CN113913421A - 全血dna提取试剂及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及全血DNA提取试剂及提取方法。本发明提供的全血DNA提取试剂由裂解液、异丙醇、磁珠悬液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液、蛋白酶K组成。其中裂解液由胍类化合物、三羟甲基氨基甲烷、稳定剂和表面活性剂组成。该试剂操作简便，可在自动化核酸提取仪上一步法实现样本裂解、核酸与磁珠结合，所得基因组DNA含量高，完整度好，纯度高，并可同时完成1‑96个样本提取，实现快速、高通量、完全自动化的提取纯化核酸。

Description

全血DNA提取试剂及提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及全血DNA提取试剂及提取方法。
背景技术
随着分子生物学技术飞速发展，基因组水平上的研究已成为研究热点。分子生物学的很多常规实验都需要以提取基因组DNA为前提，无论是PCR扩增、基因测序、还是构建基因组文库，都需要提取基因组DNA，且提取到的基因组DNA质量会直接影响下游分子生物学实验。随着现代疾病诊断技术和精准医疗的蓬勃发展，需要处理的样品量日益增多，因此高效、可靠、高通量的DNA提取方法成为相关研究领域的迫切需求。
目前基因组DNA提取纯化的方法有多种，如苯酚氯仿抽提法、SDS法、离心柱法和磁珠法，这些方法各有优缺点。并且基于以上方法研究的全血DNA提取试剂盒种类繁多，但当前的全血DNA提取试剂盒提取时存在诸多缺点，如样本需要前处理且处理时间长、提取过程复杂、提取过程耗时较长、易造成样本间的交叉污染等。当样本量较多时，易出错且浪费大量的时间及人力物力。
自动化核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸的提取工作的仪器，核酸提取仪分为两类：一类是大型自动化仪器，一般称为自动液体工作站，其价格昂贵运行成本高，适合一次提取几千个同一种类标本。另一类是小型自动化提取仪器，其利用封装好的配套试剂自动完成提取纯化过程，其设备价格低、运行成本也较低，并且操作方便，因此得到了越来越多的应用。
小型自动化提取仪器的配套试剂对提取效果存在显著的影响，而目前仅有少数试剂盒可实现高通量、自动化的提取，且细胞裂解和与磁珠结合的步骤必须分开进行，并未实现完全自动化。因此，为更有效的配合磁珠法提取核酸的使用，提供高通量、完全自动化的全血DNA提取试剂势在必行。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供高通量、完全自动化的全血DNA提取试剂及提取方法
本发明提供的全血DNA提取试剂，包括裂解液、磁珠、异丙醇、洗涤液I、洗涤液Ⅱ、洗脱液和蛋白酶K；
所述裂解液包括：胍类化合物、三羟甲基氨基甲烷、稳定剂和表面活性剂；
所述洗涤液I包括：胍类化合物、三羟甲基氨基甲烷、稳定剂、表面活性剂和异丙醇；
所述洗涤液Ⅱ为乙醇水溶液；
所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷。
本发明提供的全血DNA提取试剂操作简便，可在自动化核酸提取仪上一步法实现样本裂解、核酸与磁珠结合，所得基因组DNA含量高，完整度好，纯度高，并可同时完成1～96个样本提取，实现快速、高通量、完全自动化的提取纯化核酸。
本发明中，所述裂解液由水和1M～10M胍类化合物、10mM～50mM三羟甲基氨基甲烷、5mM～50mM稳定剂、1vol％～10vol％表面活性剂组成。
本发明中，所述洗涤液I由水和0.5M～5M胍类化合物、0.1M～1M氯化钠、1mM～10mM稳定剂、5mM～20mM三羟甲基氨基甲烷、0.5vol％～10vol％表面活性剂、40vol％～80vol％异丙醇组成。
一些实施例中，所述胍类化合物为盐酸胍或异硫酸氰胍中至少一种。所述表面活性剂选自Tween-20、Triton X-100、NP-40中至少一种。所述稳定剂选自EDTA或柠檬酸钠。
一些具体实施例中，所述裂解液有水和1M～10M盐酸胍、10mM～50mM三羟甲基氨基甲烷、5mM～50mM EDTA和1vol％～10vol％表面活性剂组成。
一些具体实施例中，所述洗涤液I由水和0.5M～5M盐酸胍、0.1M～1M氯化钠、1mM～10mM EDTA、5mM～20mM三羟甲基氨基甲烷、0.5vol％～10vol％表面活性剂和40vol％～80vol％异丙醇组成。
本发明中，所述磁珠为氧化硅羟基纳米磁珠。超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，直径为100～2000nm。本发明所述磁珠存在于磁珠悬液中。其中悬浮磁珠的缓冲液为10％～80％的乙醇水溶液。采用的磁珠悬液中，磁珠的浓度为5-50mg/mL。作为优选，磁珠的浓度为10mg/mL。
本发明中，所述洗涤液II为体积分数为60％～100％的乙醇水溶液。优选的，所述洗涤液II为体积分数为70％的乙醇水溶液。
本发明中，所述洗脱液的pH值为7.0～9.0，其中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1mM～50mM。作为优选，洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mM。
本发明中，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
本发明提供的试剂可以用于制备全血DNA提取的试剂盒。
所述全血DNA提取试剂盒中，包括本发明所述的提取试剂。所述试剂盒中还可以包括提取所需的其他工具或试剂。
本发明还提供了一种全血DNA的提取方法，其包括：
步骤1：将全血、蛋白酶K、裂解液、异丙醇和磁珠混合，孵育反应后，分离磁珠；
步骤2：将步骤1分离出的磁珠依次经洗涤液I、洗涤液II洗涤后，以洗脱液洗脱后，分离磁珠取上清液，获得全血DNA溶液。
本发明中，所述全血为新鲜的全血或抗凝全血。其中抗凝剂对提取的结果不产生影响。
本发明中，所述全血、蛋白酶K、裂解液、异丙醇和磁珠的体积比为200:10:300:300:10。
本发明中，步骤1所述孵育反应的条件包括55℃孵育5min，然后结合反应5min；步骤2所述洗脱的条件包括55℃孵育5min。
本发明提供的全血DNA提取试剂由裂解液、异丙醇、磁珠悬液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液、蛋白酶K组成。其中裂解液由胍类化合物、三羟甲基氨基甲烷、稳定剂和表面活性剂组成。该试剂操作简便，可在自动化核酸提取仪上一步法实现样本裂解、核酸与磁珠结合，所得基因组DNA含量高，完整度好，纯度高，并可同时完成1-96个样本提取，实现快速、高通量、完全自动化的提取纯化核酸。
附图说明
图1为具体实施例1中采用本发明方法与Omega磁珠法血液提取试剂盒提取方法的基因组完整度比较示意图；
图2为具体实施例2中采用本发明方法向96深孔板各列中加入试剂的示意图。
具体实施方式
本发明提供了全血DNA提取试剂及提取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种基于纳米磁珠的全血DNA提取试剂盒，该试剂盒由裂解液、异丙醇、磁珠悬液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液、蛋白酶K组成。
所述裂解液含有胍类化合物、三羟甲基氨基甲烷、稳定剂和表面活性剂；所述胍类化合物选自盐酸胍、异硫酸氰胍或其组合；磁珠为氧化硅羟基纳米磁珠；洗涤液Ⅰ包括胍类化合物、三羟甲基氨基甲烷、稳定剂、表面活性剂、异丙醇；所述表面活性剂选自Tween-20、Triton X-100、NP-40或其组合；所述稳定剂为EDTA或柠檬酸钠。洗涤液Ⅱ为乙醇溶液；洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷。
所述磁珠悬液中，磁珠为氧化硅羟基纳米磁珠，具体为超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，直径为100～2000nm、浓度为5-50mg/mL。
所述裂解液pH值为7.0～10.0，包含1～10M胍类化合物、10～50mM三羟甲基氨基甲烷、5～50mM稳定剂、1～10％表面活性剂。所述胍类化合物选自盐酸胍、异硫酸氰胍或其组合。
所述洗涤液包括洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ；洗涤液Ⅰ包含0.5～5M盐酸胍、0.1～1M氯化钠、1～10mM稳定剂、5～20mM三羟甲基氨基甲烷、体积比为0.5～10％的表面活性剂、体积比为40～80％的异丙醇。所述表面活性剂选自Tween-20、Triton X-100、NP-40或其组合。洗涤液Ⅱ包含体积比为60～100％的乙醇。
所述洗脱液包括0.1～50mM三羟甲基氨基甲烷，pH值为7.0～9.0。
本发明提供了一种上述试剂盒的一步法提取全血DNA的应用方法，包括以下步骤：
(1)取一个新的离心管，向其中加入冷冻的抗凝全血或新鲜全血，蛋白酶K、裂解液、异丙醇和纳米磁珠，涡旋混匀，于55℃条件下孵育5分钟，然后结合反应5分钟，将离心管置于磁性分离器上，弃去EP管中全部液体；
(2)向离心管中加入洗涤液Ⅰ，振荡混匀，置于磁性分离器上，弃去离心管中全部液体，重复此步骤一次；
(3)向离心管中加入洗涤液Ⅱ，振荡混匀后，置于磁性分离器上，弃去离心管中全部液体；
(4)向离心管中加入洗脱液，于55℃条件下孵育5分钟，置于磁性分离器上，弃去离心管中全部液体，将洗脱液转移至新的离心管内，-20℃保存备用。
其中，步骤(1)中加入的裂解液为200～400μL，异丙醇为200～400μL，全血为100～300μL，纳米磁珠为50～200μL；步骤(2)、(3)中加入的洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ为400～1000μL；步骤(4)中加入的核酸洗脱液为50～200μL。
本发明还提供了一种上述试剂盒一步法核酸提取的应用方法，包括以下步骤：
(1)所述96深孔板第1列和第7列依次加入冷冻抗凝全血或新鲜全血、蛋白酶K、裂解液、异丙醇；
(2)所述96深孔板第2列和第8列加入纳米磁珠；
(3)所述96深孔板第3列和第9列加入洗涤液Ⅰ；
(4)所述96深孔板第4列和第10列加入洗涤液Ⅰ；
(5)所述96深孔板第5列和第11列加入洗涤液Ⅱ；
(6)所述96深孔板第6列和第12列加入洗脱液；
(7)运行核酸提取仪，结束后将96深孔板第6列和第12列的洗脱液转移至新的EP管内，-20℃保存备用。
其中，步骤(1)中加入的裂解液为200～400μL，异丙醇为200～400μL，全血为100～300μL；步骤(2)中加入的纳米磁珠为50～200μL；步骤(3)、(4)、(5)中加入的洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ为400～1000μL；步骤(6)中加入的核酸洗脱液为50～200μL。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
试剂盒包括如下七种试剂：
①裂解液：pH值为8.5，包含7M盐酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷、50mM EDTA、10％Tween-20。
②异丙醇。
③纳米磁珠悬液：超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，溶液为30％乙醇，直径为100nm、浓度为10mg/mL。
④洗涤液Ⅰ：4M盐酸胍、1M氯化钠、10mMEDTA、20mM三羟甲基氨基甲烷、体积比为10％的Tween-20、体积比为60％的异丙醇。
⑤洗涤液Ⅱ：体积比为70％的乙醇
⑥洗脱液：10mM三羟甲基氨基甲烷，pH值为8.0
⑦蛋白酶K：浓度为20mg/mL。
实施例2
试剂盒包括如下七种试剂：
①裂解液：pH值为9.0，包含4M异硫酸氰胍、50mM三羟甲基氨基甲烷、50mMEDTA、1％Tween-20。
②异丙醇。
③纳米磁珠悬液：超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，溶液为30％乙醇，直径为100nm、浓度为10mg/mL。
④洗涤液Ⅰ：4M盐酸胍、1M氯化钠、10mMEDTA、20mM三羟甲基氨基甲烷、体积比为10％的Tween-20、体积比为60％的异丙醇。
⑤洗涤液Ⅱ：体积比为70％的乙醇
⑥洗脱液：10mM三羟甲基氨基甲烷，pH值为8.0
⑦蛋白酶K：浓度为20mg/mL。
实施例3：
试剂盒包括如下七种试剂：
①裂解液：pH值为8.5，包含2M盐酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷、50mMEDTA、3％Tween-20。
②异丙醇。
③纳米磁珠悬液：超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，溶液为30％乙醇，直径为100nm、浓度为10mg/mL。
④洗涤液Ⅰ：4M盐酸胍、1M氯化钠、10mMEDTA、20mM三羟甲基氨基甲烷、体积比为10％的Tween-20、体积比为60％的异丙醇。
⑤洗涤液Ⅱ：体积比为70％的乙醇
⑥洗脱液：10mM三羟甲基氨基甲烷，pH值为8.0
⑦蛋白酶K：浓度为20mg/mL。
实施例4
试剂盒包括如下七种试剂：
①裂解液：pH值为8.5，包含9M盐酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷、50mM EDTA、3％Tween-20。
②异丙醇。
③纳米磁珠悬液：超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，溶液为30％乙醇，直径为100nm、浓度为10mg/mL。
④洗涤液Ⅰ：4M盐酸胍、1M氯化钠、10mMEDTA、20mM三羟甲基氨基甲烷、体积比为10％的Tween-20、体积比为60％的异丙醇。
⑤洗涤液Ⅱ：体积比为70％的乙醇
⑥洗脱液：10mM三羟甲基氨基甲烷，pH值为8.0
⑦蛋白酶K：浓度为20mg/mL。
效果验证
分别采用不同的方法利用各实施例的试剂盒对全血样品进行提取：
一、一步法提取全血DNA，包括以下步骤：
(1)取一个新的离心管，向其中加入200μL抗凝全血或新鲜全血，10μL蛋白酶K、300μL裂解液、300μL异丙醇和10μL纳米磁珠，涡旋混匀，于55℃条件下孵育5分钟，然后结合反应5分钟，将离心管置于磁性分离器上，弃去EP管中全部液体；
(2)向离心管中加入500μL洗涤液Ⅰ，振荡混匀，置于磁性分离器上，弃去离心管中全部液体，重复此步骤一次；
(3)向离心管中加入500μL洗涤液Ⅱ，振荡混匀后，置于磁性分离器上，弃去离心管中全部液体；
(4)向离心管中加入100μL洗脱液，于55℃条件下孵育5分钟，置于磁性分离器上，弃去离心管中全部液体，将洗脱液转移至新的离心管内，-20℃保存备用。
完成上述实验的同时，使用对照试剂Omega磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒提取相同的全血样品，洗脱体积100μL。
琼脂糖凝胶电泳检测：对提取的6份全血DNA进行琼脂糖凝胶电泳。图1显示所提取的DNA条带单一，清晰完整，无降解，提取的DNA条带亮度与Omega磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒效果相当。
将本发明实施例1试剂盒和对照试剂(Omega磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒)提取完成后，用OneDrop 1000超微量紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，结果见图1和表1。
表1
Figure BDA0003397222730000081
从图1和表1可看到，本发明试剂盒与Omega磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒提取浓度及纯度处于同一水平。
二、利用自动化提取仪，采用实施例1～4的试剂盒对全血样本进行高通量核酸提取，包括如下步骤：
(1)96深孔板第1列和第7列依次加入200μL全血、10μL蛋白酶K、300μL裂解液和300μL异丙醇；
(2)96深孔板第2列和第8列加入200μL纳米磁珠；
(3)96深孔板第3列和第9列加入500μL洗涤液Ⅰ；
(4)96深孔板第4列和第10列加入500μL洗涤液Ⅰ；
(5)96深孔板第5列和第11列加入500μL洗涤液Ⅱ；
(6)96深孔板第6列和第12列加入100μL洗脱液；
(7)运行核酸提取仪，结束后将96深孔板第6列和第12列的洗脱液转移至新的EP管内，
-20℃保存备用。
核酸自动提取仪程序设置如表2。
表2核酸自动提取仪程序设置
Figure BDA0003397222730000091
图2为96深孔板第1列至12列均加入本发明试剂盒中试剂后的侧视示意图，一个96深孔板一次性可处理16个全血样本。
提取完成后，用OneDrop 1000超微量紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，结果见表3～6。
表3实施例1试剂盒经核酸自动提取仪抽提DNA产物检测结果
Figure BDA0003397222730000092
Figure BDA0003397222730000101
表4实施例2试剂盒经核酸自动提取仪抽提DNA产物检测结果
样品 A260nm A280nm 230nm 260/280 260/230 浓度(ng/μL)
1 0.692 0.364 0.991 1.91 0.7 34.60
2 0.656 0.348 0.834 1.89 0.79 32.78
3 0.932 0.514 1.113 1.81 0.84 46.57
4 0.729 0.399 0.807 1.83 0.91 36.43
5 1.132 0.645 2.136 1.76 0.53 56.59
6 0.969 0.546 1.936 1.78 0.5 48.44
7 0.931 0.529 1.622 1.76 0.57 46.56
8 1.028 0.586 1.826 1.76 0.56 51.40
表5实施例3试剂盒经核酸自动提取仪抽提DNA产物检测结果
Figure BDA0003397222730000102
Figure BDA0003397222730000111
表6实施例4试剂盒经核酸自动提取仪抽提DNA产物检测结果
样品 A260nm A280nm A230nm 260/280 260/230 浓度(ng/μL)
1 1.018 0.563 0.539 1.81 1.89 50.89
2 1.06 0.591 0.607 1.79 1.74 52.99
3 1.169 0.648 0.633 1.8 1.85 58.43
4 1.266 0.705 0.659 1.8 1.92 63.28
5 0.888 0.493 0.505 1.8 1.76 44.42
6 1.023 0.575 0.546 1.78 1.87 51.13
7 0.928 0.519 0.523 1.79 1.77 46.38
8 1.061 0.602 0.675 1.76 1.57 53.07
从表中结果可看到，各实施例皆能够成功提取获得DNA，其中，使用实施例1试剂盒对全血DNA进行提取所得产物含量高且纯度良好。而实施例2～4试剂盒对全血DNA进行提取所得产物相较于实施例1而言含量较低且纯度260/230较差，表明使用该裂解液提取全血DNA的裂解结合能力较差。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.全血DNA提取试剂，其特征在于，包括裂解液、磁珠、异丙醇、洗涤液I、洗涤液Ⅱ、洗脱液和蛋白酶K；
所述裂解液包括：胍类化合物、三羟甲基氨基甲烷、稳定剂和表面活性剂；
所述洗涤液I包括：胍类化合物、三羟甲基氨基甲烷、稳定剂、表面活性剂和异丙醇；
所述洗涤液Ⅱ为乙醇水溶液；
所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷。
2.根据权利要求1所述的全血DNA提取试剂，其特征在于，所述裂解液由水和1M～10M胍类化合物、10mM～50mM三羟甲基氨基甲烷、5mM～50mM稳定剂和1vol％～10vol％表面活性剂组成。
3.根据权利要求1所述的全血DNA提取试剂，其特征在于，所述洗涤液I由水和0.5M～5M胍类化合物、0.1M～1M氯化钠、1mM～10mM稳定剂、5mM～20mM三羟甲基氨基甲烷、0.5vol％～10vol％表面活性剂和40vol％～80vol％异丙醇组成。
4.根据权利要求1～3任一项所述的全血DNA提取试剂，其特征在于，所述胍类化合物为盐酸胍或异硫酸氰胍中至少一种；所述稳定剂选自EDTA或柠檬酸钠中至少一种；所述表面活性剂选自Tween-20、Triton X-100、NP-40中至少一种。
5.根据权利要求1所述的全血DNA提取试剂，其特征在于，所述磁珠为氧化硅羟基纳米磁珠。
6.根据权利要求1所述的全血DNA提取试剂，其特征在于，所述洗涤液II为体积分数为60％～100％的乙醇水溶液。
7.根据权利要求1所述的全血DNA提取试剂，其特征在于，所述洗脱液的pH值为7.0～9.0，其中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1mM～50mM。
8.一种全血DNA的提取方法，其特征在于，包括：
步骤1：将全血、蛋白酶K、裂解液、异丙醇和磁珠混合，孵育反应后，分离磁珠；
步骤2：将步骤1分离出的磁珠依次经洗涤液I、洗涤液II洗涤后，以洗脱液洗脱后，分离磁珠取上清液，获得全血DNA溶液。
9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，全血、蛋白酶K、裂解液、异丙醇和磁珠的体积比为200:10:300:300:10。
10.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，
步骤1所述孵育反应的条件包括55℃孵育5min，然后结合反应5min；
步骤2所述洗脱的条件包括55℃孵育5min。
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