CN110894540B - 用于花生品种鉴定的snp芯片、制备方法及其应用 - Google Patents

用于花生品种鉴定的snp芯片、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于花生品种鉴定的SNP芯片，所述SNP芯片包含725个SNP分子标记，所述SNP分子标记的编号分别为SNP001～SNP725，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：725所示。本发明同样提供了该SNP芯片的设计及制备方法，即该芯片所包含的SNP标记是通过分析花生栽培种重测序数据，检测SNP变异；对SNP标记进行筛选；再进行设计探针制作SNP芯片。本发明还提供了该SNP芯片在花生品种鉴定中的应用。本发明设计的725个SNP标记将为花生栽培种品种鉴定提供分子技术手段，进一步提升我国花生品种鉴定水平。

Description

用于花生品种鉴定的SNP芯片、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及植物品种鉴定的分子标记芯片领域，具体地说，涉及一种用于花生品种鉴定的SNP芯片、制备方法及其应用。
背景技术
花生是我国重要的油料作物之一，对保障我国食用油安全至关重要。种子作为农作物生产的源头，优良品种在提高作物产量和品质中发挥重要作用。开展农作物的品种鉴定是解决当前种子市场品种争议，授予新品种权的重要依据，也是保障我国种业有序竞争的有效手段。
目前，我国花生种子经营主体数量多，存在假冒伪劣种子、套牌侵权经营等问题，种子市场比较混乱，严重影响花生产业发展。花生品种鉴定技术在建立种子管理体系，打击套牌经营，裁决植物新品种保护、知识产权纠纷，维护种子市场秩序中的作用逐步显现。目前，花生品种鉴定技术还没有统一的鉴定程序和相关文件规程。花生品种鉴定技术主要还是通过传统的田间种植，观察一些重要的形态学性状进行判定。而花生具有不同的植物学类型，如珍珠豆型、普通型、多粒型、龙生型等，属于不同植物学类型的品种，农艺性状区分比较明显，但是属于同一植物学类型内的品种则难以区分。在1992年国际植物遗传资源委员会和国际半干旱作物研究所联合出版的《花生的性状描述符》一书，仅提供了30多个形态学性状供花生种质鉴定之用。由此可见，仅根据传统的农艺学性状难以对花生品种进行准确的鉴定。
随着分子标记技术的发展，农作物品种鉴定进入了分子鉴定水平。目前，最成熟的分子标记鉴定方法是SSR检测，在水稻上已经建立了完善的DNA指纹检测技术体系和品种鉴定数据库。但该方法也存在检测通量低、难以实现数据整合共享等缺陷，难以适应今后品种快速鉴定的需要。此外，由于花生基因组同源性高，具有多态性的SSR筛选难度大，覆盖率低且分布不均匀，使得利用SSR标记进行花生品种鉴定存在困难。SNP是基因组上单核苷酸变异所形成的序列多态性，是目前认为在花生品种鉴定上最具研发潜力的检测技术，与SSR标记相比具有高通量、数量多、分布均匀、易实现数据整合比较等优点。
近年来，基于SNP标记的检测技术已成为国内外研究的重点。Illumina、Affymetrix等公司相继推出了不同SNP基因分型高通量检测平台，为自动化、高通量、低成本的SNP芯片检测技术研发提供了良好的技术保障。SNP分子标记检测技术也已被广泛应用于水稻、大豆、菜豆、甜椒等作物的品种鉴定。因此，在花生上建立基于SNP芯片技术的品种鉴定方法，有望提高我国花生品种鉴定技术水平，有效提高优良的花生品种产量。
发明内容
本发明的目的是提供用于花生品种鉴定的SNP芯片及其制备方法。
本发明的另一目的是提供所述用于花生品种鉴定的SNP芯片的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供用于花生品种鉴定的SNP芯片，包含检测725个SNP分子标记的探针，所述SNP分子标记的编号分别为SNP001～SNP725，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:725所示。
本发明还提供用于品种鉴定的SNP芯片的制备方法，包含一下步骤：
(1)对伏花生进行全基因组重测序，获得花生栽培种参考基因组；
(2)对418份花生栽培种进行10X的重测序，与步骤(1)获得的参考基因组进行序列的组装比对，检测全基因组变异，获得832,949个SNP分子标记；
(3)对步骤(2)所获得的832,949个SNP分子标记，利用生物统计软件TASSEL 4.0和Haploview 4.2进行连锁不平衡分析，根据花生全基因组连锁不平衡衰退距离，以衰退距离为窗口，每个窗口筛选2～4个具有标记性的SNP，得到3,700个SNP分子标记；
(4)对步骤(3)得到的3,700个SNP分子标记，根据标记分布特征、多态性、基因分布和位点缺失率等，筛选出725个SNP分子标记；
(5)对步骤(4)筛选出的725个SNP分子标记，设计探针，制作SNP芯片，命名为Peanut725。
本发明还提供所述的SNP芯片在花生品种身份鉴定中的应用。利用所述的SNP芯片来检测待测花生样品基因组DNA，获得725个SNP标记的基因型，通过遗传统计，计算待测花生样品与已知花生样品间的遗传相似度，判断是否为同一品种。
本发明还提供所述的SNP芯片在花生品种真实性鉴定中的应用。利用所述的SNP芯片检测待测花生样品和对照花生样品基因组DNA，分别获得对应的725个SNP标记的基因型，通过遗传统计，计算待测花生样品与对照花生样品间的遗传相似度，判断是否为同一品种。
具体的遗传统计方法如下：将不同花生样品725个SNP标记基因型进行比较，根据公式(1)计算不同花生样品的遗传相似度。若两个花生样品的遗传相似度>99.0％，则两个样品属于同一品种；若两个样品的遗传相似度≤99.0％，则判定两个样品存在显著差异，不属于同一品种。
遗传相似度(GS)＝2Nij/(Ni+Nj)公式(1)
其中，Nij为两个花生样品共有的多态标记条带数，Ni为其中一个样品的差异标记条带数，Nj为另一样品的差异标记条带数。举例说明：假如样品1和样品2比较的总SNP位点数为725个，差异位点数为15个，则这两个样品的遗传相似度GS＝2(725×2-15)/(725×2+725×2)＝98.97％。
本发明的有益效果是：本发明的花生品种鉴定SNP芯片所用标记是通过全基因组重测序开发设计获得，与传统分子标记如SSR标记相比，具有通量高，成本低，数据易整合比较的优点。应用在花生品种鉴定上，可极大提高花生品种鉴定检测的准确率，缩短检测时间，减少人力成本等。
附图说明
图1为Peanut725芯片所有SNP标记在花生基因组上的分布图，每一条短线表示1个SNP位点；
图2为Peanut725芯片SNP标记检测质量效果图，A：Score>0.85，表示可信度高；B：Score<0.2，表示可信度低；C：Peanut725芯片上SNP对265个品种的分型测试Score效果；
图3为Peanut725芯片检测265份花生栽培品种的品种间和品种内遗传相似度分布图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是一下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨的情况下，可以对本发明进行修改和替换。
下述实施例中所实用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 Peanut725芯片的设计及制备。
对伏花生进行全基因组重测序，获得花生栽培种参考基因组，然后对418份花生栽培种进行10X的全基因组重测序，与花生栽培种参考基因组进行序列的组装比对，检测全基因组变异，获得832,949个SNP数据；利用生物统计软件TASSEL4.0和Haploview 4.2进行连锁不平衡分析，以衰退距离为窗口，每个窗口筛选2～4个具有标记性的SNP，得到3,700个SNP分子标记；然后对每个位点根据以下特征进行筛选评估：(1)缺失率≤5％；(2)稀有等位基因频率≤5％；(3)在基因组单拷贝；(4)不在转座子和重复区域；(5)位点上下游100bp以内不存在其他SNP；(6)基因组均匀分布；(7)二等位多态性；(8)重复性在99％以上。最后，综合考虑检测鉴定的基因分型成本，筛选出725个SNP标记，根据Illumina扩展InfiniumiSelectHD定制基因分型要求设计探针，制作芯片。所述725个SNP分子标记如序列表中SEQID NO:1～SEQ ID NO:725所示，Peanut725芯片所有SNP标记在花生基因组上的分布图如图1所示。
实施例2 Peanut725芯片的使用
(1)提取花生基因组DNA
选取265份来自我国南北方花生主栽品种，见表2。取苗期幼嫩叶片，采用BiotekeDP3111植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)按照说明书标准流程，提取花生基因组DNA。
(2)DNA质量检测
利用0.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，取1μL的DNA溶液，均匀混合6X上样缓冲溶液，上样，以1μL的λDNA作为标记。琼脂糖电源显示为单一无明显弥散DNA条带，表示DNA质量较好。进一步，利用使用紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值，OD260/OD280介于1.8-2.0之间，OD260/OD230介于1.8-2.0之间，表明所提DNA纯度合格；DNA浓度要求在50ng/μL以上。
(3)Peanut725芯片检测
将提取的基因组DNA稀释到工作浓度50ng/μL，每个样品取4μL进行上样检测。按照Illumina Infinium基因芯片检测的标准操作流程进行样品的基因分型。利用IlluminaiScan芯片扫描仪对样品进行基因型扫描，获得每个样品的SNP基因型数据。(4)Peanut725芯片结果分析
利用Illumina的GenomeStudio软件，对下机数据进行分析，获得265份品种的基因型，分析每个样品所有的SNP基因型，统计每个SNP位点所有样品的基因型分布，如图2.
表2 265份花生栽培品种
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实施例3 Peanut725芯片在花生品种身份鉴定中的应用
以下将举例说明如何利用实施例1设计制备的SNP芯片来鉴别待测样品是否为某一已知花生样品。首先，以实施例2中的265份花生品种作为指纹图库；其次，待测样品DNA提取、质量检测和芯片检测同实施例2；最后，计算待测样品与指纹图库中每一个样品间的遗传相似度，进行判定。结果显示，待测样品与指纹图库中的“湛油75”遗传相似度最高，达到99.80％。因此，判定该待测样品为“湛油75”。
判定标准是基于实施例2中的265份花生品种检测所述725个SNP基因型，得到265份花生品种各自具备的725个SNP基因型，利用公式(1)统计两两品种之间的遗传相似度(GS)：
遗传相似度(GS)＝2Nij/(Ni+Nj)公式(1)
其中，Nij为两个花生样品共有的多态标记条带数，Ni为其中一个样品的差异标记条带数，Nj为另一样品的差异标记条带数。举例说明：假如样品1和样品2比较的总SNP位点数为725个，差异位点数为15个，则这两个样品的遗传相似度GS＝2(725×2-15)/(725×2+725×2)＝98.97％。
经过上述比较和计算发现，我国目前生产上推广应用的这265份花生主栽品种两两之间的遗传相似度均低于99.0％，如图3。同理，参照实施例2，对“粤油7号”花生品种内50个单株进行725个SNP基因分型，统计该品种内两两单株之间的遗传相似度，结果显示该品种内的遗传相似度均大于99.0％。因此，在花生品种鉴定过程中，将99.0％作为判定标准，即待测样品和对照样品间的遗传相似度>99.0％，则两个样品为同一品种；反之，待测样品和对照样品间的遗传相似度≤99.0％，则两个样品为不同品种。
实施例4 Peanut725芯片在花生品种真实性鉴定中的应用
以下将举例说明如何利用实施例1设计制备的SNP芯片来鉴别待测样品是否为已知对照样品“粤油7号”。从品系圃选取3份不同株系单株叶片，从对照“粤油7号”品种内选取1个单株叶片，共4个样品作为待测样品，随机打乱，分别编号L1、L2、L3和L4。基因组DNA提取、质量检测和芯片检测同实施例2。芯片分型结果显示L1、L2、L3和L4与对照“粤油7号”差异位点数分别为128、7、226和56个，根据遗传相似度计算公式(1)，具体计算方式如实施例3所述，计算的结果显示，三者与对照的遗传相似度GS分别为91.17％、99.51％、84.41％和96.13％。根据实施例3中的判定标准，L2为“粤油7号”，其他三个样品不是对照品种“粤油7号”。成熟后，通过农艺性状表型鉴定，进一步证实L1、L3和L4样品与对照差异明显。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
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Claims (4)

1.用于花生品种鉴定的SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片包括检测探针，所述检测探针由检测725个SNP分子标记的探针组成，所述SNP分子标记的编号分别为SNP001～SNP725，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:725所示。
2.一种如权利要求1所述的SNP芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1） 对伏花生进行全基因组重测序，获得花生栽培种参考基因组；
2） 对418份花生栽培种进行10X的重测序，与步骤1）获得的参考基因组进行序列的组装比对，检测全基因组变异，获得832,949个SNP分子标记；
3） 对步骤2）所获得的832,949个SNP分子标记，根据花生全基因组连锁不平衡衰退距离，以衰退距离为窗口，每个窗口筛选2～4个具有标记性的SNP，得到3,700个SNP分子标记；
4） 对步骤3）得到的3,700个SNP分子标记，根据标记分布特征、多态性、基因分布和位点缺失率，筛选出725个SNP分子标记；
5） 对步骤4）筛选出的725个SNP分子标记，设计探针，制作SNP芯片。
3.一种如权利要求1所述的SNP芯片在花生品种身份鉴定中的应用。
4.一种如权利要求1所述的SNP芯片在花生品种真实性鉴定中的应用。
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