 항체 역가는 29일째에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. IgA 및 IgG 결과를 표 15에 나타내었다. 표 15는 또한, IgE (PCA) 및 전체 IgE 역가를 제시한다. PCA는 IgE 항체 역가가 수동 피하 아나필락시스 반응에 의해 측정됨을 의미한다. PCA는 스프라그-돌리 래트 암컷에서 수행된다. 래트를 케타민/자일라진으로 진정시키고, 면도한 다음, CT, LT, 또는 CT-CRME29H로 제형된 rUrease로 면역시킨 C57B1/6 마우스로부터의 0.1 ml 혈청(연속 4배 희석)으로 피내 주사한다. 래트를 48 내지 60시간 뒤에 진정시킨 다음 1% 에반스 블루 다이를 함유하는 PBS 중 2 ㎍ rUrease로 미정맥을 통해 정맥내 주사한다(0.1 ml).
표 10
BALB/c 마우스에서 전신 안티-rUrease IgG 항체 역가의 생성에 미치는 CT-CRM의 효과
a기하 평균 안티-재조합 우레아제 항체 역가는 28일째에 수집한 혈청 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리.
b마우스를 둔부(R), 목 부분(N)에 0 및 16일째에 10 ㎍ rUrease로 피하(SC) 면역시킨다. 위장내(IG) 면역시킨 마우스는 0, 2, 14 및 16일째에 100 ㎍ rUrease를 투여한다. 보조제는 StimulonTMQS-21(20 ㎍), CT(10 ㎍), 또는 CT 돌연변이체(10 ㎍)이다.
표 11
BALB/c 마우스에서 전신 안티-rUrease IgA 항체 역가의 생성에 미치는 CT-CRM의 효과
a기하 평균 안티-재조합 우레아제 IgA 항체 역가는 28일째에 수집한 혈청 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리.
b마우스를 둔부(R), 목 부분(N)에 0 및 16일째에 10 ㎍ rUrease로 피하(SC) 면역시킨다. 위장내(IG) 면역시킨 마우스는 0, 2, 14 및 16일째에 100 ㎍ rUrease를 투여한다. 보조제는 StimulonTMQS-21(20 ㎍), CT(10 ㎍), 또는 CT 유도체(10 ㎍)이다.
표 12
BALB/c 마우스의 점막 분비물에서 안티-우레아제 IgA 항체 역가의 생성에 미치는 CT-CRM의 효과
a안티-rUrease IgG 및 IgA 항체 역가는 29일째에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리.
bBAW 및 VW는 기관지폐포 및 질 세척액을 각각 의미한다.
c마우스를 둔부(R), 목 부분(N)에 0 및 16일째에 10 ㎍ rUrease로 피하(SC) 면역시킨다. 위장내(IG) 면역시킨 마우스는 0, 2, 14 및 16일째에 100 ㎍ rUrease를 투여한다. 보조제는 StimulonTMQS-21(20 ㎍), CT(10 ㎍), 또는 CT 유도체(10 ㎍)이다.
표 13
CT 또는 CT-CRME29H로 제형된 재조합 우레아제로 면역시킨 BALB/c 마우스에서 보호 면역반응의 생성
a안티-재조합 (r) 우레아제 IgA 항체 역가는 28일째에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 그룹 당 10 마리.
b마우스를 2, 14 및 16일째에 용량 당 100 ㎍ r 우레아제로 위장내(IG) 면역시킨다. 대조군 마우스는 0 및 16일째에 용량 당 10 ㎍ rUrease를 피하(SC) 주사한다.
crUrease를 용량 당 10 ㎍ CT 또는 CT-CRM으로 제형하거나, 용량 당 20 ㎍StimulonTMQS-21과 혼합한다.
dBAW는 기관지폐포 세척액을 의미한다.
e마우스를 108헬리코박터 펠리스 3 용량으로 29, 31 및 34일째에 챌린지시키고 44일째에 보호에 대해 분석한다. 보호는 고속 우레아제 시험으로 평가한다.
표 14
C57BL/6 마우스에서 재조합 우레아제에 대한 면역반응에 미치는 CT-CRME29H의 효과
a종점 안티-rUrease 항체 역가는 28일째에 수집하여 모은 혈청 샘플에 대하여 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리.
bBAW, FP, 및 VW는 기관지폐포 세척액, 배설물 펠릿 추출물, 및 질 세척액을 각각 의미한다.
c마우스는 0 및 16일째에 10 ㎍ rUrease로 피하(SC) 면역시킨다. 위장내(IG) 면역시킨 마우스는 0, 2, 14, 및 16일째에 100 ㎍ rUrease로 위장내(IG) 면역시킨다. 보조제는 알룸(100 ㎍), CT(10 ㎍), 또는 CT-CRME29H(10 ㎍)이다.
표 15
CT, LT, 또는 CT-CRME29H로 제조한 재조합 우레아제로 면역시킨 C57B1/6 마우스의 순환 우레아제-특이성 IgE 항체의 생성
a종점 IgA 및 IgG 항체 역가는 29일째에 수집하여 모은 혈청 샘플에 대하여 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리.
b마우스는 0, 2, 14, 및 16일째에 100 ㎍ rUrease로 위장내(IG) 면역시킨다. 보조제는 10 ㎍ CT, CT-CRME29H또는 LT이다.
cPCA는 IgE 항체 역가가 수동 피하 아나필락시스 반응에 의해 측정됨을 의미한다. PCA는 스프라그-돌리 래트 암컷에서 수행된다. 래트를 케타민/자일라진으로 진정시키고, 면도한 다음, CT, LT, 또는 CT-CRME29H로 제형된 rUrease로 면역시킨 C57B1/6 마우스로부터의 0.1 ml 혈청(연속 4배 희석)으로 피내 주사한다. 래트를 48 내지 60시간 뒤에 진정시킨 다음 1% 에반스 블루 다이를 함유하는 PBS 중 2 ㎍ rUrease로 미정맥을 통해 정맥내 주사한다(0.1 ml).
d수치는 ng/ml이다. ND는 검출되지 않음을 의미한다.
실시예 9
나이세리아 메닌자이티디스의 재조합 클래스 1 필린 및 클래스 1 외막 단백질로 면역시킨 스위스-웹스터 마우스의 면역반응
1차 실험에서, 6 내지 8주령 스위스-웹스터 마우스(그룹 당 15 마리)를 CT-CRME29H(0.1 또는 1 ㎍/마우스)로 제형된 5 ㎍의 정제된 재조합 클래스 1 필린(rpilin)으로 0, 2 및 3주째에 IN(10 ㎕) 면역시킨다. 혈청 샘플, 기관지폐포 세척액(BAW), 비강 세척액(NW) 및 질 세척액(VW)을 4주째에 ELISA로 나이세리아 메닌자이티디스 필린 특이성인 혈청 및 점막 IgA 및 IgG 항체의 측정을 위하여 각 그룹에서 5 마리의 마우스로부터 수집한다. 결과를 표 16에 나타내었다. 각 그룹의 나머지 10 마리의 마우스는 4주째에 동족 나이세리아 메닌자이티디스 스트레인 H355P+·p2IR(유아 래트를 통해 2회 계대)의 2 x 107CFU로 동시에 IN 챌린지시킨다. 비강 조직 24시간 후-챌린지로부터의 그룹 B 나이세리아 메닌자이티디스의 회수는 도 2에 나타낸 바와 같이 정량 배지로 측정한다.
2차 실험에서, 동족 메닌고코커스 스트레인에 대해 CT-CRME29H로 제형된 rpilin의 보호를 비관련 단백질 KLH와 혼합한 CT-CRME29H의 것과 비교한다. 5 마리 스위스-웹스터 마우스(6주령) 그룹을 CT-CRME29H(0.1 ㎍)의 존재 또는 부재하에 5 ㎍의 rpilin으로, 또는 CT-CRME29H(0.1 ㎍)와 함께 PorA H355로 0, 2 및 3주째에 IN 면역시킨다(10 ㎕ 용적). 종점 항체 역가는 메닌고코커스 스트레인 H355P+의 1 x 107CFU로 챌린지하기 4주 전에 수집하여 모은 혈청 샘플에 대해 전세포 및 항원-특이성 ELISA로 측정한다. 결과를 표 17과 19에 나타내었다.
3차 실험에서, IN 면역을 위해 CT-CRME29H로 제형된 메닌고코커스 PorA의 면역원성을 평가한다. IN 면역을 위해 CT-CRME29H로 제형된 메닌고코커스 PorA의 면역원성을 평가한다. 그룹 당 5 마리의 스위스-웹스터 마우스를 표 19에 표시한 바와 같이, CT-CRME29H(1 ㎍/용량)의 존재 또는 부재하에 메닌고코커스 스트레인 H44/76으로부터의 20 ㎍/용량 PorA로 0, 2 및 3주째에 IN 면역시킨다. 안티-PorA H44/76 항체 역가 및 IgG에 대한 전세포 ELISA를 실험 4주째에 수집하여 모은 혈청 및 점막 샘플에 대해 평가한다. 결과를 표 19에 나타내었다.
4차 실험에서, 메닌고코커스의 이종 스트레인의 챌린지에 대해 마우스를 보호하는 CT-CRME29H로 보조제 처리된 rpilin 및 PorA의 능력을 평가한다. 그룹 당 스위스-웹스터 마우스를 0, 2 및 3주째에 CT-CRME29H(0.1 ㎍)로 제형된, 5 ㎍의 rpilin, 스트레인 H355로부터의 PorA, 또는 스트레인 879227로부터의 PorA로 IN 면역시킨다(10 ㎕ 용적). 대조군은 열-불활성화 메닌고코커스 스트레인 870227 전세포 또는 KLH(5 ㎍)+CT-CRME29H(0.1 ㎍)이다. 종점 IgG 및 IgA 역가는 870227 스트레인으로 챌린지하기 전 4주째에 수집하여 모은 혈청 샘플에 대해 전세포 및 항원-특이성 ELISA로 측정한다. 결과를 표 20과 21에 나타내었다. 비강 조직으로부터의 세균 회수는 스트레인 870227로 챌린지시킨지 24시간 후 정량 배양에 의해 측정되며 Log10CFU±표준편차로 나타내었다. 결과를 도 4에 나타내었다.
비경구 면역을 위한 보조제로서 CT-CRME29H의 능력을 검사하기 위하여 5차 실험을 수행한다. 5 내지 6주령 스위스-웹스터 마우스 암컷 10 마리 그룹을 0 및 4주째에 CT-CRME29H(10 ㎍) 또는 MPLTM(100 ㎍)로 제형된 5 ㎍의 PorA H355로 피하 면역시킨다. 대조군은 열-불활성화 메닌고코커스 870227 전세포 또는 KLH(5 ㎍)+MPLTM(100 ㎍)로 피하 면역시킨다. 마우스를 6주째에 메닌고코커스 스트레인 970227의 1.2 x 107CFU로 챌린지시킨다. 챌린지 24시간 후, 마우스를 참수시켜 비강 조직을 균질화하고 선별배지에 플레이팅한다. 37℃ 철야 배양 후 콜로니를 계수하고 Log10CFU±표준편차로 나타내었다. 본 실험의 결과를 표 22와 도 5에 나타내었다.
표 16
스위스-웹스터 마우스에서 나이세리아 메닌자이티디스 pPilin(클래스 I H44/76)에 대한 전신 및 점막 면역반응에 미치는 CT-CRME29H의 보조제 효과
표 17
스위스-웹스터 마우스에서 메닌고코커스 항원에 대한 면역반응에 미치는 CT-CRME29H의 효과
메닌고코커스 B 전세포 ELISA의 전체 혈청 IgG
*는 모든 그룹으로부터 0주째에 모은 샘플을 나타낸다.
표 18
스위스-웹스터 마우스에서 메닌고코커스 항원에 대한 면역반응에 미치는 CT-CRME29H의 효과
모은 샘플에 대한 안티-rPilin 및 안티-PorA 항체 ELISA 역가
표 19
메닌고코커스 PorA 및 CT-CRME29H으로 비내 면역시킨 스위스-웹스터 마우스의 면역반응
안티-PorA H44/76 항체 역가
ND = 데이터 없음
WCE = H44/76 스트레인에 대한 전세포 ELISA
PorA = PorA H44/76 특이성 ELISA
표 20
CT-CRME29H와 함께 이종 및 동족 메닌고코커스 PorA 및 rPilin으로 비내 면역시킨 스위스-웹스터 마우스의 면역반응
*0주째 역가는 모든 그룹으로부터의 풀이다.
WC = 전세포
HI = 열-불활성화
표 21
CT-CRME29H와 함께 이종 및 동족 메닌고코커스 PorA 및 rPilin으로 비내 면역시킨 스위스-웹스터 마우스의 면역반응
*0주째 역가는 모든 그룹으로부터의 풀이다.
WC = 전세포
HI = 열-불활성화
ND = 데이터 없음
표 22
CT-CRME29H또는 MPLTM과 함께 PorA로 피하 면역시킨 마우스 혈청으로부터의 나이세리아 메닌자이티디스 살균활성
*nd = 비-실행
사용된 보체: 인간 UR4-97
실시예 10
호흡기 합포체 바이러스(RSV)의 정제된 천연 융합 (F) 당단백질로 면역시킨 BALB/c 마우스의 면역반응
1차 실험에서, 6 내지 8주령 BALB/c 마우스(그룹 당 5 마리)를 CT-CRME29H(1 또는 10 ㎍/마우스), 야생형 CT(1 ㎍/마우스), CT-B(1 ㎍ 또는 10 ㎍/마우스)로 또는 보조제 없이 제형된 3 ㎍의 정제된 천연 단백질로 0 및 14주째에 비내(10 ㎕) 면역시킨다. 종점 IgG 및 IgA 항체 역가를 실험 24일째에 ELISA로 분석한다. 기관지폐포 세척액 및 질 세척액으로부터 역가를 수득한다. 결과를 표 23에 나타내었다.
2차 실험에서, 6 내지 8주령 BALB/c 마우스(그룹 당 5 마리)를 0 및 14일째에 야생형 CT(1 ㎍/마우스) 또는 CT-CRME29H(1 ㎍/마우스)로 비내 예비면역시킨다(50 ㎕). 대조군은 예비면역시키지 않는다. 이어서, 28 및 42일째에, 모든 마우스를 동량의 CT 또는 CT-CRME29H로 제형한 3 ㎍의 F 단백질로 비내 면역시킨다. 종점 항체 역가는 56일째(혈청) 및 57일째(기관지폐포 및 질 세척액)에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 결과를 표 24에 나타내었다.
3차 실험에서, 순수한 BALB/c 마우스 암컷(6 내지 8주령, 그룹 당 5 마리)을 0, 1 및 2주째에 RSV A2로부터의 정제된 천연 융합 (F) 단백질로 비내(IN) 면역시킨다. 면역제는 F 단백질(3 ㎍/마우스)를 CT-CRME29H(1 ㎍ 또는 10 ㎍/마우스), CT-B(1 ㎍ 또는 10 ㎍/마우스) 또는 알룸(100 ㎍/마우스)으로 제형함으로써 제조한다. 마취된 마우스가 콧구멍 끝에 놓인 백신에서 호흡을 하도록 하여 백신을 비내 투여한다. 용량 당 전체 용적은 0, 1 및 2주째에 마우스 당 10 ㎕이다(표 25). 대조군 마우스는 F/AlOH를 함유하는 근육내 1차 면역과 비내 투여되는 생 RSV A2의 2차 면역을 받는다. 전신 체액성 면역반응은 3차 면역 후 9일째에(표 25와 26) ELISA로 분석한다. 기관지폐포 세척액, 질 및 비강 세척액을 또한 수집하여 점막 항체 반응의 특징규명에 사용한다. 면역 마우스로부터의 비장을 사용하여 MHC-상용성 RSV-감염 표적 세포에 대한 항원-의존성 킬러 세포 활성을 분석한다. 동일한 면역 스케쥴을 받은 마우스의 제 2 무리를 생 RSV로 챌린지시킨다. 이 무리에서 폐 구획의 보호는 수집된 균질화 폐 조직내 바이러스 플라크의 측정에 의해 챌린지 4일 후에 추후 분석된다. ANOVA를 사용하여 통계학적 분석을 수행한다. 결과를 표 25와 26에 나타내었다.
4차 실험에서, BALB/c 마우스를 0,1 및 2주째에, CT-CRME29H(1 ㎍ 또는 10 ㎍/마우스), CTB(1 ㎍ 또는 10 ㎍/마우스) 또는 PBS와 함께 정제된 RSV F 단백질(3 ㎍/마우스)로 비내 면역시킨다. 대조군으로서, 마우스는 또한 RSV의 비내 투여 또는 F/AlOH의 근육내 투여를 받는다. 최종 면역 9일 후에 비장세포를 분리하여 시험관내에서 동계 RSV-감염 자극 세포로 자극한다. 배양 6일 후, RSV-감염 표적 세포에 의한51크롬 방출의 정량에 의해 항원-의존성 킬러 세포 활성을 측정한다. 결과를 도 6에 나타내었다.
5차 실험인 바이러스 보호 분석에서, 면역 마우스의 폐 구획을 생 RSV 챌린지 4일 후 분리하고 균질화한 다음, 감염성 바이러스의 정량을 수행한다. BALB/c 마우스를 RSV로부터의 정제된 F 단백질 및 CT-CRME29H, CTB 또는 PBS를 함유하는 백신으로 비내 면역시킨다. 마우스 그룹은 또한 대조군으로서 F/AlOH로 근육내 면역시킨다. 최종 면역 8일 후(F/AlOH 백신 3주 후), 마우스를 생 RSV로 챌린지시킨다. 4일 후에, 폐 조직을 수거하여 감염성 바이러스의 정량에 사용한다. 결과를 도 7에나타내었다.
6차 실험에서, 순수한 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령, 그룹 당 5 마리)를 0, 1 및 2주째에, RSV A2로부터의 정제된 천연 융합 (F) 단백질로 비내 면역시킨다. 면역물은 F 단백질(3 ㎍/마우스)을 CT-CRME29H(1 ㎍/마우스) 또는 알룸(100 ㎍/마우스)으로 제형하여 제조된다. 마취시킨 마우스를 콧구멍 끝에 놓인 백신에서 호흡하게 하여 백신을 비내 투여한다. 용량 당 전체 용적은 0, 1 및 2주째에 마우스 당 5 ㎕이다(표 27). 대조군 마우스는 F/AlOH를 함유하는 근육내 1차 면역을 받거나, 비내 투여되는 생 RSV A2의 1차 및 2차 면역을 받는다. 전신 체액성 면역반응은 3차 면역 2주 후(표 27과 28)에 ELISA로 분석한다. 기관지폐포 세척액, 질 및 비강 세척액도 수집하여 점막 항체 반응의 특징규명에 사용한다. 면역 마우스로부터의 비장세포를 사용하여 MHC-상용성 RSV-감염 표적 세포에 대한 항원-의존성 킬러 세포 활성을 분석한다. 동일한 면역 스케쥴을 받은 마우스의 제 2 무리를 생 RSV로 챌린지시킨다. 이 무리에서 폐 구획의 보호는 수집된 균질화 폐 조직내 바이러스 플라크의 측정에 의해 챌린지 4일 후 추후 분석된다. 결과를 표 27과 28에 나타내었다.
7차 실험에서, 4차 실험으로부터의 프로토콜을 다시 사용하여 RSV-감염 표적 세포에 대한 항원-의존성 CTL 활성을 측정한다. 결과를 도 8에 나타내었다.
8차 실험, 즉 다른 바이러스 보호 분석에서, BALB/c 마우스(그룹 당 5 마리)를 정제된 RSV F 단백질을 CT-CRME29H와 함께 또는 없이 함유하는 제형으로 비내 면역시킨다. 마우스 그룹은 또한 F/AlOH로 근육내 면역시키고 대조군으로서 면역시키지 않은 채 방치한다(순수). 최종 면역 2주 후(F/AlOH 투여 4주 후), 모든 그룹을 생 RSV로 챌린지시킨다. 4일 후, 폐 조직을 수거하여 감염성 바이러스의 정량에 사용한다. 결과를 도 9에 나타내었다.
9차 실험에서, 3 용량 프로토콜을 사용하여 CT-CRME29H의 보조제 반응을 좀더 상세히 조사한다. 5 마리의 BALB/c 마우스 그룹을 0.01, 0.1 또는 1.0 ㎍ CT-CRME29H와 혼합한 F 단백질(3 ㎍)로 0, 1 및 2주째에 IN(5 ㎕) 면역시킨다. 대조군 마우스를 0일째에 F/AlOH(근육내) 또는 RSV A2(IN)로 프라이밍시킨다. 혈청 항체 역가를 3차 면역 2주 후에 측정한다. 결과를 표 29에 나타내었다. 데이터는 log10기하 평균 항체 역가(±1 SD)로서 나타내었다. 유사한 결과가 두 별도의 연구에서 수득되었다.
F/CT-CRME29H에 의한 IN 면역 후, 9차 실험에서의 마우스를 또한 F 단백질에 대한 국소 항체 반응에 대해 시험한다. 3차 면역 2주 후에 참수한 마우스로부터 점막 세척 샘플을 취하여 ELISA로 안티-F 단백질-특이성 IgG 및 IgA에 대해 분석한다. 결과를 표 30에 나타내었다. 데이터는 0.03의 OD410을 생성하는 기하 평균 종점 역가의 log10으로 나타내었다. 유사한 결과가 두 별도의 연구에서 수득되었다.
10차 실험에서, F/CT-CRME29H에 의해 유도된 체액성 면역반응의 기능적인 역량을 조사하기 위하여, 혈청을 RSV A2에 대한 중화 항체 역가에 대한 플라크 감소분석에서 시험한다. 결과를 표 31에 나타내었다. 기하 평균 중화 항체 역가(log10)는 보체원으로서 5% 돼지 혈청의 존재(+C') 및 부재(-C')하에 개별 항체(그룹 당 5 마리)에 대해 측정한다. 유사한 결과가 두 별도의 연구에서 수득되었다.
11차 실험에서, 마우스(그룹 당 5 마리)는 0, 7 및 14일째에 0.01, 0.1 또는 1 ㎍의 CT-CRME29H으로 제형된 F 단백질의 IN 면역을 받는다. 대조군 마우스는 F/AlOH(근육내) 또는 RSV A2(IN)로 면역시킨다. 면역 마우스를 3차 면역 2주 후에 챌린지시켜, 후속 감염에 대한 F/CT-CRME29H의 보호능을 측정한다. 감염 4일 후, 바이러스 수준을 개개 마우스의 균질화 폐와 코 조직에서 측정한다. 결과를 표 32에 나타내었다. 데이터는 조직 g 당 기하 평균 바이러스 역가(±표준편차)로 나타내었다.
표 23
CT, CT-B, 또는 CT-CRME29H로 비내 면역 후 BALB/c 마우스에서 안티-콜레라 톡신 항체의 생성
안티-콜레라 톡신 항체 역가a
a종점 항체 역가는 연구 24일째에 수집하여 모은 샘플에 대해 측정된다. BAW 및 VW는 각각 기관지폐포 및 질 세척액을 나타낸다. 그룹 당 5 마리.
b마우스는 지시량의 야생형 CT, 시판 CT-B, 또는 CT-CRME29H와 혼합된 3 ㎍의 천연 F 단백질로 0 및 14일째에 비내 면역시킨다(10 ㎕).
cND = 데이터 없음
표 24
CT 또는 CT-CRME29H로 제형된 호흡기 합포체 바이러스의 융합 단백질의 면역원성에 미치는 앞서 존재하는 안티-콜레라 톡신 항체의 효과
안티-융합 단백질 항체 역가a
a종점 항체 역가는 56일째(혈청) 및 57일째(기관지폐포(BAW) 및 질(VW) 세척액)에 수집하여 모은 샘플에 대해 ELISA로 측정한다. 그룹 당 5 마리
b마우스는 0 및 14일째에 야생형 CT(1 ㎍) 또는 CT-CRME29H(1 ㎍)로 예비 면역시킨다(비내, 50 ㎕). 이어서, 28 및 42일째에 모든 마우스를 동량(1 ㎍)의 야생형 CT 또는 CT-CRME29H로 제형된 3 ㎍의 F 단백질로 면역시킨다(비내, 50 ㎕). 야생형 CT 또는 CT-CRME29H로 예비 면역시킨 뒤에 F 단백질로 면역시킨 마우스의 종점 안티-CT 항체 역가는 42일째에서 1,000,000 이상이다.
표 25
RSV F 단백질 및 CT-CRME29H로 비내 면역시킨 BALB/c 마우스의 전신 면역반응
안티-F 항체 역가
전체 IgG에 대해:
p ＜ 0.05: 777 내지 780 대 784; 780 대 779; 777 내지 780 대 785; 777, 778, 780 대 907 (779 대 907 p = 0.7)
p ＞ 0.05: 778 대 777 (p = 0.125);
IgG1에 대해:
p ＜ 0.05: 777 내지 780 대 784; 777 내지 780 대 907; 777 내지 780 대 785
p ＞ 0.05: 781 대 780 대 907
IgG2a에 대해:
p ＜ 0.05: 777 내지 780 대 784
표 26
RSV F 단백질 및 CT-CRME29H로 비내 면역시킨 BALB/c 마우스의 점막 면역반응
안티-F 항체 역가
표 27
RSV F 단백질 및 CT-CRME29H로 비내 면역시킨 BALB/c 마우스의 전신 면역반응
안티-F 항체 역가
전체 IgG에 대해:
p ＜ 0.05: 256 대 250 및 257
p ＞ 0.05: 256 대 258 및 259
IgG1에 대해:
p ＜ 0.05: 256 대 250 및 257
p ＞ 0.05: 256 대 258
IgG2a에 대해:
p ＜ 0.05: 256 대 250, 257 및 258
p ＞ 0.05: 256 대 259
IgGA에 대해:
p ＞ 0.05: 256 대 259
표 28
RSV F 단백질 및 CT-CRME29H로 비내 면역시킨 BALB/c 마우스의 점막 면역반응
안티-F 항체 역가
표 29
RSV F 단백질 및 CT-CRME29H로 면역시킨 후 유도된 안티-F 단백질 혈청 항체 반응
ap ＜ 0.05, F/PBS 또는 F/CT-E29H(0.01 ㎍)와 비교
bp ＞ 0.05, F/CT-E29H(0.1 ㎍) 또는 F/AlOH와 비교
cp ＜ 0.05, F/CT-E29H(0.1 및 0.01 ㎍) 및 F/PBS와 비교. p ＞ 0.05, CT-E29H(1.0 ㎍)와 비교
dp ＜ 0.05, F/PBS 및 F/CT-E29H(0.01 ㎍)와 비교.
ep ＞ 0.05, F/PBS와 비교
fp ＜ 0.05, F/CT-E29H(0.1 및 1.0 ㎍)와 비교
gND = 실행하지 않음
표 30
CT-CRME29H로 제형된 F 단백질로 면역시킨 마우스의 점막액내 안티-F 단백질 항체
표 31
CT-CRME29H로 제형된 F 단백질로 IN 면역 후 전신 안티-RSV 중화 항체의 생성
ap ＜ 0.05, F/PBS 또는 F/CT-CRME29H(0.01 ㎍)와 비교.
p ＞ 0.05, F/CT-CRME29H(0.1 ㎍), F/AlOH 또는 RSV A2와 비교
bp ＜ 0.05, F/PBS 또는 F/CT-CRME29H(0.01 ㎍)와 비교
p ＞ 0.05, F/CT-CRME29H(1 ㎍), F/AlOH 또는 RSV A2와 비교
표 32
F 단백질 및 CT-CRME29H로 IN 면역 후 폐 및 비강 조직의 바이러스 감염도
ap ＜ 0.05, F/PBS, F/CT-CRME29H(0.01 ㎍), CT-CRME29H또는 순수와 비교, p ＞ 0.05, F/AlOH 또는 RSV A2와 비교
bp ＞ 0.05, F/CT-CRME29H(0.1 ㎍)와 비교
cp ＜ 0.05, F/CT-CRME29H(0.01 ㎍), F/PBS, CT-CRME29H또는 순수와 비교,
p ＞ 0.05, F/CT-CRME29H(0.1 ㎍), F/AlOH 또는 RSV A2와 비교
dp ＜ 0.05, F/PBS, F/CT-CRME29H(0.01 ㎍), CT-CRME29H또는 순수,
p ＞ 0.05, F/CT-CRME29H(1 ㎍), F/AlOH 또는 RSV A2와 비교
실시예 11
로타바이러스 재조합 바이러스-유사 입자로 면역된 마우스의 면역반응
스포돕테라 프루기페르다(Sf-9) 세포(아메리칸 타입 컬춰 컬렉션, 미국 버지니아 매사추세츠 소재)를 SF-900 II 무혈청 배지(Gibco-BRL, 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)에서 유지시킨다. Sf9 세포를 시미언 로타바이러스 스트레인 SA11로부터의 VP2 및 VP6를 발현하는 재조합 배큘로바이러스 작제물로 동시 감염시킨다(32).
방출된 2/6-VLP를 하기와 같이 이들 감염된 Sf9 세포의 생장배지로부터 정제한다. 세포를 실온에서 30분간 830 x g에서 원심분리로 청징화한다. 이어서, 상등액을 30분간 8000 x g에서 원심분리로 추가 청징화한다. VLP를 96500 x g에서 2시간 동안 TNC 완충제(10 mM 트리스, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0) 중 35% 슈크로스를 통해 2회 원심분리로 상등액으로부터 정제한 다음 TNC 완충제에 현탁시키고4℃에서 보관한다. 정제된 VLP를 SDS-PAGE로 분석하고, 이어서 은 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색하여 순도를 측정하고, 웨스턴 블롯 분석하여 단백질 조성을 분석하여, 전자 현미경으로 입자의 보전성을 측정한 다음, BCA 단백질 분석하여 전체 단백질 농도를 측정한다.
정제된 2/6-VLP의 쿠마시 브릴리언트 블루, 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석은 VP2 및 VP6 단백질의 존재, 및 이들의 순도 및 특이적 모노클로날 항체와의 면역반응성을 확인시켜 준다. VLP의 순도는 겔 상의 밴드 강도로부터 약 95%인 것으로 평가되었다. 또한, 이들 정제된 2/6-VLP의 전자 현미경 분석은 이들의 형태학적 보전성을 확인시켜 준다(데이터는 나타내지 않았음).
마우스를 다음과 같이 면역시킨다. 본 연구에 사용된 BALB/c 및 CD-1 마우스를 로타바이러스가 없는 환경에서 기른, Charles River Laboratories(미국 뉴욕 스토어리지 소재)로부터 구입한다. 4주된 BALB/c 마우스를 0 및 2주째에, 100 및 10 ㎍의 2/6-VLP로 각각 2회 면역시킨다; 각각의 용량은 10 ㎍의 CT-CRME29H로 제형한다. BALB/c 마우스의 제 3 그룹(n = 4)은 CT-CRME29H와 함께 2/6-VLP로 IN 투여하고, 이어서 경구 부스터 면역시킨다(즉, 혼합 그룹). 이 실험에서 대조군 마우스는 CT-CRME29H(n = 10), 1X TNC 완충제(n = 5) 또는 2/6-VLP+1X TNC 완충제(n = 5)로 면역시킨다. 각각의 마우스를 1분 간격으로 콧구멍에 번갈아 가면서, 동시에 2 ㎕씩 접종액 20 ㎕로 IN 면역시킨다. 혈청 및 배설물 샘플을 0, 1, 4, 6, 8, 10, 13주째에 모든 동물로부터 수집하고 생성된 로타바이러스-특이성 혈청 IgG, IgM 및 IgA 항체, 및 배설물 IgG 및 IgA의 수준을 ELISA로 측정한다. 혈청 항체 결과를 도 10과 11에 나타내었고; 배설물 항체 결과는 도 13에 나타내었다. 13주째 혈청 샘플을 사용하여 IgG1 및 IgG2a 서브클래스를 측정한다. 항체 서브클래스 결과를 도 12에 나타내었다.
예비 면역 대변 샘플의 예비 면역 혈청 희석된 1:100 및 1:2 희석액은 ELISA에서 반응성을 보이지 않았다. TNC 완충제 또는 CT-CRME29H만을 투여한 대조군으로부터의 혈청 및 대변을 동시에 분석한다. 대조군은 연구 전반에 걸쳐 로타바이러스-특이성 혈청 또는 배설물 항체를 보이지 않았다.
4주령 CD-1 마우스는 상기에서와 같이 0, 2 및 13주째에 보조제로서 CT-CRME29H를 사용하여 3회 경구(n = 4) 또는 IN(n = 4) 면역시킨다. 대조군은 CT-CRME29H만을 투여한다. 혈청 및 대변 샘플을 0-9, 11-14, 26-28주째에 수집하고 로타바이러스-특이성 혈청 및 배설물 항체의 수준을 측정한다.
대변과 혈청 샘플 중의 IgG, IgM 및 IgA를 검출하고 정량하기 위하여, 96-웰 폴리비닐 클로라이드 마이크로타이터 플레이트(Dynex Technologies, 미국 버지니아 챈틸리 소재)를 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 희석한 과면역 기니 피그 안티-SA11 로타바이러스 혈청으로 코팅한다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 5% BLOTTO(PBS 중의 5% w/v 무지방 분유)로 블로킹한다. 현탁된 대변 샘플을 1% BLOTTO에 희석시킨 다음 플레이트에 가한다. 이어서, 플레이트를 4℃에서 밤새 배양한 다음, 이들을 TNC 완충제+0.05% TweenTM20(TNC-T)로 3회 세척한다. 토끼안티-붉은털 원숭이 로타바이러스 과면역 혈청을 1% BLOTTO+2.5% 정상 기니 피그 혈청(NGPS)에 희석시킨 다음 37℃에서 1시간 동안 플레이트에 가한다. 이어서, 플레이트를 TNC-T로 3회 세척한다. 호스래디시 퍼옥시다제-접합 염소 안티-토끼 IgG, IgM 및 IgA(Kirkegaard and Perry Laboratories, 미국 메릴랜드 게이터스버그 소재)를 1% BLOTTO+2.5% NGPS에 희석시킨 다음 플레이트에 가하고, 이를 37℃에서 1시간 배양한다. 이어서, 플레이트를 TNC-T로 4회 세척한다. TMB 기질(Kirkegaard and Perry Laboratories)을 가하고, 생성되는 컬러 반응을 실온에서 7분간 전개시킨다. 반응을 1M 인산 첨가로 정지시킨다. OD를 마이크로 플레이트 판독기(BIO-TEK Instrument, 미국 버먼트 윙코스키 소재)를 사용하여 450 nm에서 측정한다. 블랭크보다 0.1 이상의 측정치는 유의성이 있는 것으로 간주한다. SA11 스톡 바이러스를 1% BLOTTO에 희석시키고 플레이트에 가한 다음, 이를 4℃에서 밤새 배양한다. 플레이트를 TNC-T로 3회 세척한 다음; 1% BLOTTO에 1:1 희석시킨 대변 샘플 또는 1% BLOTTO에 연속 희석시킨 혈청 샘플을 적용한다. 음성 그룹으로서, 대변 샘플의 듀플리케이트를 안티-SA11 항체로 코팅하지 않은 웰에 가한다. 플레이트를 37℃에서 2시간 배양한 다음, TNC-T로 3회 세척한다. 퍼옥시다제-접합 염소 안티-마우스 IgG, IgM 및 IgA를 1% BLOTTO+2.5% NGPS에 희석한 다음 웰에 가하고; 퍼옥시다제-접합 염소 안티-마우스 IgA+IgG+IgM(H+L) 항체를 마찬가지로 희석한 다음 예비 면역 항체 검출용 웰에 가한다. 플레이트를 37℃에서 1시간 배양한 다음 TNC-T로 4회 세척한다. 플레이트를 전술한 바와 같이 항원 검출 ELISA를 위해 전개한다. IgG 서브클래스의 측정에 사용된 ELISA 프로토콜은 HRP-표지 래트(모노클로날) 안티-마우스 IgG1과 IgG2a를 제 2 항체로 사용하는 기술된 프로토콜의 변형이다(Biosource International, 미국 캘리포니아 카마릴로 소재).
Ishida 등(49)에 의해 기재된 면역조직화학 분석을 변형하여 2/6-VLP로 면역시킨 마우스 혈청내 안티-로타바이러스 VP2 및 VP6 항체의 검출에 사용한다. 간단히 말해서, 진탕 플라스크내 초기 대수기 Sf9 세포를 96 웰 조직 배양판에 2.5 x 104세포/웰의 밀도로 시딩한 다음 실온에서(RT) 1시간 배양한다. 이어서, 세포를 VP2 또는 VP6 유전자를 암호화하는 재조합 배큘로바이러스로 중복감염도 10으로 감염시키고, 28℃에서 3일간 감염을 진행시킨다. 배양 배지를 이어서 버리고, 플레이트를 RT에서 1시간 진공 오븐에서 건조시킨 다음 RT에서 30분간 PBS에서 10% 포르말린(10-15% 메탄올을 함유하는 37% 포름알데하이드 용액; Sigma)으로 고정한다. 이어서, 세포를 RT에서 5분간 TNC 완충제에서 1% 트리톤 X-100(Sigma)로 투과성이 되게 만든다.
지정된 로타바이러스 단백질을 발현하는 감염 세포 각각의 세트를 BALB/c 또는 CD-1 마우스 각각으로부터의 예비 챌린지 또는 면역 후 혈청에 노출시킨 다음 면역염색시킨다. 마우스 혈청 샘플을 PBS에서 5% FCS로 연속 희석시킨다. 샘플을 웰에 가하고 플레이트를 37℃에서 2시간 배양한다. 이어서, 플레이트를 PBS로 4회 세척한다. 호스래디시 퍼옥시다제 표지 염소 안티-마우스 IgG, IgM 또는 IgA 항체(Kirkegaard & Perry Laboratories)를 5% FCS와 함께 PBS에 가하고 37℃에서 1시간 배양한다. 웰을 PBS로 2회 세척한 후 염색 세포를 3-아미노-9-에틸-카바졸 기질(AEC)(Sigma)로 검출한다. 비감염 Sf9 세포, 무면역 마우스로부터의 혈청, 및 면역 마우스로부터의 예비-면역 혈청을 음성 대조군으로 사용한다. VP6(7D9, 5E6) 및 VP2(BP2)에 대한 모노클로날 항체를 양성 대조군으로 사용한다(50).
무면역 동물과 2/6-VLP로 면역시킨 것들을 26주째에(CD-1 마우스) 또는 13주째에(BALB/c 마우스) 10 SD50의 야생형 쥐 EDIM 로타바이러스(51)로 위관영양법으로 챌린지시킨다. EDIM 스트레인의 역가를 성체 마우스의 50%에서 배설물 바이러스 탈락을 유도하는 데 요구되는 용량인 탈락 용량 50(SD50)으로 측정한다. 트립신-활성화 챌린지 바이러스(100 ㎕)를 투여한 다음 위의 산성을 중화하기 위하여 4% 나트륨 비카보네이트 용액 100 ㎕를 경구 투여한다. 바이러스를 M199 배지(Irvine Scientific, 미국 캘리포니아 샌터 애나 소재)에 희석시킨 다음 바이러스 원액 ml 당 트립신 스톡(1 mg/ml)(Sigma Chemical Co., 미국 미주리 세인트 루이스 소재) 10 ㎕로 활성화시킨다. 챌린지 후, 대변 샘플을 9일간 모든 마우스로부터 수집한다.
배설물 샘플로 탈락하는 로타바이러스 항원은 순 광학밀도(OD) 값, 즉 동일 마우스로부터의 예비-챌린지 샘플의 OD를 제한 챌린지 후 배설물 샘플의 OD로 표현된다. 각각의 동물에 대한 탈락 곡선 아래의 면적을 측정하고 각 동물에 대한 항원 탈락의 % 감소(PRAS)는 각 동물에 대한 곡선 아래의 면적을 대조군의 평균 면적과 비교함으로써 계산된다. 이어서, 평균 PRAS를 각각의 면역 그룹에 대해 계산한다. 50% 이상의 PRAS 수준만을 보호성으로 간주한다. 결과를 도 14에 나타내었다.
윈도우용 버전 8.0을 위한 SPSS(SPSS, Inc., 미국 일리노이 시카고 소재)로 통계학적 분석을 수행한다. 독립 t 검정을 이용하여 예비-챌린지 기하 평균 역가치와 및 그룹 간 PRAS와 비교한다. 소수점 이하의 3자리 숫자까지를 P 값 계산에 고려한다(0.000 = 0).
실시예 12
아라비노스 유도성 프로모터의 사용을 통한 CT-CRM E29H 의 발현 증가
아라비노스 유도성 시스템의 작제는 다음과 같다: pIIB29H로부터의 비시스트론을 암호화하는 톡신을 증폭하기 위하여 PCR 프라이머를 합성한다.
프라이머 #1, CT29 순방향 NheI: 5′-
TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATG AGC-3′(서열번호 6);
프라이머 #2, CT29 역방향 HindIII: 5′-
GCAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC-3′(서열번호 7). PCR 단편을 암호화하는 CT-CRME29HctxA 및 ctxB를 엔도뉴클레아제 부위 NheI 및 HindIII를 사용하여 pBAD18-Cm 중으로 클로닝하며, 이에 따라 작제물 pCT18이 생성된다. ClaI 및 HindIII를 사용하여 pCT18로부터 ctxB(비브리오 콜레라 2125)를 제거하고 비브리오 콜레라 스트레인 569B로부터의 ctxB 유전자를 암호화하는 것으로 나타난 플라스미드 pMGJ142로부터의 유사 단편으로 대치한다. 생성되는 작제물인 pPX7490는 아라비노스 프로모터의 조절하에 스트레인 569B로부터의 CRME29HctxA 및 ctxB를 암호화하며, LTIIb-B 리더 서열을 갖는다.
CT-CRME29H의 대규모 발현 및 정제를 위한 프로토콜은 다음과 같다: 3L 들이 플룻형 Fernbach 플라스크를 사용한다. 플라스크 당 Hy-Soy 생장배지 1L(리터 당: Hy-Soy 10g; 효모 추출액 12.5 g; 나트륨 클로라이드 5 g; 나트륨 포스페이트, 일염기성 3.3 g; 나트륨 포스페이트, 이염기성 13.1 g). 스타터-스톡 제조의 경우, 20 ㎍/ml의 클로람페니콜 및 20 ml의 멸균 50% 글루코스를 1 플라스크에 가한다(1% 최종 글루코스 농도). 이어서, 플라스크에 pPX7490, -70℃ 동결 스톡으로 형질전환시킨 300 ㎕ DH5α를 접종한다. 플라스크를 200 rpm에서 밤새 진탕하에 37℃ 배양한다. 익일에 사용될 모든 생장 배지를 37℃에서 200 rpm으로 밤새 진탕시켜 미리 가온시킨다. 익일에 철야 배양액을, 20 ㎍/ml 클로람페니콜 및 탄소원으로 10 ml 멸균 글리세롤(1% 최종 농도)로 보충한 Hy-Soy 생장배지에 1:40으로 희석시킨다. 이 배양액을 37℃에서 Fernbach 플라스크에 4.5-5.5의 OD600으로(또는 바이오리액터에서는 그 이상으로) 아웃그로잉(outgrow)시킨다. 이어서, 배양균을 20 ml L-아라비노스(0.5% 최종 농도)로 유도한 다음 추가로 3시간 동안 배양시킨다. 유도기 3시간 후에, 대부분의 톡신이 세포-연합되었다. 세포를 원심분리로 수거하고 펠릿을 10 mM NaPO4, 1 mM EDTA(pH 7.0) 완충제에 최초 배양액 용적의 9%로 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 마이크로플루다이저를 통해 기계적으로 붕괴시킨 다음 8500xg에서 10분간 원심분리하여 세포 파편을 제거한다. 세포 용해물(상등액)을 45Ti 로터, 160,000xgAV중 42,000 rpm에서 1시간 동안 추가 청징화한다. 청징화 세포 용해물을 10 mM NaPO4(pH 7.0)으로 평형시킨 카복시메틸(CM)-세파로스TM칼럼(Pharmacia)에 로딩한다. 배양 용적 10 리터 당 대략 300 ml의 CM-세파로스TM이 사용된다. 세포 용해물은 0.102 cm/분(2 ml/분)의 비율로 칼럼에 로딩된다. 칼럼을 10 mM NaPO4(pH 7.0)의 10-15 칼럼 용적을 사용하여 0.255 cm/분(5 ml/분)으로 철저히 세척하여 오염물을 제거한다. CT-CRME29H홀로톡신을 10 mM NaPO4(pH 8.3)의 4 칼럼 용적을 가지고 0.255 cm/분으로 용출시킨다. CT-CRME29H-함유 용출액을 여과에 의해 완충제 교환시키거나 PBS에 대해 투석한 다음, 4℃에서 보관한다.
실시예 13
허피스 심플렉스 바이러스 2형의 완전한 길이 당단백질 D를 암호화하는 플라스미드 DNA로 면역시킨 BALB/c 마우스의 면역반응
6 내지 8주령 BALB/c 마우스 암컷을, 0.25% 부피바카인 처방하고, 야생형 CT, CT-CRME29H로 보조제 처리하거나 보조제 없이, 허피스 심플렉스 바이러스 2형의 완전한 길이 당단백질 D(gD2)를 암호화하는 플라스미드 DNA(pDNA)(gD 유전자를 함유하는 플라스미드는 Pachuk 등(40)에 기재되어 있으며 본원에서 참조로 인용된다)로 면역시킨다. 동물에 1차 면역 3주 뒤에 2차 면역한 다음 최종 주사 2주 후 안락사시킨다. 면역 프로토콜은 다음과 같다.
표 33
024 - gD2 유전자를 포함하는 pDNA; 023 = gD2 유전자가 삽입되지 않은 pDNA 백본
ID = 피내; IM = 근육내
그룹 4는 양성 대조군 역할; 그룹 5는 음성 대조군 역할.
증식 분석을 다음과 같이 수행한다: 1X105비장세포를 10% FCS를 함유한 완전 RPMI 배지에서 200 ng/ml의 gD2 단백질 존재 또는 부재하에 배양한다. 5% CO2존재하에 37℃에서 4일간 배양 후, 배양액을3[H]로 밤새 펄스처리한다.3[H] 혼입은 베타 카운터로 측정한다. 카운트는 SI(자극 지수 = 항원 자극의 부재하에서의 카운트로 나눈 항원 자극의 존재하에서의 카운트)로 보고된다. 결과를 표 34에 나타내었다.
ELISA를 수행하여 혈청과 질 세척액에서 항원-특이성 체액 반응을 측정한다. 간단히 말해서, 96 웰 평저 플레이트(Maxisorb, Nunc)를 4℃에서 정제된 gD2 단백질로 0.4 ㎍/ml의 농도로 코팅한다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 4% BSA로 블로킹한다. 50 ㎕(1:100 희석)의 혈청 샘플 또는 50 ㎕의 질 세척액 샘플을 플레이트에 가한다. 혈청에 대해 1시간 및 질 세척액에 대해 4℃에서 밤새 배양한 후, 플레이트를 PBS로 5회 세척하고, 퍼옥시다제-접합 안티-마우스 Ig(Sigma, 미국 미주리 세인트 루이스 소재)의 1:3000 희석액을 가한 다음 플레이트를 1시간 동안 배양한다. 플레이트를 기질 3,3′, 5,5′-테트라메틸벤지딘(TMB)-H2O2(Biotecx, 미국 텍사스 휴스턴 소재) 첨가 전에 PBS로 세척한다. Emax마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, 미국 캘리포니아 서니베일 소재) 상 450 nm에서 판독에 앞서 30분간 발색시킨다. 결과를 표 35(혈청) 및 표 36(질 세척액)에 나타내었다.
전술한 바와 같이 표준 ELISA를 이용하여 사이토킨을 측정한다. 플레이트를 적당히 코팅하여 24시간 또는 72시간된 gD2-자극 배양액으로부터의 상등액으로부터 각각 IL-5 또는 감마 인터페론을 포획한다. 결과를 표 37에 나타내었다.
표 34
HSV gD2에 대한 pDNA를 CT 또는 CT-CRME29H와 투여한 후 gD2-특이성 세포 증식 반응(SI)
표 35
pDNA HSV gD2를 CT 또는 CT-CRME29H와 투여한 후 gD2-특이성 체액 반응(ng/ml)
표 36
pDNA HSV gD2를 CT 또는 CT-CRME29H와 투여한 후 질 세척액에서의 gD2-특이성 체액 반응(ng/ml)
표 37
gD2-특이성 사이토킨 ELISA 프로필(pg/ml)
참조문헌

Claims (27)

  1. 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충으로부터의 선택된 항원, 및 야생형 콜레라 홀로톡신에 비해 독성이 감소되고 콜레라 홀로톡신의 A 서브유닛 위치 29의 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환되며 상기 항원에 대한 척추동물 숙주내 면역반응을 증강시키는, 유효 보조량의 돌연변이체 콜레라 홀로톡신을 포함하는 항원 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 1종 이상의 항원을 포함하는 항원 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 위치 29의 아미노산이 히스티딘인 항원 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 선택된 항원이 헤모필루스 인플루엔자 P4 외막 단백질, 헤모필루스 인플루엔자 P6 외막 단백질, 헤모필루스 인플루엔자 부착 및 침투 단백질(Hap), 헬리코박터 파이로리 우레아제 단백질, 나이세리아 메닌자이티디스 그룹 B 재조합 클래스 1 필린(rpilin), 나이세리아 메닌자이티디스 그룹 B 클래스 1 외막 단백질(PorA), 호흡기 합포체 바이러스 융합 단백질, 로타바이러스 바이러스-유사 입자 또는 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 유형 2 당단백질 D(gD2)인 항원 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 선택된 항원이 헤모필루스 인플루엔자 P4 외막 단백질, 헤모필루스 인프루엔자 P6 외막 단백질, 헤모필루스 인플루엔자 Hap 단백질 또는 이들의 배합물인 항원 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 선택된 항원이 헬리코박터 파이로리 우레아제 단백질인 항원 조성물.
  7. 제 4 항에 있어서, 선택된 항원이 나이세리아 메닌자이티디스 rpilin, 나이세리아 메닌자이티디스 PorA 단백질 또는 이들의 배합물인 항원 조성물.
  8. 제 4 항에 있어서, 선택된 항원이 호흡기 합포체 바이러스 융합 단백질인 항원 조성물.
  9. 제 4 항에 있어서, 선택된 항원이 로타바이러스 바이러스-유사 입자인 항원 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 바이러스-유사 입자가 로타바이러스 2/6-바이러스-유사 입자인 항원 조성물.
  11. 제 4 항에 있어서, 선택된 항원이 HSV gD2인 항원 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 항원 조성물이 HSV gD2를 암호화하는 플라스미드 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 백신인 항원 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서, 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 항원 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서, 돌연변이체 콜레라 홀로톡신 외에 제 2 보조제를 추가로 포함하는 항원 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서, 콜레라 홀로톡신의 A 서브유닛에 아미노산 29 이외의 위치에서 적어도 하나의 추가 돌연변이가 일어나는 항원 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 아미노산 7의 아르기닌, 위치 9의 아스파트산, 위치 11의 아르기닌, 위치44의 히스티딘, 위치 53의 발린, 위치 54의 아르기닌, 위치 61의 세린, 위치 63의 세린, 위치 70의 히스티딘, 위치 97의 발린, 위치 104의 타이로신, 위치 106의 프롤린, 위치 107의 히스티딘, 위치 109의 세린, 위치 110의 글루탐산, 위치 112의 글루탐산, 위치 114의 세린, 위치 127의 트립토판, 위치 146의 아르기닌 및 위치 192의 아르기닌이 치환되는 적어도 하나의 추가 돌연변이가 일어나는 항원 조성물.
  17. 척추동물 숙주에 제 1 항의 항원 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충으로부터 선택된 항원을 함유하는 항원 조성물의 척추동물 숙주 면역반응 도출능을 증가시키는 방법.
  18. 척추동물 숙주에 제 5 항의 항원 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 헤모필루스 인플루엔자 항원을 함유하는 항원 조성물의 척추동물 숙주 면역반응 도출능을 증가시키는 방법.
  19. 척추동물 숙주에 제 6 항의 항원 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 헬리코박터 파이로리 항원을 함유하는 항원 조성물의 척추동물 숙주 면역반응 도출능을 증가시키는 방법.
  20. 척추동물 숙주에 제 7 항의 항원 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 나이세리아 메닌자이티디스 항원을 함유하는 항원 조성물의 척추동물 숙주 면역반응 도출능을 증가시키는 방법.
  21. 척추동물 숙주에 제 8 항의 항원 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 합포체 바이러스 항원을 함유하는 항원 조성물의 척추동물 숙주 면역반응 도출능을 증가시키는 방법.
  22. 척추동물 숙주에 제 9 항의 항원 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 로타바이러스 항원을 함유하는 항원 조성물의 척추동물 숙주 면역반응 도출능을 증가시키는 방법.
  23. 척추동물 숙주에 제 11 항의 항원 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 허피스 심플렉스 바이러스 항원을 함유하는 항원 조성물의 척추동물 숙주 면역반응 도출능을 증가시키는 방법.
  24. 콜레라 홀로톡신 A 서브유닛의 위치 29에서 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환된 면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신을 암호화하고, 아라비노스 유도성 프로모터에 작동적으로 연결되는 DNA 서열을 포함하는 분리 정제된 DNA 서열을 함유하는 플라스미드.
  25. 제 24 항의 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 숙주세포.
  26. 숙주세포를 제 24 항의 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시킨 다음 숙주세포에 의한 재조합 면역원성 독성제거 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 숙주세포를 발현시키는 단계를 포함하는, 콜레라 홀로톡신이 야생형 콜레라홀로톡신에 비해 감소된 독성을 지니고 콜레라 홀로톡신 A 서브유닛의 위치 29에서 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환되는 면역원성 돌연변이체 콜레라 홀로톡신의 생산방법.
  27. 항원 조성물 제조를 위한, 야생형 콜레라 홀로톡신에 비해 감소된 독성을 지니고 콜레라 홀로톡신 A 서브유닛의 위치 29에서 글루탐산이 아스파트산 이외의 아미노산으로 치환되며, 항원에 대한 척추동물에서의 면역반응을 증강시키는 유효 보조량의 돌연변이체 콜레라 홀로톡신을, 병원성 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충으로부터 선택된 항원과 병용하는 용도.
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