CN110317805B - 一种核酸片段分选纯化试剂及方法 - Google Patents

一种核酸片段分选纯化试剂及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸片段分选纯化试剂及方法，该试剂包括磁珠结合液、洗涤液、洗脱液，可用于对混合物样本中不同区段靶向核酸片段的分选、纯化，所述靶向核酸片段分选步骤如下：将含不同区段的第一核酸混合物与磁珠结合液混匀，室温放置后，再置于磁力架上静置，弃上清液，洗涤、洗脱；所述的第一核酸混合物与磁珠结合液的体积混合比为1:1.2‑0.45。此外还可根据需要选择是否进行第二步分选，即取第一核酸混合物与磁珠结合分离后的上清液作为第二核酸混合物，再次进行结合分离、洗涤、洗脱；可通过调整加入的磁珠结合液的体积分选不同区段的靶向核酸片段。本发明提供的试剂及方法可用于下游的核酸片段分析及二代测序平台文库构建等。

Description

一种核酸片段分选纯化试剂及方法
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种核酸片段分选纯化试剂及方法。
背景技术
英国生物化学家Sanger发明了双氧终止DNA测序法，极大推动了基因测序发展的行业前景，随后逐渐出现第二代测序技术和第三代测序技术，这两种技术一般统称为下一代测序技术(NGS)，下一代测序的应用范围较广，如下几个面：1、Denovo测序、重测序及其他DNA测序；2、RNA测序；3、宏基因组测序；4、表观遗传学。而下一代测序需要的核酸模板不论从质量还是数量都有一定的要求，且核酸模板的片段大小对减小测序误差有着重要的意义。
核酸的分离与纯化技术是分子生物行业的一项基础技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域，核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。在分离纯化中将目标核酸与样品中其他组分分离，例如蛋白质污染物或者其他核酸，通常也称为非靶核酸。而对于某些应用而言，片段大小的差异是区分靶核酸与非靶核酸的重要依据。
目前可以分选不同大小片段的靶核酸的方法有两种，一种采用切胶回收，但其实验方法操作繁琐，耗时长，紫外照射存在一定的危险性，并且易使核酸碱基发生突变。另一种方法在专利US6534262描述到利用聚乙二醇(PEG)和氯化钠来分离沉淀核酸，有效分选出目的核酸片段，但需要处理较长时间，操作复杂，而且核酸混合物中核酸含量较高时，才会有良好的回收效率。因此本发明的目的是提出一个快速，简单，回收率高，还能实现高通量的一种核酸片段分选纯化试剂及方法。
发明内容
为解决现有技术及方法的不足之处，本发明提出一种核酸片段分选纯化试剂及方法，是一种即快速又简单、回收率及纯度高，且能实现自动化移液工作站的高通量操作的分选试剂及方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种核酸片段分选纯化试剂，包含以下组分：磁珠结合液、洗涤液、洗脱液；
所述的磁珠结合液为含10-500mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.5-2.5M盐酸胍、1-50％(W/V)且分子量范围为200-20000的聚乙二醇、1-50mM氯化锂、1-50mM氯化镁、0.5-25％(V/V)的无水乙醇及5-50mg/ml磁性颗粒；
洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水或tris缓冲液或TE缓冲液。
进一步的，所述的聚乙二醇优选分子量为4000-10000，更优选为分子量10000。
进一步的，所述的磁性颗粒为表面包裹亲水性高分子介质并具有活性功能基团羟基的四氧化三铁颗粒，所述颗粒具有超顺性，且粒径为1-3um。
进一步的，所述磁珠结合液的pH为7-8。
进一步的，所述洗脱液的pH为7-8。
一种核酸片段分选纯化方法，基于上述的核酸片段分选纯化试剂实现。方法如下：将含不同区段的第一核酸混合物与磁珠结合液混匀，室温放置后，再置于磁力架上静置，弃上清液，用洗涤液洗涤磁性颗粒纯化核酸，再用洗脱液洗脱磁性颗粒上的核酸片段；所述的第一核酸混合物与磁珠结合液的体积混合比为1:1.2-0.45。
此外，在第一核酸混合物与磁珠结合液混匀，室温放置再置于磁力架上静置后，可以取其上清液，作为第二核酸混合物，再次加入磁珠结合液，混匀，室温放置后，再置于磁力架上静置，弃上清液，用洗涤液洗涤磁性颗粒纯化核酸，再用洗脱液洗脱磁性颗粒上的核酸片段；所述的第二核酸混合物与加入的磁珠结合液的体积比为1:0.2-0.5。
进一步的，所述的第一核酸混合物可以来源于：PCR扩增产物、DNA被机械剪切后产物、DNA被片段化酶切后产物、或NGS前处理的核酸产物。
本发明提供的试剂及方法可用于下游的核酸片段分析及二代测序平台文库构建等。
本发明的方法具有如下优势：
1)本试剂及方法所分选的核酸可直接用于构建基因库，回收率及纯度高；
2)本试剂及方法分选的核酸速度快，操作简单，可适合于手工操作及自动化操作；
3)本试剂及方法可以配合半自动化及全自动化移液工作站，实现高通量分选核酸片段大小。
附图说明
图1 DNA上片段梯度分选。
图2 DNA下片段梯度分选。
图3 DNA中间片段分选。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明。
实施案例1：DNA上片段梯度分选
采用含100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1kb，1.2kb，1.5kb，2kb，3kb的核酸混合物进行核酸分选模板，分选不同区段的核酸片段。
具体操作步骤如下：
1、结合：取7个1.5mlEP管，分别加入50ul核酸混合物，然后根据需分选目的片段大小选择特定的磁珠结合液体积(见表1)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将EP管置于磁力架静置2min，弃上清液。
2、洗涤：取200ul洗涤液漩涡混匀磁珠，室温放置30s，结束后将离心管置于磁力架静置2min，弃上清液，室温晾干2-5min。
3、洗脱：向磁珠中加入20ul洗脱液，吸打混匀磁珠，56℃温育5min，再置于磁力架上，待磁珠完全分离，将上清液转移至新的EP管。
4、进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图见图1。
所述磁珠结合液为425mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，2M盐酸胍，30％分子量为10000聚乙二醇，50mM氯化锂，25mM氯化镁，25％无水乙醇，50mg/ml磁颗粒。
所述的洗涤液为70％无水乙醇。
所述的洗脱液为pH 8.0TE。
表1不同体积的磁珠结合液对应分选核酸片段
磁珠结合液体积比 1.2× 0.8× 0.7× 0.6× 0.55× 0.5× 0.45×
DNA片段大小 100bp-3.0kb 200bp-3.0kb 300bp-3.0kb 500bp-3.0kb 800bp-3.0kb 2.0kb-3.0kb 0bp
从电泳图可以看出，在一定范围内，随着磁珠结合液的体积减少，分选的片段越来越大，满足分选的要求。
实施案例2：DNA下片段梯度分选
采用含100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1kb，1.2kb，1.5kb，2kb，3kb的核酸混合物进行核酸分选模板，分选不同区段的核酸片段。
具体操作步骤如下：
1、第一次结合(去除上片段)：取6个1.5mlEP管，分别加入50ul核酸混合物，然后根据需分选目的片段大小选择特定的磁珠结合液体积(见表2)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将EP管置于磁力架静置2min，上清液转移至新的EP管备用。
2、第二次结合(结合下片段)：根据目的片段大小选择特定的磁珠结合液体积(见表2)，加入到转移的上清液中，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将EP管置于磁力架静置2min，弃上清液。
3、洗涤：取200ul洗涤液漩涡混匀磁珠，室温放置30s，结束后将EP管置于磁力架静置1min，弃上清液，室温晾干2-5min。
4、洗脱：向磁珠中加入20ul洗脱液，吸打混匀磁珠，56℃温育5min，再置于磁力架上，待磁珠完全分离，将上清液转移至新的EP管。
5、进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图见图2。
所述磁珠结合液为425mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，2M盐酸胍，30％分子量为10000聚乙二醇，50mM氯化锂，25mM氯化镁，25％无水乙醇，50mg/ml磁颗粒。
所述的洗涤液为70％无水乙醇。
所述的洗脱液为pH 8.0TE。
表2不同体积的磁珠结合液(两步)对应分选核酸片段
第一体积比 1.2× 0.9× 0.8× 0.75× 0.7× 0.65×
第二体积比 0.2× 0.5× 0.6× 0.65× 0.7× 0.75×
DNA片段大小 100bp 100-200bp 100-300bp 100-400bp 100-500bp 100-700bp
表中：第一体积比是指第一次结合中所加入的磁珠结合液与核酸混合物的体积比，第二体积比为第二次结合中磁珠结合液与转移的上清液的体积比。
从电泳图可以看出，不同组合可以得到不同区段的核酸片段。
实施案例3：DNA中间片段分选
采用含100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1kb，1.2kb，1.5kb，2kb，3kb的核酸混合物进行核酸分选模板，分选不同区段的核酸片段。
具体操作步骤如下：
1、第一次结合(去除上片段)：取7个1.5mlEP管，分别加入50ul核酸混合物，然后根据需分选目的片段大小选择特定的磁珠结合液体积(见表3)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将EP管置于磁力架静置2min，上清液转移至新的EP管备用。
2、第二次结合(结合中间片段)：根据目的片段大小选择特定的磁珠结合液体积(见表3)，加入到转移的上清液中，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将EP管置于磁力架静置2min，弃上清液。
3、洗涤：取200ul洗涤液漩涡混匀磁珠，室温放置30s，结束后将EP管置于磁力架静置1min，弃上清液，室温晾干2-5min。
4、洗脱：向磁珠中加入20ul洗脱液，吸打混匀磁珠，56℃温育5min，再置于磁力架上，待磁珠完全分离，将上清液转移至新的EP管。。
5、进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图见图3。
所述磁珠结合液为425mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，2M盐酸胍，30％分子量为10000聚乙二醇，50mM氯化锂，25mM氯化镁，25％无水乙醇，50mg/ml磁颗粒。
所述的洗涤液为70％无水乙醇。
所述的洗脱液为pH 8.0TE。
表3不同体积的磁珠结合液(两步)对应分选核酸片段
第一体积比 1.2× 0.8× 0.7× 0.6× 0.55× 0.5× 0.45×
第二体积比 0.2× 0.4× 0.2× 0.2× 0.2× 0.2× 0.2×
DNA片段大小 100bp 100-200bp 200-400bp 300-800bp 300bp-1.0kb 400bp-3.0kb 500bp-3.0kb
从电泳图可以看出，不同组合可以得到混合核酸中的中间区段的核酸片段。

Claims (8)

1.一种核酸片段分选纯化试剂，其特征在于，包含以下组分：磁珠结合液、洗涤液、洗脱液；所述的磁珠结合液为含10-500mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.5-2.5M盐酸胍、1-50%（W/V）且分子量范围为200-20000的聚乙二醇、1-50 mM氯化锂、1-50 mM氯化镁、0.5-25%（V/V）的无水乙醇及5-50mg/ml磁性颗粒；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水或tris缓冲液或TE缓冲液；所述的聚乙二醇为分子量10000。
2.如权利要求1所述的核酸片段分选纯化试剂，其特征在于：所述的磁性颗粒为表面包裹亲水性高分子介质并具有活性功能基团羟基的四氧化三铁颗粒，所述颗粒具有超顺性，且粒径为1-3um。
3.如权利要求1所述的核酸片段分选纯化试剂，其特征在于，磁珠结合液的pH为7-8。
4.如权利要求1所述的核酸片段分选纯化试剂，其特征在于，洗脱液的pH为7-8。
5.一种核酸片段分选纯化方法，其特征在于：基于如权利要求1-4任一项所述的核酸片段分选纯化试剂实现。
6.如权利要求5所述的核酸片段分选纯化方法，其特征在于，方法如下：将含不同区段的第一核酸混合物与磁珠结合液混匀，室温放置后，再置于磁力架上静置，弃上清液，用洗涤液洗涤磁性颗粒纯化核酸，再用洗脱液洗脱磁性颗粒上的核酸片段；所述的第一核酸混合物与磁珠结合液的体积混合比为1:1.2-0.45。
7.如权利要求6所述的核酸片段分选纯化方法，其特征在于，在第一核酸混合物与磁珠结合液混匀，室温放置再置于磁力架上静置后，可以取其上清液，作为第二核酸混合物，再次加入磁珠结合液，混匀，室温放置后，再置于磁力架上静置，弃上清液，用洗涤液洗涤磁性颗粒纯化核酸，再用洗脱液洗脱磁性颗粒上的核酸片段；所述的第二核酸混合物与加入的磁珠结合液的体积比为1:0.2-0.5。
8.如权利要求6或7所述的核酸片段分选纯化方法，其特征在于，所述的第一核酸混合物来源于：PCR扩增产物、DNA被机械剪切后产物、DNA被片段化酶切后产物、或NGS前处理的核酸产物。
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