CN109833329A - 一种透明质酸-多孔纳米硒复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米材料技术领域，公开了一种透明质酸‑多孔纳米硒复合物及其制备方法与应用。具体为将多孔纳米硒水溶液与EDC和NHS混合后进行活化，然后将活化后的多孔纳米硒水溶液与HA混合反应，得到透明质酸‑多孔纳米硒复合物水溶液。本发明所得超大比表面积多孔结构的纳米硒可消除活性氧抑制炎症氧化损伤，相比于传统的纳米硒，具有对活性氧更高的亲和力和反应活性，增强活性氧与纳米硒的电子亲和力和传导效率。并且通过HA的修饰，提高了多孔硒对炎症巨噬细胞的靶向性，能够增加细胞的药物摄取量，从而保证细胞内药物维持在较高水平。增强了多孔硒消除炎症细胞内和体内活性氧的活性，为硒类抗氧化剂的功能化修饰提供了思路。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，特别涉及一种透明质酸-多孔纳米硒复合物及其制备方法与应用。
背景技术
炎症作为典型的病理特征，存在于诸多疾病中，例如细菌感染，癌症以及动脉粥硬化等。尤其在败血症中，全身炎症会引发多种器官衰竭从而导致急性死亡的危险。研究发现在炎症微环境中浸润着大量活化的巨噬细胞，从而产生过量的活性氧，引起细胞外毒性。活性氧主要包括超氧阴离子(.O2-)，羟基自由基(.OH)和过氧化氢(H2O2)，过量的活性氧往往会破坏正常细胞的核酸，脂质体和蛋白质，导致严重的损伤。因此开发高效的抗氧化剂抑制炎症损伤成为败血症治疗过程中及临床手术中的迫切需要。硒是天然的抗氧化剂，硒在体内可以通过提高含硒还原酶的活性对抗自由基的氧化损伤。并且近年来随着纳米技术的发展，纳米材料的独特结构和理化性质促进了纳米硒在诸多疾病的研究和应用。有研究发现硒纳米粒子具有消除羟基自由基的活性，但是由于纳米硒的低反应活性，其活性氧消除效率只有22％。因此，为了进一步提升纳米硒消除活性氧的能力，需要开发一种新型靶向性高反应活性的纳米硒。
此外，对巨噬细胞低靶向性是纳米硒活性氧消除效率低的另一个重要原因。透明质酸是特异性结合细胞表面分子CD44的分子，而且CD44在巨噬细胞是一种高表达的蛋白分子，因此通过在纳米硒表面修饰透明质酸分子是增强其靶向性的有效策略。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法。
本发明另一目的在于提供上述方法制备的透明质酸-多孔纳米硒复合物。
本发明再一目的在于提供上述透明质酸-多孔纳米硒复合物在制备治疗败血症药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，包括以下步骤：
将多孔纳米硒水溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合后进行活化，然后将活化后的多孔纳米硒水溶液与透明质酸(HA)混合反应，得到透明质酸-多孔纳米硒复合物(MSe-HA)水溶液。
所述多孔纳米硒水溶液中多孔纳米硒的浓度为0.1～10mg/mL；优选为2mg/mL。
所述多孔纳米硒、EDC和NHS的摩尔比为1：0.1：0.1～1：20：20；优选为1：1：1～1：2：2。
所述活化的时间为0.5～10h；优选为3～5h；更优选为4h。
所述多孔纳米硒和透明质酸的质量比为1：1～1：10；优选为1：3～1：5。
所述透明质酸的分子量为10KD～50KD。
所述混合反应的条件为在室温下搅拌反应6～18h；混合反应时间优选为8～14h；更优选为12h。
优选地，混合反应完后还包括纯化过程，具体为将混合反应完后的溶液离心收集沉淀并洗涤后重悬，即得到MSe-HA水溶液；所述离心为在8000～10000rpm离心10～15min；所述洗涤的次数为3次。
所述多孔纳米硒水溶液的制备步骤为：
将介孔二氧化硅粉末溶于有机溶剂后与3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)混合，回流反应得到氨基化的介孔二氧化硅溶液，然后滴加***钠水溶液搅拌反应，再滴加还原剂持续搅拌反应，待反应完成后得到反应液，然后加入氢氟酸刻蚀掉介孔二氧化硅得到多孔纳米硒。
所述有机溶剂为无水乙醇和甲苯中的至少一种。
所述介孔二氧化硅、有机溶剂和APTES的质量体积比为0.1g：5mL：10μL～20g：100mL：100μL；优选为10g：10mL：50μL。
所述回流反应的时间为3～10h；优选为6h。
所述***钠水溶液中***钠的浓度为0.1～1.0mol/L。
所述氨基化的介孔二氧化硅溶液与***钠水溶液的体积比为1：2～1：10；优选为1：4。
所述还原剂为柠檬酸、天冬氨酸、谷氨酸、维甲酸和L-抗坏血酸中的至少一种。
所述***钠与还原剂的摩尔比为1：1～1：5。
所述第一次搅拌反应的时间为15～60min，第二次搅拌反应的时间为1～5h；
优选地，所述第一次搅拌反应的时间为30min，第二次搅拌反应的时间为2h。
所述氢氟酸的浓度为20～70wt％，优选为40.0wt％；用量满足每1mL的反应液对应加入5～200μL的氢氟酸。
所述介孔二氧化硅用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)模版水解正硅酸乙酯(TEOS)的方法制备得到，具体步骤为：
将十六烷基三甲基溴化铵溶于水后加入有机溶剂A，然后调节溶液至碱性，待搅拌溶解后加入正硅酸乙酯，再升高温度搅拌反应得到反应液，然后将反应液在酸性溶液和有机溶剂B的混合溶液中回流得到介孔二氧化硅。
所述有机溶剂A为乙醇和甲苯中的至少一种。
所述十六烷基三甲基溴化铵、水和有机溶剂A的质量体积比为50mg：20mL：5mL～200mg：100mL：50mL；优选为100mg：68mL：30mL。
所述正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的摩尔比为1：1～1：10。
所述调节溶液至碱性为使用氨水或NaOH水溶液将溶液pH调节至9～10。
所述升高温度继续搅拌反应为升高至45～70℃然后搅拌反应12～36h；优选为升高至60℃搅拌反应24h。
优选地，搅拌反应完后还包括纯化过程，具体为将搅拌反应后的溶液离心清洗三次；更优选为使用乙醇清洗。
所述酸性溶液为HCl，有机溶剂B为无水乙醇；所述酸性溶液与有机溶剂的混合溶液的pH值为1～3。
所述回流的时间为8～12h。
本发明未指明温度均为在室温下进行，所述室温为25～35℃。
一种由上述方法制备得到的透明质酸-多孔纳米硒复合物。
所述透明质酸-多孔纳米硒复合物在制备治疗败血症药物中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明提供了超大比表面积多孔结构的纳米硒可消除活性氧抑制炎症氧化损伤，相比于传统的纳米硒，多孔硒具有对活性氧更高的亲和力和反应活性，增强活性氧与纳米硒的电子亲和力和传导效率，因此本发明的多孔纳米硒具有高效广谱的活性氧消除活性。
(2)本发明提供了靶向性多孔纳米硒在消除活性氧治疗败血症的应用，通过透明质酸的修饰，有效提高了多孔硒对炎症巨噬细胞的靶向性，能够增加细胞的药物摄取量，从而保证细胞内药物维持在较高水平。进一步增强了多孔硒消除炎症细胞内和体内活性氧的活性，为硒类抗氧化剂的功能化修饰提供了思路。
(3)本发明提供的透明质酸修饰的多孔纳米硒制备过程及产物体系简单，产品可直接保存和使用，且制备方法简便。
(4)本发明提供的透明质酸修饰-多孔纳米硒在水溶液中具有良好的稳定性和分散性，可在室温环境中保存使用。此外，透明质酸和硒都是人体内必需物质和元素，具有良好的生物相容性，在体内具有较低的刺激性。与活性氧反应之后可降解为无毒性物质，具有良好的临床应用潜力。
附图说明
图1为实施例1所得MSe NPs的透射电镜和比表面检测图，其中A为透射电镜图，39000倍；B为透射电镜图，65000倍；C为氮气吸附脱吸附曲线图；D为孔径分布图。
图2是实施例1所得MSe-HA NPs的透射电镜和合成图，其中A为透射电镜图，B为红外光谱图，C为紫外光谱图。
图3为实施例1所得Se NPs、MSe NPs和MSe-HA NPs消除活性氧效果图，其中A为发射波长为650nm时的荧光强度图；B为发射波长为510nm时的荧光强度图；C为发射波长为425nm时的荧光强度图；D为超氧阴离子消除效率图；E为羟基自由基消除率图；F为过氧化氢消除率图。
图4为实施例1所得MSe NPs和MSe-HA NPs在巨噬细胞细胞和小鼠内的靶向图，其中A为巨噬细胞的细胞吸收图；B为巨噬细胞的细胞吸收中荧光量化图；C为多孔纳米硒体内靶向图；D为多孔纳米硒体内靶向荧光量化图。
图5为实施例1所得Se NPs、MSe NPs、MSe-HA NPs消除巨噬细胞内活性氧实验图，其中A为激光共聚图；B为流式细胞图。
图6为实施例1所得Se NPs、MSe NPs、MSe-HA NPs消除小鼠体内活性氧治疗败血症实验图，其中A为小鼠耳朵损伤图；B为活性氧探针DCFH-DA荧光图；C为活性氧探针DCFH-DA荧光量化图；D为小鼠肝和肺的H&E切片图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
RAW264.7细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；C57BL/6小鼠(广东省动物实验中心)
实施例1纳米硒、多孔纳米硒和透明质酸-多孔纳米硒复合物的合成
(1)多孔纳米硒(MSe NPs)和纳米硒的合成方法：将100mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于68mL蒸馏水中在常温下搅拌，加入30mL乙醇，然后用氨水pH调节9～10，待搅拌溶解后加入80μL TEOS，然后升温至60℃，持续搅拌反应24h，反应结束后用无水乙醇离心清洗三次，并在HCl和乙醇的混合溶液(pH为1)中回流6h得到介孔二氧化硅。取10g介孔二氧化硅粉末溶于10mL无水乙醇中，再加入50μL APTES回流6h得到氨基化的介孔二氧化硅。利用氨基化二氧化硅带正电可以吸附带负电***钠的性质，取5mL的介孔二氧化硅溶液，滴加5mL的***钠溶液(5mg/mL)搅拌30min，然后滴加10mL还原剂L-抗坏血酸溶液(10mg/mL)持续搅拌2h。待反应完成后离心洗涤三次，加入100μL的氢氟酸刻蚀掉介孔二氧化硅得到多孔纳米硒。
(2)MSe-HA NPs的合成方法：将步骤(1)得到的多孔纳米硒溶于水中配制成2mg/mL的溶液，将所得溶液10mL在室温下用EDC(30mg)和NHS(40mg)活化4h后，加入50mg的HA(M＝105)在室温下搅拌12h，8000rmp离心收集沉淀并洗涤3次后重悬，即得到MSe-HA NPs水溶液。
(3)纳米硒(Se NPs)的合成方法：取5mL的***钠溶液(5mg/mL)搅拌30min，然后滴加10mL还原剂L-抗坏血酸溶液(10mg/mL)持续搅拌2h。待反应完成后离心洗涤三次得到纳米硒。
图1为实施例1所得MSe NPs的透射电镜和比表面检测图，其中A为透射电镜图，39000倍；B为透射电镜图，65000倍；C为氮气吸附脱吸附曲线图；D为孔径分布图。从图1A和图1B中可以看出，MSe NPs约为150nm分散均匀的纳米粒子，并且多孔结构均匀分布在MSeNPs表面，通过氮气吸附脱附实验进一步检测显示(图1C和图1D)，MSe NPs为明显的多孔结构，其孔径主要集中在17.2nm，比表面积为1160.196g/m2。图2是实施例1所得MSe-HA NPs的透射电镜和合成图，其中图A为透射电镜图，图B为红外光谱图，图C为紫外光谱图。从透射电镜图可以看出，透明质酸修饰之后的多孔纳米硒纳米粒径则增加到约为155nm，紫外和红外则表明透明质酸成功修饰在多孔纳米硒上。
实施例2：传统纳米硒(Se NPs)、多孔硒(MSe)、透明质酸-多孔纳米硒(MSe-HA)消除溶液中活性氧实验
本实施例中MSe、MSe-HA和SeNPs为实施例1制备得到。
(1)超氧阴离子消除实验：取2.28mg黄嘌呤溶于1mL浓度为10mM的NaOH溶液中配成黄嘌呤浓度为15mM均匀溶液待用。取黄嘌呤稀释(0.6mM)液40μL，黄嘌呤氧化酶4.8μL一起加入到805.2μL PBS缓冲中，37℃反应40min。然后分别加入100μL浓度为20μg/mL Se NPs、MSe和MSe-HA溶液共同孵育40min，同时设置空白对照组，并每组设置三个重复组。然后分别加入50μL的二氢乙啶探针孵育40min，上机检测各组分的荧光强度，激发波为470nm,发射波为650nm，结果见图3。
(2)羟基自由基消除实验：取18mg FeSO4.7H2O溶于10mL去离子水中(pH＝3～4)，同时取10μL过氧化氢原溶液(30％)稀释至5mL。然后取4mL过氧化氢稀释液加入到4mL FeSO4溶液中反应10min，待反应完成后，将溶液均分成四组，分别加入100μL浓度为200μg/mL SeNPs、MSe和MSe-HA溶液共同孵育1h，同时设置空白对照组，并每组设置三个重复组。然后分别加入1mL水杨酸溶液(1.8mM)孵育15min，然后上机检测荧光强度，激发波为385nm,发射波为510nm，结果见图3。
(3)过氧化氢消除实验：取对苯二甲酸溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)制成0.5mM的溶液待用。取10μL过氧化氢原溶液(30％)稀释至5mL。然后取4mL过氧化氢稀释液均分成四组，分别加入100μL浓度为200μg/mL Se NPs、MSe和MSe-HA溶液共同孵育6h，同时设置空白对照组，并每组设置三个重复组。然后加入1mL对苯二甲酸溶液孵育30min，然后上机检测荧光强度，激发波为320nm，发射波为425nm，结果见图3。
图3为实施例1所得Se NPs、MSe NPs和MSe-HA NPs消除活性氧效果图。黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应会产生超氧阴离子(.O2-)，超氧阴离子可以氧化二氢乙啶荧光探针(HE)生成于650nm处有特殊吸收的氧化乙啶，因此荧光强度的大小直接反应了溶液中超氧阴离子的浓度。如图3A所示，通过荧光检测并扣除背景之后，检测发现空白对照组、Se NPs组、MSeNPs组和MSe-HA NPs组平均荧光强度分别为292.1，127.6，69.3和64.9，如图3D所示，Se NPs组、MSe NPs组和MSe-HA NPs组超氧阴离子的消除效率分别为50.17％、78.73％和78.81％。因此，证明了通过增大比表面积有效提升了纳米硒消除超氧阴离子自由基的效率。
亚铁离子与过氧化氢的反应会产生活性氧羟基自由基(.OH)，羟基自由基可以氧化水杨酸(SA)生成于510nm处有特殊吸收的2,3-二羟基苯甲酸，因此荧光强度的大小直接反应了溶液中羟基自由基的浓度。如图3B所示，通过荧光检测并扣除背景之后，检测发现空白对照组、Se NPs组、MSe NPs组和MSe-HA NPs组平均荧光吸光度为分别为0.58368，0.29104，0.12391和0.1002。如图3E所示，Se NPs组、MSe NPs组和MSe-HA NPs组羟基自由基的消除效率分别为55.92％、78.91％和82.83％。因此，证明了通过增大比表面积有效提升了纳米硒消除羟基自由基的效率。
对苯二甲酸与过氧化氢的反应会产生于425nm处有特殊吸收的2-羟基对苯二甲酸，因此荧光强度的大小直接反应了溶液中过氧化氢的浓度。如图3C所示，通过荧光检测并扣除背景之后，检测发现空白对照组、Se NPs组、MSe NPs组和MSe-HA NPs组平均荧光吸光度为分别为1746，1337，219.3和179.8。如图3F所示，Se NPs组、MSe NPs组和MSe-HA NPs组羟基自由基的消除效率分别为32.12％、87.32％和89.81％。因此，证明了通过增大比表面积有效提升了纳米硒消除过氧化氢的效率。
实施例3：多孔硒、透明质酸-多孔纳米硒靶向性实验
(1)RAW264.7细胞吸收实验：为了检测实施例1所得多孔纳米硒(MSe NPs)和透明质酸-多孔纳米硒(MSe-HA NPs)的靶向能力，我们采用共聚焦激光显微镜检测了LPS活化的RAW264.7细胞对MSe NPs和MSe-HA NPs的吸收能力。简而言之，活化的RAW264.7细胞以1×105密度种于共聚焦小皿中，并孵育24h，接着分别加入50μL含以FITC标记的MSe NPs(10μg/mL)和MSe-HA NPs(10μg/mL)的培养基到细胞中，细胞与药物分别孵育0.5h、1h、2h、4h和8h后，细胞以PBS洗涤三次，并以DAPI染色15min。细胞样品以PBS再洗一遍，并于共聚焦激光显微镜下观察，结果见图4。
(2)炎症小鼠体内靶向性实验：为了检测多孔纳米硒(MSe NPs)和透明质酸-多孔纳米硒(MSe-HA NPs)的靶向炎症部位靶向能力，采用荧光活体成像观察了MSe NPs和MSe-HA NPs在炎症部位的积累量，荧光强度越强表示纳米的积累量越多，靶向能力越强。简而言之，将10μL浓度为10ng/mL脂多糖(LPS)溶液注射到C57BL/6右耳，待12h后，耳朵出现明显的红肿表示右耳有明显的炎症反应，接着分别将含以FITC标记的MSe NPs(10μg/mL)和MSe-HANPs(10μg/mL)的PBS水溶液通过尾静脉注射到小鼠体内，注射量为200μg/kg(药物/小鼠体重)，然后分别观察药物在0.5h、1h、2h、4h、8h和12h时体内荧光的分布情况，结果见图4。
图4为实施例1所得MSe NPs和MSe-HA NPs在巨噬细胞细胞和小鼠内的靶向图，其中A为巨噬细胞的细胞吸收图；B为巨噬细胞的细胞吸收中荧光量化图；C为多孔纳米硒体内靶向图；D为多孔纳米硒体内靶向荧光量化图。
激光共聚焦检测表明，MSe和MSe-HA和RAW264.7细胞共同孵育2h内荧光强度呈现时间依赖性。并且在2h后荧光强度达到饱和，没有明显的增强。此外，通过对比可以发现MSe-HA在2h的荧光强度明显强于MSe，并且荧光半定量显示MSe-HA的荧光强度是MSe的1.98倍(图4B)，因此通过吸收实验表明通过透明质酸修饰可以增强多孔纳米硒对巨噬细胞的靶向性。如图4C所示，体内荧光实验结果进一步显示MSe-HA在1h时就可以达到炎症部位，并进行有效的积累。并在4h时达到最大，其荧光强度是MSe的4倍(图4D)，也证明了采用透明质酸修饰-多孔纳米硒对炎症具有优异的靶向性。
实施例4：传统纳米硒、多孔硒、透明质酸-多孔纳米硒消除细胞中活性氧实验
本实施例中Se NPs、MSe NPs和MSe-HA NPs为实施例1制备得到。
为了检测传统纳米硒(Se NPs)、多孔纳米硒(MSe NPs)和透明质酸-多孔纳米硒(MSe-HA NPs)消除活化巨噬细胞内活性氧的能力，我们采用流式细胞仪与共聚焦激光显微镜检测了RAW264.7细胞经过各种处理之后细胞内活性氧荧光强度。简而言之，活化的RAW264.7细胞以1×105密度种于共聚焦小皿中，并孵育24h，接着分别加入50μL含浓度为10μg/mL的Se NPs、MSe NPs和MSe-HA NPs的培养基到细胞中，同时设置空白对照组，细胞与药物分别孵育12h后，以PBS洗涤细胞三次，并以活性氧探针(DCFH-DA)染色30min。细胞样品以PBS再洗一遍，并于共聚焦激光显微镜下观察(激发和发射波长分别为495nm和525nm)。流式细胞仪检测则是将活化RAW264.7细胞以每孔5×104密度种于六孔板中，并于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，分别加入50μL含浓度为10μg/mL的Se NPs、MSe NPs和MSe-HA NPs的培养基到细胞中，同时设置空白对照组，细胞与药物分别孵育12h后，以PBS洗涤细胞三次，并以活性氧探针(DCFH-DA)染色30min。细胞样品以PBS再洗一遍，并于流式细胞仪中检测，结果见图5。
图5为实施例1所得Se NPs、MSe NPs、MSe-HA NPs消除巨噬细胞内活性氧实验图。激光共聚焦检测表明，如图5A所示，在与LPS诱导的RAW 264.7孵育12h后，空白对照组(LPS)中活性氧荧光强度是最强的，而加入纳米作用的各实验组中细胞内活性氧荧光强度则表现出不同程度的下降，并且可以发现MSe和MSe-HA消除活性氧的效率明显强于传统纳米硒(Se)，由此也证明了具有多孔结构的纳米硒具有更强的活性氧消除能力。而且MSe-HA因为具有良好的靶向能力，其消除活性氧的效率比MSe更强，处理后细胞内活性氧基本被完全消除。流式细胞仪检测也表现出相同的趋势，如图5B所示，结果检测表明，空白对照组中活性氧荧光强度为2315，Se NPs处理后的细胞内活性氧荧光强度为1238，而MSe和MSe-HA处理过后的荧光强度则只有900和804，因此具有靶向性的超大比表面的MSe-HA具有良好的巨噬细胞内活性氧消除能力。
实施例5：传统纳米硒、多孔硒、透明质酸-多孔纳米硒消除体内活性氧治疗败血症实验
本实施例中Se NPs、MSe NPs和MSe-HA NPs为实施例1制备所得。
取6-8周龄，均重为20.0g左右的C57BL/6小鼠平均分为四组，每组5只进行造模，将10μL溶解有脂多糖的生理盐水溶液(100ng/mL)注射至小鼠右耳内，12h后待小鼠右耳出现红肿进行处理。即分别尾静脉注射浓度为2mg/mL的Se NPs、MSe NPs和MSe-HA NPs的PBS水溶液，注射量为200μg/Kg(药物/小鼠体重)，同时设置空白对照组。此后每隔24h观察小鼠右耳红肿情况，并用手机拍照记录。在治疗四天后注射活性氧探针(DCFH-DA)并用活体荧光成像观察小鼠右耳中活性氧浓度。同时通过观察肝肺器官损伤切片观察败血症治疗情况。结果见图6。
图6为实施例1所得Se NPs、MSe NPs、MSe-HA NPs消除小鼠体内活性氧治疗败血症实验图。如图6A所示，第四天时，空白对照组小鼠右耳出现明显的损伤情况，这是对照组炎症部位活性氧浓度高导致的氧化损伤。而注射Se NPs、MSe NPs和MSe-HA NPs治疗组则表现出不同程度的治疗效果，其中MSe NPs只有些许红肿，没有发生损伤情况，MSe-HA NPs则完全抑制了损伤与正常老鼠无异。如图6B所示，活体成像检测则进一步表明，对照组中活性氧浓度明显高于治疗组，MSe NPs和MSe-HA NPs治疗组中则完全抑制了活性氧，同时从肝肺切片也可以看出采用MSe NPs和MSe-HA NPs治疗组中则完全肝肺的损伤(图6D)。这些结果表明，MSe NPs和MSe-HA NPs在体内也具有良好的活性氧消除能力有效地抑制了炎症氧化损伤和治疗了败血症。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将多孔纳米硒水溶液与EDC和NHS混合后进行活化，然后将活化后的多孔纳米硒水溶液与透明质酸混合反应，得到透明质酸-多孔纳米硒复合物水溶液。
2.根据权利要求1所述的透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，其特征在于：
所述多孔纳米硒水溶液中多孔纳米硒的浓度为0.1～10mg/mL；
所述多孔纳米硒、EDC和NHS的摩尔比为1：0.1：0.1～1：20：20；
所述透明质酸的分子量为10KD～50KD；
所述多孔纳米硒和透明质酸的质量比为1：1～1：10。
3.根据权利要求1所述的透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，其特征在于：
所述活化的时间为0.5～10h；
所述混合反应的条件为在室温下搅拌反应6～18h；
所述混合反应完后还包括纯化过程，具体为将混合反应完后的溶液离心收集沉淀并洗涤后重悬，即得到透明质酸-多孔纳米硒复合物水溶液。
4.根据权利要求1～3任一项所述的透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，其特征在于，所述多孔纳米硒水溶液的制备步骤为：
将介孔二氧化硅粉末溶于有机溶剂后与APTES混合，回流反应得到氨基化的介孔二氧化硅溶液，然后滴加***钠水溶液搅拌反应，再滴加还原剂持续搅拌反应，待反应完成后得到反应液，然后加入氢氟酸刻蚀掉介孔二氧化硅得到多孔纳米硒。
5.根据权利要求4所述的透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，其特征在于：
所述介孔二氧化硅、有机溶剂和APTES的质量体积比为0.1g：5mL：10μL～20g：100mL：100μL；
所述氨基化的介孔二氧化硅溶液与***钠的体积比为1：2～1：10；
所述***钠与还原剂的摩尔比为1：1～1：5；
所述第一次搅拌反应的时间为15～60min，第二次搅拌反应的时间为1～5h。
6.根据权利要求4所述的透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，其特征在于：
所述***钠水溶液中***钠的浓度为0.1～1.0mol/L；
所述还原剂为柠檬酸、天冬氨酸、谷氨酸、维甲酸和L-抗坏血酸中的至少一种；
所述氢氟酸的浓度为20～70wt％。
7.根据权利要求4所述的透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，其特征在于，所述介孔二氧化硅的制备步骤为：
将十六烷基三甲基溴化铵溶于水中后加入有机溶剂A，然后调节溶液至碱性，待搅拌溶解后加入正硅酸乙酯，再升高温度搅拌反应得到反应液，然后将反应液在酸性溶液和有机溶剂B的混合溶液中回流得到介孔二氧化硅。
8.根据权利要求7所述的透明质酸-多孔纳米硒复合物的制备方法，其特征在于：
所述十六烷基三甲基溴化铵、水和有机溶剂A的质量体积比为50mg：20mL：5mL～200mg：100mL：50mL；
所述正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的摩尔比为1：1～1：10；
所述升高温度继续搅拌反应为升高至45～70℃然后搅拌反应12～36h；
所述回流的时间为8～12h。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述方法制备的透明质酸-多孔纳米硒复合物。
10.根据权利要求9所述透明质酸-多孔纳米硒复合物在制备治疗败血症药物中的应用。
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