CN117965781A

CN117965781A - 一种花生40K液相SNP芯片“PeanutGBTS40K”及其应用

Info

Publication number: CN117965781A
Application number: CN202311644765.4A
Authority: CN
Inventors: 鲁清; 陈小平; 洪彦彬; 李少雄; 刘浩
Original assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2023-12-04
Publication date: 2024-05-03
Also published as: CN116004898A

Abstract

本发明公开了一种花生40K液相SNP芯片“PeanutGBTS40K”及其应用，涉及植物生物技术和植物分子育种技术领域，其技术要点为：所述芯片PeanutGBTS40K的基因分型位点包括40990个SNP位点，且定位于花生参考基因组“伏花生”20条染色体和9条Scaffold上；该花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K应用于花生品种的基因型检测、品种鉴定、基因遗传定位、全基因组关联分析、全基因组选择中。本发明的“PeanutGBTS40K”液相芯片是从大规模花生基因组重测序数据中筛选获得，总共有40990个SNP位点，包含了花生产量、品质、抗性等主要农艺性状的关联位点，在花生育种多个领域具有广阔的应用前景。

Description

一种花生40K液相SNP芯片“PeanutGBTS40K”及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术和植物分子育种技术领域，具体涉及一种花生40K液相SNP芯片“PeanutGBTS40K”及其应用。

背景技术

花生是世界范围内广泛栽培的油料与经济作物，也是人们重要的植物油脂和植物蛋白质来源之一。随着花生基因组测序的完成，基于现代生物技术和分子遗传改良技术成为未来分子设计育种的有力工具，而高密度、低成本的分子标记技术的设计与开发是开展分子设计育种的前提。

传统技术中的分子标记，例如限制性片段长度多态性(RFLP)和简单序列重复(SSR)等已然在作物分子标记辅助育种领域发挥着重要作用。但是，这些分子标记在基因组分布数量少、通量低、操作技术繁琐、大规模分型成本高，导致难以大规模商业化应用。随着基因组从头测序和大规模重测序的发展，单核苷酸多态性(SNP)标记成为现代分子育种的最重要标记。单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的***或缺失所致，既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。SNP在动植物基因组中分布广泛，具有密度高、遗传稳定和易于自动化分型等特点，已发展成为动物遗传变异研究中常见的分子标记。

目前，现有技术中用于SNP位点分型的基因芯片技术主要包括固相芯片和液相芯片。固相芯片一般基于探针与DNA序列的互补杂交，通过标记物的荧光显色信号进行分型，主流芯片检测包括Illumina SNP芯片、Affymetrix SNP芯片和Agilent芯片等。在动物研究中，牛90K芯片、绵羊Illumina 50K芯片、山羊Illumina 50K芯片、鸡600K Affymetrix高密度芯片等，都已经被广泛用于大规模商业化育种，应用在遗传多样性分析、进化分析、全基因组关联分析、全基因组选择等领域；在植物种，玉米10K芯片、小麦55K芯片、水稻44K芯片等，主要应用于遗传作图、全基因组关联分析等领域。在花生上，已有研究者开发了第一款58K芯片‘Axiom_Arachis’，应用于花生的基因分型、亲缘关系分析等。虽然固相芯片在过去几十年的发展中取得了较好的进展，但是现有的固相芯片在检测流程中存在单位位点的设计开发和后续的分型成本高，不易于定制；位点无法增删，灵活性差，一经设计则位点被固定下来。

为了克服上述缺陷，研究者开发了液相芯片。液相芯片是一种基于靶向测序基因型检测(GBTS)的技术体系，广泛应用于不同物种的分子和基因型检测。根据所涉及的标记数量，GBTS液相芯片由2个技术体系组成：GenoPlexs和GenoBaits，前者基于多重PCR的捕获测序技术，后者基于液相探针杂交的捕获测试技术。液相芯片技术具有便携式、自动化、高通量、智能化、低成本、高精准度、高灵敏度、对检测平台要求较低等优点。目前，已在黄瓜、辣椒、玉米、小麦、水稻、西兰花等作物种开发了多款液相芯片，应用于遗传作图、全基因组关联分分析、全基因组选择育种等领域。然而，在花生上，目前尚未有液相芯片的开发报道，处于空白状态。

为此，本发明旨在基于GBTS技术体系的GenoBaits技术，开发了花生第一款高密度液相芯片“PeanutGBTS40K”，可应用于花生基因型检测、品种鉴定、基因遗传定位、全基因组关联分析、全基因组选择育种等领域，以解决上述现有技术中的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种花生40K液相SNP芯片“PeanutGBTS40K”及其应用，本发明的方案中该PeanutGBTS40K芯片能够用于花生基因型检测、品种鉴定、基因遗传定位、全基因组关联分析以及全基因组选择育种。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K，所述花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K的基因分型位点包括40990个SNP位点，且定位于花生参考基因组“伏花生”20条染色体和9条Scaffold上。

进一步地，所述花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K含有一套用于检测与花生农艺性状相关的SNP位点组合的核苷酸探针。

本发明还提供了一种分子标记检测方法，该分子标记检测方法基于上述所述的一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K实现，所述方法为基于液相芯片的SNP位点分型方法。

本发明还提供了一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K的应用，所述花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K在制备花生品种的基因型检测、品种鉴定、基因遗传定位、全基因组关联分析、全基因组选择的产品中的应用。

与现有技术相比，本方案的有益效果：

1、本发明的PeanutGBTS40K液相芯片从大规模花生基因组重测序数据中筛选获得，其总共有40990个SNP位点，包含了花生产量、品质、抗性等主要农艺性状的关联位点，在花生育种多个领域具有广阔的应用前景；

2、本发明的PeanutGBTS40K液相芯片是花生上第一款高密度液相芯片；基于靶向捕获测序技术可对目标位点进行分型，同时对目标位点侧翼序列的SNP也可准确分型，可得到比标记位点更多的SNP分型信息；可以对芯片位点进行灵活增删，位点选择的灵活性高，突破固相芯片的技术局限；液相芯片可利用二代测序平台，分型成本低、通量高。

附图说明

图1是本发明实施例中花生PeanutGBTS40K液相芯片位点在基因组上的分布；

图2是本发明实施例中花生218份RIL的位点检出率分布；

图3是本发明实施例中利用PeanutGBTS40K液相芯片构建的遗传图谱；

图4是本发明实施例中花生含油率QTL遗传定位；

图5本发明实施例中花生含油率全基因组关联分析；

图6是本发明实施例中图6花生含油率全基因组选择育种((A)为全基因组选择模型筛选；(B)为全基因组选择的高油株系含油率比较)；

图7-图10是本发明实施例中探针获取操作流程指示图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

本发明实施例提供的方案为：一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K及其应用，以下为本发明的具体实施方式。

本发明实施例中上述液相SNP芯片PeanutGBTS40K的SNP位点在基因组上的信息如下表1所示。

表1花生“PeanutGBTS40K”SNP位点编号及基因组位置

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以下为本发明方案的具体实施：

实施例1：花生“PeanutGBTS40K”液相芯片的设计和制备

本实施例利用一个390份花生种质资源材料构成的自然群体的～10X全基因组重测序数据，首先经测序数据质量控制后，获得数据12.95 Tb的测序原始数据；通过GATK、SAMTOOLS、ANNOVAR等软件将测序reads比对到“伏花生”参考基因组，并进行群体SNP的检测、过滤，共获得250万个SNP用于后续的筛选。本发明利用250万个SNP开展了花生28个主要农艺性状的全基因组关联分析，共获得了17803个显著性关联SNP；开展了全基因组选择性清除分析，保留前5％的XPCLR位点，共获得17389个全基因组受选择区域SNP。

本发明实施例利用250万个SNP，筛选的目标SNP位点用于液相芯片设计和制备，筛选参数包括：过滤掉稀有等位基因频率<5％、缺失率>20％和杂合率>10％的位点；保证位点在基因组上基本均匀分布，相邻位点间距离<1Mb；包含重要的全基因组关联分析显著性SNP，如下表2所示；包含重要的全基因组选择性清除SNP。最终，将所有候选位点去除重复位点后，共筛选了40990个SNP用于设计液相芯片，如表1所示。根据这40990个SNP位点的位置及其侧翼200bp序列，通过石家庄博瑞迪生物技术有限公司采用靶向捕获测序技术设计引物并进行探针合成，得到花生“PeanutGBTS40K”液相芯片。

表2.重要农艺性状显著性SNP位点数目

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实施例2：花生“PeanutGBTS40K”液相芯片的基因分型流程

利用“PeanutGBTS40K”液相芯片进行基因分型的流程主要包括样品DNA提取、样品DNA片段化、样品末端修复、样品测序接头连接、样品DNA纯化、样品文库扩增、DNA杂交、DNA捕获、DNA杂交捕获文库质检、DNA杂交捕获文库测序，具体步骤和标准的操作流程可参考博瑞迪生物科技有限公司实验技术手册：

http://www.molbreeding.com/index.php/Technology/GenoBaits.html。

获得的基因型测序数据，经过FastQ软件质控后，用BWA软件的默认参数将测序数据比对到“伏花生”参考基因组上，用GATK软件对测序数据进行SNP鉴定，最后对探针捕获测序的基因型分型信息进行提取，形成最终的基因型分型文件。

实施例3：花生“PeanutGBTS40K”液相芯片在基因型检测中的应用

利用“PeanutGBTS40K”液相芯片，参照实施例2的基因分型流程，对216份重组自交系(RIL)进行基因分型。通过数据分析，所得基因型构成218个RIL个体DNA指纹图谱数据库。结果显示“PeanutGBTS40K”液相芯片对样品的检出率在91.4％-98.5％之间，表明该液相芯片可高效的实现对花生样品的基因分型(如图2所示)。

实施例4：花生“PeanutGBTS40K”液相芯片在基因遗传定位中的应用

通过实施例3对216份RIL个体进行基因分型，获得每个个体的基因型。对子代中多态性标记进行严格的筛选过滤：(1)过滤掉异常碱基，将其视为缺失(NA)；(2)筛选基因型至少覆盖所有子代80％以上个体的标记；(3)对严重偏分离的多态性标记进行过滤，最终获得39456个高质量标记。利用使用R包ASMap(Taylor等，2017)中的mstmap函数进行遗传图谱的构建，绘制出花生高密度遗传图谱(图3)。随后，结合216份RIL个体两个环境(2016广州和2017广州)下的含油率表型，利用使用R/qtl的scanone()函数对各个性状进行复合区间作图，扫描步长为5cM，使用LOD＝3做为阈值筛选QTL。结果两个环境下，总共在7条染色体上定位到12个含油率QTLs(图4)。上述结果表明，利用“PeanutGBTS40K”液相芯片能够在花生的基因遗传定位中应用，基因分型成本低、准确性高，数据分析流程简单、易于操作，具有广阔的开发应用前景。

实施例5：花生“PeanutGBTS40K”液相芯片在全基因组关联分析中的应用

通过实施例3对112份花生种质资源组成的自然群体进行因分型，获得每个个体的基因型。对子代中多态性标记进行严格的筛选过滤：(1)过滤掉异常碱基，将其视为缺失(NA)；(2)筛选基因型至少覆盖所有子代80％以上个体的标记；(3)对严重偏分离的多态性标记进行过滤，最终获得39743个高质量标记。利用GAPIT v3(Wang等，2021)软件，采用混合线性模型进行含油率的全基因组关联分析，以-log10(p)＞6为阈值，在A02和A08分别找到一个显著性关联位点，其位置分别在A02_6653689和A08_44514436(图5)。这些结果表明，利用“PeanutGBTS40K”液相芯片能够有效开展自然群体的基因分析，可以应用于花生的全基因组关联分析，挖掘优良关联位点。

实施例6：花生“PeanutGBTS40K”液相芯片在全基因组选择育种中的应用

以高含油率油资源(58.8％)和低含油率品种(43.5％)为亲本，通过杂交自交构建了包含218个后代个体的群体，建立参考群体和育种群体，用于含油率的全基因组选择育种。表型调查显示，该群体含油率范围在45.5％-57.8％之间，平均含油率为52.2％。利用“PeanutGBTS40K”液相芯片，参照实施例2的基因分型流程，对该群体进行基因分型。对获得的原始基因型数据进行数据过滤，最终获得38355个高质量SNP位点，用于后续的含油率的全基因组选择育种研究。利用rrblup、svmrbf、svmpoly、randomforest等11个全基因组选择代表模型对参考群体的基因型数据和表型数据进行训练，并通过5×交叉验证进行准确性评估。从全基因组选择的预测模型来看，随机森林(Randomforest)模型具有最好的预测准确性，对含油率的预测准确性达到0.322(图6)。利用该模型对后代进行选留，每一轮选留前20的基因组育种值(GEBVs)个体种植，构成下一轮的育种群体。经过三轮的选择，育种群体的含油率在44.3％-56.7％之间，群体的平均含油率为49.0％，比低油亲本的含油率提高了近5.5％；筛选到10个高含油率的株系，含油率在51.6％-56.7％之间，平均含油率为53.0％(图6)。这表明利用“PeanutGBTS40K”液相芯片可实现含油率性状的有效改良，为花生复杂农艺性状的遗传改良提供了新方法。

通过本发明的上述实施例，关于“PeanutGBTS40K”液相芯片有以下几点说明：

(1)40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K的基因分型位点包括40990个SNP位点，具体SNP基因型在上述表1；

(2)如上述表1所示，根据这40990个SNP位点的位置信息，以每个SNP上下游200bp区间获取参考基因组“伏花生”的侧翼序列，即为该SNP的探针序列；

(3)通过石家庄博瑞迪生物技术有限公司采用靶向捕获测序技术进行探针合成、测试，得到花生“PeanutGBTS40K”液相芯片。

具体的探针获取过程如下：

(A)参考基因组“伏花生”下载。从公共数据库peanutbase下载参考基因组序列(arahy.Fuhuasheng.gnm1.XX5Y.genome_main.fna.gz)；然后，解压缩到本地。

下载链接：

https://data.legumeinfo.org/Arachis/hypogaea/genomes/Fuhuasheng.gnm1.XX5Y/

(B)根据表1所示的染色体及SNP的物理位置(bp)，往上下游各取200bp，得到探针序列所在区间。该区间内的序列，即为该SNP的探针序列。比如A01_100044822_A这个SNP的探针序列为A01染色体的100044622-100045022bp。我们可以利用TBtools软件(https://www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(23)00281-2)进行操作。操作如图7-图10所示，打开软件，按照软件提示：输入从数据库下载并解压缩后的“伏花生”参考基因组序列(genomic.fna)；给一个输出路径；输入我们需要提取的区间染色体(ChrID，注意在“伏花生”参考基因组中A01对应的染色体编号为CM014315.1，以此类推)、起始位置(StartPos)、终止位置(EndPos)；点击start；得到的序列即为A01_100044822这个SNP的探针序列：CTTCTGCAATGGATTCCAAATTTGGAACATCACAAATATATAATGAATGTAGGCCAGTGAGATTATTAATAGGTTCTGGTAATGAAGTAATCTTGTCGCAATTCTTTACCGAAAAATAACTCAGGTTAGGAGTGGACGAAATCGACTCCAGTTCAGGACATCCATATACTTCGAGATGTTCAAGAAACATGAGAGACTGGATTGCTGCTGCTtcttccaaaattgaaattgatttcAATTTTTTACAACCCCAAAGCTTAAGACTCTTGAGCACAGGGAGAGAACCTAAGGGAAATGACGTCAGCGAGCAACAGCTACTCGATATGTAGAGATCCTCAAGTGCCTTGCAACTATGAAGGAACTCATGAGTTGGGAATTCAAGGCTCTCACAATATTCGATA。

同理，例如表1第二列A03_123703421_T：探针区间为123703221-123703621，其序列为(注意：A03对应的染色体编号为CM014317.1)：AGAAATgttgtggtattttttttttttggtcaagtggaTTGGACAGCCCCCAATCCTAGGTATTACATCCATGCTTCACACACCCACACAACACACACACGCACACGCTACATGGGTATTATGGGTTCTTTAAACAATATCCAACCTTAGCTGAGATTCGAACCCGGGTGCAGCTTGCAAGAGGCATATAGATATGCCATTGTGCTAGGCCTCCGCTGCAATGTTGTggtgttgattgttgaaggtaagATGGGGATAGGGTGATTGTGACTTGTGGTCAATGTGTAGGATTGTTGGCCTACTAGGAAAAGAATAAGTGATGGGCTTATGGTGAGGTGAGGCCATAGAGAATTCTAAAGCAATGGGTGGGAAAATATAATGTAgagtttgggttgagcttg。

同理，例如表1中第3列A05_29278005_C，探针区间为29277805-29278205，其序列为(注意：A05对应的染色体编号为CM014319.1)：

acacACTTTCATCTTTCACTGTAGTCATTTTTTTCTTCATCAACAGTGCAGCTACTTTCTTCTTTTGCTGCTGCTTCTACTTTTGCCTTTTCTTTGGCAGCCATGGATGTCACCGCGTTGCCTTATTCTCGTCATTGCAGATCGTCGTTGCCACGGGTCTCATTATTTCACCACCACCATTTTTCAGATCTATTCCAgttctttctgttttcttttcttttttttttgctagatTTGCAGTTTttcatcaccttcttctttgcttcGGTCACTTTTCTCAACCTTCATCACatctttctcatttttatttttgtttatcttttaattgtcgatcaattttttatttttaaaatctaattattgaaatttttcattctatttcaatttttaatttgaattgt。

其余位点探针序列的获得，以此类推。

以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护

以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K，其特征是：所述花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K的基因分型位点包括40990个SNP位点，且定位于花生参考基因组“伏花生”20条染色体和9条Scaffold上。

2.如权利要求1所述的一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K，其特征是：所述花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K含有一套用于检测与花生农艺性状相关的SNP位点组合的核苷酸探针。

3.一种分子标记检测方法，其特征是：所述方法基于权利要求1-2任一项所述的一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K实现，其特征是：所述方法为基于液相芯片的SNP位点分型方法。

4.如权利要求1-2任意一项所述的一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K的应用，其特征是：所述花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K在制备花生品种的基因型检测、品种鉴定、基因遗传定位、全基因组关联分析、全基因组选择的产品中的应用。