CN115894279A - 橄榄油神经酰胺及其合成方法与用途 - Google Patents

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叶柳
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了橄榄油神经酰胺，其由橄榄油脂肪酸与鞘氨醇类化合物反应得到，所述鞘氨醇类化合物选自鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇，本方案还公开了橄榄油神经酰胺的合成方法与用途。橄榄油神经酰胺在皮肤天然屏障的修复、抗炎、组织愈合、抗衰老等方面表现出优异性能，在化妆品、保健品、生物医药等领域有着广泛的应用前景。

Description

橄榄油神经酰胺及其合成方法与用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及橄榄油神经酰胺及其合成方法与用途。
背景技术
神经酰胺(Ceramide，又称分子钉)天然存在于皮肤中，是皮肤屏障(角质层)非常重要的组成部分，含量高达40～50wt％，神经酰胺是一类由鞘氨醇类长链碱基与脂肪酸组成的神经鞘氨脂质，其中的鞘氨醇部分、脂肪酸部分的碳链长度、不饱和度和羟基数目都是可以变化的，神经酰胺代表了一类化合物。神经酰胺在调控皮肤屏障功能，恢复皮肤水分以及增强皮肤角质细胞之间的粘着力等方面表现出优异的性能。
由于神经酰胺的重要性，许多化妆品和制药公司正在研究、开发相应的产品。天然植物来源的神经酰胺因其更加可持续和更加环保的原料来源，以及与皮肤神经酰胺成分相近，能形成有效的皮肤屏障防止水分流失，并对抗外部损坏，将可能成为下一代环境友好、安全可靠的神经酰胺产品。
橄榄油一般指橄榄油油脂，是由新鲜的油橄榄果实直接冷榨而成的，不经加热和化学处理，保留了天然营养成分，在西方被誉为“液体黄金”、“植物油皇后”、“地中海甘露”。橄榄油富含丰富的单不饱和脂肪酸——油酸，还有维生素A、维生素B、维生素D、维生素E、维生素K及抗氧化物等，被认为是迄今所发现的油脂中最适合人体的油脂。数据表明，橄榄油可以降低儿茶酚胺的合成，同时抑制皮肤活性氧生成、脂质过氧化和蛋白质羰基化的增加，具备良好的抗衰老、抗氧化性和美白美容、收缩毛孔等功效。因其含有丰富的脂溢性维生素，对于皮肤十分有益，是一种安全可靠的美容佳品，因此被誉为“可以吃的化妆品”。此外，有研究表明，橄榄油在医药方面有促进血液循环、减少心血管疾病、促进骨骼和神经***的发育、减肥、疗伤，减慢老年人神经细胞功能退化等作用，橄榄油还可作为镇静剂以及治疗黄疸和胆结石的辅助治疗手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用植物来源的橄榄油脂肪酸合成得到的神经酰胺。
本发明的另一目的是提供橄榄油神经酰胺的合成方法，其利用天然植物来源且易得的橄榄油油脂或者橄榄油脂肪酸作为原料。
本发明的另一目的是提供橄榄油神经酰胺的用途。
为达到上述目的之一，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，橄榄油神经酰胺，其由橄榄油脂肪酸与鞘氨醇类化合物反应得到，所述鞘氨醇类化合物选自鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇。
反应即可以是化学合成反应(如下文详述)，也可采用微生物发酵法，即应用雪氏毕赤酵母或酿酒酵母，在一定环境下发酵得到鞘氨醇类化合物，然后加入脂肪酸，最终得到神经酰胺；或者以橄榄油为原料，选用合适的菌株，进行发酵得到橄榄油神经酰胺。
鞘氨醇指2-氨基-4-十八烯-1,3-二醇，植物鞘氨醇指2-氨基-十八烷-1，3，4-三醇，二氢鞘氨醇指2-氨基-十八烷-1，3-二醇。
进一步地，所述橄榄油脂肪酸由橄榄油水解得到。
进一步地，所述橄榄油脂肪酸含有20～83wt％油酸，优选55～83wt％油酸。
进一步地，所述橄榄油脂肪酸含有7.5～20wt％棕榈酸。
进一步地，所述橄榄油脂肪酸含有3.5～70wt％亚油酸，优选3.5～21wt％亚油酸。
进一步地，所述橄榄油脂肪酸含有0.5～5wt％硬脂酸。
进一步地，所述橄榄油脂肪酸含有0.1～1.0wt％亚麻酸。
此外，橄榄油脂肪酸还含有0～3.5wt％棕榈油酸、0～0.6wt％花生酸、0～0.4wt％二十碳烯酸、0～0.3wt％十七烷酸、0～0.3wt％十七碳一烯酸、0～0.2wt％山嵛酸、0～0.2wt％二十四烷酸、0～0.05wt％豆蔻酸。
橄榄油脂肪酸的组成为：20～83wt％油酸、7.5～20wt％棕榈酸、3.5～70wt％亚油酸、0.5～5wt％硬脂酸、0.1～1.0wt％亚麻酸、0～3.5wt％棕榈油酸、0～0.6wt％花生酸、0～0.4wt％二十碳烯酸、0～0.3wt％十七烷酸、0～0.3wt％十七碳一烯酸、0～0.2wt％山嵛酸、0～0.2wt％二十四烷酸、0～0.05wt％豆蔻酸。
橄榄油脂肪酸的主要成分为油酸，其他的脂肪酸包括亚油酸、棕榈酸和硬脂酸、亚麻酸，是必要组分，受树种、土壤、气候、产地、采摘季节、提取过程的影响，各组分的含量会有所不同，而棕榈油酸、花生酸、二十碳烯酸、十七烷酸、十七碳一烯酸、山嵛酸、二十四烷酸、豆蔻酸不一定含有，是可选组分或者非必要组分。
橄榄油神经酰胺，其组成包括：油酸神经酰胺，亚油酸神经酰胺，棕榈酸神经酰胺，硬脂酸神经酰胺，亚麻酸神经酰胺；因为脂肪酸都会参与相同的反应，反应后神经酰胺的质量占比变化不大，所以可以参照橄榄油脂肪酸的组成，橄榄油神经酰胺的组成为：20～83wt％油酸神经酰胺，7.5～20wt％棕榈酸神经酰胺，3.5～70wt％亚油酸神经酰胺，0.5～5wt％硬脂酸神经酰胺，0.1～1.0wt％亚麻酸神经酰胺；优选的组成为：55～83wt％油酸神经酰胺，7.5～20wt％棕榈酸神经酰胺，3.5～21wt％亚油酸神经酰胺，0.5～5wt％硬脂酸神经酰胺，0.1～1.0wt％亚麻酸神经酰胺。各组分的含量因橄榄油脂肪酸或油脂中各脂肪酸的含量不同而存在差异。此外，橄榄油神经酰胺还包括棕榈油酸、花生酸、二十碳烯酸、十七烷酸、十七碳一烯酸、山嵛酸、二十四烷酸、豆蔻酸中一种或多种与鞘氨醇类化合物反应得到的神经酰胺，即还包括0～3.5wt％棕榈油酸神经酰胺、0～0.6wt％花生酸神经酰胺、0～0.4wt％二十碳烯酸神经酰胺、0～0.3wt％十七烷酸神经酰胺、0～0.3wt％十七碳一烯酸神经酰胺、0～0.2wt％山嵛酸神经酰胺、0～0.2wt％二十四烷酸神经酰胺、0～0.05wt％豆蔻酸神经酰胺。
橄榄油神经酰胺，其组成包括：油酸神经酰胺、棕榈酸神经酰胺、亚油酸神经酰胺；油酸神经酰胺占比20～83wt％，优选55～83wt％，棕榈酸神经酰胺占比7.5～20wt％，亚油酸神经酰胺占比3.5～70wt％，优选3.5～21wt％。
进一步地，橄榄油神经酰胺包括硬脂酸神经酰胺，硬脂酸神经酰胺占比0.5～5wt％。
进一步地，橄榄油神经酰胺包括亚麻酸神经酰胺，亚麻酸神经酰胺占比0.1～1.0wt％。
油酸神经酰胺是油酸与鞘氨醇类化合物缩合反应得到，包括油酸植物鞘氨醇神经酰胺、油酸鞘氨醇神经酰胺、油酸二氢鞘氨醇神经酰胺；亚油酸神经酰胺是亚油酸与鞘氨醇类化合物缩合反应得到，包括亚油酸植物鞘氨醇神经酰胺、亚油酸鞘氨醇神经酰胺、亚油酸二氢鞘氨醇神经酰胺；棕榈酸神经酰胺是棕榈酸与鞘氨醇类化合物缩合反应得到，包括棕榈酸植物鞘氨醇神经酰胺、棕榈酸鞘氨醇神经酰胺、棕榈酸二氢鞘氨醇神经酰胺；硬脂酸神经酰胺是硬脂酸与鞘氨醇类化合物缩合反应得到，包括硬脂酸植物鞘氨醇神经酰胺、硬脂酸鞘氨醇神经酰胺、硬脂酸二氢鞘氨醇神经酰胺；亚麻酸神经酰胺是亚麻酸与鞘氨醇类化合物缩合反应得到，包括亚麻酸植物鞘氨醇神经酰胺、亚麻酸鞘氨醇神经酰胺、亚麻酸二氢鞘氨醇神经酰胺；花生酸神经酰胺、二十碳烯酸神经酰胺等以此类推。
本发明的第二方面，橄榄油神经酰胺的合成方法，包括以下步骤：
在缩合剂条件下，橄榄油脂肪酸与鞘氨醇类化合物反应，所述缩合剂为EDCI和Et3N。
进一步地，所述橄榄油脂肪酸、鞘氨醇类化合物、EDCI、Et3N的摩尔比为1：(1～1.5)：(1～2)：(1～2)，所述反应的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈中的至少一种。
在市场上购买的橄榄油一般是油脂形态，需要水解成橄榄油脂肪酸，因此还包括以下步骤：
橄榄油油脂通过皂化反应水解得到橄榄油脂肪酸。
进一步地，所述皂化反应是橄榄油油脂在氢氧化钾溶液中水解。
进一步地，所述橄榄油油脂与氢氧化钾的质量比为1：(1～2)。
本发明的第三方面，橄榄油神经酰胺在化妆品、药品、膳食品或保健品中的用途。
进一步地，所述橄榄油神经酰胺具有皮肤屏障修复、组织愈合、抗衰老、抗炎、抗光老化、抗氧化、促进胶原合成、提高弹性蛋白、美白功效中的至少一种。
一种组合物，包括橄榄油神经酰胺，所述组合物具有皮肤屏障修复、组织愈合、抗衰老、抗炎、抗光老化、抗氧化、促进胶原合成、提高弹性蛋白、美白功效中的至少一种。
该组合物含有可接受的辅料，包括增溶剂、防腐剂、抗氧剂、pH调节剂、促渗剂、脂质体、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化剂、香精及色素中的一种或多种；该组合物为霜剂、乳剂、溶液剂、膜剂、气雾或喷雾形式。
本发明具有以下有益效果：
橄榄油脂肪酸属于天然形成的脂肪酸，最主要的成分是单不饱和脂肪酸——油酸或者亚油酸，此外还含有棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸等，其与天然存在于皮肤中的鞘氨醇类化合物，经温和反应制备得到橄榄油神经酰胺，在皮肤天然屏障的修复、抗氧化、抗衰老等方面表现出优异性能，在化妆品、保健品、生物医药等领域有着广泛的应用前景。
1、与单一的神经酰胺相比效果更好。不同的神经酰胺，因其结构的差异，功效也会存在差异，单一结构的神经酰胺一般难以具备全面的效果。本方案基于仿生的思路，利用天然来源的橄榄油油脂或脂肪酸作为原料，合成复合的神经酰胺，以弥补不同神经酰胺功效的差异，橄榄源中的微量脂肪酸可以形成微量神经酰胺，起到功效补充的作用。
2、与复配的神经酰胺相比效果更好。除了油酸(或油脂)，橄榄油还含有维生素、多酚等成分，这些所营养物质有滋润皮肤、增强细胞活力等效果，用橄榄油合成的神经酰胺，与橄榄油中含有的其它活性成分具有协同增效的作用，相比按照类似比例复配的神经酰胺，具有更好的效果。
3、成本更低。本发明的方法快速得到多种神经酰胺复配的组合物，植物源的橄榄油油脂或其脂肪酸来源广泛、易于商业化获取、成本较低，更加环保经济，有别于将不同的单一神经酰胺混合复配的思路，单一成分的脂肪酸不仅原料价格高，而且需要分别生产不同的神经酰胺，然后再进行复配，增加了制备成本。
4、合成方法简单。本发明的方法可以采用化学合成，实现一步制备多种神经酰胺，也可以使用微生物发酵法。
附图说明
图1、2为实施例4细胞增殖活力检测结果柱形图；
图3为实施例5细胞迁移能力检测结果；
图4为实施例6弹性蛋白酶抑制率柱形图；
图5为实施例7抗炎修复功效检测结果柱形图；
图6为实施例8MMP1表达量柱形图；
图7、8为实施例9抗氧化性测试结果柱形图；
图9为实施例10美白活性测试结果柱形图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
EDCI指1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，Et3N指三乙胺。硅胶柱层析使用青岛海洋硅胶(粒径0.040-0.063mm)。薄层色谱分析(TLC)使用60F254硅胶板，TLC显色采用UV光(254nm)或碘。NMR图谱使用Bruker DPX 400核磁共振仪表征，1H NMR为400MHz，溶剂为氘代甲醇，氘代DMSO或氘代四氢呋喃，以四甲基硅烷(TMS)为内标。化学位移的单位是ppm，耦合常数的单位是Hz。在1H NMR中，δ表示化学位移，s表示单峰，d表示双峰，t表示三重峰，q表示四重峰，m表示多重峰。
实施例1
橄榄油脂肪酸和植物鞘氨醇合成神经酰胺
第一步：将50g橄榄油油脂溶于60mL四氢呋喃，冰浴下冷却，滴加100mL氢氧化钾(25wt％)溶液，滴加完毕后升至室温反应，至TLC检测反应完毕。
后处理：加入稀盐酸(3N)调节反应体系的pH值到3，加入150mL乙酸乙酯萃取水相，加入100mL饱和食盐水洗一次，有机相加入无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到40g橄榄油脂肪酸。
第二步：将橄榄油脂肪酸(50mmol，分子量以油酸计)、EDCI(60mmol)、Et3N(60mmol)加入250mL加入圆底烧瓶中，再加入100mL二氯甲烷，随后在室温条件下搅拌1小时，随后将植物鞘氨醇(60mmol)加入到反应体系中，在室温条件下搅拌，至TLC检测反应完毕。
后处理：加入水淬灭反应，分离有机层，干燥，过滤并真空浓缩后经溶剂洗涤得到橄榄油神经酰胺，产物经HPLC分析，HPLC色谱条件：使用岛津高效液相色谱仪(LC-2030C3DPlus)，用Innoval ODS-2 4.6*250mm，5μm色谱柱，柱温：30℃，进样体积：10μL，流速：1.0mL/min，蒸发温度：40℃，载气流速：2.5L/min，流动相：100％甲醇。
各成分HPLC的保留时间为：油酸-植物鞘氨醇神经酰胺11.3min，亚油酸-植物鞘氨醇神经酰胺9.5min，棕榈酸-植物鞘氨醇神经酰胺10.7min，硬脂酸-植物鞘氨醇神经酰胺13.9min，亚麻酸-植物鞘氨醇神经酰胺8.2min。
所得产物经制备型高效液相色谱分离，得到油酸-植物鞘氨醇神经酰胺、棕榈酸-植物鞘氨醇神经酰胺、亚油酸-植物鞘氨醇神经酰胺、硬脂酸-植物鞘氨醇神经酰胺、亚麻酸-植物鞘氨醇神经酰胺(核磁氢谱经与标准图谱比较一致)，质量比依次为21.3％、10.5％、63.2％、2.4％、0.4％，其余为其他成分，含量较少。本实施例使用国产的橄榄油脂肪酸，主要成分是亚油酸，所得产物以亚油酸神经酰胺为主。
实施例2
橄榄油脂肪酸和鞘氨醇合成神经酰胺
第一步：将50g橄榄油油脂溶于60mL四氢呋喃，冰浴下冷却，滴加100mL氢氧化钾(25wt％)溶液，滴加完毕后升至室温反应，至TLC检测反应完毕。
后处理：加入稀盐酸(3N)调节反应体系的pH值到3，加入150mL乙酸乙酯萃取水相，加入100mL饱和食盐水洗一次，有机相加入无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到40g橄榄油脂肪酸。
第二步：将橄榄油脂肪酸(50mmol，分子量以油酸计)、EDCI(75mmol)、Et3N(75mmol)加入250mL加入圆底烧瓶中，再加入100mL二氯甲烷，随后在室温条件下搅拌1小时，随后将鞘氨醇(50mmol)加入到反应体系中，在室温条件下搅拌，至TLC检测反应完毕。
后处理：加入水淬灭反应，分离有机层，干燥，过滤并真空浓缩后经溶剂洗涤得到橄榄油神经酰胺，产物经HPLC分析，HPLC色谱条件：使用岛津高效液相色谱仪(LC-2030C3DPlus)，用Innoval ODS-2 4.6*250mm，5μm色谱柱，柱温：30℃，进样体积：10μL，流速：1.0mL/min，蒸发温度：40℃，载气流速：2.5L/min，流动相：(2wt％水+98wt％甲醇)均含0.1wt％甲酸。
各成分HPLC的保留时间为：油酸-鞘氨醇神经酰胺20.7min，亚油酸-鞘氨醇神经酰胺16.6min。
所得产物经制备型高效液相色谱分离，得到油酸-鞘氨醇神经酰胺、棕榈酸-鞘氨醇神经酰胺、亚油酸-鞘氨醇神经酰胺、硬脂酸-鞘氨醇神经酰胺、亚麻酸-鞘氨醇神经酰胺(核磁氢谱经与标准图谱比较一致)，质量比依次为61.8％、12.6％、19.3％、3.4％、0.6％，其余为其他成分，含量较少。本实施例使用进口的橄榄油脂肪酸，主要成分是油酸，所得产物以油酸神经酰胺为主。
油酸-鞘氨醇神经酰胺氢谱：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.70(d,J＝8.9Hz,1H),5.69(dt,J＝15.3,6.7Hz,1H),5.45(dd,J＝15.4,7.5Hz,1H),5.34(t,J＝4.9Hz,2H),4.03(t,J＝7.5Hz,1H),3.85(ddd,J＝9.5,4.6,2.4Hz,1H),3.68(d,J＝5.0Hz,2H),2.19(t,J＝7.6Hz,2H),2.03(q,J＝6.9,6.0Hz,6H),1.64–1.51(m,2H),1.30(d,J＝14.5Hz,41H),0.90(t,J＝6.7Hz,6H)。亚油酸-鞘氨醇神经酰胺氢谱：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.69(d,J＝8.9Hz,1H),5.69(dt,J＝15.3,6.7Hz,1H),5.46(dd,J＝15.3,7.4Hz,1H),5.41–5.25(m,4H),4.03(t,J＝7.5Hz,1H),3.85(tdd,J＝7.5,4.7,2.2Hz,1H),3.68(d,J＝5.0Hz,2H),2.77(t,J＝6.4Hz,2H),2.20(q,J＝7.6,6.9Hz,2H),2.13–1.94(m,6H),1.67–1.49(m,2H),1.31(d,J＝19.6Hz,40H),0.90(td,J＝6.8,3.8Hz,6H)。
实施例3
橄榄油脂肪酸和二氢鞘氨醇合成神经酰胺
第一步：将50g橄榄油油脂溶于60mL四氢呋喃，冰浴下冷却，滴加100mL氢氧化钾(25wt％)溶液，滴加完毕后升至室温反应，至TLC检测反应完毕。
后处理：加入稀盐酸(3N)调节反应体系的pH值到3，加入150mL乙酸乙酯萃取水相，加入100mL饱和食盐水洗一次，有机相加入无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到40g橄榄油脂肪酸。
第二步：将橄榄油脂肪酸(50mmol，分子量以油酸计)、EDCI(100mmol)、Et3N(100mmol)加入250mL加入圆底烧瓶中，再加入100mL二氯甲烷，随后在室温条件下搅拌1小时，随后将二氢鞘氨醇(75mmol)加入到反应体系中，在室温条件下搅拌，至TLC检测反应完毕。
后处理：加入水淬灭反应，分离有机层，干燥，过滤并真空浓缩后经溶剂洗涤得到橄榄油神经酰胺，产物经HPLC分析，HPLC色谱条件：使用岛津高效液相色谱仪(LC-2030C3DPlus)，用Innoval ODS-2 4.6*250mm，5μm色谱柱，柱温：30℃，进样体积：10μL，流速：1.0mL/min，蒸发温度：40℃，载气流速：2.5L/min，流动相：(2wt％水+98wt％甲醇)均含0.1wt％甲酸。
各成分HPLC的保留时间为：油酸-二氢鞘氨醇神经酰胺23.6min，亚油酸-二氢鞘氨醇神经酰胺19.1min。
所得产物经制备型高效液相色谱分离，得到油酸-二氢鞘氨醇神经酰胺、棕榈酸-二氢鞘氨醇神经酰胺、亚油酸-二氢鞘氨醇神经酰胺、硬脂酸-二氢鞘氨醇神经酰胺、亚麻酸-二氢鞘氨醇神经酰胺(核磁氢谱经与标准图谱比较一致)，质量比依次为29.9％、18.2％、45.1％、2.3％、0.9％。其余为其他成分，含量较少。
油酸-二氢鞘氨醇神经酰胺氢谱：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ5.34(t,J＝4.9Hz,2H),3.81(q,J＝5.6Hz,1H),3.75–3.65(m,2H),3.65–3.51(m,1H),2.22(dd,J＝9.2,5.4Hz,2H),2.03(q,J＝6.3Hz,4H),1.70–1.49(m,5H),1.48–1.05(m,45H),0.90(t,J＝6.6Hz,6H)。亚油酸-二氢鞘氨醇神经酰胺：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ5.42–5.24(m,4H),3.89–3.75(m,1H),3.75–3.64(m,2H),3.64–3.53(m,1H),2.77(t,J＝6.4Hz,2H),2.22(t,J＝7.4Hz,2H),2.06(q,J＝6.8Hz,4H),1.57(ddt,J＝33.9,13.9,5.8Hz,4H),1.31(d,J＝21.5Hz,40H),0.90(td,J＝6.8,3.7Hz,6H)。
实施例4
MTT法检测化合物对细胞的增殖活力
将HaCaT细胞以1×104个/孔的密度种于96孔板，培养箱内过夜。24h后弃去上清液，加入含不同浓度的实施例1产物的培养基100μL，继续孵育24h后除去培养基，每孔中加入100μL噻唑蓝(MTT)，测定450nm处吸光度，计算细胞存活率＝A给药孔/A空白孔×100％。
结果如图1所示，橄榄油神经酰胺对细胞活力有促进作用，在浓度为70、150、250、300mg/L时的细胞存活率分别为102.7％、121.2％、145.2％、165.2％，表现出明显的促进细胞增殖效果，具有良好的组织修复能力。
按照相同的方法测试神经酰胺3B(即油酸神经酰胺)对细胞的增殖活力，结果如图2所示，在浓度为70、150、250、300mg/L时的细胞存活率分别为101.7％、111.2％、126.8％、141.9％，其促进细胞增殖效果和组织修复潜力不如橄榄油神经酰胺。
实施例5
细胞迁移评估皮肤屏障修复作用
原理：当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上划痕工具制造一个空白区域，空白区域的细胞被机械力去除掉了，通过一段时间的培养，观察细胞向无细胞区域迁移的情况，通过测量细胞的迁移距离反映细胞的迁移能力。
操作步骤：
1、培养板划线。首先使用Marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线，划线时注意线不要太粗。
2、铺细胞。在孔中加入约5×105个细胞(不同的细胞数量有所不同，根据细胞的生长快慢调整)，接种原则为过夜后融合率达到100％。
3、细胞划线。第二天用枪头，垂直于细胞平面，沿着头一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕(不同孔之间最好使用同一只枪头)。
4、洗细胞。划痕完成后，使用无菌PBS洗细胞3次，洗去不贴壁的细胞，即划线时划线的细胞，划线后留下的间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基。
5、细胞培养、观察。样品(实施例1产物、神经酰胺3B)用培养基稀释后(浓度为0.08mM)加入细胞培养皿，将细胞放入37℃、5wt％CO2培养箱培养，在24h取出细胞，显微镜观察并测量划痕的宽度，并拍照，用Image J软件计算愈合率。
结果如图3所示，相比溶剂对照组，实验组的划痕宽度更窄，说明橄榄油神经酰胺具有更好的组织愈合能力。溶剂对照组在24h后的愈合率为31.25％，橄榄油神经酰胺在24h后的愈合率为74.48％，神经酰胺3B在24h后的愈合率为59.32％。本发明的化合物明显提升了细胞愈合速率，具备良好的皮肤组织修复活性，而且效果比神经酰胺3B更好。
实施例6
弹性蛋白酶抑制实验测试抗衰老作用
弹性蛋白酶抑制方法：取2mg/mL弹性蛋白酶溶液2mL，加入不同浓度实施例1产物，充分涡旋混匀，在37℃、400r/min摇床振荡20min，立即加入pH6.0的0.5mol/L磷酸盐缓冲液5mL，涡旋混匀，取混匀液适量至2mL离心管内，在9 391×g下离心10min，精密吸取上清液200μL至96孔板内，在波长495nm处酶标仪测定吸光度，同时进行400～800nm光谱扫描。
以底物加酶溶液为空白对照组，底物加酶和样品溶液为酶抑制组，底物加样品不加酶溶液作扣背景用。每组均设3复孔。抑制率(％)＝[1–(An–An′)/(A0–A0′)]×100％，式中，A0为加酶不加样品的吸光度，A0′为仅加底物不加样品和酶的吸光度，An为仅加样品溶液的吸光度，An′为加样品不加酶的吸光度。若An′>An，则表现为促进作用，促进率(％)＝[1–(An′–An)/(A0–A0′)]×100％。
结果如图4所示，橄榄油神经酰胺在不同浓度下对弹性蛋白酶均具有较好的抑制效果，具体而言，在250mg/L的浓度时对弹性蛋白酶的抑制率为11.13％，在500mg/L的浓度时对弹性蛋白酶的抑制率为21.67％，在1000mg/L的浓度时对弹性蛋白酶的抑制率为30.26％，在2000mg/L的浓度时对弹性蛋白酶的抑制率为19.81％。
按照相同的方法测试神经酰胺3B对弹性蛋白酶的抑制活性，在浓度为582mg/L(即1mmol/L)时的弹性蛋白酶抑制率为9.76％，其抑制效果不如相近浓度的橄榄油神经酰胺。
实施例7
LPS诱导细胞法检测抗炎修复功效
将B16小鼠黑色素瘤细胞以密度1×104个/孔种于96孔板，置于培养箱内贴壁过夜，24h后弃去上清液，加入100μL经DMEM培养基稀释的不同浓度的实施例1产物，阴性对照组为不含样品的DMEM培养基，每组3个复孔，在5wt％CO2、37℃环境中孵育。给药2h后脂多糖模型组与实验组加入10μg/mL LPS并共同孵育至24h。反应结束后取细胞上清液50μL，使用IL-6ELISA试剂盒检测细胞内IL-6基因表达。
结果如图5所示，在工作浓度为10μg/mL的LPS刺激下，IL-6水平为基础水平的12.51倍。在浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L的橄榄油神经酰胺的作用下，IL-6因子水平显著降低，分别为基础水平的11.13，10.26，8.31，6.10倍，呈剂量依赖性，这证明橄榄油神经酰胺具有良好的抗炎效果，可以促进炎症受损皮肤的修复。
实施例8
MMP1又称间质性胶原酶、基质金属蛋白酶，属基质金属蛋白酶家族，其主要作用底物为纤维性胶原，可降解细胞外基质中的胶原纤维和明胶及改变细胞的微环境。MMP1在弹性蛋白中起着重要作用，抑制MMP1可提高成纤维细胞胶原蛋白和弹性蛋白合成，MMP活性降低可增加胶原合成速度。
将HaCaT细胞以1×105个/孔的密度种于96孔板，培养箱内过夜。24h后弃去上清液，加入含不同浓度的实施例1产物(模型组不加入药物)的培养基100μL，阴性对照组为不含药物的DMEM培养基，每组3个复孔，在质量分数5％CO2、37℃环境中孵育2h后，辐射UVA紫外线。紫外线辐射光源与细胞之间的距离为15cm，UVA强度为200mJ/cm2，辐射时间为1.5h，结束辐射后，在培养箱内继续孵育12h。使用MMP-1ELISA试剂盒检测细胞内MMP-1基因表达。
结果如图6所示，阴性对照组的MMP1表达量设为1，模型组的表达量为1.67，橄榄油神经酰胺在50mg/L的浓度时，MMP1的表达量为1.50，在100mg/L的浓度时，MMP1的表达量为1.39，在150mg/L的浓度时，MMP1的表达量为1.32，在200mg/L的浓度时，MMP1的表达量为1.34，浓度越高，对MMP1的抑制效果越显著。
UVA紫外线辐射后，角质形成细胞促进成纤维细胞MMP1表达升高，从而引起皮肤细胞外基质和皮肤胶原降解，导致皮肤光老化。上述结果表明，橄榄油神经酰胺可以抑制紫外线辐射导致的成纤维细胞产生MMP1，对防止皮肤光老化有一定作用。
实施例9
DPPH自由基清除检测抗氧化性能
DPPH是1,1-二苯-2-三硝苯肼，可以用于抗氧化实验。
将对应浓度(50、100、200、400、800mg/L)样品分别与0.1mol/L DPPH、无水乙醇溶液按1：1的体积比例混合均匀，DPPH与无水乙醇1：1等体积混合，室温避光反应30min，于517nm处测吸光值。样品与DPPH反应液的吸光度记作A1，样品与无水乙醇反应液的吸光度记作A2，DPPH与无水乙醇反应液的吸光度记作A3，样品的DPPH清除率＝[1-(A1-A2)/A3]×100％。
结果如图7所示，在浓度为50、100、200、400、800mg/L时的DPPH自由基清除率分别为29.42％、39.49％、46.77％、55.26％和67.01％，表现出优异的抗氧化效果。按照相同的方法测试神经酰胺3B(即油酸神经酰胺)的抗氧化效果，结果如图8所示，在浓度为50、100、200、400、800mg/L时的DPPH自由基清除率为7.76％、12.82％、24.10％、29.60％、33.16％。橄榄油神经酰胺对DPPH的清除率高于神经酰胺3B(油酸神经酰胺)，具有更好的抗氧化效果。
实施例10
美白活性测试
取指数生长期B16细胞，用质量分数0.25％胰蛋白酶-EDTA消化并吹打均匀，将细胞按3×105个/孔的密度接种于12孔板。于37℃、质量分数5％CO2环境中培养过夜。弃去上清液，加入含不同质量浓度样品的培养液，以不加药物的RPMI-1640培养基孵育为空白组，加DMEM培养基孵育为造模组，每组3个复孔，在质量分数5％CO2、37℃环境中孵育24h。将孔板中培养基弃去，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一到两次后，加入1mL含质量分数10％DMSO的NaOH溶液(1mol/L)，置于80℃或100℃下恒温2h至细胞完全溶解。置于酶标仪中，于405nm下测吸光值。计算出黑素抑制生成率＝(各孔OD值/空白组OD值)×100％。
结果如图9所示，造模组的黑色素表达为157.36％，在浓度为10、20、40、80、100mg/L时，橄榄油神经酰胺的黑色素抑制率分别为147.77％、131.84％、120.56％、108.82％、96.28％，橄榄油神经酰胺表现出很好的美白效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.橄榄油神经酰胺，其由橄榄油脂肪酸与鞘氨醇类化合物反应得到，所述鞘氨醇类化合物选自鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇。
2.根据权利要求1所述的橄榄油神经酰胺，其特征在于，所述橄榄油脂肪酸由橄榄油水解得到。
3.根据权利要求1或2所述的橄榄油神经酰胺，其特征在于，所述橄榄油脂肪酸含有20～83wt％油酸和3.5～70wt％亚油酸。
4.橄榄油神经酰胺，其组成包括：油酸神经酰胺，亚油酸神经酰胺，棕榈酸神经酰胺，硬脂酸神经酰胺，亚麻酸神经酰胺。
5.根据权利要求4所述的橄榄油神经酰胺，其组成包括：20～83wt％油酸神经酰胺，7.5～20wt％棕榈酸神经酰胺，3.5～70wt％亚油酸神经酰胺，0.5～5wt％硬脂酸神经酰胺，0.1～1.0wt％亚麻酸神经酰胺。
6.根据权利要求4或5所述的橄榄油神经酰胺，其组成还包括：0～3.5wt％棕榈油酸神经酰胺、0～0.6wt％花生酸神经酰胺、0～0.4wt％二十碳烯酸神经酰胺、0～0.3wt％十七烷酸神经酰胺、0～0.3wt％十七碳一烯酸神经酰胺、0～0.2wt％山嵛酸神经酰胺、0～0.2wt％二十四烷酸神经酰胺、0～0.05wt％豆蔻酸神经酰胺。
7.权利要求1～6任意一项所述的橄榄油神经酰胺的合成方法，包括以下步骤：
在缩合剂条件下，橄榄油脂肪酸与鞘氨醇类化合物反应，所述缩合剂为EDCI和Et3N；
所述橄榄油脂肪酸、鞘氨醇类化合物、EDCI、Et3N的摩尔比为1：(1～1.5)：(1～2)：(1～2)，所述反应的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈中的至少一种。
8.权利要求1～6任意一项所述的橄榄油神经酰胺在化妆品、药品、膳食品或保健品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述橄榄油神经酰胺具有皮肤屏障修复、组织愈合、抗衰老、抗炎、抗光老化、抗氧化、促进胶原合成、提高弹性蛋白、美白功效中的至少一种。
10.一种组合物，包括权利要求1～6任意一项所述的橄榄油神经酰胺，所述组合物具有皮肤屏障修复、组织愈合、抗衰老、抗炎、抗光老化、抗氧化、促进胶原合成、提高弹性蛋白、美白功效中的至少一种。
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