CN115707783A

CN115707783A - 油菜全基因组SNP-Panel开发方法与育种应用

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Publication number: CN115707783A
Application number: CN202110956549.8A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 王博; 李娟娟; 张倩; 彭妍
Original assignee: Wuhan Jinuosaike Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Jinuosaike Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2023-02-21

Abstract

本发明涉及一种应用于油菜分子育种领域的基因检测技术，具体涉及油菜全基因组SNP‑Panel开发方法及育种应用，先提取油菜中DNA，基于油菜全基因组重测序和基于芯片扫描结果分析全基因组覆盖优化精选1010个SNP；再设计1010个SNP标记，每个SNP位点包含两个不同碱基变异位点，并进行组合，构成一个基因Panel；然后使用引物对进行扩增，然后添加测序接头，完成二代测序文库的构建；质控与定量；在illumina测序仪上完成PE150测序获得序列数据；最后通过专门开发的软件“GKPanel”，自动化分析数据，获取所标记的各位点的基因型。利用该技术可实现分子育种领域的基因检测及分析需求，检测覆盖度广，分析速度快，检测成本低，大幅度提高我国油菜育种效率，缩短育种周期，促进农业发展。

Description

油菜全基因组SNP-Panel开发方法与育种应用

技术领域

本发明涉及一种应用于油菜分子育种领域的基因检测技术，具体涉及油菜全基因组SNP-Panel开发方法与育种应用。

背景技术

“主要经济作物分子设计育种”项目是国家重点研发计划“七大农作物育种”重点专项第一批启动项目；分子设计育种技术将实现对农艺性状的精确改良，显示出比其他育种手段更为突出的优越性，是今后作物育种技术发展的方向。油菜全基因组SNP-Panel是高效育种技术体系，能够实现油菜分子设计育种的流程化、信息化，大幅度提高我国油菜育种效率，缩短育种周期，促进农业发展；通过油菜SNP-Panel的技术开发积累，相关技术还可以应用于其他粮食作物、蔬菜、水果、花卉、家畜、鱼类等的分子设计育种；满足不同物种的分子育种需求，加快优质品种的开发时间，满足人民对生活物质“量”和“质”的需求。

目前分子标记辅助育种的技术有SSR/InDel、KASP和基因芯片，SSR/InDel和KASP可用的标记少，单价高，不适合全基因组范围的分子标记辅助育种；基因芯片价格高且核心技术为国外所有，不能大规模应用且不能满足个性化的需求，同时存在技术壁垒，鉴于当前的国际形势，不利于国内育种的安全。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种低价且能满足个性化需求的全基因组水平的分子标记育种技术。

本发明一方面包括油菜全基因组SNP-Panel的开发方法，包括以下步骤：

(1)获取需检测的油菜DNA样品，包括提取干种子、幼嫩茎段、叶片、幼穗老叶、发芽幼苗中的DNA；

(2)基于油菜全基因组重测序数据经生物信息学分析得到65883个SNP；

(3)基于芯片扫描结果分析全基因组SNP得到5374个SNP；

(4)基于步骤(2)、步骤(3)全基因组覆盖优化精选1010个SNP；

(5)设计1010个SNP标记，每个SNP位点包含两个不同碱基变异位点，用于检测该位点的等位基因变化；

(6)将1010个SNP标记进行组合，构成一个基因Panel；

(7)使用引物对进行扩增，然后添加测序接头，完成二代测序文库的构建；

(8)质控与定量；

(9)在illumina测序仪上完成PE150测序获得序列数据；

(10)通过专门开发的软件“GKPanel”，自动化分析数据，获取所标记的各位点的基因型。

基于油菜芯片扫描结果分析全基因组SNP，按每1Mb距离选择1个SNP变异，获得特定SNP标记，根据该SNP标记的特定碱基序列设计可结合特定SNP标记位点的扩增引物对，通过多重PCR、二代测序和生物信息学分析软件“GKPanel”获得所有个体基因型。

该特定SNP标记为本发明所特指的1010个SNP(具体分布见附图)，其均匀覆盖水稻全基因组。

该扩增引物为能够与特定碱基序列的SNP标记位点结合的任意引物对，每一个SNP标记均有一对可成功扩增SNP标记位点序列的扩增引物，以期高程度解读油菜基因组。

该全基因组SNP-Panel可实现10000个样品的同时检测，每个样品一次可检测1000个和1000个以上均匀覆盖油菜全基因组的SNP标记，该SNP标记的数量优选地为1010个。

该生物信息学分析软件“GKPanel”为自主开发的专门软件。

本发明另一方面提供了全基因组SNP-Panel在分子育种中的应用。

本发明所述油菜全基因组SNP-Panel开发、检测及育种应用的方法主要包括以下几个步骤：

(1)提取油菜基因组DNA，包括提取干种子、幼嫩茎段、叶片、幼穗老叶、发芽幼苗中的DNA；

(2)设计能够结合目标位点的扩增引物对，包括从全基因组重测序技术鉴定得到的大量SNP标记中选择本发明所特指的1010个SNP，确定该SNP标记的特定碱基序列，使用Primer3软件设计扩增引物并使用ePCR软件检测引物，最后挑选出能够特异性结合SNP标记位点的引物对；

(3)多重PCR扩增和文库构建，包括将1010个SNP标记进行组合，构成一个基因Panel，扩增目标SNP标记，添加测序接头并完成二代测序文库的构建；

(4)质控与定量，包括采用实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质控和定量，为上机测序做准备；

(5)二代测序上机，包括在illumina测序仪上完成PE150高通量测序获得序列数据；

(6)生物信息分析，包括开发专门的生物信息学分析软件“GKPanel"，自动化分析数据，获取各样品所标记的各位点的基因型，指导客户进行育种选择。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.解决了之前全基因组分子标记成本过高不能使用的问题，同时解决了不能客户不同需求的个性化问题，该产品可以用于种质资源的DNA指纹图谱；遗传相似度分析与杂种优势群的划分；基因/QTL初步定位；GWAS分析；全基因组分子标记辅助育种，解决重要经济性状形成与调控、经济作物对环境的响应机制及优质丰产生理基础等科学问题。

2.油菜全基因组SNP-Panel是高效育种技术体系，能够实现油菜分子设计育种的流程化、信息化，大幅度提高我国油菜育种效率，缩短育种周期，促进农业发展；通过油菜全基因组SNP-Panel的技术开发积累，相关技术还可以应用于其他粮食作物、蔬菜、水果、花卉、家畜、鱼类等的分子设计育种；满足不同物种的分子育种需求，加快优质品种的开发时间，满足人民对生活物质“量”和“质”的需求。

附图说明

图1为本发明油菜全基因组SNP-Panel开发方法与育种应用中1010个SNP在油菜基因组上的分布情况示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的耗材、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一，油菜基因组DNA的提取

1.选取水稻组织，优选幼嫩组织，包括干种子、新鲜叶片、幼穗老叶、幼苗或幼嫩茎段；

2.试剂配制：CTAB缓冲液，包括2％CTAB，1.4M NaCl，lOOmM Tris-HCl，lOmM EDTA，pH＝8.0；洗涤缓冲液，包括76％乙醇，lOmM乙酸铵；TE缓冲液，包括20mM Tris-HCl，lmMEDTA，pH8.O；冰无水乙醇，将无水乙醇预先存放于-20℃，存放时间大于1小时；

3.使用CTAB法提取水稻组织中的DNA：将取自油菜的组织剪碎，并在液氮环境中研磨；加入与组织的量相当的预热CTAB，并迅速置于65℃水浴，水浴30min至lh，每隔5分钟摇动一次，其中，优选水浴1小时；4℃，12000rpm/min离心lOmin后，移出上清并加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀；4℃，12000rpm/min离心15min后，移出上清并加入两倍体积冰无水乙醇，于-20℃放置30min以上，优选为lh；4℃，12000rpm/min离心lOmin后，弃上清，沉淀经洗涤缓冲液洗涤后风干；加入50μL至lOOμL的TE缓冲液，充分溶解；用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计检测浓度和纯度；将检测后的DNA保存于-20℃。

实施例二，特定碱基序列SNP标记的选择、设计和扩增。

1.SNP标记的选择，基于经生物信息学分析的油菜全基因组重测序数据，得到65883个SNP；基于油菜芯片扫描结果分析全基因组SNP，获得5374个SNP；基于已报道的已克隆油菜重要功能基因，和通过按每1Mb距离选择1个SNP变异，获得均匀分布于油菜基因组上的大量SNP标记，所述大量SNP标记的数量为1000或1000以上；

2.SNP标记的设计，基于获得的大量SNP，选择其中1010个SNP标记进行设计(图1)，每个SNP位点包含两个不同碱基变异位点，用于检测该位点的等位基因变化(表1)。

表1包含两个不同碱基变异位点的1010个SNP

3.SNP标记的扩增，经过序列比对、分析和拼接后，将基因组数据转换为数据库文件后，使用Primer3进行扩增引物的批量设计，并使用NCBI-ePCR程序对SNP标记的扩增引物逐一测试，筛选出能够与SNP标记位点特异性结合的引物对，该特异性结合的引物对只能扩增出含有SNP标记的单一条带，且引物对与引物对之间无重复；

随机选择合成10个SNP位点的引物，通过实时荧光定量PCR扩增验证，验证步骤如下：

1)配制PCR反应体系，该体系为20μL体系，包括：2μL上述提取的水稻基因组DNA、2.5mMdNTP混合物、lμL引物对、2μL扩增缓冲液、0.6μLTaqDNA聚合酶、15mMMgC1₂，最后加水，补至终体积20μL；

2)PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃，延伸5min；溶解曲线段；室温保持；

3)根据溶解曲线段Tm值确认引物验证结果。

实施例三，个体基因型的检测和分析。

1.多重PCR扩增，本发明涉及1010个SNP标记的扩增，将1010个SNP标记进行组合，构成一个基因Panel，使用能够特异性扩增该1010个SNP标记位点的引物对，对提取的油菜组织DNA的目标区域进行扩增；将扩增产物酶切后添加接头，回收和纯化后选择片段，最终完成二代测序文库的构建；

2.质控与定量，包括采用凝胶电泳、实时荧光定量PCR和Agilent2100对构建好的文库进行质控和定量，为上机测序做准备；

3.在illumina测序仪上完成PE150测序获得序列数据；

4.使用“GKPanel“生物信息学软件进行分析，其中“GKPanel”为自主开发的软件，包括：内置水稻全基因组标准序列；原始数据中正向数据集和反向数据集分离模块；测序结果比对拼接模块；SNP标记基因分型模块；分析准确率验证模块。

实施例四，油菜全基因组SNP-Panel的育种应用。

由于油菜全基因组SNP-Panel选取了均匀分布于基因组上的1010个SNP标记，因此标记度高，可高程度解读油菜基因组，得到各样品的基因型，从而应用于遗传研究和育种的各个方面，为育种全过程提供支持。

1.在油菜育种过程中鉴定各项指标的表型中的应用。

油菜育种的核心是选择和组合合适的表型，包括但不限千：株高、叶夹角、开花时间、每株分蘖数、含油量、粒色差异、抗病、耐逆。基因型与表型有显著关联，因此通过确定基因型可预侧水稻表型，从而进行水稻的人工选择和培育。

2.在油菜种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用。

种质资源是育种的基础和前提，育种首先要对种质资源有初步认识。油菜全基因组SNP-Panel标记数目多，单次样本检测量大，具有较高的区分度，且可以很方便地对育种资源进行群体目标性状的筛选和鉴定；

油菜全基因组SNP-Panel可标记待改良植株表型，通过与表型有显著关联的基因标记对相关品种进行精确改良，且可实现多个优良性状的聚合。

功能基因鉴定最有效的方法是功能标记，基因功能标记来源于功能基因内部直接引起表型性状变异的多态性基因序列。使用油菜全基因组SNP-Panel对野生型和改良型植株进行标记，比对分析两者差异，从而获得优良植株的育种方法，为育种提供辅助。另一方面，通过油菜全基因组SNP-Panel辅助育种，在苗期即可进行基因型测定，大大缩短育种年限，提高育种选择效率。

3.在油菜分子设计育种中的应用。

使用油菜全基因组SNP-Panel分析优异品质的油菜植株基因，联合抗倒伏、抗菌核病等基因，可用于植株各种性状的设计，以育成更加优质的水稻新品种。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.油菜全基因组SNP-Panel开发方法与育种应用，其特征在于，包括以下步骤：

(3)基于芯片扫描结果分析全基因组SNP得到5374个SNP；

(4)基于步骤(2)、步骤(3)全基因组覆盖优化精选1010个SNP；

(6)将1010个SNP标记进行组合，构成一个基因Panel；

(8)质控与定量；

(9)在illumina测序仪上完成PE150测序获得序列数据；

2.根据权利要求1所述的油菜全基因组SNP-Panel开发方法，其特征在于，步骤(4)所述SNP位点的物理位置是基于油菜品种中双11的全基因组序列比对以及芯片扫描结果确定的。

3.根据权利要求1所述的油菜全基因组SNP-Panel开发方法，其特征在于，步骤(4)所述1010个SNP标记包含产量、品质、抗性等目标性状基因和一套背景选择标记。

4.根据权利要求1所述的油菜全基因组SNP-Panel开发方法，其特征在于，步骤(5)所述1010个SNP位点的物理位置是基于油菜品种Darmor的全基因组序列比对以及芯片扫描结果确定。

5.根据权利要求1所述的油菜全基因组SNP-Panel开发方法，其特征在于，步骤(5)所述1010个SNP标记在染色体上的分布如下：A01染色体40个SNPs；A02染色体40个SNPs；A03染色体46个SNPs；A04染色体36个SNPs；A05染色体43个SNPs；A06染色体42个SNPs；A07染色体36个SNPs；A08染色体34个SNPs；A09染色体53个SNPs；A10染色体19个SNPs；C01染色体65个SNPs；C02染色体76个SNPs；C03染色体92个SNPs；C04染色体81个SNPs；C05染色体58个SNPs；C06染色体49个SNPs；C07染色体73个SNPs；C08染色体52个SNPs；C09染色体75个SNPs。

6.根据权利要求1所述的油菜全基因组SNP-Panel开发方法，其特征在于，步骤(6)所述1010个SNP标记可以依据育种的个性化需求自由组合、选择。

7.根据权利要求1所述的油菜全基因组SNP-Panel开发方法，其特征在于，步骤(6)所述由1010个SNP序列构成的基因Panel为特定碱基序列的SNP标记位点。

8.根据权利要求1所述的油菜全基因组SNP-Panel开发方法，其特征在于，步骤(7)所述引物对为能够与特定碱基序列的SNP标记位点结合的任意一组引物。

9.油菜全基因组SNP-Panel育种应用，其特征在于，可用于以下任一种育种应用或育种应用组合：

(1)在油菜育种过程中鉴定各项指标的表型中的应用；

(2)在油菜种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种、全基因组关联分析、QTL分析、物种进化分析中的应用；

(3)在油菜分子设计育种、标记辅助的主效基因选择、回交育种及其背景选择、分子辅助育种、全基因组育种、种子纯度检测、转基因成份鉴定中的应用。