CN117535283A - 一种磁珠法提取血液基因组dna的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其应用，该试剂盒由裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液组成。本发明使用肌氨酸钠和CHAPS配合其他组分进行细胞裂解，成本低且更加高效。此外，使用十四烷基磺基甜菜碱作为表面活性剂配合其他组分进行洗涤，从而更好地降低干扰物质含量，提高核酸纯度。本发明的试剂盒能够充分提取血液样本中的DNA并去除杂质，有效提高DNA的得率和纯度。本发明的提取试剂盒搭配磁珠法全自动核酸提取仪使用，操作简单、方便、安全，可满足大批量样本的提取要求。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取的技术领域，具体地，涉及一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其应用。
背景技术
血液是一种常见的临床检测样本，从血液样本中提取基因组DNA是临床检测和生物医学研究的基础。然而，血液样本的成分复杂，包含血浆、红细胞、白细胞和血小板，其中大部分基因组DNA存在于白细胞中，而含有基因组DNA的白细胞体积占比仅有1%左右，核酸含量较低。因此，从血液样本中快速获得稳定的高浓度和高纯度的基因组DNA至关重要。
传统的核酸提取方法，如酚-氯仿抽提法、煮沸裂解法、CTAB法、层析柱法等，这些方法普遍存在操作步骤复杂，耗时长，无法自动化操作，提取效率低等缺点，有的甚至还需要使用有毒有机试剂，这对环境和操作人员的健康都有较大影响。与传统的核酸纯化方法相比，磁珠法核酸提取技术作为一种简单、快速、可靠、可自动化的核酸提取方法越来越备受瞩目。
中国发明专利CN116769770A公开了一种血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒及提取方法，在裂解液、洗涤液、洗脱液、磁珠悬液、蛋白酶K溶液的共同作用下，得到提取的DNA总量在10 μg左右，A260/A280在1.80左右，A260/A230在2.0以上，浓度和纯度较优。然而，该实验方法需要手动操作，不适合大批量样本的高通量处理，而且试剂盒中包含了蛋白酶K，蛋白酶K需要低温运输，不仅增加了成本，如果保存不得当还会导致酶失活，最终使提取的效果大打折扣。
中国发明专利CN116334073A公开了一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法，该方法可以适配全自动核酸提取仪，漂洗液采用了无醇配方，提高了实验的安全性能。然而，该试剂盒同样使用了蛋白酶K，且提取的核酸A260/A230在1.70左右，并未达到最优的范围2.0～2.3之间，A260/A280有一个甚至超过了2.0，存在RNA的污染，因此该试剂盒提取的DNA纯度仍需进一步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有技术中存在的上述缺陷与不足，提供一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种用于磁珠法提取血液基因组DNA的裂解液。
本发明的第二个目的是提供上述的裂解液在制备用于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明提供了一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒。该试剂盒由裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液组成，裂解液中包括以下组分：盐酸胍、PEG8000、碘化钠、Tris-HCl、EDTA、CHAPS、肌氨酸钠；磁珠为硅羟基磁珠；洗涤液Ⅰ中包括以下组分：盐酸胍、氯化钠、Tris-HCl、EDTA、十四烷基磺基甜菜碱、Triton X-100、异丙醇；洗涤液Ⅱ中包括以下组分：乙醇、Tris-HCl、EDTA；洗脱液中包括以下组分：Tris-HCl、EDTA。
本发明的试剂盒中，裂解液不添加蛋白酶K来破坏蛋白，而是采用以蛋白强变性剂（盐酸胍）和表面活性剂（肌氨酸钠、CHAPS）的协同作用来强化裂解效果，高效破坏和核酸连接的蛋白质，使得核酸充分释放出来。同时，碘化钠也能变性蛋白质，使蛋白质变性沉淀，从而使核酸能够摆脱蛋白质的缠绕。血液样本裂解后，酶抑制剂EDTA能够和金属离子络合，避免金属离子对核酸带来影响；Tris-HCl缓冲液可以提供一个较为合适的裂解环境，PEG8000有利于核酸在裂解液中沉淀富集，配合磁珠，更有利于提高吸附核酸的选择性，减少磁珠吸附的杂质，从而提高核酸的提取率和纯度。
洗涤液Ⅰ中加入两性离子表面活性剂（十四烷基磺基甜菜碱），它具有优良的清洗性、稳定性、耐碱性、耐电解质性；Triton X-100是非离子表面活性剂，主要作用是溶解样本表面的脂质，使样本裂解更加快速充分；异丙醇的作用主要是沉淀或者析出DNA。盐酸胍、Triton X-100、十四烷基磺基甜菜碱、异丙醇等物质的配合使用，可以更好的降低蛋白质、胍盐等干扰物质的含量，提高核酸纯度。
洗涤液Ⅱ中，乙醇如果加入过少则会清洗不干净，从而导致出现杂质，如果加入乙醇过多，乙醇挥发不彻底会对后面的扩增产生一定的抑制作用。70%乙醇溶液、Tris-HCl和EDTA的配合使用，不仅可以达到清洗胍盐等杂质的功能，还能维持核酸的稳定性。
因此，本发明要求保护以下内容：
一种用于磁珠法提取血液基因组DNA的裂解液，所述裂解液含有以下组分：3～7 M盐酸胍、4～10% PEG8000（w/v）、0.3～0.7 M碘化钠、50～100 mM Tris-HCl、50～80 mMEDTA、5～10% CHAPS（w/v）、0.5～2%肌氨酸钠（w/v），pH 7.0～9.0。
优选地，所述裂解液含有以下组分：4～6 M盐酸胍、5～8% PEG8000（w/v）、0.4～0.6 M碘化钠、70～90 mM Tris-HCl、50～70 mM EDTA、5～10% CHAPS（w/v）、0.5～2%肌氨酸钠（w/v），pH 7.5～8.5。
更优选地，所述裂解液含有以下组分：6 M盐酸胍、8% PEG8000（w/v）、0.6 M碘化钠、80 mM Tris-HCl、60 mM EDTA、10% CHAPS（w/v）、2%肌氨酸钠（w/v），pH 8.2。
任一上述的裂解液在制备用于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒的产品中的应用。
一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒中含有任一上述的裂解液。
优选地，所述试剂盒中还含有磁珠。
更优选地，所述磁珠为硅羟基磁珠。
优选地，所述试剂盒中还含有洗涤液Ⅰ；
所述洗涤液Ⅰ含有以下组分：1～3 M盐酸胍、0.5～1.5 M氯化钠、30～50 mM Tris-HCl、10～30 mM EDTA、5～7%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、1～3% Triton X-100（w/v）、15～25%异丙醇溶液（v/v），pH 7.5～8.0。
更优选地，所述洗涤液Ⅰ含有以下组分：2 M盐酸胍、1 M氯化钠、40 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、6%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、2% Triton X-100（w/v）、20%异丙醇溶液（v/v），pH 7.8。
优选地，所述试剂盒中还含有洗涤液Ⅱ；
所述洗涤液Ⅱ含有以下组分：70～75%乙醇溶液（v/v）、55～65 mM Tris-HCl、5～15 mM EDTA。
更优选地，所述洗涤液Ⅱ含有以下组分：70%乙醇溶液（v/v）、60 mM Tris-HCl、10mM EDTA。
优选地，所述试剂盒中还含有洗脱液；
所述洗脱液含有以下组分：5～15 mM Tris-HCl、0.5～1.5 mM EDTA，pH 7.5～8.5。
更优选地，所述洗脱液含有以下组分：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开了一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其应用。该试剂盒由裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液组成，裂解液中包括以下组分：盐酸胍、PEG8000、碘化钠、Tris-HCl、EDTA、CHAPS、肌氨酸钠；磁珠为硅羟基磁珠；洗涤液Ⅰ中包括以下组分：盐酸胍、氯化钠、Tris-HCl、EDTA、十四烷基磺基甜菜碱、Triton X-100、异丙醇；洗涤液Ⅱ中包括以下组分：乙醇、Tris-HCl、EDTA；洗脱液中包括以下组分：Tris-HCl、EDTA。
与现有产品相比，本发明的试剂盒至少具有以下优势：
（1）本发明的试剂盒不使用氯仿、苯酚等有毒试剂，采用预分装试剂板，适配全自动核酸提取仪，可满足大批量样本的高通量处理，减少人员操作步骤，从而大大降低对环境以及操作人员的危害。
（2）裂解液中使用肌氨酸钠和CHAPS配合本发明的其他组分，可以更高效破坏细胞膜结构，更加高效、快速的释放核酸，增加裂解效率，从而增加核酸提取量，提高核酸的A260/A230值，使核酸保持在良好的纯度范围内。另外不需要再额外使用蛋白酶K，有效降低实验成本，提高实验操作效率。
（3）十四烷基磺基甜菜碱为两性离子表面活性剂，具有优良的清洗性能，在洗涤液中配合本发明的其他组分，可以更好的降低干扰物质含量，提高核酸纯度。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例中所用磁珠为洛阳吉恩特生物科技有限公司的GNT-201硅羟基磁珠，提取核酸所用仪器为凯普全自动核酸提取仪HBNP-4801A。
实施例1 一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒
一、组成成分
试剂盒中包括裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液。
裂解液包括以下组分：6 M盐酸胍、8% PEG8000（w/v）、0.6 M碘化钠、80 mM Tris-HCl、60 mM EDTA、10% CHAPS（w/v）、2%肌氨酸钠（w/v），pH 8.2。
GNT-201硅羟基磁珠的浓度为2 mg/mL。
洗涤液Ⅰ包括以下组分：2 M盐酸胍、1 M氯化钠、40 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、6%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、2% Triton X-100（w/v）、20%异丙醇溶液（v/v），pH 7.8。
洗涤液Ⅱ包括以下组分：70%乙醇溶液（v/v）、60 mM Tris-HCl、10 mM EDTA。
洗脱液包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0。
二、使用方法
1. 将试剂盒中的各组分分装到96孔板的预分装试剂板中，该预分装试剂板的第1列和第7列深孔板内装有裂解液，第2列和第8列深孔板内装有洗涤液Ⅰ，第3列和第9列深孔板内装有洗涤液Ⅱ，第4列和第11列深孔板内装有磁珠溶液，第6列和第12列深孔板内装有洗脱液，具体如表1所示。
表1 预分装试剂板
2. 分别在第1列和第7列加入300 μL血液样本。
3. 打开凯普全自动核酸提取仪HBNP-4801A仪器，将加入样本的预分装试剂板放入提取仪中，然后***磁棒套。
4. 选择对应的核酸提取程序，运行提取程序，提取程序如表2和表3所示，两个提取程序同时运行。
表2 提取程序1
表3 提取程序2
5. 自动化程序结束后，取出预分装试剂板和磁套，将第6列和第12列提取得到的核酸溶液取出进行下一步检测或保存于-20±5℃。
6. 取2 μL核酸溶液使用Nanodrop 2000进行荧光分光光度检测得出A260/A280、A260/A230比值，纯净DNA样品应1.8≤A260/A280≤2.0，如果比值低于1.8，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响，A260/A230的比值应大于2.0，如果比值低于2.0，表示样品中存在污染物，如碳水化合物、胍盐等。
实施例2 一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒
一、组成成分
试剂盒中包括裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液。
裂解液包括以下组分：6 M盐酸胍、8% PEG8000（w/v）、0.6 M碘化钠、80 mM Tris-HCl、60 mM EDTA、10% CHAPS（w/v）、0.5%肌氨酸钠（w/v），pH 8.2。
GNT-201硅羟基磁珠的浓度为2 mg/mL。
洗涤液Ⅰ包括以下组分：2 M盐酸胍、1 M氯化钠、40 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、6%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、2% Triton X-100（w/v）、20%异丙醇溶液（v/v），pH 7.8。
洗涤液Ⅱ包括以下组分：70%乙醇溶液（v/v）、60 mM Tris-HCl、10 mM EDTA。
洗脱液包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0。
二、使用方法
依照实施例1的使用方法进行使用。
实施例3 一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒
一、组成成分
试剂盒中包括裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液。
裂解液包括以下组分：6 M盐酸胍、8% PEG8000（w/v）、0.6 M碘化钠、80 mM Tris-HCl、60 mM EDTA、5% CHAPS（w/v）、2%肌氨酸钠（w/v），pH 8.2。
GNT-201硅羟基磁珠的浓度为2 mg/mL。
洗涤液Ⅰ包括以下组分：2 M盐酸胍、1 M氯化钠、40 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、6%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、2% Triton X-100（w/v）、20%异丙醇溶液（v/v），pH 7.8。
洗涤液Ⅱ包括以下组分：70%乙醇溶液（v/v）、60 mM Tris-HCl、10 mM EDTA。
洗脱液包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0。
二、使用方法
依照实施例1的使用方法进行使用。
实施例4 一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒
一、组成成分
试剂盒中包括裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液。
裂解液包括以下组分：6 M盐酸胍、8% PEG8000（w/v）、0.6 M碘化钠、80 mM Tris-HCl、60 mM EDTA、10% CHAPS（w/v）、2%肌氨酸钠（w/v），pH 8.2。
GNT-201硅羟基磁珠的浓度为2 mg/mL。
洗涤液Ⅰ包括以下组分：2 M盐酸胍、1 M氯化钠、40 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、3%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、2% Triton X-100（w/v）、20%异丙醇溶液（v/v），pH 7.8。
洗涤液Ⅱ包括以下组分：70%乙醇溶液（v/v）、60 mM Tris-HCl、10 mM EDTA。
洗脱液包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0。
二、使用方法
依照实施例1的使用方法进行使用。
实施例5一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒
一、组成成分
试剂盒中包括裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液。
裂解液包括以下组分：5 M盐酸胍、8% PEG8000（w/v）、0.6 M碘化钠、80 mM Tris-HCl、60 mM EDTA、10% CHAPS（w/v）、1.5%肌氨酸钠（w/v），pH 8.2。
GNT-201硅羟基磁珠的浓度为2 mg/mL。
洗涤液Ⅰ包括以下组分：2 M盐酸胍、1 M氯化钠、40 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、6%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、2% Triton X-100（w/v）、20%异丙醇溶液（v/v），pH 7.8。
洗涤液Ⅱ包括以下组分：70%乙醇溶液（v/v）、60 mM Tris-HCl、10 mM EDTA。
洗脱液包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0。
二、使用方法
依照实施例1的使用方法进行使用。
实施例6一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒
一、组成成分
试剂盒中包括裂解液、磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液。
裂解液包括以下组分：4 M盐酸胍、8% PEG8000（w/v）、0.6 M碘化钠、80 mM Tris-HCl、60 mM EDTA、10% CHAPS（w/v）、1%肌氨酸钠（w/v），pH 8.2。
GNT-201硅羟基磁珠的浓度为2 mg/mL。
洗涤液Ⅰ包括以下组分：2 M盐酸胍、1 M氯化钠、40 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、6%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、2% Triton X-100（w/v）、20%异丙醇溶液（v/v），pH 7.8。
洗涤液Ⅱ包括以下组分：70%乙醇溶液（v/v）、60 mM Tris-HCl、10 mM EDTA。
洗脱液包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0。
二、使用方法
依照实施例1的使用方法进行使用。
对比例1
本对比例和实施例1的区别在于，裂解液中不含有肌氨酸钠，其他同实施例1。
对比例2
本对比例和实施例1的区别在于，裂解液中不含有CHAPS，其他同实施例1。
对比例3
本对比例和实施例1的区别在于，裂解液中不含有肌氨酸钠和CHAPS，其他同实施例1。
对比例4
本对比例和实施例1的区别在于，裂解液中PEG8000换成等质量体积比的PEG3000，其他同实施例1。
对比例5
本对比例和实施例1的区别在于，裂解液中PEG8000换成等质量体积比的PEG6000，其他同实施例1。
对比例6
本对比例和实施例1的区别在于，裂解液中PEG8000换成等质量体积比的PEG10000，其他同实施例1。
对比例7
本对比例和实施例1的区别在于，裂解液中PEG8000换成等质量体积比的PEG12000，其他同实施例1。
对比例8
本对比例和实施例1的区别在于，洗涤液Ⅰ中不含有十四烷基磺基甜菜碱，其他同实施例1。
对比例9
本对比例和实施例1的区别在于，洗涤液Ⅰ中十四烷基磺基甜菜碱换成等质量体积比的NP40，其他同实施例1。
对比例10
本对比例和实施例1的区别在于，洗涤液Ⅰ中十四烷基磺基甜菜碱换成等质量体积比的吐温20，其他同实施例1。
对比例11
本对比例和实施例1的区别在于，洗涤液Ⅰ中十四烷基磺基甜菜碱换成等质量体积比的十二烷基磺基甜菜碱，其他同实施例1。
对比例12
本对比例和实施例1的区别在于，裂解液中不含有肌氨酸钠和CHAPS，洗涤液Ⅰ中不含有十四烷基磺基甜菜碱，其他同实施例1。
性能测试
使用实施例1～6和对比例1～12的试剂盒进行核酸提取，提取得到的核酸浓度和纯度结果见表4。
表4 核酸浓度和纯度
表4的数据结果表明，使用本发明实施例1～6，尤其是实施例1提供的试剂盒提取制得的血液基因组DNA浓度高、纯度高，实施例1各组分之间充分发挥协同作用，配合本发明的提取方法共同实现了提取得到浓度高，蛋白质或者酚类物质的影响小且胍盐等污染物少的DNA。
实施例1和对比例1～3的数据结果表明，在裂解液中添加肌氨酸钠和CHAPS之后，它们二者充分发挥协同作用，加强裂解，不仅提高了提取核酸的浓度，也提高了A260/A280、A260/A230的比值。
实施例1和对比例4～7的数据结果表明，在裂解液中添加PEG8000比添加PEG63000、PEG6000、PEG10000、PEG12000的效果要好，提取得到的DNA浓度更高、纯度更好。
实施例1、对比例8和对比例12的数据结果表明，裂解液充***解，洗涤液充分清洗，最终使核酸的得率高，纯度好。对比例8未添加十四烷基磺基甜菜碱，对比例12未添加肌氨酸钠、CHAPS、十四烷基磺基甜菜碱，导致清洗作用减弱，还存在碳水化合物、胍盐等物质残留，从而使A260/A230下降。另外将十四烷基磺基甜菜碱替换成别的表面活性剂，如NP40、吐温20、十二烷基磺基甜菜碱等，清洗效果都不如十四烷基磺基甜菜碱，A260/A230没有达到2.0以上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种用于磁珠法提取血液基因组DNA的裂解液，其特征在于，所述裂解液含有以下组分：3～7 M盐酸胍、4～10% PEG8000（w/v）、0.3～0.7 M碘化钠、50～100 mM Tris-HCl、50～80 mM EDTA、5～10% CHAPS（w/v）、0.5～2%肌氨酸钠（w/v），pH 7.0～9.0。
2. 根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液含有以下组分：4～6 M盐酸胍、5～8% PEG8000（w/v）、0.4～0.6 M碘化钠、70～90 mM Tris-HCl、50～70 mM EDTA、5～10% CHAPS（w/v）、0.5～2%肌氨酸钠（w/v），pH 7.5～8.5。
3. 根据权利要求2所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液含有以下组分：6 M盐酸胍、8% PEG8000（w/v）、0.6 M碘化钠、80 mM Tris-HCl、60 mM EDTA、10% CHAPS（w/v）、2%肌氨酸钠（w/v），pH 8.2。
4.权利要求1～3任一所述的裂解液在制备用于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒的产品中的应用。
5.一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～3任一所述的裂解液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有磁珠。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠为硅羟基磁珠。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有洗涤液Ⅰ；
所述洗涤液Ⅰ含有以下组分：1～3 M盐酸胍、0.5～1.5 M氯化钠、30～50 mM Tris-HCl、10～30 mM EDTA、5～7%十四烷基磺基甜菜碱（w/v）、1～3% Triton X-100（w/v）、15～25%异丙醇溶液（v/v），pH 7.5～8.0。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有洗涤液Ⅱ；
所述洗涤液Ⅱ含有以下组分：70～75%乙醇溶液（v/v）、55～65 mM Tris-HCl、5～15 mMEDTA。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有洗脱液；
所述洗脱液含有以下组分：5～15 mM Tris-HCl、0.5～1.5 mM EDTA，pH 7.5～8.5。
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