CN116254364A

CN116254364A - 与花生脂肪含量性状相关的snp标记及其应用

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Publication number: CN116254364A
Application number: CN202310177085.XA
Authority: CN
Inventors: 邓丽; 任丽; 李阳; 郭敏杰; 殷君华; 芦振华; 苗建利; 李绍伟; 胡俊平; 谷建中; 王培云; 姚潜; 申卫国; 蔡君玲; 李传强
Original assignee: Kaifeng Academy Of Agriculture And Forestry
Current assignee: Kaifeng Academy Of Agriculture And Forestry
Priority date: 2023-02-28
Filing date: 2023-02-28
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2043-02-28
Also published as: CN116254364B

Abstract

本发明属于植物遗传育种领域，具体涉及与花生脂肪含量性状相关的SNP标记及其应用。本发明利用全基因组关联分析，获得控制脂肪含量相关重要SNP位点，该位点位于花生8号染色体的38378278处（Arahy.08_38378278），该位点多态性表现为该处核苷酸为T或C。当花生基因组序列中Arahy.08_3837827813处基因型为TT时，该花生为高脂肪含量材料，当花生基因组序列中Arahy.08_38378278处基因型为CC时，该花生为低脂肪含量材料。该SNP标记可用于（1）花生分子标记辅助育种；（2）鉴定花生种质资源脂肪含量性状；（3）花生遗传图谱构建。

Description

与花生脂肪含量性状相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于植物遗传育种领域，具体涉及一个与花生脂肪含量性状相关的SNP标记及其应用。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物，花生籽仁中脂肪含量在50％左右，2021年我国花生种植面积达到480.53万公顷，总产1830.78万吨，植物油产能逐渐提高。随着人们消费层次的升级，我国植物油供给存在严重不足，作为全球最大的食用油进口国，提高油料产能和质量，提升关键技术研究，是保障食用油供给安全提供保障的有力举措。

全基因组关联分析是基于连锁不平衡(LD)方法检测自然群体中基因位点及其等位变异，并将等位基因变异与目标性状联系起来分析其基因作用效应的方法，2001年首次用于植物遗传研究(Thornsberry J.M.,et al.2001.Dwarf8 polymorphisms associatewith variation in flowering time.Nat.Genet.28(3),286-289.)。利用全基因组关联分析能够有效获得控制花生品质的显著性位点，发掘脂肪性状关键位点，为高脂肪花生新品种的选育提供技术支撑。

目前有关花生脂肪含量的研究不是很多，位点主要集中在A05、A07、A08、A09、B01、和B09染色体上，Pandey等利用2个RIL群体检测到78个脂肪QTL位点(Pandey,M.K.,etal.2014.Identification of QTL associated with oil content and mapping FAD2genes and their relative contribution to oil quality in peanut(Arachishypogaea L.),BMC Genet.15,133.)，Liu等将控制脂肪合成的基因缩小至A08上的0.8Mb区间(Liu,N.,et al.2020.High-resolution mapping of a major and consensusquantitative trait locus for oil content to a～0.8-Mb region on chromosomeA08 in peanut(Arachis hypogaea L.).Theor.Appl.Genet.133,37-49.)，Sun等利用318份RIL群体发掘qA05.1对脂肪和蛋白有显著的影响(Sun,Z.,et al.2022.QTL mapping ofquality traits in peanut using whole-genome resequencing.Crop J.10(1),177-184)。现有技术研究结果不尽相同，主要是因为脂肪性状是由主效位点和微效位点共同控制，鉴于不同群体材料定位到的结果不同，利用不同群体材料广泛开展脂肪含量性状定位研究至关重要。另外，现有技术的研究多数停留在SNP位点或者物理区间的发掘，并没有针对性状进行有效的验证，将研究结果切实应用于生产是我们亟待解决的重要问题。开发脂肪相关分子标记，开展高脂肪花生品种选育与推广，能有效提高我国花生生产的质量和效益、促进我国花生加工业的发展、缓解我国食用植物油的供需矛盾、增强我国花生的市场竞争能力。

发明内容

本发明提供了一个与花生脂肪含量性状相关的重要SNP

(Single Nucleotide Polymorphism)标记，以提高花生育种效率。

具体的，本发明利用全基因组关联分析，获得控制脂肪含量相关的重要SNP位点，该位点位于花生8号染色体的38378278处(Arahy.08_38378278)，Arahy.08_38378278位点多态性表现为该处核苷酸为T或C。

当花生基因组序列中Arahy.08_38378278处基因型为TT时，该花生为高脂肪含量材料，当花生基因组序列中Arahy.08_38378278处基因型为CC时，该花生为低脂肪含量材料。

上述SNP位点的开发过程如下：

(1)将花生自然群体(大于100份)在多年多点条件下进行种植，考察脂肪含量性状，去除错误值、异常值，利用对照品种矫正肥力差异，采用混合线性模型对脂肪含量性状进行矫正计算BULP值(最佳线性无偏预测值)。

(2)对花生栽培种开选016进行从头测序、组装，对群体中的每份材料进行二代重测序(深度10×)，以开选016为参考基因组并进行多态性变异位点检测，获得基因型数据。质控标准为：SNP位点在样品的缺失率Miss<＝0.2、次等位基因频率Maf>＝0.05。

(3)结合表型数据和基因型数据开展全基因组关联分析，探索花生脂肪含量性状相关的显著性关联的SNP位点。

(4)对显著性SNP位点开展汇总统计分析、表型变异率分析、和连锁Block(区块)分析，锁定SNP位点Arahy.08_38378278。

(5)提取群体中所有材料在该位点的基因型，对显著性位点进行箱线图分型分析，高脂肪含量基因型为TT，低脂肪含量基因型为CC。

另外，可以通过开发用于检测Arahy.08_38378278位点多态性或基因型的产品来进行以下应用：

(1)花生分子标记辅助育种；

(2)鉴定花生种质资源脂肪含量性状；

(3)花生遗传图谱构建。

上述产品包括：

(1)检测Arahy.08_38378278位点多态性或基因型的分子标记；如KASP(竞争性等位基因特异性PCR)标记。

(2)用于检测上述分子标记的引物组合物；

(3)包含上述引物组合物的试剂或者试剂盒；

(4)用于检测上述Arahy.08_38378278位点多态性或基因型的探针；

(5)包含上述探针的芯片。比如根据本发明获得的SNP位点的上下游序列，可以设计一条覆盖目标SNP的液相探针；利用该液相探针可以进一步制备SNP液相芯片。

在本发明的进一步方案中，设计了检测Arahy.08_38378278位点多态性或基因型KASP标记，该KASP标记的引物序列(5’～3’)如下：

primer_X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTAATTAGTGGTGGCTAAAGTTACAC；

primer_Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTAATTAGTGGTGGCTAAAGTTACAT；primer_C：GCTTTTCTTTGTGAAGAGTTACACTTTTTAAG。也可以对上述PCR引物进行标记物标记，标记物为生物领域常用物质，包括但是不限于染料。

利用上述分子标记或引物对花生育种材料进行相关鉴定，可快速筛选高脂肪含量材料，提高育种效率。

具体的，鉴定花生脂肪含量性状的方法，包括：提取花生基因组DNA，利用上述产品检测花生Arahy.08_38378278位点基因型，根据基因型确定花生的脂肪含量性状。在实践应用中，可以利用上述KASP标记的引物对提取的花生基因组DNA进行PCR扩增，测序，获得花生Arahy.08_38378278位点基因型。Arahy.08_38378278处基因型为TT时，该花生为高脂肪材料，Arahy.08_38378278处基因型为CC时，该花生为低脂肪材料。

再者，本发明还提供一种花生育种方法，首先，检测花生基因组Arahy.08_38378278位点的基因型，Arahy.08_38378278处基因型为TT时，该花生为高脂肪含量材料，Arahy.08_38378278处基因型为CC时，该花生为低脂肪含量材料，根据育种目标选择相应基因型的花生材料作为亲本、后代选择、鉴定品种。

本发明的有益效果为：

(1)本发明利用全基因组关联分析发现一个与花生脂肪含量相关的重要SNP位点，关联分析中基因型数据的深度和广度均超越了现有技术，call SNP的个数是最多的。

(2)本发明199份材料均为开选016的衍生材料，本发明先对开选016进行了从头组装，以其为参考基因组进行关联分析，结果更为可靠。

(3)本发明对P值较高、PVE大于8％的显著性SNP位点进行了两方面的验证，挖掘研究材料中独有的优异标记位点。一方面用极端表型材料的基因型探索基因型分布(箱线图)，另一方面对有明显基因分型的显著性位点设计1对KASP引物，用本发明中的材料进行基因型验证。

(4)利用本发明的SNP标记可直接用于花生种质资源进行鉴定，基因型为TT的为高脂肪含量材料，基因型为CC的为低脂肪含量材料。

附图说明

图1为SNP在花生染色体上的密度分布图。图中Chr1、2……20表示染色体1、2……20。

图2为脂肪含量在4个环境中的曼哈顿图和QQ plot图。曼哈顿图中横坐标1、2……20表示染色体，OC为oil content(脂肪含量)，E1、E2、E3和E4分别表示2019年开封、2019年信阳、2020年开封和2021开封四个试验环境。

图3为Arahy.08_38378278的区块连锁图。

图4为Arahy.08_38378278处两种碱基类型之间的表型差异。OC为oil content(脂肪含量)，E1、E2、E3和E4分别表示2019年开封、2019年信阳、2020年开封和2021开封四个试验环境。

图5为Arahy.08_38378278处SNP分型的KASP验证。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

一、试验材料

来源于开封的开农系列花生品种或品系均由开封市农林科学研究院选育，来源于石家庄的冀花系列花生品种均由河北省农林科学院提供，来源于武汉的中花系列花生品种均由中国农科院油料作物研究所提供，K198(AT1-1)从美国乔治亚洲引种而来。

表1 199份花生材料信息

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二、试验方法及结果

1.1表型数据

1.1.1田间试验设计

将199份材料连续三年(2019年、2020年和2021年)在河南开封和河南信阳的试验田进行种植。4个试验环境分别为E1(2019年开封)、E2(2019年信阳)、E3(2020年开封)和E4(2021开封)。采用随机区组排列试验设计，每个材料种植小区面积13.34m²(6.67m×2m)，穴距20cm，行距40cm，3次重复，每个重复均设置对照品种。试验田肥力中等，排水灌溉方便，地势平坦，沙壤土。在花生生长期间，及时进行了田间管理和收获。

1.1.2农艺性状调查及品质测定

收获晒干后，利用德国近红外分析仪Perton DA7250进行品质检测，考察199份材料的脂肪含量(oil content,OC)性状。

1.1.3表型数据处理

利用Microsoft Excel 2010整理、计算表型数据，删除错误值和异常值，确保表型数据符合正态分布。利用Genstat 18th Edition软件的混合线性模型计算各性状的blup值作为每个环境3个重复的矫正值。

1.2基因型数据

利用植物基因组DNA试剂盒从苗期嫩叶中提取基因组DNA。用琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop评估DNA完整性、质量和浓度。

(一)、参考基因组开选016测序组装：

方法：

(1)、三代技术：利用PacBioSequel II平台进行三代测序，要求测序深度不低于100×。

(2)、二代Illumina数据：利用Illumina nova-seq PE150平台进行二代测序，要求测序深度不低于100×，Q20≥90％，Q30≥85％。

(3)、Hi-C数据：根据物种信息选择四碱基酶或者六碱基酶构建Hi-C文库，要求测序深度不低于100×，Q20≥85％，Q30≥80％。

(4)、转录组数据：利用Illumina nova-seq PE150平台完成开选016的二代转录组测序，用于基因组辅助注释，要求数据量不低于6G/样本，Q20≥85％，Q30≥80％。

测序组装结果：

(1)、开选016三代测序量297.92G，深度为109.77×，结合二代测序共549.80G测序数据。

(2)、采用kmer17软件进行survey分析：基因组大小为2,703.87Mbp，修正后为2,686.33Mbp，杂合率为0.13％，重复序列比例为84.15％。

(3)、对花生基因组进行测序denovo组装，组装结果如下：contig总长2.53Gbp，contig N50长度达到11.48Mbp；scaffold总长2.53Gbp，scaffold N50长度达到11.48Mbp。

(4)、利用Hi-C数据挂载染色体得到染色体水平基因组。

(5)、对组装质量进行一致性评估、序列完整性评估、EST序列评估、RNA序列评估、CEGMA评估和BUSCO评估。

全部小片段reads比对到基因组的比对率约为99.65％，覆盖率约为99.80％，说明reads和组装得到的基因组有很好的一致性；1614个直系同源单拷贝基因组装出来了99.2％的完整单拷贝基因，说明组装结果较完整；248个CEGs(Core Eukaryotic Genes)组装出来了241个基因，比例为97.18％，说明组装结果较完整。

(二)、199份材料基因型数据处理

采用Illumina二代测序平台对199份材料进行深度为10×的重测序，对测序数据进行质控，保留高质量SNP，质控标准为：SNP位点在样品的缺失率Miss<＝0.2、次等位基因频率Maf>＝0.05。以花生栽培种开选016(完成denovo组装)为参考基因组进行call SNP，共得到631,988个SNPs，染色体上SNP的平均密度为251.71/M。如图1所示。

1.3全基因组关联分析

1.3.1显著性位点检测

全基因组关联分析使用GEMMA0.94.1版(全基因组高效混合模型关联)软件包进行关联分析，采用分析模型为y＝Xα+Sβ+Kμ+e。其中y对应于表型，X对应于基因型，S对应于结构矩阵，K是相对亲缘关系矩阵。Xα和Sβ表示固定效应，Kμ和e表示随机效应。本实施例利用Bonferroni检验设置全基因组关联分析的阈值为-log10(0.05/631988)＝7.10，获得脂肪含量性状的曼哈顿图和QQplot图，如图2所示。

1.3.2SNP位点汇总统计及表型变异解释率分析

对关联分析结果中显著性SNP位点进行汇总统计(表2)，4个环境中分别检测到17、24、24和8个SNP位点，主要集中在chr08上，共鉴定出72个非冗余关联位点，1个重复性位点即Arahy.08_38378278，对其进行表型变异解释率分析，该位点在不同环境下的最高phenotypicvariationexplained(PVE)为12.86％。

表2脂肪含量在四个环境中显著SNP的数量

1.3.3SNP位点Block分析

在Arahy.08_38378278上下游各115kb区域(群体材料半衰期为115kb)使用LDBlockShow 1.40软件进行LD单倍型块图分析，结果显示，该SNP位点处于深红色三角形区块内，它与其附近的SNP处于高度连锁不平衡状态，形成单倍型，如图3所示，排除了显著性位点的假阳性，可靠性高。

1.4关联位点验证

1.4.1箱线图验证

利用R语言中的box plot包对P值较高、PVE大于8％的显著性位点进行箱线图验证。对SNP两种碱基类型之间的表型差异制作箱线图。各选择Oil≥50％，Oil≤49％的40个极端表型制作箱线图。在Arahy.08_38378278位点，高脂肪基因型为TT，低脂肪基因型为CC，如图4所示。

1.4.2基因型验证，分子标记开发

本实施例提取Arahy.08_38378278位点在参考基因组(开选016)中的前后各200bp的序列，利用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术，设计KASP标记，在199份材料群体中进行扩增、测序、检测。

KASP标记的引物序列(5’～3’)如下：

primer_X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTAATTAGTGGTGGCTAAAGTTACAC；

primer_Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTAATTAGTGGTGGCTAAAGTTACAT；

primer_C：GCTTTTCTTTGTGAAGAGTTACACTTTTTAAG；

竞争性等位基因特异性PCR反应体系如下表(表中2×KASP Master Mix为LGC(Laboratory of the Government Chemist)公司产品)：

表3竞争性等位基因特异性PCR反应体系

PCR的反应程序为：

a)94℃、15min；b)94℃、20s，61℃、60s，以0.6℃/循环的速度降温，10次循环；c)94℃、20s，55℃、60s，26次循环；d)94℃、20s，57℃、60s，3次循环。

结果显示，Arahy.08_38378278具有独特的基因分型，如图5所示，TT聚在了一起，CC聚在了一起，该KASP标记可以将具有不同基因型的材料分开，开发的标记是可靠的。

参考基因组开选016(低脂肪材料)中Arahy.08_38378278位置处基因型为CC，其为低脂肪含量材料，该材料Arahy.08_38378278位置处附近的碱基序列(5’～3’)如下：

TATACATCTTACAAAAAAGTGTTATATAAATTTGATATGCTAGTAATAAATTTTTTGCTGTTTTTTATTTTATATATATAGTTGTTACGAGCAGAACACTACTTTTGTTATGAAGCAGCTGATACAATATTGGAAGCATTTTAGGTAAGCCAAGTCTTTGGTGGCTATGTCTATGGTAATTAGTGGTGGCTAAAGTTACACTTTTAACTTAAAAAGTGTAACTCTTCACAAAGAAAAGCGTCATCTAATGGAAAAAAGTAAATTAGAATATTTAAGAGAAGAAATAATTAAGTTATCAAAATTAATAGATCAAAAATTAATGATTTTAACTAATGTTAACTGTAATGACACCGAATTCTTAAAATCAATACAAAATAATTTTTCTCAAAATCTTTATTTTA，划线的碱基C即为开选016的Arahy.08_38378278位点。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims

1.与花生脂肪含量性状相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点位于花生8号染色体的38378278处，花生8号染色体的38378278处多态性表现为该处核苷酸为T或C。

2.根据权利要求1所述的与花生脂肪含量性状相关的SNP位点，其特征在于，

当花生8号染色体的38378278处基因型为TT时，该花生为高脂肪含量材料，当花生8号染色体的38378278处基因型为CC时，该花生为低脂肪含量材料。

3.用于检测花生8号染色体的38378278处多态性或基因型的产品，其特征在于，所述产品包括：

（1）检测花生8号染色体的38378278处多态性或基因型的分子标记；

（2）用于检测（1）中所述分子标记的引物组合物；

（3）包含（2）中所述引物组合物的试剂或者试剂盒；

（4）用于检测花生8号染色体的38378278处多态性或基因型的探针；

（5）包含（4）中所述探针的芯片。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述分子标记为KASP标记，所述KASP标记的引物组合物包括：

primer_X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTAATTAGTGGTGGCTAAAGT

TACAC-3’；

primer_Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTAATTAGTGGTGGCTAAAG

TTACAT-3’；

primer_C：5’-GCTTTTCTTTGTGAAGAGTTACACTTTTTAAG-3’。

5.权利要求3的用于检测花生8号染色体的38378278处多态性或基因型的产品在以下任意一项中的应用：

花生分子标记辅助育种；

鉴定花生种质资源脂肪含量性状；

（3）花生遗传图谱构建。

6.鉴定花生脂肪含量性状的方法，其特征在于，包括：提取花生基因组DNA，利用权利要求3的产品检测花生8号染色体的38378278处基因型，根据基因型确定花生的脂肪含量性状；花生8号染色体的38378278处基因型为TT时，该花生为高脂肪含量材料，花生8号染色体的38378278处基因型为CC时，该花生为低脂肪含量材料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用权利要求4中所述的KASP 标记的引物组合物对提取的花生基因组DNA进行PCR扩增，测序，获得花生8号染色体的38378278处基因型。

8.一种花生育种方法，其特征在于，包括：

检测花生8号染色体的38378278处基因型，花生8号染色体的38378278处基因型为TT时，该花生为高脂肪材料，花生8号染色体的38378278处基因型为CC时，该花生为低脂肪材料；

根据育种目标选择相应基因型的花生材料作为亲本、选择后代、鉴定品种。