CN1261458C - 化学修饰法制备具有谷胱苷肽过氧化物酶活性的含硒透明质酸化合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于含硒透明质酸的制备技术。采用简单的化学合成法，以透明质酸多糖分子中的-OH作为活化修饰部位，以NaHSe作为修饰剂，硒化透明质酸。产物硒化后经氧化，得到产品硒化透明质酸，每克透明质酸含硒量约为280μg。硒和多糖的结合，提高了硒和多糖各自的效用，本发明正是巧妙的利用天然透明质酸及硒的性质，使硒化后的透明质酸具有较原透明质酸更高的抗氧化活性，更重要的是增添了新的GPX活性，深入挖掘了硒化多糖在提高机体免疫力，预防和治疗包括肿瘤在内的多种疾病的巨大潜力。

Description

化学修饰法制备具有谷胱苷肽过氧化物酶活性的含硒透明质酸化合物

技术领域  本发明是利用化学修饰的方法制备具有高谷胱苷肽过氧化物酶(GPX)活性的含硒透明质酸的技术。该发明利用天然透明质酸的性质，使硒化后的透明质酸不但其抗氧化活性较纯透明质酸有所提高，而且还增添了新的GPX活性。硒和透明质酸的结合同时提高了硒和透明质酸各自的效用，这为硒化多糖在提高机体免疫力，预防和治疗包括肿瘤在内的多种疾病的应用上提供了应用前景。

背景技术

1.透明质酸由于透明质酸具有抗氧化性，故有“皮肤清道夫”的美誉，对分解皮肤表面由于太阳紫外线照射产生的超氧自由基起到关键作用。透明质酸及其衍生物又作为基础药物与各类治疗药物组成的复方制剂中的载体，把不同的治疗药物导向并保留在人体各个不同的病理部位，这样不仅可以使药物作用到更精确的靶位上，在提高治疗药物在病理部位的浓度，大大增强疗效的同时，又可避免很多药物的全身性副作用。透明质酸同载体激素、抗生素等制成的长效或定向释放制剂也有很好的发展前景。透明质酸经交联后形成的不同分子量和溶解度的大分子聚合物，可作为缓释剂。新近研究表明透明质酸与癌症的发生有密切关系。在诸多影响癌浸润及转移的因素中，普遍存在于细胞外基质中的透明质酸与癌细胞表面、内部相应受体的相互作用，已引起广泛重视。细胞周期蛋白CD44是癌症发生的关键因子，现有研究表明，透明质酸能够特异性的与之亲和。这种特性引起了人们的广泛关注。以透明质酸为载体的抗癌靶向药物如：透明质酸-氟脲嘧啶，透明质酸-二氯灭痛等，已经进入三期临床阶段。

2.硒硒是人体必须的微量元素，具有抗氧化，抗衰老，增强机体的抗肿瘤免疫能力，尤其较高浓度的硒能够对肿瘤细胞增殖起到强烈的抑制作用，其在体内循环途径的起始价态是-2价。硒能显著的影响机体内的免疫***，所以提高机体内血硒水平能够对许多由缺硒引起的地方性疾病如克山病、大骨节病、肝癌等起到预防和治疗作用。体内的硒蛋白酶谷胱苷肽超氧化物酶(GSH-Px)可降低或清除脂质过氧化物产生的自由基对膜的伤害，防止膜质过氧化，保护生物膜不受损伤的功能。在我国，最早的含硒化合物处于提取阶段，中国专利92107669.X公开了题为“硒多糖及其制备方法”，介绍了从富硒酵母中提取硒多糖的制备方法，该方法的生物利用度有了很大的提高，但仍不十分理想，且产物仅为葡聚糖和硒的结合物，其生物活性也未见报道。还有相关专利报道了其他种生物多糖，如卡拉胶，它是一种来源于中国海南岛的植物多糖，经过动物实验证明，硒化卡拉胶较***钠具有更好的生物利用度和生物增益效应，而且毒性小。但报道的方法是将硒转化为硝酸盐再进行硒化，引入了杂质，分离提纯步骤复杂。该法最终得到的硒化多糖中，硒以硒酸酯(+7价)和硒氢(-2价)两种形式存在，+7价硒不能像-2价的硒那样被人体直接吸收并行使生物功能，并且毒性药显著大于-2价硒。并且由于其所用原料为植物多糖类物质，它的组织相容性问题将限制其作为注射类药物在临床中应用。我们所采用的方法原料为透明质酸，现有研究已表明其具有非常良好的组织相容性，目前已经被广泛应用为药物载体。

2.鉴于含硒酶在预防和治疗白内障、克山病、心血管病、炎症及癌症等方面的巨大应用潜力，而天然含硒酶自身具有诸如来源有限，体外环境中易失活，分子量大，容易引起人体内免疫反应等缺点。近年来，科学工作者一直致力与对新型含硒酶的开发和活性的模拟。最早的含硒酶模拟物有Ebselen(PZ51)，Glutaselenone等，虽然已有详细的实验证明这些模拟物具有较好的GPX活性和在医用制药方面的开发潜力，但同时模拟物自身也存在水溶性差、催化效率低等缺点，如PZ51，Glutaselenone的催化效率仅为天然GPX的千分之一左右。八十年代后期，抗体酶的制备进入了新阶段，但普遍的催化效率要比天然酶低2-3个数量级。到了九十年代初，人们开始应用化学合成法人工模拟含硒酶，如中国专利94102481.4公开了题为“化学突变具有底物结合部位的单克隆抗体制备含硒抗体酶”，介绍了用标准单抗制备技术和简单的化学突变相结合的方法制备活力为天然兔肝GPX0.21倍的含硒抗体酶的方法；在此基础上，中国专利96112628.0公开了题为“活力高于天然酶的含硒抗体酶的制备方法”，介绍了制备具有底物结合部位和催化部位共同组成活性中心输水腔的单抗，近而得到活力可达天然兔肝GPX10倍的抗体酶的方法，但上述的方法都是以蛋白质为基本出发点合成的模拟物，无法避免由外源蛋白质引入体内导致的免疫***发生的排斥反应，所以很难应用于医药制剂及临床治疗。中国专利00133040.3公开了题为“含硒环糊精及其在制备治疗白内障药物中的应用”，介绍了运用简单的化学合成方法，以环糊精为酶的底物结合部位，制备活力为PZ51GPX7倍的硒化环糊精，其稳定性和抗氧化活性较好。但相对于透明质酸来讲，环糊精不具备靶向性药物载体的作用，因此以环糊精为底物合成的含硒化合物应用于临床治疗，具有副作用大，药物疗效低的缺点。

透明质酸作为主要的生产原料，可通过生物体内提取和微生物发酵法大量制备，这就很好的解决了成本高的问题。经过对透明质酸性质的研究，新开发的模拟物在制备阶段不经历如上述专利所述的PMSF的活化过程，这与已有的方法相比较，不但降低了生产的成本，而且整个制备过程都不引入新的杂质，简化了产品的制备、分离提纯等步骤，也使模拟物生产成本大大降低，工艺简化，而生物活性较环糊精硒化产物提高近10倍。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种简单工艺制备具有GPX活性及抗氧化活性的含硒多糖。其原理为以透明质酸多糖分子中的-OH作为修饰部位，以NaHSe作为修饰剂，硒化透明质酸。产物经硒化后具有GPX活性和高抗氧化活性。

本发明的制备工艺为：NaHSe与透明质酸水溶液在特定条件下反应生成含-SeH的透明质酸；硒化的透明质酸经空气中氧化，生成双硒桥联化合物。经已醇沉淀，离心，弃上清，沉淀用乙醇、丙酮反复洗涤，挥去有机溶剂，样品冷冻干燥，得含硒透明质酸纯品。

由本发明制备工艺可以得到的含硒透明质酸为淡黄色粉末状物质，每克含硒透明质酸的含硒量约为280μg。所含硒价态为-2价。

上述的制备方法中，所说的透明质酸水溶液的浓度为1～10mg/mL，其最佳用量为5mg/mL。

所说的透明质酸水溶液，在硒化前最好通氮气除氧，然后密封备用。

透明质酸与NaHSe的用量摩尔比为1∶1000～1∶25000，其最佳摩尔比为1∶2500。

透明质酸硒化反应时间为6～48h，其最佳反应时间为48h。

透明质酸硒化反应温度为20～80℃，其最佳反应温度为60℃。

本发明有如下特点：

1含硒透明质酸的制备方法独特新颖，为酶的模拟物开发提供了一条新的路线。

2含硒透明质酸制备方法简单。

3含硒透明质酸的活性广泛，且活力高。

4含硒透明质酸具有硒和多糖双方面的应用前景，多方面的应用潜力，可作多种药物的开发。

具体实施方式

1.双硒桥联透明质酸的合成路线：

(1)将透明质酸用水充分溶解至浓度为5mg/mL，取100ml该水溶液在容器中通高纯氮气除氧10min，保证反应体系的惰性环境，然后密封备用。

(2)NaHSe的制备：将2.028g NaBH₄溶解于25mL水中，再将1.974g硒粉加入到NaBH₄中，此时观察到水中有大量的气体生成，并伴随有热量放出，待泡沫逐渐消退时，盖上一插有针头的胶塞，反应结束后，反应体系冷却，有大量的盐析出，液体呈无色。由于NaBH₄与H⁺反应，伴随有少量H₂Se产生，为防止中毒，反应在通风橱中进行。反应的方程式如下：

(3)取制备好的NaHSe水溶液25mL，迅速加至如(1)所示的透明质酸水溶液中，迅速密封反应体系，防止NaHSe被氧化，开始硒化反应。反应的方程式为：

             

(4)将硒化反应体系置于60℃的水浴中，反应48h。

(5)透明质酸硒化反应后产物充分暴露于空气中，使过量的NaHSe充分氧化。

(6)氧化后的含硒透明质酸用1mol/L的HCl调pH值至7.0。

(7)用乙醇将含硒透明质酸沉淀，收集沉淀，经乙醇、丙酮反复洗涤后，冷冻干燥，得含硒透明质酸纯品。

2.硒含量测定

将硒化后的透明质酸配成1.5mg/mL的水溶液，取500μL加入新配制的1mol/L的NaBH₄溶液50μL，反应20min后，用1mol/L的咪唑淬灭，用1mol/L的HCl调pH值至中性，精确测量终体积。取多糖溶液158μL，加入2.79ml的pH 8.0的Tris-HCl Buffer，再加入30μL 0.01mol/L的DTNB分析液。反应10min后测定其在412nm处吸光度值，以蒸馏水代替糖溶液做参比.测定含硒量。测定在上述制备条件下生成的每克含硒透明质酸含硒量约为280μg。

3.硒化透明质酸活性研究

(1)硒化透明质酸的GPX活性

测活体系500μL，含50mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.0、1mmol/L叠氮钠。1mmol/L谷胱苷肽，0.25mmol/LNADPH，1U谷胱苷肽还原酶，加入0.5mmol/LH₂O₂启动反应，在340nm处监测NADPH被氧化的吸光度变化。测定酶活时，以蒸馏水代替含硒多糖作为空白对照。酶活力单位定义为每分钟每微摩尔含硒多糖消耗1微摩尔NADPH为一个活力单位。最终测定在上述条件下得到的含硒多糖的比活力为75.2U/μmol。

(2)硒化透明质酸的抗氧化活性研究

测活体系为3ml，取用上述制备的硒化透明质酸溶液100μL，加入2ml蒸馏水，依次加入20mmol/L的水杨酸钠300μL，0.5mmol/L的FeSO₄300μL，最后加入60mmol/L的H₂O₂300μL，将反应体系在32℃的水浴中反应1h后，在752分光光度计上测定其在510nm处的吸光度值。测定活力时以蒸馏水代替糖溶液作参比，以相同浓度的纯透明质酸水溶液代替糖溶液作对照，最终测定其抗OH·的活性在20μg/ml时的抑制率达到75％，是未经修饰的透明质酸的400多倍。

4.硒化条件对产物含硒量的影响

(1)将透明质酸用水充分溶解至不同浓度，浓度分别为，1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，5mg/mL，8mg/mL，10mg/mL，取100ml该水溶液进行如1中所示的硒化反应，得到其硒含量分别为每克透明质酸中含硒78，156，197，280，221，186μg。最终得到在透明质酸水溶液最佳浓度为5mg/mL时，其产物含硒透明质酸兼具硒含量高和溶解性好特点。

(2)将5mg/mL的透明质酸与NaHSe的用量摩尔比分别配制成1∶1000，1∶2500，1∶5000，1∶12500，1∶17500，1∶25000，用不同的透明质酸与NaHSe用量摩尔比进行如1中所示的硒化反应，得到其硒含量分别为每克透明质酸中含硒227，268，292，315，323，344μg。最终得到在透明质酸与NaHSe的用量最佳摩尔比为1∶2500时，其产物含硒透明质酸兼具硒含量高和硒利用率高的特点。

(3)将5mg/mL的透明质酸进行硒化，反应时间分别为6，12，24，36，48h，用不同的透明质酸硒化时间进行如1中所示的硒化反应，得到其硒含量分别为每克透明质酸中含硒123，157，185，257，282μg。最终得到在透明质酸硒化反应最佳时间为48h时，其产物含硒透明质酸具有硒含量高的特点。

(4)将5mg/mL的透明质酸进行硒化，反应温度分别为20，40，50，60，70，80℃，用不同的透明质酸硒化温度进行如1中所示的硒化反应，得到其硒含量分别为每克透明质酸中含硒36，128，207，292，331，364μg。最终得到在透明质酸硒化反应最佳温度为60℃时，其产物含硒透明质酸兼具硒含量高和透明质酸降解程度小的特点。

Claims (9)

1.一种含硒透明质酸的制备方法，其特征在于：含硒透明质酸为硒和透明质酸的化合物，其制备工艺为：NaHSe与透明质酸水溶液反应生成含-SeH的透明质酸，反应结束后将反应体系暴露于空气中氧化，除去过量的硒，产物经乙醇沉淀，离心，收集沉淀，用乙醇、丙酮反复洗涤，挥去有机溶剂，样品冷冻干燥，得含硒透明质酸纯品。

2.一种如权利要求1所示的含硒透明质酸的制备方法，得到的含硒透明质酸为淡黄色粉末状物质，每克含硒透明质酸的含硒量约为280μg，所含硒价态为-2价。

3.一种如权利要求1所示的含硒透明质酸的制备方法，其特征为透明质酸水溶液的浓度为1～10mg/mL。

4.一种如权利要求1所示的含硒透明质酸的制备方法，其特征为透明质酸水溶液在硒化前通氮气除氧，然后密封备用。

5.一种如权利要求1所示的含硒透明质酸的制备方法，其特征为透明质酸与NaHSe的用量摩尔比为1∶1000～1∶25000。

6.一种如权利要求1所示的含硒透明质酸的制备方法，其特征为透明质酸硒化反应时间为6～48h。

7.一种如权利要求1所示的含硒透明质酸的制备方法，其特征为透明质酸硒化反应温度为20～80℃。

8.一种如权利要求1所示的含硒透明质酸的制备方法，其特征为透明质酸硒化反应后产物在空气中氧化，除去过量的NaHSe。

9.一种如权利要求1所示的含硒透明质酸的制备方法，其特征为在氧化除去过量的硒之后，含硒透明质酸用HCl调pH值至7.0。