CN107868839B - 一种分析水稻遗传多样性鉴定品种的snp标记、引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了一种分析水稻遗传多样性鉴定品种的SNP标记、SNP标记在水稻中的位点，获得该SNP标记的引物，及相关应用。该SNP标记通用性好，不需要大型的设备仪器；本发明的SNP标记能精确区分待测品种的基因型以及品种间的遗传差异，遗传距离很近的位点的差异也能区分；在对某个位点的引物设计好后，可以针对这个位点对多个个体进行研究，成本可以得到很好的控制。

Description

一种分析水稻遗传多样性鉴定品种的SNP标记、引物及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种分析水稻遗传多样性鉴定品种的SNP标记及应用。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物，杂交水稻更是以其显著的产量优势为我国乃至世界粮食安全作出了巨大贡献。新品种的推广和使用对保障我国粮食供应、满足人们多元化需求发挥了极其重要的作用。2001-2015年间，全国各地通过省级以上审定的水稻品种就达6310个。有效的区别鉴定这些品种材料，对水稻的品种选育、试验、质量和市场管理以及产权保护具有重要的现实意义。

品种的形态差异和特征特性的不同，本质上是由基因的差异所致。利用DNA分子标记鉴别水稻不同品种基因型的差异，是目前区别品种较为有效、快捷的方法。其中SSR标记具有操作简便快捷、多态性高和稳定性好等特点，能够准确揭示不同品种间同一位点的SSR多态性，并已广泛应用于遗传图谱的构建、遗传多样性分析以及品种纯度与真实性的鉴定。但由于SSR标记与品种的农艺性状关联性较差或缺乏关联性，难以区分近等基因系或功能代换系等，对于此类品种，需要利用相关特征功能基因的SNP标记(功能标记)才能与原品种予以区别。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的***或缺失所致。SNP在生物基因组中广泛分布，发生在编码区位置的SNP称为cSNP(coding regions SNP)，此外在基因的5′、3′端非编码区，以及内含子上都有发生。SNP标记数量较多、分布较广，如在玉米基因组中，SNP标记的平均密度约为1个SNP/57bp；在大豆基因组中，SNP标记的平均密度约为1个SNP/272bp；在水稻基因组中，SNP标记的平均密度约为1个SNP/170bp。因此，有必要利用SNP标记在种内和种间的多态性和通用性，开发一种与水稻农艺形状紧密相关，且能够分析水稻遗传多样性、鉴定品种的功能性SNP标记。

发明内容

本发明提供的一种分析水稻遗传多样性鉴定品种的SNP标记及应用，开发了与水稻农艺形状紧密相关，且能够分析水稻遗传多样性、鉴定品种的功能性SNP标记。

本发明的第一个目的是提供一种分析水稻遗传多样性鉴定品种的SNP标记，所述SNP标记在水稻种的位点如表1所示：

表1不同SNP标记位点、对应的引物序列

本发明的第二个目的是提供一种获得上述分析水稻遗传多样性鉴定品种的SNP标记的引物，获得所述SNP标记对应的的引物序列表1所示。

本发明的第三个目的是提供一种所述的分析水稻遗传多样性鉴定品种的SNP标记在水稻分子标记辅助育种中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种所述的水稻遗传多样性、鉴定品种的SNP标记的引物在水稻分子标记辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种分析水稻遗传多样性鉴定品种的SNP标记及应用，具有以下有益效果：

(1)该SNP标记通用性好，不需要大型的设备仪器；本发明的SNP标记能精确区分待测品种的基因型以及品种间的遗传差异，遗传距离很近的位点的差异也能区分。(2)在对某个位点的引物设计好后，可以针对这个位点对多个个体进行研究，成本可以得到很好的控制。利用本发明的SNP标记对不同种质材料进行指纹图谱鉴定时，通过筛选针对不同种质材料鉴定的特征SNP标记，可以实现利用1个SNP标记对特定种质材料进行鉴定的目的。

附图说明

图1是SNP标记在水稻遗传多样性分析中的应用的聚类分析图；

图2是SNP标记在水稻遗传多样性分析中的CAPs标记扩增及酶切结果；

图2中，M泳道表示50bp Marker；1-4泳道表示样品父本；5-8泳道表示样品母本；9-28泳道表示20株杂交后代；

图3是水稻分子标记辅助选择育种中基于SNP标记的目的基因鉴定电泳图；

图3中，M泳道表示50bpmarker；1-4泳道表示样品父本；5-8泳道表示样品母本；9-28泳道表示20株杂交后代。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1试验材料与方法

征集长江中下游地区主推杂交水稻及亲本样品245份(表2)，其中，常规种/亲本157份，两系杂交种38份，三系杂交种50份。CTAB法提取单株DNA(每品种10个单株)，-20℃保存，作为下一步工作的实验材料。

表2 245份水稻样品

2、水稻功能基因筛选

从决定水稻品种特征的性状和特点出发，选择与水稻主要农艺性状密切相关的已知重要功能基因，具体信息如表3所示。

表3水稻主要农艺性状密切相关的已知重要基因功能

3、功能性SNP标记筛选

3.1、种子发苗：从表1征集的水稻样品中随机选取96个常规种/亲本样品，各取种子若干，28℃发芽一周。

3.2、DNA提取：CTAB法提取DNA。

3.3、PCR扩增反应体系：1×PCR缓冲液，2.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTPs，0.1μmol/L上游引物1、0.1μmol/L上游引物2、0.2μmol/L下游引物，1.0U Taq DNA聚合酶，20ng-40ng样品DNA，总体积10μL。

3.4、PCR反应程序：94℃15min，94℃20s、76℃30s(每循环降落0.6℃)、循环10次，94℃20s、55℃1min、循环26次，72℃5min，30℃保存。在PCR仪上运行变性程序。

3.5、PCR扩增产物电泳检测(非变性聚丙烯酰胺凝胶)：在一定体积的6％非变性聚丙烯酰胺溶液中加入0.5％体积的过硫酸铵溶液和0.1％体积的TEMED，充分混匀后，灌胶。100V恒压，预电泳10-30min。每孔加样1-3μL。200-250V恒压，电泳1-2h，二甲苯氰FF电泳到中部即可。关闭电源，将凝胶从玻璃板上剥离，并及时做记号以区别胶板。将凝胶浸入固定液中，置于摇床上摇动固定5min。用适量ddH₂O进行快速漂洗一次。在新配制的染色液中摇动染色10min。用适量ddH₂O(含0.2％体积的0.1％硫代硫酸钠)快速漂洗，时间不超过10s。在新配制的显影液中摇动直至显出清晰的条带。在固定液中定影5min。在胶片观察灯上直接记录结果或照相。

3.6、毛细管电泳荧光检测

PCR扩增：每样品扩增4个单株，扩增反应体系为：1×PCR缓冲液，2.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTPs，0.1μmol/L上游引物1、0.1μmol/L上游引物2、0.1μmol/L锚定引物1、0.1μmol/L锚定引物2，0.2μmol/L下游引物，1.0U Taq DNA聚合酶，20ng-40ng样品DNA，总体积10μL。反应程序同3.4。

荧光检测：将PCR产物稀释40倍，在96孔板的各孔中分别加1μL稀释后的PCR产物，9.05μL去离子甲酰胺、0.05μL Genescan500-LIZ分子量内标(ABI公司)，4000r/min离心1min，95℃变性5min，于冰上放置10min，于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳分析。预电泳15kV下3min；电进样2kV下10s；电泳15kV下20min。同时，用Data collection软件收集原始数据。电泳完毕，用Genemapper4.0软件对Data Collection软件收集的原始数据进行分析，软件***将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标Genescan500-LIZ进行比较，从而确定不同样品SSR扩增片段的精确长度(单位：bp)。每个样品进行独立的4次重复实验，取4次重复的平均值，并四舍五入作为该样品在此位点扩增片段的大小。

3.7、SNP标记筛选

通过相关网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)，下载整理上述功能基因的SNP位点2687个。结合相关文献，剔除效应为无义突变(Synonymous)、内含子(INNTRON)，5端非翻译区(UTR-5-PRIME)、3端非翻译区(UTR-3-PRIME)等非功能位点，保留非无义突变(Non-Synonymous)、引入起始密码子(introduce initiation codons)、破坏起始密码子(disrupt initiation codons)、引入终止密码子(introduce stop codons)、破坏剪切位点(disrupt splice sites)等，且频率≤0.95的位点，最终获得功能性SNP位点1319个。不同SNP标记位点、对应的引物序列、及农艺性状如发明内容部分的表1所示。表1中，我们分别设计了两个上游引物和一个下游引物，主要作用是，利用引物末端碱基的特异匹配实现SNP分型的检测，具体包括：1、两条上游引物末端碱基不同的等位基因与一条下游引物构成primer mix，两条上游引物的5’端不同。2、模板与primer mix中相匹配的引物结合。3、两个上游引物分别可以用于等位基因特异性的末端序列的互补链合成。4、实现分型差异，从而达到鉴定的目的。我们设计的2条上游引物和1条下游引物，实际结合后扩增的，是相匹配的1条上游引物和下游引物，另外未匹配的上游引物就不存在功能了，其实还是2条引物，由于不同品种与两条上游引物的匹配情况是不一样的，也就是利用我们这个SNP引物设计的特点和创新。表1中每个SNP标记位点对应两个引物，其中序号为1的标记在序列表中引物的编号依次对应SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，序号为2的标记在序列表中引物的编号依次对应SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以此类推，按SNP标记位点顺序对相应的引物进行编号，最终序号为1的标记在序列表中引物的编号依次对应SEQ IDNO.370、SEQ ID NO.371和SEQ ID NO.372。序列表中各序列均为DNA人工序列。本发明SNP标记设计：在SNP位点的上、下游各60bp范围内设计扩增引物，2条上游引物设计要求：长度14-35bp，3’端分别与两种等位基因型互补，其中1条引物倒数第三位碱基由G/C突变为A/T，或由A/T突变为G/C；下游引物设计要求：长度14-25bp，退火温度最适63℃、最小58℃、最大68℃。最后，2条上游引物分别锚定与水稻无任何同源性，长度相差至少4bp的两条引物。本发明应用的锚定引物分别为：M13-1-gtaaaacgacggccagt，M13-2-cgccagggttttcccagtcacgac，锚定引物使两种基因扩增产物长度相差至少4bp，利于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，便于标记荧光标记，利于毛细管电泳检测。

4、功能性SNP标记在水稻遗传多样性分析中的应用

4.1种子发苗：从征集的245份水稻样品中，各取种子若干，28℃发芽一周。

4.2DNA提取：操作步骤同3.2；扩增反应体系：操作步骤同3.3；PCR扩增反应程序：操作步骤同3.4；PCR扩增产物电泳检测：操作步骤同3.5。

4.6SNP标记电泳检测谱带数据记录。

4.7水稻品种聚类分析：根据全部的125个SNP标记在245份材料间均检测到多态性，检测效率达到100％。图1是功能性SNP标记在水稻遗传多样性分析中的应用的聚类分析图；由图1可以看出，聚类分析可以明显地将这245份材料按照遗传距离的远近分成不同类群，群体结构分析表明这245份材料存在明显的群体结构，能精确区分待测品种的基因型以及品种间的遗传差异。

5、功能性SNP标记在水稻分子标记辅助选择育种中的应用

水稻父本：携有决定稻米直链淀粉含量的主效基因(蜡质基因Wx)的GG等位基因型；母本：携有Wx的TT等位基因型。分别利用CAPs标记和功能性SNP标记对双亲及杂交后代进行DNA扩增分析，比较两种比较筛选的后代基因型是否一致，以验证功能性SNP标记的在水稻分子标记辅助选择育种中的应用有效性。

5.1DNA提取：取水稻父本和母本各4株幼嫩叶片及20株杂交后代幼嫩叶片。CTAB法提取DNA，具体操作步骤同3.2。

5.2(1)CAPs标记扩增及酶切：先利用Wx的(GG/TT)位点特异性检测CAPS-AccI标记：上游引物：F:5’-gcttcacttctctgcttgtg-3’，下游引物：R:5’-atgatttaacgagagttgaa-3’。PCR反应体系(25μL)：2.5μL10×PCR buffer，2.0μL MgCl2(25mM)，2.0μL dNTPs(2.0mM)，2μLPrimer-F(10μM)，2μL Primer-R(10μM)，0.2μL Taq酶(5u/μL)，4μL模板DNA，10.3μL ddH₂O。(2)扩增反应程序：95℃5min，94℃40s，55℃40s，72℃60s，35cycles；72℃7min。AccⅠ酶切：10μL PCR扩增产物，1.5μl的10×酶切缓冲液，5U Acc I酶，用无菌ddH₂O将总体积补足至15μL，混匀后在37.0℃保温1-4h。(3)电泳检测：利用2％琼脂糖凝胶电泳检测，GG基因型产生403bp和57bp的片段；TT基因型不能被酶切，只有460bp的条带；杂合GT基因型能被部分酶切，可同时出现460bp和403bp的条带。结果如图2所示。图2中，1-4、10、17、24泳道代表样品为GG基因型产生403bp和57bp的片段；5-8、11、14、15、26、27泳道代表样品为TT基因型不能被酶切，只有460bp的条带；9、12、13、16、18、19、21、22、23、25、28泳道代表样品为杂合GT基因型能被部分酶切，可同时出现460bp和403bp的条带。限制性内切酶酶切法适用于实验室检测比较少量的SNP，但是需要的都是常规的实验试剂，可以较方便快捷的完成检测的工作。根据124个多态性SNP标记信息，应用NTSYS软件计算出245份供试品种之间的遗传距离，并按照UPGMA法绘制了遗传关系聚类图(参见图1)。结果表明，开发的SNP标记有助于分析水稻品种的遗传差异，这些分子标记用于分子辅助育种是当前研究的热点。

5.3SNP标记扩增分析：再利用筛选出Wx的(GG/TT)位点特异性标记SNP-sf0601764762，对上述单株进行扩增分析，反应体系同3.3，反应程序同3.4。上游引物1：F:5'-GTAAAACGACGGCCAGTcaggaagaacatctgcaCgt-3’，上游引物2：F:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACcaggaagaacatctgcaagg-3’，下游引物：R:5'acgagcaatgaaagatgcatgtga3’。电泳检测：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，GG基因型扩增出114bp的片段；TT基因型扩增出121bp的片段；杂合GT型能扩增出114和121bp的两个片段，结果如图3所示。

5.4杂交后代选择对比：利用Caps-AccI标记分析杂交后代Wx的基因型，保留产生403bp和57bp的片段GG基因型的单株；利用SNP-sf0601764762分析上述单株，保留扩增出大片段的单株，从两个标记的扩增结果看，Caps-AccI标记与SNP-sf0601764762扩增亲本及后代的Wx的基因型完全一致，说明的水稻功能性SNP标记完全可用于水稻种品种真实性鉴定。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种SNP标记在分析鉴定水稻农艺性状的应用，其特征在于，所述SNP标记在水稻中的位点及对应的农艺性状如表1所示：

表1不同SNP标记位点、对应的引物序列

2.根据权利要求1所述的SNP标记在分析鉴定水稻农艺性状的应用，其特征在于，获得所述SNP标记的对应引物序列表1所示。

3.根据权利要求1所述的SNP标记在分析鉴定水稻农艺性状的应用，其特征在于，所述SNP标记用于水稻分子标记辅助育种。

4.根据权利要求1所述的SNP标记在分析鉴定水稻农艺性状的应用，其特征在于，扩增SNP标记的引物用于水稻分子标记辅助育种。

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