CN110191965B

CN110191965B - 猪全基因组50k snp芯片及应用

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Publication number: CN110191965B
Application number: CN201780002981.5A
Authority: CN
Inventors: 刘剑锋; 冯文; 杜恒; 赵鹏举
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2037-12-13
Also published as: WO2019113818A1; CN110191965A

Abstract

本发明提供一种猪全基因组50K SNP芯片及应用，所述SNP分子标记主要来自于以下3类：第一类，根据已有文献报道的现有重要经济功能基因的显著位点筛选得来SNP位点；第二类，从国内外多个品种测序数据筛选出的多态性良好的SNP位点；第三类，来源于SNP数据库，3类探针共计包含50000个SNP位点。本发明提供的猪全基因组50K SNP芯片，可用于特异性鉴定欧洲猪与亚洲猪，进行全基因组选择育种，目标性状QTL、关联位点及候选基因鉴定，亲缘关系鉴定等方面。

Description

猪全基因组50K SNP芯片及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、功能基因组学、生物信息学、基因组育种技术领域，具体地说，涉及猪全基因组50K SNP芯片及应用。

背景技术

SNP是指基因组水平上单个核苷酸的变异，包括单碱基的缺失、***、转换及颠换等形成的分子标记，具有数量大分布广的特点。SNP作为遗传标记，对复杂性状的遗传变异具有贡献，因此被广泛应用于遗传研究中。SNP芯片是将带有荧光标记的DNA探针固定在硅片上制作而成，再通过探针DNA与基因组DNA杂交进行SNP分型。SNP与硅片表面的探针结合而不是基因组序列，这样可以将大量个体的DNA固定到一张芯片上分析。

Illumina公司的Infinium SNP芯片技术是目前比较成熟和应用广泛的全基因SNP检测平台。首先将变性的DNA与芯片微珠上的探针进行杂交，然后去除未杂交结合的DNA，并将获得的DNA进行特殊标记碱基的延伸反应；最后通过标记和荧光基团的免疫结合将SNP信息转化为可视的荧光信息。

目前基于第二代测序技术的SNP新型高通量分子标记技术已经在猪中得到了大量的应用。目前在猪上最常见的芯片是Illumina公司推出的两款60K芯片(PorcineSNP60BeadChip)，大约有6万个位点，但是这些位点的分布均匀性一般，还有10K多位点在染色体上的位置不详。已有研究表明，基因组选择的准确性与SNP分子标记的分布有关，SNP在染色体上分布越均匀，基因组选择准确性越高。基因组选择育种中。一般认为，SNP分子标记密度越高，基因组选择准确性越高。但Su等人在2012年的研究表明，当标记密度由54K增加到777K后，其准确性只提高了1％左右，这是因为在实际应用中，大部分标记是没有效应的。因此单纯地追求提高标记的数量，不但提高准确性的程度有限，也会增加成本。综合考虑以上因素，提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一款猪全基因组50K SNP芯片及应用。

本发明提供的猪全基因组50K SNP芯片，所述50K SNP芯片包含如SEQ ID NO：1-50000所示的SNP分子标记。

所述SNP分子标记主要来自于3类SNP位点：第一类，是根据已有文献报道的具有重要经济功能基因的显著位点，包含5788个SNP位点；第二类，是从国内外多个猪品种测序数据筛选出的多态性良好的SNP位点，包含35765个SNP位点；第三类，是从NCBI的猪SNPdatabase数据库补充的前两类SNP未能覆盖的区域，包含8447个SNP位点。以上3类探针共计包含50000个SNP位点。本款芯片是采用Illumina公司Infinium专利制造技术(US6,429,027)制作的光纤微珠芯片。

本发明还提供一种制备上述基因芯片的方法，用于本发明的猪SNP检测芯片的特异性探针，所述SNP标记其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-50000所示。本发明的猪全基因组SNP芯片上的SNP位点是指SEQ ID NO：1-50000所示序列中每条序列的第71位碱基。然后利用Infmium芯片制造技术制作SNP芯片。

本发明还提供24个用于鉴定中外猪种的SNP分子标记，所述SNP分子标记选自以下至少一种，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1435，1895、3713、3716、3717、3719、4298、6716、11665、12437、13507、13540、13586、28056、35883、35970、36063、40325、40889、41835、42501、48782、48813或49078所示，每条序列第71位碱基为SNP突变位点，该位点与欧洲猪和亚洲猪品种关联。

本发明还提供所述SNP分子标记单独或组合使用在猪基因分型检测中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记单独或组合使用在制备SNP分型芯片中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记单独或组合使用在制备猪全基因组SNP芯片中的应用。

本发明还提供一种SNP分型芯片，所述SNP分型芯片包含上述SNP分子标记中的至少一个。

本发明还提供所述SNP分子标记单独或组合使用在鉴定欧洲猪和亚洲猪品种中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记单独或组合使用在猪分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供所述SNP分型芯片或所述50K SNP芯片在鉴定欧洲猪和亚洲猪品种中的应用。

本发明还提供所述SNP分型芯片或所述50K SNP芯片在猪全基因组选择育种中的应用。

本发明还提供所述SNP分型芯片或所述50K SNP芯片在猪全基因组关联分析中的应用。

本发明还提供所述SNP分型芯片或所述50K SNP芯片在猪的聚类分析及亲缘关系鉴定中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的用于鉴定中外猪种的SNP分子标记具有SNP位点分布均匀，全基因组覆盖率高的特点，利用这些SNP标记进行全基因组育种，能有效地通过连锁不平衡提高与性状的关联程度，保证了育种值估计的准确性。筛选SNP位点时使用大白猪、长白猪、杜洛克和梅山猪的重测序数据，筛选出几个品种共同最小等位基因频率＞0.05的SNP，所选位点有较高的多态性，还能够提高基因组选择育种值的准确性。本款芯片增加了通过功能验证的与猪生长性状、繁殖性状及健康性状等相关的显著SNP位点，提高了芯片的实用性。又对比筛选了我国代表性的地方猪种、国内外高度选育商用猪种的特征位点，增加了24个亚洲特有的SNP突变位点，可以特异性鉴定欧洲与亚洲猪。此外，该款芯片还可用于目标性状QTL、关联位点及候选基因鉴定，亲缘关系鉴定等方面。

附图说明

图1为本发明制备猪全基因组50K SNP芯片所用的SNP分子标记相邻SNP的距离(单位：kb)。

图2为本发明SNP位点在全基因组水平分布。

图3为本发明实施例3中猪100kg校正日龄全基因组关联分析结果的曼哈顿图。

图4为本发明实施例4中中外猪种聚类结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 用于鉴定中外猪种的SNP分子标记的获得及50K猪全基因组SNP芯片的制备方法

SNP位点鉴定流程：为了使SNP位点在全基因组水平上均匀分布，将染色体分为48kb一个窗口/区间，每个区间优先选择1-2个第一类探针中SNP，如果小于1个，则筛选一个第二类探针中的SNP；将第一类探针和第二类探针选择完后，仍然不能覆盖的窗口，则选取一个第三类探针的SNP。

1、第一类探针(SNP位点)的获得：

结合公共数据库NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)、QTLdatabase(https：//www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/index/)获得与猪生长性状、繁殖性状及健康形状等经济性状相关候选基因内部及上下游SNP位点、全基因组关联分析和QTL结果显著SNP。经去除重复位点、根据位点的MAF＜0.05及位点注释在基因结构中的位置(基因内和调控区优先)筛选得到31,2980个位点备选SNP。

猪的全基因组长度约为3Gb，为了保证这些SNP在全基因组水平上尽可能均匀分布，将猪全基因组全长以每48kb划分为一个窗口，下一个窗口的起始位置为上一个窗口选定的SNP位置。具体确定SNP的方法：1)若该窗口里有大于等于3个以上的备选SNP，则选取其中使该窗口的分布最均匀的两个点；2)若该窗口里的备选SNP数为2个或1个，则备选SNP直接成为最终目标SNP；3)若该窗口无第一类探针的备选SNP，则保留该窗口，等待第二类探针的备选SNP筛选。最终确定5788个第一类探针的SNP。

2、第二类探针的获得：

对国内外包括大白、长白、杜洛克、梅山、滇南小耳猪、藏猪在内的多个猪品种进行全基因组重测序，筛选其中满足每个品种MAF＞0.05的SNP位点，去重，得到9,383,407个多态性良好的SNP位点。其中，特异性备选了208,608个亚洲猪品种特有的SNP。

完成第一类探针筛选后，对于尚无SNP的窗口，填充第二类探针，具体方法如下：1)若该窗口有超过2个以上的备选SNP，选取其中距离该窗口中位点最近的1个SNP；2)若该窗口只有1个SNP，则该SNP直接成为目标SNP；3)若该窗口无第二类探针的备选SNP，则保留该窗口，等待第三类探针的备选SNP筛选。最终确定35765个第二类探针的SNP，其中包括24个亚洲猪品种特有的SNP。

3、第三类探针的获得：

从NCBI上的猪SNP database数据库下载得到第三类探针。筛完成第二类探针筛选后，对于尚无SNP的窗口，填充第二类探针，具体方法如下：1)若该窗口有超过2个以上的备选SNP，选取其中距离该窗口中位点最近的1个SNP；2)若该窗口只有1个SNP，则该SNP直接成为目标SNP。最终确定8447个第三类探针的SNP。

将鉴定好的SNP位点交给Illumina公司由Infmium iSelect打分***(http：//www.illumina.com/)打分，将基因内分值＜0.7和基因间＜0.9的位点去掉。对于删掉的不合格的SNP位点，选取距离其最近的SNP位点进行补充，并且再次进行打分。按照以上步骤鉴定和筛选，最后共获得50,000个标签SNP位点。按照Illumina Infmium iSelect HD设计要求需要50,000种微珠(beads)。所有50,000个标签SNP位点为SEQ ID NO：1-50000所示的50,000条DNA序列。将这些标签序列交由Illumina公司设计制作Infmium SNP芯片。

该款50K SNP芯片具有三个优点：一是具有经济性状的功能相关性。芯片搜集并确定了大量与猪生长性状、繁殖性状及健康性状等相关的显著位点，增加了芯片的实用性；二是位点分布均匀(相邻SNP的距离见图1)，多态性好。芯片的位点在全基因组分布均匀(芯片位点在各染色体分布数量见表1，SNP位点在全基因组分布水平见图2)，保证了育种值估计的准确性；且在筛选位点时使用重测序数据保证了所选位点有较高的多态性；三是具有特异性，对比筛选了我国代表性的地方猪种、国内外高度选育商用猪种的特征位点，特别加入了24个亚洲特有的SNP位点，具体所述SNP分子标记核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1435，1895、3713、3716、3717、3719、4298、6716、11665、12437、13507、13540、13586、28056、35883、35970、36063、40325、40889、41835、42501、48782、48813或49078所示，可以特异性鉴定欧洲与亚洲猪。

表1芯片位点在各染色体分布数量

染色体	SNP位点数量	染色体	SNP位点数量	染色体	SNP位点数量
						1	5974	8	2971	15	2926
2	3185	9	3066	16	1660
						3	2796	10	1488	17	1357
4	2805	11	1632	18	1195
						5	2147	12	1271	X	2458
6	3101	13	4276	Y	6
						7	2655	14	3031	总计	50000

实施例2 50K猪全基因组SNP芯片在基因组选择育种中的应用——多场联合遗传评估

利用50K猪全基因组SNP芯片进行多场联合遗传评估。对赤峰和四川的两个猪场的大白猪进行检测，使用“一步法”对达100kg体重日龄(AGE)/背膘厚(BF)、总产仔数(TNB)进行遗传评估。具体步骤如下：

(1)提取两个猪场大白猪的DNA进行SNP芯片检测，并对芯片检测结果进行质控，个体CR＞95％，MAF＞0.01，Hardy-Weinberg平衡检验＞0.001，质控后两个猪场分别有1210头和544头猪，42,074个高质量SNP位点用于全基因组选择；

(2)模型：

AGE/BF＝HYSS+Litter+animal+error

TNB＝HYS+Parity+perm+animal+error

HYSS为测定日龄和背膘厚时动物个体所在的猪群、年度、季节和动物个体的性别的组合

***环境效应；

Litter为动物个体出生时所在窝的随机效应；

HYS为母猪产仔时所在的猪群、年度和季节的综合***环境效应；

Parity为胎次固定效应；

perm为影响同一母猪多个胎次的产仔数的随机永久环境效应；

animal为动物个体的随机加性遗传效应，即育种值；

τ＝1，w＝0.05，ω＝1，error为随机误差，

H为个体关系矩阵，A阵是根据系谱构建的分子亲缘关系矩阵，A₂₂为有基因型信息的个体在A阵中对应的元素，G阵为基于SNP标记构建的基因组关系矩阵，G*是校正的G阵，G*＝βG+α，其中α和β通过求解如下方程式得到：

式中，Avg指求均值，diag和offdiag分别代表全部对角线元素和非对角线元素。

(3)使用软件PI-BLUP进行遗传评估。所用软件名称为：基于预条件共轭梯度法间接求解混合模型方程组软件V1.0，简称：PI-BLUP，软件著作登记证书号：2017SRBJ0784。

(4)结果

不同遗传评估方法的准确性见表2。

表2遗传评估方法的准确性比较

可以看出，使用本发明的猪全基因组50K SNP芯片进行基因组选择相比传统方法仅利用表型信息进行育种值估计，能够有效提高遗传评估的准确性。

实施例3 50K猪全基因组SNP芯片在全基因组关联分析中的应用

用本发明提供的50K猪全基因组SNP芯片对1214头内蒙古赤峰某场的大白猪进行基因型检测，基因型质控条件为：个体CR＞95％，MAF＞0.01，Hardy-Weinberg平衡检验＞0.001，质控后得到1006个合格个体和42185个高质量SNP位点用于GWAS分析。根据猪100kg的校正日龄，进行基于一般线性模型(GLM模型)的GWAS分析。以p＜1×10^-5作为潜在相关水平和全基因组相关水平，得到结果曼哈顿图如图3所示。结果显示，在4号和6号染色体上的显著关联位点可能是新的调控位点。

实施例4 基于50K全基因组SNP芯片进行聚类分析

使用本发明提供的50K猪全基因组SNP芯片对35头杜洛克(DL)、6头长白猪、15头大白猪、5头欧洲家猪(OZ)、11头亚洲家猪(YZ)以及32头中国梅山猪(MS)提取的DNA进行基因型检测，使用MEGA软件进行聚类分析，结果如图4所示。结果显示，杜洛克(DL)、长白(CB)、大白(DB)、欧洲家猪(OZ)、亚洲家猪(YZ)、梅山猪(MS)先各自聚集为第一类，杜洛克、大白、长白以及欧洲家猪汇聚为第二类，梅山和亚洲猪聚集为单独的第二类，最后欧洲猪与亚洲猪汇聚为第三类。该结果表明，本发明提供的芯片能够很好地应用于亚洲猪和欧洲猪遗传分类和进化分析中，鉴定结果准确可靠。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.猪全基因组50K SNP芯片，其特征在于，所述50K SNP芯片包含如SEQ ID NO:1-50000所示的SNP分子标记。

2.权利要求1所述50K SNP芯片在猪全基因组选择育种中的应用。

3.权利要求1所述50K SNP芯片在猪全基因组关联分析中的应用。

4.权利要求1所述50K SNP芯片在猪的聚类分析及亲缘关系鉴定中的应用。

5.权利要求1所述50K SNP芯片在鉴定欧洲猪和亚洲猪品种中的应用。

6.权利要求1所述50K SNP芯片在猪基因分型检测中的应用。

7.权利要求1所述50K SNP芯片在猪分子标记辅助育种中的应用。

8.用于鉴定中外猪种的SNP分子标记组合在鉴定欧洲猪和亚洲猪品种中的应用；

所述SNP分子标记组合由24个SNP分子标记组成，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1435, 1895、3713、3716、3717、3719、4298、6716、11665、12437、13507、13540、13586、28056、35883、35970、36063、40325、40889、41835、42501、48782、48813或49078所示，每条序列第71位碱基为SNP突变位点，该位点与欧洲猪和亚洲猪品种关联。