CN117821650B - 一种芋全基因组SNP-Panel及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种芋全基因组SNP‑Panel及其应用。本发明要解决的技术问题是开发一种覆盖芋全基因组的通量高、成本低的分子标记检测体系。本发明的技术方案是一种芋全基因组SNP‑Panel，包括695个SNP位点以及所述SNP位点的扩增引物。利用所述SNP‑Panel通过一次扩增反应，可实现695个SNP位点的同时检测，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种芋全基因组SNP-Panel及其应用。
背景技术
芋，俗称芋头、芋艿，是天南星科的一种重要的作物，既可作为蔬菜，又可以作为粮食食用。全国各地均有种植，常年栽培面积约150万亩。目前芋品种选育仍然以传统的表型选择为主要的技术手段，通过田间个体的表型观察来进行目标单株的选择，工作量大，育种周期长，精准度也不足。分子设计育种技术将实现对农艺性状的精确改良，显示出比其他育种手段更为突出的优越性，是今后作物育种技术发展的方向。
近年来随着高通量测序技术的飞速发展，芋基因组信息越来越丰富，为开展芋分子设计育种打下了良好的基础。目前分子标记辅助育种的技术有SSR/InDel、KASP和基因芯片，SSR/InDel和KASP可用的标记少，单价高，不适合全基因组范围的分子标记辅助育种；基因芯片价格高且核心技术为国外所有，不能大规模应用且不能满足个性化的需求，同时存在技术壁垒，鉴于当前的国际形势，不利于国内育种的安全。因此，开发一种覆盖全基因组的通量高、成本低的分子标记检测体系对于开展芋分子育种具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是开发一种覆盖芋全基因组的通量高、成本低的分子标记检测体系。
本发明的技术方案是一种芋全基因组SNP-Panel，包括695个SNP位点以及所述SNP位点的扩增引物，所述695个SNP位点信息及扩增引物序列如表1所示；
表1 695个SNP位点信息及扩增引物序列
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表1中的染色体上的碱基位置是以公开的芋全基因组序列Taro_JAAS_v1.0作为参照。
本发明还提供了所述芋全基因组SNP-Panel的应用，为如下之一：
a、建立芋DNA指纹数据库和/或遗传多样性分析；
b、芋种质资源鉴定、品种鉴定、种子纯度或/和转基因成份鉴定；所述芋种质资源为选育品种、地方品种、野生资源或近缘种；
c、芋表型关联分析；
d、芋分子设计育种、回交育种及其背景选择或全基因组育种。
进一步的，所述建立芋DNA指纹数据库的步骤如下：利用上述695个SNP位点的引物对芋的基因组DNA进行混合PCR扩增，扩增产物经测序、分型，获得芋在所述695个SNP位点上的的基因型数据，即构成芋DNA指纹数据库。
更进一步的，所述遗传多样性分析的步骤如下：在获得芋DNA指纹数据库后，对待分析样本建立聚类树状图，计算遗传多样性参数，即可得到芋的遗传多样性分析结果。
其中，所述芋表型关联分析的方法包括如下步骤：获得待分析样本的695个SNP位点基因型数据，分析并筛选在差异表型个体中呈现多态性的SNP位点信息；利用筛选的SNP在分离群体中进行关联分析，确定与目标性状紧密连锁的SNP。
特别的，所述芋分子设计育种、回交育种及其背景选择的方法包括如下步骤：获得待转育芋品种在695个SNP位点基因型数据，获得背景基因型；根据育种目标选择目标基因供体亲本，与待转育品种进行杂交建立杂交分离群体或回交分离群体；在分离群体中，通过目标性状进行前景筛选；获得选择的分离群里中个体的695个SNP位点基因型数据；比较个体基因型与所述获得的背景基因型，选择变异位点数最少的个体进行进一步转育，直至获得含有目标性状基因、背景基因型完全恢复的稳定个体。
优选的，所述种子纯度鉴定的方法包括如下步骤：获得待检测品种杂交种F1及双亲本在695个SNP位点基因型数据，分析并选择在双亲本中纯合且呈现多态性的SNP位点引物；利用筛选出的多态性SNP引物对F1进行PCR扩增测序分析检测，分析F1与双亲本的关系，从而鉴定芋品种种子纯度。
更优选的，所述选择的多态性SNP数量不少于2个。
本发明的有益效果：本发明提供了一种芋全基因组SNP-Panel，包括695个SNP位点以及所述SNP位点的扩增引物，所述SNP位点均匀分布于芋14条染色体上，覆盖面广，密度高。利用所述SNP-Panel通过一次扩增反应，可实现695个SNP位点的同时检测，能够实现芋分子设计育种的流程化、信息化，大幅度提高我国芋育种效率，缩短育种周期。本发明所述芋全基因组SNP-Panel体系稳定性好，操作简单，成本低，很好的解决了之前芋全基因组分子标记成本过高的问题，能够显著促进芋产业的发展，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为挑选的SNP在基因组上的分布情况。
图2为21份芋的***发生树。
具体实施方式
实施例1芋特定SNP筛选及SNP-Panel开发
1.核心种质资源重测序：
挑选不同类型、表型差异大、遗传距离较远的核心芋种质资源进行重测序，以公布的芋品种‘longxiangyu’基因组序列Taro_JAAS_v1.0为参考(网址：https://ftp.cngb.org/pub/CNSA/data2/CNP0001082/CNS0231432/CNA0014218/Taro_Lachesis_assembly_Chr.fa.gz)，形成核心芋种质数据库。
2.变异检测：
利用高通量测序数据变异数据分析软件GATK(version3.7)进行变异分析，按照如下条件进行了筛选：1)各样品测序深度不小于5；2)所有样品基因型缺失比例不超过50％；3)较小等位基因频率不低于5％。共获得了6772726个为SNP。
3.特异SNP筛选及SNP-Panel开发：
根据如下标准筛选可用SNPs：1)SNP间隔大于500Kb；2)SNP对应的MAF不小于0.1；3)基因型缺失小于10％；共得到4282个SNP。使用Primer3软件(version 2.5.0)来设计各目标SNP位点的扩增引物，设置的参数包括：a)引物序列的长度在17～32bp之间；b)Tm值在60～64℃之间；c)产物大小不超过500bp；d)测序reads必须能够覆盖目标位点。
对每个目标位点设计3对引物，然后使用e-PCR软件(version 2.3.12)检测每对引物的扩增特异性，去掉非特异引物，并去掉引物之间形成二聚体的引物组合后，最终获得了695个SNP位点的扩增引物，这695个SNP位点即组成了本发明所述最终的SNP-Panel。这695个SNP位点在基因组上分布情况如图1所示。
实施例2芋种质资源DNA指纹图谱
1.采用CTAB法提取芋组织的DNA以获得DNA
1)试剂配制：
CTAB缓冲液(pH＝8.0)：2％CTAB，1.4M NaCl，l00mM Tris-HCl，l0mM EDTA；洗涤缓冲液：76％乙醇，l0mM乙酸铵；TE缓冲液(pH＝8.0)：20mM Tris-HCl，1mM EDTA；冰无水乙醇：将无水乙醇预先存放于-20℃，存放时间大于1小时。
2)提取芋组织中的DNA：
将取自芋的幼嫩组织剪碎，并在液氮环境中研磨；加入与组织的量相当的预热CTAB，并迅速置于65℃水浴，水浴30min至1h，每隔5min摇动一次；4℃、12000rpm离心l0min后，移出上清并加入等体积氯仿和异戊醇(氯仿和异戊醇体积比为24︰1)混合液，混匀；4℃、12000rpm离心15min后，移出上清并加入两倍体积冰无水乙醇，于-20℃放置1h；4℃、12000rpm离心l0min后，弃上清，沉淀经洗涤缓冲液洗涤后风干；加入5μL至l00μL的TE缓冲液，充分溶解；用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计检测浓度和纯度；将检测后的DNA保存于-20℃。
2.文库构建与测序:
使用实施例1中表1所述695个SNP引物进行PCR扩增(PCR反应体系：DNA模板10～100ng，10μM正、反向引物各0.5μL，2×KAPA2G Fast Multiplex Mix 12.5μL，PCR级水补足至25μL。PCR运行程序：95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec，20～35个循环；72℃延伸1min)捕获各目标位点的DNA序列，然后回收产物并质检合格后依据Illumina文库构建流程完成Paired-end(PE)测序文库构建，取各个样本等量DNA构建一个PE文库并在Illumina Hiseq测序仪上进行PE150测序。
3.目标位点基因型分析:
对测序获得的原始数据进行数据质控，得到高质量的clean data，然后使用BWA软件将clean data比对到各目标位点，得到SAM格式的比对结果，然后使用samtools软件将SAM格式的文件转换成BAM格式，接着使用Picard工具中的SortSam对BAM文件进行排序，得到最终的BAM文件。使用GATK确定各目标位点的基因型，即构成芋种质资源DNA指纹图谱，如表2显示部分芋种质资源图谱信息。芋种质资源均来自国家水生蔬菜种质资源圃(武汉)，详细清单见表3。
表2显示部分芋种质资源图谱信息
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统计发现，21份芋种质资源中需要检测的基因型共有14595个，最终获得了有效数据(Q30)的基因型比例为90.94～92.84％，平均测序深度为58.31倍。
表3 21份芋种质资源列表
| 样品编号 | 种质名称 | 种质类型 | 来源地 | 来源国 |
| R11 | 汀芋1号 | 槟榔芋 | 福建 | 中国 |
| R12 | 绵阳多头芋 | 红芽多头芋 | 四川 | 中国 |
| R13 | 瑞金芋 | 红芽多子芋 | 江西 | 中国 |
| R14 | 王十三芋-2 | 白芽多子芋 | 江西 | 中国 |
| R15 | 唐江芋-2 | 野芋 | 江西 | 中国 |
| R16 | 参内多头 | 白芽多头芋 | 福建 | 中国 |
| R18 | 虾籽芋(乌绿) | 红芽多子芋 | 山东 | 中国 |
| R21 | 昆明芋头 | 白芽多子芋 | 云南 | 中国 |
| R22 | 荔浦芋 | 槟榔芋 | 广西 | 中国 |
| R23 | 宜宾水芋 | 匍匐茎魁芋 | 四川 | 中国 |
| R24 | 覃塘野芋 | 野芋 | 广西 | 中国 |
| R26 | 乐昌香芋 | 槟榔芋 | 广东 | 中国 |
| R27 | 草堂人头芋 | 长魁芋 | 四川 | 中国 |
| R28 | 雨林红梗 | 紫芋 | 云南 | 中国 |
| R29 | Kolkata Taro 4 | 野芋 | 加尔各答 | 印度 |
| R30 | Beung Mai Hom槟榔芋 | 槟榔芋 | 沙功那空府 | 泰国 |
| R32 | 福鼎芋 | 槟榔芋 | 福建 | 中国 |
| R33 | 蓬安野生芋 | 匍匐茎魁芋 | 四川 | 中国 |
| R36 | 八月红 | 魁芋 | 海南 | 中国 |
| R38 | 仁寿人头芋 | 长魁芋 | 四川 | 中国 |
| R39 | 资中红合芋 | 红芽多子芋 | 四川 | 中国 |
实施例3芋种质资源遗传多样性分析
为了验证SNP-Panel的可靠性和应用价值，挑选21份不同类型的芋，对其695个SNP标记进行了检测。参照实施例2的实验方法，得到了21份芋的SNP基因型，然后基于SNP基因型构建***发生树。使用MEGA11软件中的邻接法(neighbor-joining methods)构建***发生树，并使用ggtree(version 3.6.2)进行可视化。结果如图2所示。可以看出，21份芋能被本发明所述的芋全基因组SNP-Panel清晰区分，相同类型的芋能被聚到一起，表明亲缘关系更近。***发生树的结果揭示了21份芋种质资源的亲缘关系，将有效指导下一步的芋育种研究。
以上所述为本发明的实施例，并非因此限制本发明的范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (1)
1.芋全基因组SNP-Panel在建立芋DNA指纹数据库和/或遗传多样性分析中的应用，其特征在于：包括695个SNP位点以及所述SNP位点的扩增引物，所述695个SNP位点信息及扩增引物序列如表1所示；
所述建立芋DNA指纹数据库的步骤如下：利用上述695个SNP位点的引物对芋的基因组DNA进行混合PCR扩增，扩增产物经测序、分型，获得芋在所述695个SNP位点上的的基因型数据，即构成芋DNA指纹数据库；
所述遗传多样性分析的步骤如下：在获得芋DNA指纹数据库后，对待分析样本建立聚类树状图，计算遗传多样性参数，即可得到芋的遗传多样性分析结果；
表1 695个SNP位点信息及扩增引物序列
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表1中的染色体上的碱基位置是以公开的芋基因组序列Taro_JAAS_v1.0作为参照。
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2024
- 2024-01-11 CN CN202410038691.8A patent/CN117821650B/zh active Active
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Also Published As
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