CN117487796A - 一种细胞dna快提取试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种细胞dna快提取试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及DNA提取领域，具体而言，涉及一种细胞DNA快提取试剂盒及其使用方法，是针对细胞样本类型的，可用于常规PCR扩增和荧光定量PCR。本发明提供的细胞DNA快提取试剂盒，包括独立包装的裂解液1、裂解液2和洗脱液；所述裂解液1包括如下组分：浓度为3％的SDS；所述裂解液2包括如下组分：浓度为3M醋酸钠；所述洗脱液包括如下组分：浓度为10mMpH 8.0Tris‑HCl、0.1mM pH 8.0EDTA和0.5mg/ml RNaseA。本发明的试剂组分简单，提取DNA产量高，操作简单快捷，减少样本污染等优点。

Description

一种细胞DNA快提取试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及DNA提取领域，具体而言，涉及一种细胞DNA快提取试剂盒及其使用方法，可用于常规PCR扩增和荧光定量PCR。
背景技术
核酸是各类生命的最基本物质之一，不仅起着储存和传递遗传信息的作用，在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中也起着决定性的作用。自1869年瑞士物理学家Friedrich Miescher首次从白细胞中分离出核酸以来，全球各国的研究者们在核酸提取和纯化方法上进行了不懈的研究探索。
随着分子生物学技术快速发展，DNA提取技术也不断发展和完善，对于不同类型样本，市面上已有多种不同提取纯化基因组DNA方法，现有的核酸提取试剂与方法主要有酚－氯仿抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法、磁珠法、二氧化硅基质法等，这些方法各有优缺点，如样本处理时间比较长、处理过程复杂、容易造成样本间交叉污染和成本比较高等，但都遵循几个原则：保持DNA分子的完整性；防止DNase酶对基因组DNA的降解；排除其他核酸分子污染；尽量去除蛋白质、糖类和脂类等；防止有机溶剂和金属离子污染。
另外，申请号为CN202111542009.1的中国专利申请，其名称为全血液DNA提取试剂盒及核酸提取方法，采用的是磁珠法提取，包含裂解液、蛋白酶K溶液、第一漂洗液、第二漂洗液以及洗脱液，该方法操作步骤比较多，操作时间比较长，且提取DNA浓度不是很高。类似的，申请号为CN202310946242.9的中国专利申请，其名称为一种血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒及提取方法，包括裂解液、洗涤液、洗脱液、磁珠悬液、蛋白酶K溶液，提取DNA浓度和纯度相对有所提高，但每个组分中含有多个成分，配制比较繁琐，使用成本也相对比较高。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种细胞DNA快提取试剂盒及其使用方法，试剂组分简单，DNA产量高，操作简单快捷，减少样本污染。针对细胞样本提取，为获得较高产量和纯度的基因组DNA，本发明采用SDS溶解膜蛋白破坏细胞膜，解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质变性而沉淀下来，加入醋酸钠，可调节盐离子的浓度，中和核酸分子的负电荷，使用异丙醇将DNA沉淀下来，然后用冰的70％乙醇洗去残留的杂质，最后使用TE缓冲液洗脱DNA。
本发明中，解决技术问题的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供了一种细胞DNA快提取试剂盒。
所述的细胞DNA快提取试剂盒，包括独立包装的裂解液1、裂解液2和洗脱液；
所述裂解液1包括如下组分：浓度为2％-3％的SDS，该组分溶解膜蛋白破坏细胞膜，解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质变性而沉淀下来；
所述裂解液2包括如下组分：浓度为2M-3M醋酸钠，该组分可调节盐离子的浓度，中和核酸分子的负电荷，便于后续沉淀DNA；
所述洗脱液包括如下组分：浓度为10mM pH 8.0Tris-HCl、0.1mM pH 8.0EDTA和0.5mg/ml RNaseA，该组分可将DNA沉淀洗脱下来，并去除其中RNA。
优选的，所述的细胞DNA快提取试剂盒中，检测试剂由独立包装的裂解液1、裂解液2和洗脱液组成；
所述的裂解液1成分为：浓度为3％的SDS；
所述的裂解液2成分为：浓度为3M醋酸钠；
所述的洗脱液由如下组分组成：浓度为10mMpH 8.0Tris-HCl、0.1mM pH 8.0EDTA和0.5mg/ml RNaseA。
在本发明的第二方面，提供了一种细胞DNA快提取试剂盒的使用方法。
所述细胞DNA快提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)PBS清洗：吸取需要提取的细胞200μL到1.5ml EP管，使用移液器加入1ml PBS，振荡混匀，放入离心机中6000rpm离心2min，离心结束后取出EP管去掉上清液，保留沉淀，向沉淀中加入150μLPBS，振荡混匀；
(2)向上一步骤中加入200μL裂解液1，振荡5s混匀，瞬时离心，然后再加入200μL裂解液2，振荡充分混匀，放入离心机中12000rpm离心5min；
(3)离心结束后取出EP管，缓慢吸取550μL上清液体到一个新的1.5ml EP管中，勿吸到白色沉淀；
(4)加入550μL异丙醇，缓慢颠倒充分混匀，观察是否有白色沉淀析出，然后放入离心机中12000rpm离心3min，离心结束后倒掉上清液；
(5)加1ml 70％乙醇(保存在-20℃)润洗,不要扰动DNA沉淀，然后倒掉上清液；
(6)重复步骤5一次。
(7)将EP管放入离心机中6000rpm离心30s，离心结束后取出EP管，用移液器缓慢吸掉残留液体，开盖晾干30min；
(8)加400μL洗脱液，充分振荡混匀溶解沉淀，然后瞬时离心，取上清到新的EP管中，即最终DNA。
在本发明的第三方面，提供了利用第一方面所述细胞DNA快提取试剂盒或利用第二方面所述方法提取的DNA进行PCR的方法，具体如下：
将DNA样本稀释到30ng/μL；Taq酶为EZ#4；
引物如下：
C-F:CATCTGGACTCTTCTTCTCATGCC
C-R:GAGCTCAAACACCCAGCAAGAAG
反应体系和扩增程序如下：
组分 加入量
PCR缓冲液 9μL
Primer1(1μM) 2.5μL
Primer2(1μM) 2.5μL
Taq酶 0.6μL
模板DNA 2μL
灭菌水 3.4μL
总体积 20μL
在本发明的第四方面，提供了利用第一方面所述细胞DNA快提取试剂盒或利用第二方面所述方法提取的DNA进行荧光定量PCR的方法，具体如下：
将DNA样本稀释到30ng/μL；选择EZ#2为Taq酶，
引物如下：
Q-F:GAACTCTTGTGCTCACGCTGCT
Q-R:ACTGCAGAAAGGAAGTGTGCCAA
探针为：Q-QF:5'-FAM-AAGGGACCAACAGGCAGTCTTCGT-3'-MGB
扩增体系和扩增程序如下：
本发明提供的细胞DNA快提取试剂盒是在室温条件下储存和操作的，无需特殊条件，其组分简单，操作简单快捷，能更大程度减少样本污染，DNA产量更高。
附图说明
图1为a1、b1、c1、d1、a2、b2、c2和d2样本扩增产物电泳图。
图2为a1、b1、c1、d1、a2、b2、c2和d2荧光曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例的细胞DNA快提取试剂盒，检测试剂由独立包装的裂解液1、裂解液2和洗脱液组成；
裂解液1为：浓度为3％的SDS。
裂解液2为：浓度为3M醋酸钠。
洗脱液组分为：浓度为10mM pH 8.0Tris-HCl、0.1mM pH 8.0EDTA和0.5mg/mlRNaseA。
取4管细胞悬浮液HCT-116(上海富衡生物科技有限公司，FH0027)、SW620(上海富衡生物科技有限公司，FH0021)、T24(上海富衡生物科技有限公司，FH0171)、HEPG2(上海富衡生物科技有限公司，FH0076)，振荡混匀，从每管细胞各取2份200μL细胞悬浮液标记a1和a2、b1和b2、c1和c2，d1和d2，其中a1、b1、c1和d1四管用本发明试剂盒提取，a2、b2、c2和d2用从江苏康为世纪生物科技有限公司购买的试剂盒Universal Genomic DNA Kit(CW2298M)提取。
本实施例的细胞DNA快提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)PBS清洗：吸取需要提取的细胞200μL到1.5ml EP管，使用移液器加入1ml PBS，振荡混匀，放入离心机中6000rpm离心2min，离心结束后取出EP管去掉上清液，保留沉淀，向沉淀中加入150μLPBS，振荡混匀；
(2)向上一步骤中加入200μL裂解液1，振荡5s混匀，瞬时离心，然后再加入200μL裂解液2，振荡充分混匀，放入离心机中12000rpm离心5min；
(3)离心结束后取出EP管，缓慢吸取550μL上清液体到一个新的1.5ml EP管中，勿吸到白色沉淀；
(4)加入550μL异丙醇，缓慢颠倒充分混匀，观察是否有白色沉淀析出，然后放入离心机中12000rpm离心3min，离心结束后倒掉上清液；
(5)加1ml 70％乙醇(保存在-20℃)润洗,不要扰动DNA沉淀，然后倒掉上清液；
(6)重复步骤5一次。
(7)将EP管放入离心机中6000rpm离心30s，离心结束后取出EP管，用移液器缓慢吸掉残留液体，开盖晾干30min；
(8)加400μL洗脱液，充分振荡混匀溶解沉淀，然后瞬时离心，取上清到新的EP管中，即最终DNA，标记a1、b1、c1和d1。
对比例1
于江苏康为世纪生物科技有限公司购买试剂盒Universal Genomic DNA Kit(CW2298M)，按照试剂盒说明书提取DNA，提取后的DNA进行浓度和纯度测定，编号为a2、b2、c2和d2。
实施例1和对比例1提供的DNA浓度和纯度测定结果如下表：
Num Name ID Type 260nm 280nm 230nm 260/280 260/230 C:ng/uL
1 User1 a1 DNA-50 2.278 1.189 1.288 1.92 1.77 113.943
2 User1 b1 DNA-50 2.433 1.339 1.861 1.82 1.31 121.673
3 User1 c1 DNA-50 2.796 1.508 1.557 1.85 1.8 139.841
4 User1 d1 DNA-50 3.192 1.729 1.668 1.85 1.91 159.608
5 User1 a2 DNA-50 1.988 1.085 1.098 1.83 1.81 99.442
6 User1 b2 DNA-50 2.08 1.108 1.505 1.88 1.38 104.001
7 User1 c2 DNA-50 2.06 1.09 1.16 1.89 1.78 103.004
8 User1 d2 DNA-50 2.391 1.275 1.359 1.88 1.76 119.583
DNA质量鉴定：
(1)常规PCR:8个样本a1、b1、c1、d1、a2、b2、c2和d2分别稀释到30ng/μL进行实验；
引物为C-F:CATCTGGACTCTTCTTCTCATGCC
C-R:GAGCTCAAACACCCAGCAAGAAG
反应体系和扩增程序如下：
组分 加入量
PCR缓冲液 9μL
Primer1(1μM) 2.5μL
Primer2(1μM) 2.5μL
Taq酶 0.6μL
模板DNA 2μL
灭菌水 3.4μL
总体积 20μL
PCR缓冲液成分如下：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μMdNTP，2mM DTT，3％DMSO，0.02％吐温20。Taq酶为EZ#4(江苏伟禾生物市售产品，编号WH22004)。
扩增产物电泳图如图1：扩增8个样本a1、b1、c1、d1、a2、b2、c2和d2电泳图。
结果分析：a1与a2、b1与b2、c1与c2、d1与d2电泳条带亮度差不多，因此本发明提供的细胞DNA快提取试剂盒提取的DNA质量与使用江苏康为世纪Universal Genomic DNA Kit(CW2298M)提取的DNA质量相当，但本发明提供的细胞DNA快提取试剂盒提取浓度更高、组分简单、操作简单快捷，都优于江苏康为世纪Universal Genomic DNA Kit(CW2298M)试剂盒。
(2)荧光定量PCR：样本a1、b1、c1、d1、a2、b2、c2和d2
引物为Q-F:GAACTCTTGTGCTCACGCTGCT
Q-R:ACTGCAGAAAGGAAGTGTGCCAA
探针Q-QF:5'-FAM-AAGGGACCAACAGGCAGTCTTCGT-3'-MGB
PCR缓冲液成分如下：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μMdNTP，2mM DTT，3％DMSO，0.02％吐温20。Taq酶为EZ#2(江苏伟禾生物市售产品，编号WH22002)
图2为扩增a1、b1、c1、d1、a2、b2、c2和d2样本荧光曲线图。
CT值：a1、b1、c1、d1、a2、b2、c2和d2样本CT值分别为23.88、23.84、24.08、24.13、24.45、24.42、24.87、25.21。
结果分析：a1与a2、b1与b2、c1与c2、d1与d2样本CT值和荧光曲线都很接近，因此本发明提供的细胞DNA快提取试剂盒提取的DNA质量与江苏康为世纪Universal Genomic DNAKit(CW2298M)提取的DNA质量相当，但本发明提供的细胞DNA快提取试剂盒提取浓度更高、组分简单、操作简单快捷，都优于江苏康为世纪Universal Genomic DNA Kit(CW2298M)试剂盒。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种细胞DNA快提取试剂盒，其特征在于，包括独立包装的裂解液1、裂解液2和洗脱液；
所述裂解液1包括如下组分：浓度为2％-3％的SDS；
所述裂解液2包括如下组分：浓度为2M-3M醋酸钠；
所述洗脱液包括如下组分：浓度为10mM pH 8.0Tris-HCl、0.1mM pH 8.0EDTA和0.5mg/ml RNaseA。
2.根据权利要求1所述的细胞DNA快提取试剂盒，其特征在于，所述的细胞DNA快提取试剂盒中，检测试剂由独立包装的裂解液1、裂解液2和洗脱液组成。
3.根据权利要求2所述的细胞DNA快提取试剂盒，其特征在于，所述的裂解液1成分为：浓度为3％的SDS。
4.根据权利要求2所述的细胞DNA快提取试剂盒，其特征在于，所述的裂解液2成分为：浓度为3M醋酸钠。
5.根据权利要求2所述的细胞DNA快提取试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液由如下组分组成：浓度为10mMpH 8.0Tris-HCl、0.1mM pH 8.0EDTA和0.5mg/ml RNaseA。
6.如权利要求1-5任意一项所述细胞DNA快提取试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)PBS清洗：吸取需要提取的细胞200μL到1.5ml EP管，使用移液器加入1ml PBS，振荡混匀，放入离心机中6000rpm离心2min，离心结束后取出EP管去掉上清液，保留沉淀，向沉淀中加入150μLPBS，振荡混匀；
(2)向上一步骤中加入200μL裂解液1，振荡5s混匀，瞬时离心，然后再加入200μL裂解液2，振荡充分混匀，放入离心机中12000rpm离心5min；
(3)离心结束后取出EP管，缓慢吸取550μL上清液体到一个新的1.5ml EP管中，勿吸到白色沉淀；
(4)加入550μL异丙醇，缓慢颠倒充分混匀，观察是否有白色沉淀析出，然后放入离心机中12000rpm离心3min，离心结束后倒掉上清液；
(5)加1ml 70％乙醇(保存在-20℃)润洗,不要扰动DNA沉淀，然后倒掉上清液；
(6)重复步骤5)一次；
(7)将EP管放入离心机中6000rpm离心30s，离心结束后取出EP管，用移液器缓慢吸掉残留液体，开盖晾干30min；
(8)加400μL洗脱液，充分振荡混匀溶解沉淀，然后瞬时离心，取上清到新的EP管中，即最终DNA。
7.利用如权利要求1-5任意一项所述细胞DNA快提取试剂盒或利用如权利要求6所述方法提取的DNA进行PCR的方法，其特征在于，具体如下：
将DNA样本稀释到30ng/μL；Taq酶为EZ#4；
引物如下：
C-F:CATCTGGACTCTTCTTCTCATGCC
C-R:GAGCTCAAACACCCAGCAAGAAG
反应体系和扩增程序如下：
组分 加入量 PCR缓冲液 9μL Primer1(1μM) 2.5μL Primer2(1μM) 2.5μL Taq酶 0.6μL 模板DNA 2μL 灭菌水 3.4μL 总体积 20μL
8.利用如权利要求1-5任意一项所述细胞DNA快提取试剂盒或利用如权利要求6所述方法提取的DNA进行荧光定量PCR的方法，其特征在于，具体如下：
将DNA样本稀释到30ng/μL，选择EZ#2为Taq酶，
引物如下：
Q-F:GAACTCTTGTGCTCACGCTGCT
Q-R:ACTGCAGAAAGGAAGTGTGCCAA
探针为：Q-QF:5'-FAM-AAGGGACCAACAGGCAGTCTTCGT-3'-MGB扩增体系和扩增程序如下：
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