CN108103235B - 一种苹果砧木抗寒性鉴定的snp分子标记、引物及其应用 - Google Patents
一种苹果砧木抗寒性鉴定的snp分子标记、引物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108103235B CN108103235B CN201810139526.6A CN201810139526A CN108103235B CN 108103235 B CN108103235 B CN 108103235B CN 201810139526 A CN201810139526 A CN 201810139526A CN 108103235 B CN108103235 B CN 108103235B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- apple
- cold resistance
- snp
- primer
- molecular marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、引物及其应用,该分子标记为T↔G颠换类型。依据该分子标记开发了扩增引物及SNP基因芯片,实现了苹果砧木个体抗寒性性状的早期鉴定。本发明这一SNP分子标记和SNP基因芯片可以实现苹果砧木抗寒性的快速、准确的鉴定,降低了苹果砧木杂种苗选育的时间和经济成本。本发明为苹果砧木抗寒分子标记辅助育种提供了标记资源,为利用基因工程手段培育抗寒新种质奠定了基础,具有重要的理论意义和实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP(单核苷酸多态性)分子标记及其引物,还涉及一种SNP基因芯片及快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法,属于作物遗传育种技术领域。
背景技术
由于气候异常导致极端天气频现,对农业生产造成较大影响,其中低温成为制约我国农业生产效益的一个重要环境因子。低温导致的冷害和冻害等非生物胁迫是影响植物生长发育和繁殖的主要限制因素。在植物育种过程中,需要将抗低温胁迫能力作为重要指标,用以评价、衡量新种质生产应用的价值和潜力。传统育种中,针对实生后代多采用生理生化或逆境胁迫下的表型评价,淘汰不符合抗寒育种目标的个体,具有测试条件要求高、处理过程繁杂、准确性差、工作量大、效率低等缺点,对于苹果等多年生木本作物,个体大、不易移动,育种实践中对其抗寒性准确评价难以实现,获得抗性新品种的周期长。
为适应低温胁迫,植物在分子水平上进化形成了相应的机制,诱导胁迫相关基因的表达,进一步调控不同的复杂信号通路,调控下游生理生化变化,如活性氧清除、渗透势调节、生物膜保护等生物学过程来抵御逆境。通过鉴定筛选与抗寒性表型遗传控制位点紧密连锁的分子遗传标记,可以实现通过分子标记方法鉴别实生后代抗寒性的高低,极大提高育种中早期选择的工作效率,缩短育种时间。
目前随着植物基因组测序的发展,基于遗传图谱的数量性状定位研究技术方兴未艾,对于解析和开发关键表型背后的分子标记提供了一条新的研究途径。依据这一策略国内外已鉴定到多个与苹果果实品质、抗病性、矮化性等相关或连锁的分子标记。这些标记中少数开始用于辅助育种阶段,例如欧洲育种计划中,开发出4个抗黑星病标记(3 SSR 和1SCAR),2个抗白粉病标记(1 SSR 和1 SCAR),2个抗火疫病标记(SCAR),利用这些标记从9个杂交组合的1041株后代中筛选出25 株抗病株系,可以作为下一步培育抗病品种的亲本。但目前关于抗非生物逆境(寒冷、干旱、盐、碱等)连锁标记开发还较少,分子辅助选择或分子辅助育种工作还处于相对滞后的阶段。
矮砧集约栽培是当前苹果的主要趋势,优良矮化砧木是实现集约栽培的基础。国外矮砧育种开展较早,如英国利用杂交等技术育成M系、MM 系等矮化砧木,对促进世界苹果栽培变革发挥了重要作用。此外,美国、加拿大、日本、波兰、前苏联等国家利用杂交、实生、诱变等技术,育成 G系、MAC系、O系、JM 系、B系等抗病、抗虫或抗重茬矮化砧木。我国砧木育种开展较晚,育种成果主要为通过常规杂交育成的矮化砧木SH系和GM256。根据当前我国苹果产业发展需求,急需自主选育抗性和适应性强、矮化性好、易繁殖、综合性状优良的矮化砧木。但目前通过常规育种获得新品种周期长,而通过分子辅助技术获得抗逆新品种日益受到重视,其中开发连锁标记是这一工作的前提。
发明内容
针对筛选苹果抗寒性新种周期长的不足,本发明提供了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记,以达到为苹果抗寒性砧木分子辅助育种提供标记的目的。
本发明还提供了扩增该SNP分子标记的PCR引物以及含有该引物的SNP基因芯片,通过该引物和基因芯片,能够快速的筛选出苹果抗寒株系,提高了育种的效率。
本发明还提供了快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法,该方法操作便捷,效率高,耗时短,为苹果抗寒性新种的培育提供了有利的技术支持。
本发明利用抗寒性较强的苹果砧木“60-160”(低温半致死温度-37.42C°)与不抗寒矮化砧木“M9”(低温半致死温度-30.05C°)构建的杂交群体200株系和简化基因组测序(RAD-seq)技术,构建高密度遗传图谱。评价图谱构建群体的梯度降温(0~-40 ℃)条件下枝条相对电导率,求得各株系低温半致死温度(Lethal Temperature,LT50)。利用构建遗传图谱,开展此低温半致死温度的数量性状位点(QTLs)定位,鉴定获得年份间稳定存在、与性状连锁性强的SNP遗传标记。根据株系测序结果,确认该SNP遗传标记为位于苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基,为颠换类型:T↔G。即本发明苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记(简称SNP分子标记,下同)位于苹果参考基因组第4号染色体上,该苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基上存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异。从LT50结果看,当第4519417号碱基处为TT基因型时,株系的LT50表型值低,表示半致死温度更低,抗寒性更强,为GG基因型时,株系的LT50表型值高,表示半致死温度更高,抗寒性更弱,为TG基因型时,半致死温度介于GG基因型和TT基因型之间,抗寒性也介于这两者之间。因此,通过检测该4519417号碱基处的基因型,可以直接从分子层面获得株系的抗寒性能。
进一步的,为了更方便的通过扩增的方式获取第4519417号碱基处的基因型,将该碱基物理位置上下游各50bp碱基的该段碱基序列作为SNP分子标记,该SNP分子标记的碱基序列为:TAACTCTAGGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATTTAATAATTGTGCCT/GTCAGATGAAGCTTAATAAAGCATCTCTTTTCTTGGGCTTCGATGTTTTTA,如SEQ ID NO:1所示,在该碱基序列的第51位碱基处存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异(T/G等位基因),为51T或51G。
进一步,本发明还提供了用于扩增SEQ ID NO:1所示的碱基序列的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物,该引物可用于竞争性等位基因特异性PCR扩增,该引物如下:
T等位基因引物(Primer_Allele):5’AAAGAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAA 3’,如SEQ ID NO:2所示;
G等位基因引物(Primer_Allele):5’GAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAC 3’,如SEQID NO:3所示;
通用引物(Primer_Common):5’GGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATT 3’,如SEQ IDNO:4所示。
进一步的,上述T等位基因引物和G等位基因引物上都带有荧光标记,但这两种引物上带有的荧光标记种类不同。荧光标记可以是现有技术中常用的荧光标记,例如FAM荧光标记、HEX荧光标记。
本发明还提供了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片(简称SNP基因芯片),该SNP基因芯片上固定有上述苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物,引物共三种。利用该SNP基因芯片可以实现苹果砧木抗寒性的快速、准确的鉴定。
本发明的SNP分子标记和SNP基因芯片可以用于苹果育种中,用来筛选抗寒的苹果砧木杂交后代个体。SNP分子标记和SNP基因芯片的使用提供了一种分子辅助育种的新方式,使苹果抗寒性新种的快速筛选成为了可能。本发明SNP分子标记、苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片在苹果育种中的应用也在保护范围之内。
本发明还提供了一种快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法,该方法包括以下步骤:
(1)提取苹果基因组DNA,以该DNA为模板,在苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片上进行竞争性等位基因特异性PCR反应;
(2)PCR扩增结束后,将SNP基因芯片进行分析,根据SNP分子标记的基因型判断苹果砧木抗寒性的高低。
进一步的,竞争性等位基因特异性PCR扩增(KASP扩增)的流程在现有技术中有相关记载,本领域技术人员可以按照现有技术进行操作。在本发明具体实施方式中,所用的KASP扩增反应体系为1微升,包含20纳克模板DNA,0.14微升3种引物(T等位基因引物、G等位基因引物和通用引物)的混合物,0.5微升Master mix(2x)(英国LGC公司),ddH2O补足1微升。KASP扩增程序为:95 °C变性15 min,1个循环;95 °C变性20 s,61 °C 退火60 s,10个循环,退火温度以每循环0.6 °C降温;95 °C变性20 s,55 °C 退火60 s,26个循环。
上述方法中,T等位基因引物作为检测TT基因型的引物,G等位基因引物作为检测GG基因型的引物,这两种引物上分别带有荧光标记。PCR结束后,根据荧光信号强弱判断被检测样本的基因型。
上述方法中,PCR扩增后将芯片进行分析,得到基因型。其中抗寒性高低与基因型关系如下:TT基因型的抗寒性>TG基因型的抗寒性>GG基因型的抗寒性。根据所得的基因型,可以选择所需的新种。
本发明利用抗寒性较强的苹果砧木“60-160”(低温半致死温度-37.42C°)与不抗寒矮化砧木“M9”(低温半致死温度-30.05C°)构建的杂交群体株系和简化基因组测序(RAD-seq)技术,构建高密度遗传图谱。通过对遗传图谱的分析得到了对苹果砧木抗寒性具有显著影响的SNP(单核苷酸多态性)分子标记,依据该分子标记开发了扩增引物及SNP基因芯片,实现了苹果砧木个体抗寒性性状的早期鉴定。本发明这一SNP分子标记和SNP基因芯片可以实现苹果砧木抗寒性的快速、准确的鉴定,降低了苹果砧木杂种苗选育的时间和经济成本。本发明为苹果砧木抗寒分子标记辅助育种提供了标记资源,为利用基因工程手段培育抗寒新种质奠定了基础,具有重要的理论意义和实际应用价值。
附图说明
图1为本发明“60-160×M9”遗传连锁图谱;
图2为本发明试验群体测定的0℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃ 梯度低温下枝条相对电导率以及低温半致死温度表型的群体频率分布图;
图3为本发明“60-160”דM9”群体低温半致死温度(LT50)表型的QTL定位图;
图4为本发明苹果砧木抗寒性连锁SNP标记“hk134”的物理位置及上下游序列图;
图5为本发明“60-160”דM9”群体中不同个体的KASP检测结果图;
图6为本发明采用SNPTyper对KASP反应信号的分型结果转化图;
图7为采用本发明分子标记对试验群体的基因型分型结果的验证图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的说明,以使本领域技术人员能够更清楚、完整的理解本发明的技术方案。下述说明仅为示例性的,并不对其内容进行限定。
实施例1
本发明苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记采用以下方法获得:
1、所用试剂和仪器
采用Plant Genomic DNA Kit(TIANGEN)试剂盒提取试验群体中个体的基因组DNA(gDNA),该试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;酶切用限制性内切酶EcoRⅠ购自美国Sigma-Aldrich公司;酶切样品后处理所需试剂:接头、ATP、连接酶、平末端酶等均购自美国Illumina公司;测序在北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行,测序使用IlluminaHiseq 2500测序平台(美国)。
2、SNP分子标记获取方法
(1)“60-160×M9”遗传连锁图谱构建
以苹果抗寒砧木“60-160”(低温半致死温度-37.42C°)×不抗寒砧木“M9”(低温半致死温度-30.05C°)杂交后代为试材。随机选取200个杂交株系为作图群体。利用植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)进行双亲及株后代的全基因组DNA(gDNA)提取。提取DNA后,测序文库构建操作步骤描述如下:取500ng gDNA样品,利用限制性内切酶EcoRⅠ 进行酶切。样品65℃预热20min,加入2μL 100nM的Illumina P1接头,同时加入1μL100nM的rATP,1μL10×NEB缓冲液,1μL(1000U)的T4DNA连接酶和5μLH2O,常温反应20min。再次65℃加热20min,超声破碎成平均约500bp的片段。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳,回收300-700bp的片段。
用平末端酶处理DNA样品。18℃纯化样品,并利用15U的Klenow exo在DNA的3'末端加上腺嘌呤。再次纯化样品,加入1μM的P2接头,反应温度为18℃。再次纯化,获得50μL纯净的DNA。对纯化后的样品进行浓度测定,并进行PCR扩增。扩增后电泳回收片段,稀释后用于测序。构建好RAD测序文库,利用诺禾致源Illumina Hiseq 2500测序平台进行测序,测序策略采用pair-end双端测序,测序长度为150bp。
RAD测序得到原始数据,去除接头和低质量序列后用来进行标记的开发。利用测序标签将不同单株的测序数据进行区分,然后对于相似的测序序列进行聚类分析。聚类时mismatch设置为5。舍弃序列支持数≤2或者≥100的聚类簇(以保证位点分型准确性和防止拷贝数变异)。杂合位点至少需要有5条序列支持,其中次好碱基的支持序列数3。获得SNP位点后,利用孟德尔遗传规律,通过双亲的位点信息删除没有多态性的位点。选择分型类型为lm×ll,nn×np和hk×hk的位点。
用来构建遗传图谱的标记经过以下条件筛选:缺失该标记的单株少于60株(约为总群体的20%,标记的卡方检验lm×ll,nn×np类型标记符合预期的1:1分离比,hk×hk类型标记符合1:2:1分离,卡方检验的显著性水平p<0.01。
筛选得到的标记利用Jionmap 4.0作图软件进行遗传连锁图谱绘制,分群阈值设置为LOD=6。利用回归算法,分别构建双亲图谱和整合图谱。利用Kosambi’s函数计算遗传距离,分三轮依次增加标记。作图时,删除存在可以连锁的标记和多重组单株,以确保标记在图谱中的顺序更为准确。
连锁群分群时,有15个标记因为不能加入任何一个连锁群而被删除。进一步经过分离比的卡方检验,30个标记因发生偏分离被舍弃。软件绘图中,141个标记因为与所在连锁群的其他标记连锁不够紧密或是位置不稳定而删除。此外,5个单株因为测序量过小使得它们在超过20%的标记位点缺失分型数据而删除。还有13个单株因为存在多重组现象也被剔除。
最终,绘制完成的整合遗传连锁图谱由182个单株、2240个标记(939个lm×ll标记、886个nn×np标记和415个hk×hk标记)组成(见图1)。标记分布于17条连锁群,根据标记对应参考基因组的物理位置,17条连锁群对应于苹果的17条染色体,各连锁群对应的标记数、遗传距离及标记密度等统计量如表1所示。每个连锁群的标记数量从88到205不等。整合图谱总长为1396.7cM,平均密度为每标记0.62cM。
(2)遗传群体低温半致死温度评价与数量性状位点(QTLs)定位
分别于2015年11月下旬和2016年11月下旬进入休眠期后,采集用于作图的“60-160”× “M9”182个株系和2亲本的1 年生枝条用于抗寒性评价。
采集测试株系的1 年生枝条先后用自来水、蒸馏水冲洗干净,用石蜡封闭枝条两端的剪口,每种砧木分6 份,用干净纱布包好放入塑料袋中,置-40℃的冰箱中人工冷冻处理。设-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃ 5 个低温梯度,以0℃为对照。将样品放在低温保存箱中,降至目的温度后,保持12h,再逐步升温至0℃。温度升降速率均为2℃ /h。取出后在4℃下放置8h,以备测定用。测定砧木枝条各处理温度下的相对电导率,以Logistic方程拟合,求拐点温度,即为砧木各株系的低温半致死温度(LT50)。LT50是评价植物抗寒性的一种高效的数量性状指标,砧木各株系测定的0℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃梯度低温下枝条相对电导率以及低温半致死温度表型的群体频率分布图见图2,从图中可以看出,各指标表现出连续变异,说明受多基因遗传控制的数量性状,符合QTL定位要求。
利用遗传连锁图谱和作图群体的LT50表型评价结果,进行QTL定位。利用软件MapQTL6.0,通过区间作图法来检测QTL位点,算法模型釆用混合模型。全基因组范围内QTL位点的显著性阈值为LOD=3.0,p<0.05。位于LOD峰值的标记为与位点紧密连锁的标记。鉴定到共定位于4号连锁群(LG4)43.11—47.75cM的2个QTL:LT2015QTL.2015和LT2016QTL.2016,此2个QTL在2015和2016两年间稳定存在,其LOD峰值标记均为hk134,在2015和2016年,该位点LOD值分别为3.84和4.48,其解释表型变异率分别为19.8%和23.6%(见图3),确认“hk134”为与低温半致死温度紧密连锁的分子标记。
(3)苹果砧木抗寒性连锁SNP标记开发与应用
根据株系测序结果,确认“hk134”连锁SNP标记为位于苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基,SNP为颠换类型:T↔G(见图4),即第4519417号碱基处为T/G等位基因。
依据连锁SNP标记对应的苹果基因组物理位置,下载该标记物理位置上下游各50bp碱基(见图4),作为SNP分子标记,其基因序列如SEQ ID NO:1所示,同时设计了采用竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)反应扩增该SNP分子标记的PCR引物,引物共三种,序列如下:
T等位基因引物(Primer_AlleleFAM):5’AAAGAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAA 3’,如SEQ ID NO:2所示,该引物带有FAM荧光标记;
G等位基因引物(Primer_AlleleHEX):5’GAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAC 3’,如SEQ ID NO:3所示,该引物带有HEX荧光标记;
通用引物(Primer_Common):5’GGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATT 3’,如SEQ IDNO:4所示。
实施例2
为了高效、快速、准确的检测本发明SNP分子标记,可以将其制成SNP基因芯片。该SNP基因芯片上固定有上述扩增SNP分子标记的PCR引物,基因芯片由美国Affymetrix公司制得。提取试验群体的基因组DNA,在SNP基因芯片上进行KASP反应,扩增SNP分子标记,通过SNP分子标记的基因型快速鉴定试验群体的抗寒性能。具体操作如下:
采集182株“60-160”דM9”作图群体株系,采用植物基因组DNA提取试剂盒(PlantGenomic DNA Kit,北京天根公司)提取试验群体基因组DNA,在制作的SNP基因芯片上进行KASP反应。KASP扩增反应体系共1微升,包含20纳克模板DNA,0.14微升3种引物(T等位基因引物、G等位基因引物和通用引物)的混合物,0.5微升Master mix(2x)(英国LGC公司),ddH2O补足1微升。用移液器将配制的反应体系注入基因芯片,密封进出口。将基因芯片置于离心托架上,离心速度3000rpm,离心1min,离心均匀分配到反应孔。而后,将基因芯片放入平板PCR仪(北京博奥晶典生物技术有限公司制造)上进行扩增,运行扩增程序:95 °C变性15 min,1个循环;95 °C变性20 s,61 °C 退火60 s,10个循环,退火温度以每循环0.6 °C降温;95 °C变性20 s,55 °C 退火60 s,26个循环。待PCR扩增程序运行结束后,将基因芯片放入晶芯LuxScan 10K/D 微阵列芯片扫描仪(北京博奥晶典生物技术有限公司制造),进行扫描,生成KASP检测结果图,如图5所示,不同显色表示不同基因型。将采集的荧光信号转换成数字信号,生成基因芯片的原始数据,然后再通过分型软件SNPTyper进行分型,根据分型结果即可判定测试群体中各个株系的抗寒性高低。
图6为采用SNPTyper对KASP反应信号的分型结果转化图,显示为3种分型结果:GG、TT和TG,表示参加试验的182个株系可分为上述3种基因型。确定该标记基因型分型结果所对应的表现型(LT50),对试验群体的基因型分型结果进行验证,如图7所示。图中所示的TT、TG、GG所对应的柱状图为该标记芯片对作图群体分型后各基因型的表型值(LT50)的四分位数分布图,hh、hk、kk所对应的柱状图为通过测序获得该标记位点的基因型分型结果所对应的表型值的四分位数分布图。根据这两种基因型分型方法分型后所对应的表现型结果来看,这两种方法分型结果一致。并且,采用不同分型方法在该遗传标记位点对群体进行基因型分型,均将试验群体分为3个表型显著差异的类群(柱状图上字母a、b、c分别表示在5%水平上差异显著),即高表型值类群、低表型值类群和介于二者之间的中间型类群,其中,TT/hh基因型株系的LT50表型值低,表示半致死温度更低(抗寒性强),GG/kk基因型株系的LT50表型值高,表示半致死温度更高(抗寒性弱),TG/hk介于二者之间。由此可以看出,采用本发明分子标记对试验群体的基因型分型结果与测序分型结果完全一致,同时实现了试验杂交群体抗寒性的快速、准确的鉴定,降低了苹果砧木杂种苗选育的时间和经济成本。本发明分子标记为苹果砧木抗寒分子标记辅助育种提供了标记资源,为利用基因工程手段培育抗寒新种质奠定基础,具有重要的理论意义和实际应用价值。
序列表
<110> 山东省果树研究所
<120> 一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、引物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 苹果(Malus domestica)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(.101)
<220>
<221> mutation
<222> (51)..(.51)
<223> n=t或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
taactctagg gttgcaacca gtgtttgata agatatttaa taattgtgcc ntcagatgaa 60
gcttaataaa gcatctcttt tcttgggctt cgatgttttt a 101
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aaagagatgc tttattaagc ttcatctgaa 30
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gagatgcttt attaagcttc atctgac 27
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gggttgcaac cagtgtttga taagatatt 29
Claims (8)
1.一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记,其特征是:该SNP分子标记位于苹果参考基因组第4号染色体上,该苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基上存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异;其碱基序列如SEQ ID NO:1所示,在该碱基序列的第51位碱基处存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异,为51T或51G。
2.用于扩增权利要求1所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物,其特征是:
T等位基因引物:5’AAAGAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAA 3’;
G等位基因引物:5’GAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAC 3’;
通用引物:5’GGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATT 3’。
3.根据权利要求2所述的PCR引物,其特征是:T等位基因引物和G等位基因引物上均带有荧光标记,这两种引物上的荧光标记不同。
4.一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片,其特征是:所述SNP基因芯片上固定有权利要求2或3所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物。
5.权利要求1所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记在筛选抗寒的苹果砧木杂交后代个体中的应用。
6.权利要求4所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片在筛选抗寒的苹果砧木杂交后代个体中的应用。
7.一种快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法,其特征是包括以下步骤:
(1)提取苹果基因组DNA,以该DNA为模板,在权利要求4所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片上进行竞争性等位基因特异性PCR反应;
(2)PCR扩增结束后,将SNP基因芯片进行分析,根据SNP分子标记的基因型判断苹果砧木抗寒性的高低。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征是:抗寒性高低与基因型关系如下:TT基因型>TG基因型>GG基因型。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810139526.6A CN108103235B (zh) | 2018-02-11 | 2018-02-11 | 一种苹果砧木抗寒性鉴定的snp分子标记、引物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810139526.6A CN108103235B (zh) | 2018-02-11 | 2018-02-11 | 一种苹果砧木抗寒性鉴定的snp分子标记、引物及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108103235A CN108103235A (zh) | 2018-06-01 |
CN108103235B true CN108103235B (zh) | 2021-05-18 |
Family
ID=62205613
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810139526.6A Active CN108103235B (zh) | 2018-02-11 | 2018-02-11 | 一种苹果砧木抗寒性鉴定的snp分子标记、引物及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108103235B (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110055350B (zh) * | 2019-05-28 | 2022-05-27 | 山东省果树研究所 | 一种苹果果实“酯香型”性状鉴定的snp分子标记、引物及其应用 |
CN111739641A (zh) * | 2020-06-23 | 2020-10-02 | 杭州和壹医学检验所有限公司 | 一种胃癌风险预测方法、***、计算机设备及可读存储介质 |
CN111996276B (zh) * | 2020-08-20 | 2021-03-23 | 中国农业大学 | 鉴定寒富苹果杂种后代抗寒性的snp分子标记及其应用 |
CN112322618A (zh) * | 2020-12-02 | 2021-02-05 | 辽宁省果树科学研究所 | 一种分子标记及其在苹果砧木矮化性筛选中的应用 |
CN113549705B (zh) * | 2021-07-01 | 2023-07-25 | 山东大丰园农业有限公司 | 梨砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用 |
CN113957167B (zh) * | 2021-07-19 | 2022-09-27 | 山东大丰园农业有限公司 | 樱桃砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用 |
CN114752696B (zh) * | 2022-02-21 | 2023-03-24 | 中国农业大学 | 一种检测接穗评价砧木优劣的芯片及其制备方法和应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102622634A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-08-01 | 中国农业科学院果树研究所 | 一种苹果种质资源条形码标识的制备方法 |
CN103614373A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-03-05 | 山东省果树研究所 | 苹果MdMYB1基因中与早结果性状相关的突变及其鉴定方法 |
CN103882142A (zh) * | 2014-04-08 | 2014-06-25 | 北京林业大学 | 一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法 |
CN104531718A (zh) * | 2014-12-19 | 2015-04-22 | 山东农业大学 | 苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用 |
WO2015081441A1 (en) * | 2013-12-06 | 2015-06-11 | Suncor Energy Inc. | Methods for increasing resistance of plants to abiotic stresses |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040091900A1 (en) * | 2002-06-21 | 2004-05-13 | Guy Charles L. | Materials and methods for providing plants with increased resistance to environmental stress |
-
2018
- 2018-02-11 CN CN201810139526.6A patent/CN108103235B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102622634A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-08-01 | 中国农业科学院果树研究所 | 一种苹果种质资源条形码标识的制备方法 |
CN103614373A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-03-05 | 山东省果树研究所 | 苹果MdMYB1基因中与早结果性状相关的突变及其鉴定方法 |
WO2015081441A1 (en) * | 2013-12-06 | 2015-06-11 | Suncor Energy Inc. | Methods for increasing resistance of plants to abiotic stresses |
CN103882142A (zh) * | 2014-04-08 | 2014-06-25 | 北京林业大学 | 一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法 |
CN104531718A (zh) * | 2014-12-19 | 2015-04-22 | 山东农业大学 | 苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用 |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
An Overview of Cold Hardiness in Woody Plants: Seeing the Forest Through the Trees;Michael Wisniewski等;《Hort Science》;20030831;第38卷(第5期);第952-959页 * |
Development of SNP-based assays for disease resistance and fruit quality traits in apple (Malus×Domestica Borkh.) and validation in breeding pilot studies;Isabelle O. Baumgartner等;《Tree Genetics & Genomes》;20160405;第12卷(第3期);第1-21页 * |
Genome-wide analysis of antioxidant enzyme gene families involved in drought and low-temperature responses in Apple (Malus domestica);Xing-Liang Li等;《The Journal of Horticultural Science and Biotechnology》;20171009;第93卷(第4期);第1-10页 * |
High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit development;Nicolas Daccord等;《Nature Genetics》;20170605;第49卷(第7期);第1099-1108页 * |
Malus x domestica cultivar Golden Delicious chromosome 4 genomic scaffold, MalDomGD1.0 alternate locus group alt_haplotype2.MalDomGD1.0 Lg4_Scaffold29, whole genome shotgun sequence;Velasco,R.等;《GenBank》;20160622;Accession No: NW_007545551.1 * |
Mapping the sensory perception of apple using descriptive sensory evaluation in a genome wide association study;Beatrice Amyotte等;《PLoS ONE》;20170223;第12卷(第2期);第1-25页 * |
几种苹果矮化砧木的抗寒性研究;殷丽丽等;《青岛农业大学学报(自然科学版)》;20111231;第28卷(第3期);第198-200页 * |
应用Logistic方程确定植物组织低温半致死温度的研究;朱根海等;《南京农业大学学报》;19860930(第3期);第11-16页 * |
抗寒苹果、梨种质资源遗传多样性研究;张冰冰;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20091115(第11期);第D048-16页 * |
苹果分子标记及辅助育种研究进展;常源升等;《园艺学报》;20171231;第44卷(第9期);第1658-1680页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108103235A (zh) | 2018-06-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108103235B (zh) | 一种苹果砧木抗寒性鉴定的snp分子标记、引物及其应用 | |
CN115029451B (zh) | 一种绵羊液相芯片及其应用 | |
AU2021104302A4 (en) | Marker primer combination for molecular identification of quantitative traits of spines of apostichopus japonicus and use thereof | |
CN112289384A (zh) | 一种柑橘全基因组kasp标记库的构建方法及应用 | |
CN117965781A (zh) | 一种花生40K液相SNP芯片“PeanutGBTS40K”及其应用 | |
CN106755413B (zh) | 水稻氮素吸收利用位点qNUE6及其分子标记方法 | |
CN117106967A (zh) | 水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记及其应用 | |
CN110331222B (zh) | 一种棉花育性恢复相关的分子标记及其应用 | |
CN116479163A (zh) | 与松散型花椰菜叶色黄化基因连锁的分子标记及应用 | |
CN113736866B (zh) | 用于检测番茄黄化曲叶病毒病抗性的snp位点组合及其应用 | |
CN113046465B (zh) | 一组与小麦抗寒性显著关联的snp位点及其在遗传育种中的应用 | |
CN115141893A (zh) | 包含7个分子标记的预测猕猴桃果实干物质含量的分子标记组及其应用和试剂盒 | |
CN108060247B (zh) | 一种与陆地棉8号染色体纤维强度相关的单体型 | |
CN111733278A (zh) | 水稻钠钾离子吸收qtl连锁的snp分子标记及其应用 | |
CN113736906B (zh) | 用于检测番茄黄萎病抗性的snp位点组合及其应用 | |
CN116103428B (zh) | 一种与西瓜种子大小相关的dCAPS分子标记及其应用 | |
CN108300797B (zh) | 陆地棉25号染色体与纤维强度相关的单体型 | |
CN108060246B (zh) | 一种与陆地棉7号染色体纤维强度相关的单体型 | |
CN118186137A (zh) | 鉴定菊花光反应周期长短的kasp标记、其开发方法及应用 | |
CN115747370A (zh) | 不结球白菜kasp分子标记及其在种质资源鉴定中的应用 | |
CN117230230A (zh) | 一个鉴定小麦的黑胚病抗性的分子标记及其方法 | |
CN117305500A (zh) | 水稻抗倒伏QTL qPR7.3分子标记及其检测PCR引物和应用 | |
CN118028515A (zh) | 与辣椒果实宽度基因紧密连锁的InDel分子标记、引物、试剂盒和应用 | |
CN113736908A (zh) | 用于检测番茄叶霉病抗性的snp位点组合及其应用 | |
CN116590461A (zh) | 一种鉴定千年桐植株性别的InDel标记、引物及它们的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |