CN114271372B - 一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法，将植物硒蛋白加入氢氧化钠稀溶液预处理，再用活性炭对预处理蛋白进行吸附、脱色，之后利用碳二亚胺法活化透明质酸，将预处理蛋白和活化的透明质酸共混反应，经过精制得到以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品。本发明工艺简单，通过对植物硒蛋白进行初步水解，植物硒蛋白暴露更多的氨基、羧基残基，更利于后期进行修饰。另外通过活性炭吸附脱色，降低了例如平菇蛋白的异味及蛋白水解产生的色素，使最终产物的颜色感官舒适。本发明制备的以透明质酸为载体的硒植物蛋白，因透明质酸的靶向作用使得小分子植物硒蛋白更容易富集于炎症、肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明属于功能食品领域，具体是一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法。
背景技术
透明质酸是一种天然的糖胺聚糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖的双糖单元反复交替连接而成，在细胞迁移、增殖、分化、黏附和基因表达等方面发挥着重要作用。透明质酸相对分子量分布较广泛(1～1x104)，小分子量透明质酸已被证明可诱导引发受体介导的细胞内信号。人体内有多种透明质酸受体，如CD44受体、透明质酸介导能动性受体、透明质酸内吞受体、***内皮细胞透明质酸受体等，其中CD44是涉及透明质酸最重要的一个受体，也是目前研究最为广泛、深入的。近年研究表明，CD44标准体(CD44S)及其拼接变异体(CD44V)在肿瘤的发生、发展中起到重要作用，与肿瘤的生长、炎症的发展密切相关，多种抗肿瘤和减少细胞损伤的药物、食物围绕透明质酸为载体进行开发。
硒是人体正常生理活动所必需的一种微量元素，参与机体重要的生理生化活动。硒在生物体内主要通过形成硒半胱氨酸的形式整合在各种硒蛋白的活性位点上，主要的有谷胱甘肽过氧化物酶，硫氧还蛋白还原酶，碘化酪氨酸脱氢酶等。以谷胱甘肽过氧化物酶为例，该酶可以还原机体代谢过程不断产生自由基，使机体内自由基水平维持动态平衡位于一种正常的无害水平。当机体内的硒含量较低时，造成机体对自由基的清除速度减慢，这些都会造成体内自由基水平过高，进而对机体组织细胞造成损伤，最终引发疾病的产生。该机制也是硒对某些类型肿瘤、炎症、心血管等疾病具有防护作用的重要理论依据。
现有技术下生产的硒产品，基本思路是采用天然农作物吸收无机硒再转化为有机硒，有的产品进一步提取农作物的蛋白，从而获得纯度较高的富硒植物蛋白。此类技术缺陷很多，例如富硒大米，硒含量总体较低。现有技术广泛采用的蘑菇富硒技术，其提取的蘑菇蛋白硒含量虽然较高，但蘑菇蛋白本身的难闻异味，使得其在食品添加领域应用受限，往往需要添加较多的酸味辅料掩盖蘑菇蛋白的异味。
现有技术生产的硒产品由于缺乏靶向作用，经人服用后硒广泛分布于人体组织中，并不能很好的富集于人体受损的部位，因此需要长期、大剂量的服用，而过多的硒摄入对人体存在潜在的副作用。现有技术也在积极探索具有靶向功能的载体***来解决此类问题，在食品医药领域，透明质酸载体研究较多。
现有的技术方案鲜有报道采用预处理植物蛋白的方式来增强蛋白的可修饰性，本发明创造性的对几类易于修饰的植物蛋白进行初步水解处理，使其暴露更多活性基团，大大增强了植物蛋白的可修饰性，给开发以透明质酸为载体的硒产品设计提供了思路。
专利CN 111840315 A公布了一种纳米硒材料、制备方法及使用方法。其特征在于纳米硒材料在使用前加入交联剂，与透明质酸反应形成三维网络结构，包覆还原形成的纳米硒，而且能与氨基葡萄糖反应，当交联的透明质酸逐渐降解，其包覆的纳米硒逐步释放出来，延长纳米硒发挥作用的时间，减少一次性加入纳米硒的短暂高浓度导致的对人体的伤害。该方法采用的硒源为***钠，***钠虽然可以用于食品添加，但其较高的毒性，早已被市场淘汰，此外该技术方案和本发明想要制备的植物硒蛋白作为附载物的技术方案有本质区别。
专利CN 109833329 A公布了一种透明质酸-多孔纳米硒复合物及其制备方法与应用，该制备方法步骤繁琐，且反应过程中使用了较多的有毒、强腐蚀性溶剂，步骤繁琐，环保性较差，工艺不适用于功能食品生产。
发明内容
为了克服上述背景技术中现有技术以透明质酸为载体的硒产品存在的问题，同时开发一种可以安全食用、无异味、既保留植物硒蛋白安全可靠的特性还能附带靶向功能的硒产品，本发明采用的工艺简单，条件温和，所有原料来源廉价易得，可以大批量制备。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法，先将含植物硒蛋白加入氢氧化钠稀溶液制备预处理，再用活性炭对预处理蛋白进行吸附、脱色，之后利用碳二亚胺法活化透明质酸，最后将预处理蛋白和活化的透明质酸共混反应，经过精制得到以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品。
本发明进一步的改进在于，包含如下步骤：(1)将植物硒蛋白加入质量浓度0.5％-10％NaOH溶液于40-80℃下共热20分钟-3小时。反应完毕后，调节PH至7，过滤洗涤得到预处理蛋白。植物硒蛋白和氢氧化钠溶液的质量比为1∶25-1∶300。(2)将(1)中获得的预处理蛋白加入纯化水中，用酸调节PH至5，升温至70℃-100℃后加入活性炭搅拌3小时，过滤，调节PH至7，浓缩过滤，用纯化水洗涤滤物3次。(3)将透明质酸溶于水中，于室温下加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用酸调节PH至5，保持室温1-3小时，之后加入步骤(2)处理的植物蛋白，室温下反应12-72小时，之后升温至70摄氏度反应5小时后降温，进行透析、冷冻干燥得产品。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(1)所使用的植物硒蛋白为富硒平菇蛋白、富硒山药蛋白、富硒无花果蛋白，植物蛋白的分子量为20kDa-80kDa，优选的采用富硒平菇蛋白。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(1)所使用的植物硒蛋白若为富硒山药蛋白，则可以省略步骤(2)。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(2)调节PH的酸为醋酸、柠檬酸、酒石酸、草酸，优选的采用质量浓度10％的柠檬酸。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(3)中透明质酸溶液质量浓度为1％-3％，透明质酸的分子量为5kDa-100Kda。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入的质量为透明质酸质量的5％-35％，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比为1∶1-1∶1.3。
本发明的有益效果：
(1)本发明制备的预处理植物硒蛋白，通过对植物硒蛋白进行初步水解，植物硒蛋白暴露更多的氨基、羧基残基，相较之前高分子量的蛋白，更利于后期进行修饰。(2)本发明制备的预处理植物硒蛋白，通过活性炭吸附脱色，降低了例如平菇蛋白的异味及蛋白水解产生的色素，使最终产物的颜色感官舒适。(3)本发明制备的以透明质酸为载体的硒植物蛋白，因透明质酸的靶向作用使得小分子植物硒蛋白更容易富集于具有CD44靶体的炎症、肿瘤细胞，增强了靶向作用。(4)本发明通过对透明质酸修饰有机溶剂易溶解的蛋白质基团，增大了透明质酸在有机溶剂中的溶解度，提供了一种表征思路。
附图说明
图1是实施例1制备的预处理植物硒蛋白的1H-NMR谱图，所用溶剂为CDCl3，a为氘代氯仿溶剂峰，b为蛋白氨基残基特征峰。
图2是实施例1制备的预处理植物硒蛋白经过氘水处理后的1H-NMR谱图，所用溶剂为CDCl3，a为氘代氯仿溶剂峰。
图3是实施例2制备的基于透明质酸为载体的植物硒蛋白产品1H-NMR谱图，所用溶剂为CDCl3，a为氘代氯仿溶剂峰。
图4是实施例3中制备的基于透明质酸为载体的植物硒蛋白产品的靶向性试验。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将通过实施例对本发明做进一步的描述，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他等效的替代方案，都应当都属于本发明保护的范围。
一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品的制备方法及应用，先将含硒植物蛋白加入氢氧化钠稀溶液制备预处理植物蛋白，再用活性炭对预处理蛋白进行吸附、脱色，之后利用碳二亚胺法活化透明质酸，最后将预处理蛋白和活化的透明质酸共混反应，经过精制得到以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品。
以下为具体实施例，无特殊说明的原料均为市场常规采购的原材料。
实施例1，预处理硒植物蛋白的制备：
称取分子量为70kDa的富硒平菇蛋白5克，加入质量浓度0.5％的NaOH溶液125克，于50℃下搅拌共热30分钟。之后加入1mol/L稀盐酸溶液，调节PH至7，减压蒸馏至出现固体析出后，冰水中冷却，并过滤得到灰色的预处理蛋白3.9克。
将上述获得的预处理蛋白加入纯化水中，用质量浓度10％的柠檬酸调节PH至5，再升温至70℃，加入椰壳制备的活性炭搅拌3小时后，过滤掉活性炭，用氢氧化钠溶液调节PH至7，浓缩过滤，用纯化水洗涤滤物，至洗脱液近乎无色后，停止洗涤，将预处理蛋白热风干燥烘干，得到初步纯化后的预处理蛋白3.2克。
取上述经过初步纯化后的蛋白于核磁管中，加入氘代氯仿超声至溶解，进行表征。图1显示，a为氘代氯仿溶剂峰，经过初步水解纯化后，蛋白质氨基酸残基暴露较多，其关键的活性位点伯氨基位于b处。之后加入氘水，再次进行表征，可以看到位于低场的活泼氢几乎被置换，高场的伯氨基残基也被置换。
实施例2，以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品的制备：
将分子量为90kDa的透明质酸溶于纯化水中，配置成质量浓度2％的透明质酸溶液，取前述溶液200克，室温下按照摩尔比1∶1.05加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐共1克，用1mol/L稀盐酸调节PH至5，保持室温2小时，之后加入实施例1最终处理的平菇蛋白，室温下反应72小时，之后升温至70摄氏度反应5小时后降温。截留分子量100kDa以上进行透析，水洗，并将截留物冷冻干燥，得产物2.1克。
取上述透明质酸为载体的植物硒蛋白于核磁管中，加入氘代氯仿，适当升温并超声至溶解，进行表征。图3显示，a为氘代氯仿溶剂峰，化学位于位于高场的氨基基本反应完毕。
实施例3，基于透明质酸为载体的植物硒蛋白产品的靶向性试验：
取小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，活化后以104密度孵育培养皿中24小时，接着加入异硫氰酸荧光素标记的蛋白，每间1小时取样，PBS缓冲液处理后，以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，再次PBS处理后，于共聚激光显微镜下观察。图4可以看见，空白组经过4小时后未观察到蛋白进入细胞内部，而经过本发明制备的透明质酸负载植物蛋白可以快速进入细胞内部，显示了良好的靶向性。a为未修饰蛋白组，b为透明质酸修饰组。
本发明经过预处理平菇硒蛋白，使得蛋白的可修饰性大幅增强，此外，有臭味的平菇硒蛋白经过预处理之后，臭味大大减少，使得廉价的平菇蛋白有更高的经济价值。预处理蛋白经过透明质酸修饰后，水溶性增强，更易被吸收，且具有靶向性，更易富集于病变、炎症细胞部位。
Claims (5)
1.一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将植物硒蛋白加入氢氧化钠溶液共热，调节pH至7，过滤洗涤得到预处理蛋白，将获得的预处理蛋白加入纯化水中，用酸调节pH至5，升温至70℃-100℃后加入活性炭搅拌3小时，过滤，调节pH至7，浓缩过滤，用纯化水洗涤滤物，将透明质酸溶于水中，室温下加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用盐酸调节pH至5，保持室温1-3小时，之后加入处理的植物蛋白，室温下反应12-72小时，之后升温至70℃反应5小时后降温，进行透析、冷冻干燥得产品。
2.根据权利要求1所述的一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法，其特征在于：所述植物硒蛋白为富硒平菇蛋白、富硒山药蛋白、富硒无花果蛋白，所述活性炭为椰壳活性炭。
3.根据权利要求1所述的一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法，其特征在于：所述植物硒蛋白与氢氧化钠稀溶液反应，氢氧化钠浓度为质量浓度0.5％-10％，反应温度为40-80℃，反应时间为20分钟-3小时，植物硒蛋白和氢氧化钠溶液的质量比为1∶25-1∶300。
4.根据权利要求1所述的一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法，其特征在于：所述植物硒蛋白的分子量为20kDa-80kDa，透明质酸的分子量为5kDa-100kDa。
5.根据权利要求1所述的一种以透明质酸为载体的植物硒蛋白产品制备方法，其特征在于：所述透明质酸溶液质量浓度为1％-3％，所述N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量比为1∶1-1∶1.3，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入的质量为透明质酸质量的5％-35％。
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