CN118185922A - 一种富集胎儿游离dna的血浆核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法,包括:全部游离DNA回收和大片段游离DNA去除。通过在盐离子酸性溶液体系下,使游离DNA与羟基结合部结合获得全部游离DNA和在碱性条件下使含有羧基结合部的液相与结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分进行混合孵育,去除核酸大片段。从而实现简并血浆游离DNA提取与游离DNA筛选富集流程,以孕妇血浆为样本起始,实现稳定高效的获得胎儿游离DNA占比提升的游离DNA提取产物的目的,并且该方法可根据下游检测需求通过调整核心试剂的比例,选择性地调整(提高)提取产物胎儿游离DNA的富集浓度(即胎儿游离DNA占比),满足不同检测需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法,可根据下游检测需求选择性地提高所得游离DNA提取产物中胎儿来源游离DNA的占比。
背景技术
无创产前DNA检测技术(No-vasiveprenataltesting,NIPT)是一种基于孕妇外周血血浆中胎儿来源游离DNA(cffDNA)的新型产前筛查技术。主要筛查疾病包括唐氏综合征(T21)、爱德华氏综合征(T18)、帕陶氏综合征(T13)、性染色体非整倍体及部分染色体拷贝数变异。该技术通过采集孕妇静脉血,分离血浆并提取血浆中的游离DNA(即cfDNA)制备测序文库,借助于高通量基因测序方法进行深度测序,同时结合生物信息学分析技术,评估胎儿患染色体异常疾病的风险。目前,无创产前基因检测已经在临床上广泛应用,降低了孕妇因过度的侵入性产前诊断而导致的流产风险,同时提高了胎儿染色体非整倍体疾病的检出率,降低了检测的假阳性率。此外,NIPT还应用于单基因遗传病检测,可直接检测胎儿是否携带致病基因;同时,还可以应用在染色体微缺失/微重复检测方面。染色体微缺失/微重复是除染色体非整倍体之外的另一大引起新生儿出生缺陷的遗传性因素,是一类由于染色体拷贝数变异(copynumbervariation,CNV)而导致的具有复杂临床表型的综合征性疾病。研究表明,在高测序深度、高胎儿游离DNA浓度的情况下,NIPT可用于检测胎儿染色体微缺失重复检测。
由此可知NIPT在染色体非整倍体疾病、单基因遗传病检测、染色体微缺失/微重复检测等方面,其最终检测靶标都是孕妇外周血血浆中全部游离DNA中的胎儿游离DNA(即cffDNA)部分,其检测的准确性会受到孕妇外周血血浆中全部游离DNA中胎儿游离DNA占比的影响。通常情况下,孕妇外周血游离DNA中胎儿游离DNA占比非常低,这种占比对NIPT等后续检测策略构成相当大的挑战,再加上不同母体个体间差异、实验操作误差以及样本质量等因素的影响,检测样本中胎儿游离DNA的含量极大地影响了相关检测的效率和准确性。提高胎儿游离DNA在待检样本中的占比,即提高待检样本中靶标胎儿游离DNA的浓度,可有效降低母源性游离DNA带来的背景噪音数据,提高检测结果的准确性,降低假阴性发生概率。同时,提高待检样本中胎儿游离DNA的浓度还可以减小后续建库试剂体系和高通量测序所需数据量,有利于降低检测成本。因此,有必要开发一种稳定而高效地富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法,可根据下游检测需求选择性地提高所得游离DNA提取产物中胎儿游离DNA的占比。
发明内容
需要说明的是,本发明是基于发明人的下列研究和发现才完成的:
本发明发现,孕妇外周血血浆中婴儿来源游离DNA部分片段大小与母源游离DNA片段大小存在差异,其全部游离DNA片段大小峰值约为166bp,而胎儿游离DNA片段则较小,约为143bp。基于这一发现,可实现通过使用对不同片段大小的DNA具有不同回收效率的片段筛选方案有针对性地实现富集孕妇血浆全部游离DNA中150bp以下的小片段部分,去除大片段部分(根据检测目标的不同,所述的大片段与小片段的区分阈值N取值不同),从而提高胎儿游离DNA在全部游离DNA中的占比。由此也可见,胎儿游离DNA的富集过程中核心环节应当为大片段去除(或小片段富集)步骤。该步骤的高回收精度、稳定的大片段的去除(或小片段富集)能力可在很大程度稳定而有效地提高下游产出待检样本中胎儿游离DNA的浓度。
本发明发现,在使用现有的DNA片段筛选方案(包括但不限于二氧化硅吸附/洗脱、凝胶电泳、固相可逆吸附等)来富集胎儿游离DNA,均存在富集效果的稳定性差以及富集后游离DNA的回收效率不足的问题。在一具体实施例中,首先使用高结合力羟基磁珠提取孕妇血浆样本,获得全部游离DNA溶液。然后,使用高效的片段筛选纯化试剂富集所得全部游离DNA溶液以获得富集胎儿游离DNA的提取产物。但该方案针对相同样本的平行实验结果,呈现出显著的不稳定性,说明该方案存在富集稳定性差的问题。分析发现其中采用将固定体积的游离DNA溶液与一定比例的固定体积羧基磁珠核酸纯化试剂混合,达到对不同片段具有不同纯化效率的反应体系,结合大片段DNA与羧基磁珠上,保留小片段DNA于溶液中。但这一过程对于片段大小的回收效率差异精确依赖DNA溶液与磁珠溶液混合后的体系中的有效分子浓度有关(包括但不限于PEG浓度,盐离子浓度等),这一有效分子浓度取决于最终反应溶液中的自由水含量以及大分子PEG含量、阳离子含量的比例。因此如果想要达到高精度高稳定性的大片段去除效果,就高度依赖两个因素:1)液体混合过程中的取样体积的精度和稳定;2)提取产物DNA溶液中的自由水含量。但在实际操作中,这两因素会受液相残留(例如:乙醇、洗涤液等)、液体间混合体积变化、吸取移液操作的精确性和稳定性等的影响。例如:1)液体混合体积的准确性及精密度的问题。在实际实验操作中,实验过程会因移液器具自身的精度以及操作的波动性,具有不可避免的随机误差以及可能的人为失误。导致大片段去除步骤反应液浓度在传统流程下的固有精度受到限制,无法消除操作带来的误差,进而不能保证筛选效果及筛选效果稳定性。2)在提取实验过程中,提取产物游离DNA溶液在进行最后的洗脱步骤前需要高浓度醇溶液漂洗去除多余的杂质及离子,并在洗脱前将漂洗也去除。但是因为移液***无法精密全部去除容器内溶液,一般会采用晾干的方式以最终去除。但这一过程在实际操作过程中,会因为液体去除操作的不完全,或晾干过程的不充分(晾干不充分在核酸提取中是常见的,因为过度的晾干操作会导致磁珠板结,影响后续核酸洗脱效果),导致提取产物核酸溶液中总会或多或少的残留不同程度的漂洗液。这部分漂洗液的存在,会使得大片段去除步骤选取固定体积溶液混合时,其中真正的自有水含量比例存在不确定性,导致大片段去除步骤体系浓度(水基质溶液)产生误差,不能保证筛选效果及筛选效果稳定性。
本发明发现,在游离DNA洗脱过程中,容器吸附、磁珠浸入等原因不可避免地导致部分游离DNA溶液形成无法被移液器吸取的死体积,无法进入后续片段筛选过程,进而造成的游离DNA损失。此问题可以通过增大洗脱体积的方式来降低死体积占比,但大片段去除步骤中混合后筛选体系所需的倍数于待筛选核酸液相(即游离DNA提取过程中的洗脱体系)的混合比例,使得下游体系限制了游离DNA提取过程中的洗脱体系的体积上限,继而限制了核酸片段富集回收率。
为解决上述问题,本发明提供一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法,简并了孕妇血浆游离DNA提取流程与胎儿游离DNA筛选富集流程,构建了一套双核分步式连续反应方案,以孕妇血浆为样本起始,实现稳定高效的获得胎儿游离DNA占比提升的游离DNA提取产物,并且该方法可根据下游检测需求通过调整核心试剂的比例,选择性地调整(提高)提取产物胎儿游离DNA的富集浓度(即胎儿游离DNA占比),满足不同检测需求。
因此,在一方面本发明提供一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法,其包括:全部游离DNA回收和大片段游离DNA去除。
其中,全部游离DNA回收,是通过在盐离子酸性溶液体系下,使游离DNA与羟基结合部结合,获得结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分和包含其余成分的液相部分;分离并除去液相部分,获得结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分;
其中,大片段游离DNA去除,通过在碱性条件下使含有羧基结合部的液相与结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分进行混合孵育,获得包含有与羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分和包含未与羧基结合部和/或羟基结合部结合的游离DNA片段的液相部分;分离固相和液相,获得包含待富集胎儿来源游离DNA片段的液相部分;
在一些实施方式中,羟基结合部包括带有羟基修饰基团的核酸结合载体;
在一些实施方式中,羧基结合部包括带有羧基修饰基团的核酸结合载体。
在一些实施方式中,羧基结合部具有游离DNA片段筛选能力,可同时洗脱羟基结合部上结合的游离DNA片段,并选择性地结合其中目标片段大小的游离DNA片段。
在一些实施方式中,盐离子酸性溶液体系通过向体系中加入裂解液实现。
在一些实施方式中,裂解结合液含有离液盐。例如,离液盐,包括碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、异硫氰酸胍中的任一种或多种。
在一些实施方式中,裂解结合液还含有表面活性剂、Tris、EDTA。
在一些实施方式中,面活性剂为非离子型表面活性剂。
例如,表面活性剂为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯中的一种或多种。
在一些实施方式中,Tris为Tris-HCl和Tris-AC中的任一种或两种。
在一些实施方式中,裂解结合液含有4~6M异硫氰酸胍,0.5~2M盐酸胍,1~4重量%Triton X-100,50~100mM Tris-HCl,pH5~6,5~10mM EDTA。
在一些实施方式中,羟基结合部选自羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜、带羟基硅胶模、微孔玻璃、嵌入二氧化硅颗粒滤膜、硅胶颗粒、二氧化硅构成的藻土型树脂、玻璃纤维中的任一种或多种。
例如,所述羟基结合部选自羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜中的任一种或多种。
例如,所述羟基结合部为羟基磁珠;
例如,所述羟基磁珠为羟基磁珠悬浮液,其包含30~80mg/ml羟基修饰磁珠。
例如,所述羟基磁珠悬浮液,其包括40mg/ml羟基修饰磁珠。
在一些实施方式中,所述羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种。
例如,所述羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种。
例如,所述羧基结合部为羧基磁珠。
在一些实施方式中,所述羧基磁珠为含有PEG和盐离子的碱性羧基磁珠悬浮液。
所述羧基磁珠悬浮液,其组成选自可实现目标胎儿游离DNA富集浓度提升的任一组合。
例如,所述PEG选自PEG6000~20000任一种或多种。
例如,所述羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.05~2重量%的羧基修饰磁珠,10~20重量%的PEG6000~20000,1~4M的NaCl,1-100mM的Tris-HCl,以及0.1-10mM的EDTA,pH值为6.0~9.0。
例如,所述羧基磁珠悬浮液,其组成包括1重量%的羧基修饰磁珠,14重量%的PEG10000,1.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
在一些实施方式中,所述大片段游离DNA是指除片段长度大于N的游离DNA片段。例如,N大小为50bp~300bp中的任一长度。
例如,所述N大小为50~250bp中的任一长度。
例如,所述N大小为100-200bp中的任一长度。
例如,所述N大小为150bp。
在一些实施方式中,大片段游离DNA去除步骤后还包括小片段游离DNA回收和洗脱。
其中,所述小片段游离DNA回收是通过将大片段游离DNA去除步骤中获得包含待富集胎儿来源游离DNA片段的液相部分与第二羧基结合部进行混合孵育,获得包含有与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分和包含其余成分的液相部分;分离固相和液相,获得与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分。
在一些实施方式中,所述洗脱,是通过低盐溶液洗脱第二羧基结合部上结合的游离DNA片段,洗脱溶液即为胎儿来源游离DNA占比提升的游离DNA富集提取产物。
在一些实施方式中,所述第二羧基结合部包括带有羧基修饰基团的核酸结合载体。
在一些实施方式中,所述洗脱步骤前还包括洗涤步骤,其可去除残留在与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相上的PEG和盐溶液。
例如,所述洗涤步骤使用70%~80%乙醇溶液。
在一些实施方式中,所述第二羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种。
例如,所述第二羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种。
例如,所述第二羧基结合部为羧基磁珠。
例如,所述羧基磁珠为含有PEG和盐离子的碱性第二羧基磁珠悬浮液,所述第二羧基磁珠悬浮液中的PEG和盐离子浓度大于羧基磁珠悬浮液。
例如,所述PEG选自PEG6000~20000。
例如,所述第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.05~2重量%的羧基修饰磁珠,15~30重量%的PEG6000~20000,1~4M的NaCl,1-100mM的Tris-HCl,以及0.1-10mM的EDTA,pH值为6.0~9.0。
例如,所述第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括1重量%的羧基修饰磁珠,25重量%的PEG10000,2.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
在一些实施方式中,所述全部游离DNA回收步骤前还包括游离DNA的释放步骤,其通过将孕妇血浆样本进行消化裂解,释放游离DNA进入到消化液中。
例如,所述游离DNA的释放进一步包括将孕妇血浆样本,与含有蛋白酶K和SDS的体系进行混合孵育;
例如,所述混合孵育为37℃下的恒温孵育。
在一些实施方式中,所述全部游离DNA回收和大片段去除步骤间还包括洗涤步骤,其可去除结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分上残留的蛋白和盐离子;
例如,所述洗涤步骤先后使用洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ,清洗结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分。
在一些实施方式中,所述核酸结合载体包括但不限于磁珠、玻璃珠、玻璃纤维、硅胶颗粒、硅胶膜、二氧化硅颗粒中的任一种或多种。
例如,所述核酸结合载体为磁珠,其为通用的磁性纳米颗粒。
例如,所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒。
在另一方面本发明提供一种构建DNA测序文库的方法,其利用前述任一项所述的方法对DNA样本进行富集处理;将富集处理产物进行DNA建库处理,以便获得DNA测序文库。
在另一方面本发明提供前述任一项所述的方法在富集血浆DNA方面的应用。
例如,所述血浆DNA包括胎儿游离DNA、循环肿瘤DNA、病原微生物DNA中的任一种或多种。
在另一方面本发明提供前述任一项所述的方法在检测包括遗传异常、染色体畸变、染色体非整倍性、与癌症或肿瘤状态相关的生物标志物、与传染原有关的核酸中的任一项或多项中的应用。
本发明提供一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法,可根据下游检测需求选择性地提高所得游离DNA提取产物中胎儿游离DNA的占比。克服了液体混合体积的准确性及精密度的影响和提取产物游离DNA溶液中的自由水含量的对富集稳定性的影响,提升了胎儿游离DNA富集效果的精度和稳定性。并且通过简并的提取与筛选富集流程克服了提取过程中游离DNA溶液体积损失提升了胎儿游离DNA富集提取产量。同时,本发明可根据下游检测需求通过调整核心试剂的比例,选择性地调整提取产物胎儿游离DNA的富集浓度(即胎儿游离DNA占比),满足更多检测需求。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解。构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定,其中:
图1所示为孕妇外周血血浆中婴儿来源游离DNA部分片段大小与母源游离DNA片段大小峰分布示意图。
图2所示为本发明实施例1与对比例2两种富集方案的提取流程图。
图3所示为本发明对比例1中仅使用羟基磁珠提取孕妇血浆中全部游离DNA直接构建文库的Caliper LabChip GX检测文库峰图。
图4a所示为本发明实施例1中游离DNA提取与胎儿游离DNA富集流程简并方案(双核分步式连续反应)所得游离DNA富集提取产物的Caliper LabChip GX检测文库峰图。
图4b所示为本发明对比例2中游离DNA提取与胎儿游离DNA筛选富集流程先后独立进行反应方案(双核分步式独立反应)所得游离DNA富集提取产物的Caliper LabChip GX检测文库峰图。
图5a所示为本发明实施例1和对比例1、对比例2三种提取方案所得游离DNA富集提取产物中胎儿游离DNA富集效果。
图5b所示为本发明对比例2和实施例1提取方案所得游离DNA富集提取产物构建文库浓度结果。
图6所示为本发明实施例1提取方案中模拟胍盐残留对胎儿游离DNA富集效果的影响。
图7所示为本发明实施例1提取方案中模拟乙醇残留对胎儿游离DNA富集效果的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品,例如可以采购自Illumina公司。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”仅用于区别类似的对象,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或是用于描述特定的顺序或先后次序。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征,应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
离液盐(Chaotropic Salts):是一种可以扰乱水分子间的氢键、增加其混乱度的盐,比如在离子对色谱中常见的高氯酸盐、六氟磷酸盐等就属于离液盐。合适的离液盐的加入可以增强离子型分析物的疏水性,从而提高其保留。根据离液盐的电荷离域性和极化率大小,在Hofmeister系列中被排序,电荷离域性越强、极化率越大,离液序列越高,也就是扰乱水分子间氢键的能力越强。
磁珠:就是指具有细小粒径的超顺磁微球。磁珠一般具有超强的顺磁性,在磁场中能够迅速聚集,离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散。其次,具有合适的且差别较小的粒径,保证了足够强的磁响应性又不会沉降。再次,具有丰富的表面活性基团,以便可以和生化物质偶联,并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
羟基磁珠:磁珠表面修饰大量的硅烷醇集团(羟基),能在高盐低pH条件下和溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合,而不与其他杂质(如蛋白)结合,迅速从生物样品中分离核酸,操作安全简单,非常适用于核酸的自动化和高通量提取。
羧基磁珠:磁珠表面修饰有丰富的羧基基团,能够在特殊化学试剂的作用下将蛋白质、核酸、多肽等偶联到磁珠表面,在蛋白纯化、免疫检测、分子检测、NGS、细胞分离等领域应用广泛。
本发明中利用了羟基和羧基,两种类型基团与DNA的结合原理的不同。与高浓度离液盐(如盐酸胍、异硫氰酸胍、高氯酸钠和碘化钠等)配合使用时,羟基可在高浓度盐离子酸性体系下,不区分片段大小的将体系内全部的DNA结合到羟基基团上,在低浓度盐离子碱性溶液环境下,DNA片段与羟基基团分离。而羧基基团为在碱性环境下,在不同的PEG(聚乙二醇)和盐离子浓度下可将不同长度的DNA片段结合到羧基基团上,从而实现不同核酸片段的筛选,在适当条件下,DNA可从羧基基团表面洗脱下来。本发明通过建立一套双核(羟基磁核磁珠和羧基磁核磁珠)分步式连续反应,简并了核酸的提取流程与筛选富集流程,以血浆样本起始,稳定高效的获得胎儿来源游离DNA占比提升的游离DNA提取产物的提取方案。
在本发明中,简并了核酸的提取流程与筛选富集流程,是通过向固相的结合有游离DNA的羟基磁珠上,直接加入预先设定好PEG和盐离子浓度的液相羧基磁珠悬浮液,在同一份反应溶液体系中,同时完成DNA与羟基磁珠的分离,以及大片段游离DNA与羧基磁珠结合。使得羧基磁珠溶液在洗脱了羟基磁珠上所结合所有游离DNA的同时,又有选择性的结合了其中与溶液本身设计所含PEG和盐离子浓度对应大片段游离DNA。此时在磁场吸附下,吸取上清液(液相部分)中则包含待富集的胎儿来源游离DNA。此时,使用磁珠再次富集上清液中剩余游离DNA,洗脱后即为胎儿来源游离DNA占比提升的游离DNA提取产物。
因此,本发明一方面提供一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法,其包括:全部游离DNA回收和大片段游离DNA去除。
其中,全部游离DNA回收是在高浓度盐离子酸性溶液体系下,使游离DNA与羟基结合部结合。获得结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分和包含其余成分的液相部分。分离并除去液相部分;获得结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分。
其中,大片段游离DNA去除,通过在碱性条件下使含有羧基结合部的液相与结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分进行混合孵育。获得包含有与羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分和包含未与羧基结合部和/或羟基结合部结合的游离DNA片段的液相部分。分离固相和液相;获得包含待富集胎儿来源游离DNA片段的液相部分。
在一些实施方式中,羧基结合部具有游离DNA片段筛选能力。可同时洗脱羟基结合部上结合的游离DNA片段;并结合其中目标片段大小的游离DNA片段。
在一些实施方式中,羟基结合部为带有羟基修饰基团的核酸结合载体。例如,核酸结合载体包括但不限于磁珠、玻璃珠、玻璃纤维、硅胶颗粒、硅胶膜、二氧化硅颗粒中的任一种或多种。根据本发明的方法,例如,羟基结合部为羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜、带羟基硅胶模、微孔玻璃、嵌入二氧化硅颗粒滤膜、硅胶颗粒、二氧化硅构成的藻土型树脂、玻璃纤维中的任一种或多种。例如,羟基结合部为羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜中的任一种或多种。例如,羟基结合部为羟基磁珠。
在一些实施方式中,羟基磁珠为羟基磁珠悬浮液。例如,基磁珠悬浮液组成包括30~80mg/ml羟基修饰磁珠。例如,羟基磁珠悬浮液其组成包括40mg/ml羟基修饰磁珠。
在一些实施方式中,全部游离DNA回收步骤中的盐离子酸性溶液体系是高浓度盐离子酸性溶液体系。所述高浓度盐离子酸性溶液体系,通过向体系中加入裂解结合液实现。所述裂解结合液含有高浓度离液盐。所述高浓度离液盐,包括碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、异硫氰酸胍中的任一种或多种。例如,所述高浓度离液盐,包括盐酸胍、异硫氰酸胍任一种或多种。
在一些实施方式中,所述裂解结合液含有4~6M异硫氰酸胍,0.5~2M盐酸胍。例如所述裂解结合液含有4.5~5.5M异硫氰酸胍,0.8~1.5M盐酸胍。再例如,裂解结合液含有5M异硫氰酸胍,1M盐酸胍。
在一些实施方式中,所述裂解结合液还含有表面活性剂、Tris、EDTA。所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。例如,所述非离子型表面活性剂为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯中的一种或多种。例如,所述非离子型表面活性剂为Triton X-100。所述的Tris为Tris-HCl和Tris-AC中的任一种或两种。例如,所述的Tris为Tris-HCl。
例如,所述裂解结合液含有异硫氰酸胍、盐酸胍、Triton X-100、Tris-HCl、EDTA。例如,所述裂解结合液含有4~6M异硫氰酸胍,0.5~2M盐酸胍,1~4重量%Triton X-100,50~100mM Tris-HCl,pH5~6,5~10mM EDTA。例如,所述裂解结合液含有4.5~5.5M异硫氰酸胍,0.8~1.5M盐酸胍,2~3重量%Triton X-100,50~80mM Tris,pH5~6,5~8mM EDTA。例如裂解结合液含有5M异硫氰酸胍,1M盐酸胍,3重量%Triton X-100,50mM Tris,pH5.5,5mM EDTA。
在一些实施方式中,所述裂解结合液各成分的用量可以根据水的用量而调节,以能够满足上述浓度和pH值为目的。水可以为本领域常规的水,例如ddH2O。
在一些实施方式中,羧基结合部为带有羧基修饰基团的核酸结合载体。其中,核酸结合载体包括但不限于磁珠、玻璃珠、玻璃纤维、硅胶颗粒、硅胶膜、二氧化硅颗粒中的任一种或多种。例如,羧基结合部为羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种。例如,羧基结合部为羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种。例如,羧基结合部为羧基磁珠。
在一些实施方式中,羧基磁珠为含有PEG和盐离子碱性的羧基磁珠悬浮液。
在一些实施方式中,羧基磁珠悬浮液,其组成选自可实现目标胎儿游离DNA富集浓度提升的任一组合。
在一些实施方式中,例如,羧基磁珠悬浮液中PEG选自PEG6000~20000任一种或多种的组合。例如,羧基磁珠悬浮液中PEG为PEG10000。
在一些实施方式中,例如,羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.05~2重量%的羧基修饰磁珠,10~20重量%的PEG6000~20000,1~4M的NaCl,1~100mM的Tris-HCl,以及0.1~10mM的EDTA,pH值为6.0~9.0。例如但不限于,羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.5~1.5重量%的羧基修饰磁珠,12~18重量%的PEG10000,1~3M的NaCl,1~50mM的Tris-HCl,以及0.1~5mM的EDTA,pH值为7.0~9.0。例如,羧基磁珠悬浮液,其组成包括1重量%的羧基修饰磁珠,15重量%的PEG10000,1.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
在一些实施方式中,所述羧基磁珠悬浮液各成分的用量可以根据水的用量而调节,以能够满足上述浓度和pH值为目的。水可以为本领域常规的水,例如ddH2O。
本发明在高浓度盐离子酸性溶液环境下,将全部游离DNA分子结合到羟基磁核上,弃去上清并,洗涤进一步去除残留的盐离子后,获得结合在固相羟基磁核上的游离DNA。然后向固相的羟基磁核中,加入低浓度PEG和盐离子碱性溶液的羧基磁珠悬浮液,此时羧基磁珠悬浮液的溶液环境,会导致DNA片段与羟基磁核分离进入到溶液中,同时低浓度PEG和盐离子可以使得大片段的游离DNA结合到羧基磁珠上,而小片段游离DNA则仍然溶解在羧基磁珠悬浮液的溶液中。
在一些实施方式中,大片段游离DNA是指片段长度大于N的游离DNA片段,N大小为50bp~300bp中的任一长度。例如,N为50~250bp的任一长度。例如,N为100~200bp。例如,N为150bp。
根据本发明的方法,在大片段游离DNA去除步骤后还包括小片段游离DNA回收和洗脱。这里的小片段为待富集样本中排除大片段部分后剩余的小片段部分。
其中,小片段游离DNA回收是通过向大片段游离DNA去除步骤中获得包含待富集胎儿来源游离DNA片段的液相部分加入第二羧基结合部混合孵育。获得包含有与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分和包含其余成分的液相部分。分离固相和液相;获得与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分。
在一些实施方式中,洗脱是通过低盐溶液洗脱第二羧基结合部上结合的游离DNA片段;获得胎儿来源游离DNA占比提升的游离DNA富集提取产物。
在一些实施方式中,第二羧基结合部为带有羧基修饰基团的核酸结合载体。所述核酸结合载体包括但不限于磁珠、玻璃珠、玻璃纤维、硅胶颗粒、硅胶膜、二氧化硅颗粒中的任一种或多种。例如,第二羧基结合部为羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种。例如,第二羧基结合部为羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种。例如,第二羧基结合部为羧基磁珠。
在一些实施方式中,第二羧基结合部为含有PEG和盐离子碱性的羧基磁珠悬浮液。
在一些实施方式中,第二羧基磁珠悬浮液中的PEG和盐离子浓度大于羧基磁珠悬浮液。以达到富集所述体系中剩余的全部游离DNA。
在一些实施方式中,第二羧基磁珠悬浮液中PEG选自PEG6000~20000任一种或多种的组合。例如,第二羧基磁珠悬浮液中PEG为PEG10000。
在一些实施方式中,第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.05~2重量%的羧基修饰磁珠,15~30重量%的PEG6000~20000,1~4M的NaCl,1~100mM的Tris-HCl,以及0.1~10mM的EDTA,pH值为6.0~9.0。例如但不限于,第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.5~1.5重量%的羧基修饰磁珠,20~30重量%的PEG10000,2~4M的NaCl,1~50的Tris-HCl,以及0.1~5mM的EDTA,pH值为7.0~9.0。例如,第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括1重量%的羧基修饰磁珠,25重量%的PEG10000,2.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
在一些实施方式中,所述第二羧基磁珠悬浮液各成分的用量可以根据水的用量而调节,以能够满足上述浓度和pH值为目的。水可以为本领域常规的水,例如ddH2O。
在一些实施方式中,通过低盐溶液洗脱第二羧基结合部上结合的游离DNA片段;后分离去除固相;获得胎儿来源游离DNA占比提升的游离DNA富集提取产物。其中的低盐溶液为洗脱液。洗脱液的组成含有1mM Tris-HCl、0.01mM EDTA、0.01重量%tween20。
在一些实施方式中,所述洗脱液各成分的用量可以根据水的用量而调节,以能够满足上述浓度和pH值为目的。水可以为本领域常规的水,例如ddH2O。
根据本发明的方法,在洗脱步骤前还包括洗涤步骤;以去除残留在与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相上的PEG和盐溶液。任选地,洗涤步骤使用70%~80%乙醇溶液。更任选地,洗涤步骤使用75%乙醇溶液。
本发明先将溶解有小片段游离DNA的羧基磁珠悬浮液的溶液上清取出,加入到含有更高浓度的PEG和盐离子碱性溶液的第二羧基磁珠悬浮液中,此时在高浓度PEG和盐离子条件下,小片段游离DNA结合到羧基磁珠上,弃去上清,并洗涤进一步去除残留的PEG和盐离子后,加入不含有PEG的洗脱液,即可获得胎儿来源游离DNA占比提升的游离DNA提取产物。
本发明的关键在于利用羟基磁核和羧基磁核与DNA结合原理的不同,通过向固相的结合有游离DNA的羟基磁珠上,加入预先设定好PEG和盐离子浓度的液相羧基磁珠悬浮液,在同一份反应溶液体系中,同时完成DNA与羟基磁珠的分离,以及大片段游离DNA与羧基磁珠结合。
根据本发明的方法,在全部游离DNA回收步骤前还包括游离DNA的释放。通过将孕妇血浆样本进行消化裂解,释放游离DNA进入消化液中。
根据本发明的方法,游离DNA的释放进一步包括将孕妇血浆样本,与含有蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸钠)的体系进行混合孵育。混合孵育为37℃下的恒温孵育。
在一些实施方式中,所述蛋白酶K使用时以工作液形式,其包括蛋白酶K,50%甘油,20mM Tris,pH7.4,10mm CaCl2,0.05%防腐剂。
在一些实施方式中,SDS为以SDS缓冲液形式使用,其包括20%十二烷基硫酸钠。
根据本发明的方法,在全部游离DNA回收和大片段去除步骤间还包括洗涤步骤。以去除结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分上残留的蛋白和盐离子。具体地,先后使用洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ,清洗结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分。
在一些实施方式中,洗涤液Ⅰ含有离液盐、表面活性剂、Tris、乙醇和/或异丙醇。例如,洗涤液Ⅰ含有1~4M异硫氰酸胍,0.1~1M盐酸胍,1~3重量%Triton X-100,50~100mMTris,pH7~7.5,30-60%乙醇和/或异丙醇;洗涤液Ⅱ包含70~80%乙醇。例如但不限于,洗涤液Ⅰ包含1~3M异硫氰酸胍,0.2~0.8M盐酸胍,1~2重量%Triton X-100,50~80M Tris,pH7~7.5,30-50%乙醇和/或异丙醇;洗涤液Ⅱ包含70~80%乙醇。例如,洗涤液Ⅰ包含2M异硫氰酸胍,0.5M盐酸胍,1重量%Triton X-100,50mM Tris,pH7.4,40%乙醇和/或异丙醇;洗涤液Ⅱ包含80%乙醇。
在一些实施方式中,核酸结合载体为通用的磁性纳米颗粒,磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒,优选的,超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒。
在发明的另一方面提供一种构建DNA测序文库的方法,根据本发明富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取的方法,对DNA样本进行富集处理;将富集处理产物进行建库处理,以便获得DNA测序文库。
在发明的另一方面,本发明还可以用于富集体液中的其他DNA,包括但不限于ctDNA(循环肿瘤DNA)、病原微生物DNA。
在发明的另一方面提供一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法在检测包括遗传异常、染色体畸变或非整倍性、与癌症或肿瘤状态相关的生物标志物或与传染原有关的核酸中的任一项或多项的应用。
在发明的另一方面提供一种胎儿游离DNA的血浆核酸提取试剂盒,其包含:羟基结合部和羧基结合部。
其中,羟基结合部为带有羟基修饰基团的核酸结合载体。
其中,羧基结合部为带有羧基修饰基团的核酸结合载体。
在一些实施方式中,胎儿游离DNA的血浆核酸提取试剂盒,还包括第二羧基结合部。其中,第二羧基结合部为带有羧基修饰为基团的核酸结合载体。
在一些实施方式中,核酸结合载体为包括但不限于磁珠、玻璃珠、玻璃纤维、硅胶颗粒、硅胶膜、二氧化硅颗粒中的任一种或多种。例如但不限于,核酸结合载体为磁珠;其为通用的磁性纳米颗粒。例如,磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒、超顺磁性三氧化二铁颗粒中的任一中或两种。
在一些实施方式中,羧基结合部具有核酸片段筛选能力,可同时洗脱羟基结合部上结合的核酸片段,并选择性地结合其中目标片段大小的游离DNA片段。
在一些实施方式中,羟基结合部可选自羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜、带羟基硅胶模、微孔玻璃、嵌入二氧化硅颗粒滤膜、硅胶颗粒、二氧化硅构成的藻土型树脂、玻璃纤维中的任一种或多种。例如,羟基结合部选自羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜中的任一种或多种。例如,羟基结合部为羟基磁珠。
在一些实施方式中,羟基磁珠以羟基磁珠悬浮液形式使用,羟基磁珠悬浮液包含30~80mg/ml羟基修饰磁珠。例如,羟基磁珠悬浮液包括40mg/ml羟基修饰磁珠。
在一些实施方式中,羧基结合部和/或第二羧基结合部均可为选自羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种。例如,羧基结合部和/或第二羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种。例如,羧基结合部和/或第二羧基结合部为羧基磁珠。
在一些实施方式中,羟基磁珠以羟基磁珠悬浮液形式使用,分别为羟基磁珠悬浮液和第二羟基磁珠悬浮液。两者皆为含有PEG和盐离子的碱性溶液。例如,PEG可选自PEG6000~20000任一种或多种。
在一些实施方式中,羧基磁珠悬浮液,其组成选自可实现目标胎儿游离DNA富集浓度提升的任一组合。
在一些实施方式中,第二羧基磁珠悬浮液中的PEG和盐离子浓度大于羧基磁珠悬浮液。
在一些实施方式中,所述羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.05~2重量%的羧基修饰磁珠,10~20重量%的PEG6000~20000,1~4M的NaCl,1~100mM的Tris-HCl,以及0.1~10mM的EDTA,pH值为6.0~9.0。例如但不限于,羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.5~1.5重量%的羧基修饰磁珠,12~18重量%的PEG10000,1~3M的NaCl,1~50mM的Tris-HCl,以及0.1~5mM的EDTA,pH值为7.0~9.0。例如,羧基磁珠悬浮液,其组成包括1重量%的羧基修饰磁珠,15重量%的PEG10000,1.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
在一些实施方式中,所述羧基磁珠悬浮液各成分的用量可以根据水的用量而调节,以能够满足上述浓度和pH值为目的。水可以为本领域常规的水,例如ddH2O。
在一些实施方式中,所述第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.05~2重量%的羧基修饰磁珠,15~30重量%的PEG6000~20000,1~4M的NaCl,1~100mM的Tris-HCl,以及0.1~10mM的EDTA,pH值为6.0~9.0。例如但不限于,第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.5~1.5重量%的羧基修饰磁珠,20~30重量%的PEG10000,2~4M的NaCl,1~50的Tris-HCl,以及0.1~5mM的EDTA,pH值为7.0~9.0。例如,第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括1重量%的羧基修饰磁珠,25重量%的PEG10000,2.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
在一些实施方式中,所述第二羧基磁珠悬浮液各成分的用量可以根据水的用量而调节,以能够满足上述浓度和pH值为目的。水可以为本领域常规的水,例如ddH2O。
根据本发明的试剂盒,还包括裂解结合液。裂解结合液为盐离子酸性溶液,其含有离液盐。例如,裂解结合配方包含离液盐、表面活性剂、Tris、EDTA。
本发明一些实施方式中,所述离液盐包括但不限于碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、异硫氰酸胍中的任一种或多种的组合。例如,为盐酸胍、异硫氰酸胍中的任一种或两种。
本发明一些实施方式中,所述裂解结合液配方包含4~6M异硫氰酸胍,0.5-2M盐酸胍,1~4%Triton X-100,50~100mM Tris,pH5-6,5-10mM EDTA。例如,所述裂解结合液配方包含5M异硫氰酸胍,1M盐酸胍,3%Triton X-100,50mM Tris,pH5.5,5mM EDTA。
根据本发明的试剂盒,还包括蛋白酶K。本发明一些实施方式中,蛋白酶K使用工作液的组成包含蛋白酶K,50%甘油,20mM Tris,pH7.4,10mm CaCl2,0.05%防腐剂。
根据本发明的试剂盒,还包括SDS缓冲液。本发明一些实施方式中,其组成包含20%十二烷基硫酸钠。
根据本发明的试剂盒,还包括洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ。
本发明一些实施方式中,所述洗涤液Ⅰ组成包含离液盐、表面活性剂、Tris、乙醇和/或异丙醇。例如,所述洗涤液Ⅰ组成包含1-4M异硫氰酸胍,0.1-1M盐酸胍,1~3%TritonX-100,50~100mM Tris,pH7-7.5,30-60%乙醇和/或异丙醇。例如,其组成包含2M异硫氰酸胍,0.5M盐酸胍,1%Triton X-100,50mM Tris,pH7.4,40%乙醇和/或异丙醇。
本发明一些实施方式中,所述洗涤液Ⅱ包含70%-80%乙醇和/或异丙醇。例如,其组成包含70%-80%乙醇。例如,其组成包含80%乙醇。
根据本发明的试剂盒,还包括洗脱液。
本发明一些实施方式中,所述洗脱液组成包含1mMTris-HCl、0.01mM EDTA、0.01%tween20。
在发明的另一方面提供一种胎儿游离DNA的血浆核酸提取试剂盒,在提高孕妇外周血游离DNA提取产物中胎儿游离DNA的占比方向的应用。
本发明一些实施方式中,其包括,孕妇外周血预处理。预处理后的样品在蛋白酶K和SDS缓冲液存在体系中混合孵育,获得裂解液。裂解液在羟基磁珠和裂解结合液存在的体系中混合孵育;使体系中磁珠被吸附,去除上清液。去除上清液的体系中加入羧基磁珠悬浮液,混匀孵育;使体系中磁珠被吸附,获取上清液。上清液中再次加入第二羧基磁珠悬浮液,混匀孵育;使体系中磁珠被吸附,去除上清液。使用洗涤液洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ先后清洗磁珠。加入洗脱液,使磁珠上吸附的游离DNA洗脱,获得游离DNA提取产物。
在发明的另一方面提供一种胎儿游离DNA的血浆核酸提取试剂盒在检测包括遗传异常、染色体畸变或非整倍性、与癌症或肿瘤状态相关的生物标志物或与传染原有关的核酸中的任一项或多项的应用。
实施例
以下结合附图和实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
样本:
正常妊娠男胎孕妇外周血血浆(实施例1、对比例1、对比例2均采用同一样本)。
试剂:
SDS缓冲液:20%十二烷基硫酸钠。
蛋白酶K工作液:蛋白酶K,50%甘油,20mM Tris,pH7.4,10mm CaCl2,0.05%防腐剂。
裂解结合液:5M异硫氰酸胍,1M盐酸胍,3%Triton X-100,50mM Tris,pH5.5,5mMEDTA。
羟基磁珠溶液:40mg/ml羟基修饰磁珠。
羧基磁珠溶液:1重量%的羧基修饰磁珠,15重量%的PEG10000,1.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
第二羧基磁珠溶液:1重量%的羧基修饰磁珠,25重量%的PEG10000,2.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
洗涤液Ⅰ:2M异硫氰酸胍,0.5M盐酸胍,1%Triton X-100,50mM Tris,pH7.4,40%乙醇(或异丙醇)。
洗涤液Ⅱ:80%乙醇。
洗涤液Ⅲ:75%乙醇。
洗脱液:1mMTris-HCl、0.01mM EDTA、0.01%tween20。
筛选磁珠溶液:1重量%的羧基修饰磁珠,25重量%的PEG10000,2.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
实施例1游离DNA提取与胎儿游离DNA富集流程简并方案(双核分步式连续反应/游离DNA提取与胎儿游离DNA片段筛选纯化简并反应,既本发明技术方案)
1.取300μL孕妇血浆。
2.加入按照下表配制反应混合液,振荡混匀,恒温37℃温育10min。
试剂 | 单个反应量(μL) |
SDS缓冲液 | 15 |
羟基磁珠溶液 | 30 |
洗脱液 | 15 |
蛋白酶K工作液 | 7.5 |
3.加入450μL裂解结合液,振荡混匀,室温孵育10min。
4.磁力吸附下,去除上清液;解除磁力吸附后,加入600μL洗涤液Ⅰ,振荡混匀。
5.磁力吸附下,去除上清液;解除磁力吸附后,加入300μL洗涤液Ⅱ,振荡混匀。
6.磁力吸附下,去除上清液。
7.重复洗涤液Ⅱ清洗操作。
8.解除磁力吸附后,加入平衡混匀充分的125μL羧基磁珠溶液,振荡混匀;室温静置孵育10min置换大片段DNA。然后室温下磁力吸附静置。
9.取上清重复磁力吸附静置,取上清液加入40μL平衡混匀充分的第二羧基磁珠溶液,震荡混匀;室温静置10min使磁珠与DNA充分结合。
10.室温下磁力吸附5min,去除上清液;
11.向反应中加入200μL新鲜配制的75%的乙醇,吹打后静置。静置结束后将去除上清液,并重复操作。
12.磁力吸附下,室温开盖晾干以去除残存的乙醇。
13.解除磁力吸附后,加入21.5μL洗脱液,震荡之后室温静置。
14.磁力吸附,室温静置,取上清液即为小片段富集后的游离DNA提取产物。
对比例1羟基磁珠提取游离DNA(单核提取反应)
1.取300μL孕妇血浆。
2.加入按照下表配制反应混合液,震荡混匀,恒温37℃温育10min。
试剂 | 单个反应量(μL) |
SDS缓冲液 | 15 |
羟基磁珠溶液 | 30 |
洗脱液 | 15 |
蛋白酶K工作液 | 7.5 |
3.加入450μL裂解结合液,振荡混匀,室温孵育10min。
4.磁力吸附下,去除上清液;解除磁力吸附后,加入600μL洗涤液Ⅰ,振荡混匀。
5.磁力吸附下,去除上清液;解除磁力吸附后,加入300μL洗涤液Ⅱ,振荡混匀。
6.磁力吸附下,去除上清液。
7.重复洗涤液Ⅱ清洗操作。
8.去除上清液,磁力吸附下室温干燥10-15min,直到磁珠表面无缓冲液残留。
9.解除磁力吸附,加入20.5μL洗脱液振荡打散磁珠,静置使DNA溶解后瞬时离心,使得磁珠集中在管底。
10.磁力吸附下,取上清为血浆游离DNA提取产物。
对比例2游离DNA提取与胎儿游离DNA筛选富集流程先后独立进行反应方案(双核分步式独立反应)
1.孕妇血浆游离DNA提取反应。
1)取300μL孕妇血浆。
2)加入按照下表配制反应混合液,震荡混匀,恒温37℃温育10min。
试剂 | 单个反应量(μL) |
SDS缓冲液 | 15 |
羟基磁珠溶液 | 30 |
洗脱液 | 15 |
蛋白酶K工作液 | 7.5 |
3)加入450μL裂解结合液,振荡混匀,室温孵育10min。
4)磁力吸附下,去除上清液;解除磁力吸附后,加入600μL洗涤液Ⅰ,振荡混匀。
5)磁力吸附下,去除上清液;解除磁力吸附后,加入300μL洗涤液Ⅱ,振荡混匀。
6)磁力吸附下,去除上清液。
7)重复洗涤液ⅡⅢ清洗操作。
8)去除上清液,磁力吸附下室温干燥10-15min,直到磁珠表面无缓冲液残留。
9)解除磁力吸附,加入20.5μL洗脱液振荡打散磁珠,静置使DNA溶解后离心。
10)磁力吸附下,取上清为血浆游离DNA提取产物。
2.胎儿游离DNA片段筛选富集反应。
1)取50μL血浆游离DNA提取产物加入75μL筛选磁珠溶液,振荡混匀,室温静置5min,后将反应管瞬时离心,使得管壁上的磁珠集中在管底。
2)室温下磁力吸附,取上清液;再次室温下磁力吸附,取上清液加入40μL筛选磁珠的中,混匀后室温结合5min。
3)磁力吸附后,去除上清液。
4)75%乙醇清洗2次,晾干3min。
5)21.5μL洗脱液洗脱,混匀后室温结合5min,置于磁力架上。
6)吸取上清为游离DNA富集提取产物。
实施例2胍盐、胍盐及异丙醇的残留对胎儿游离DNA富集效果的影响
使用同一份男胎混合血浆模拟孕妇血浆作为测试样本(其中该血浆样本中直接所提游离DNA中胎儿占比为8%)。
使用实施例1方案进行游离DNA的富集提取,在提取流程中弃去洗涤液Ⅱ后,测试组分别加入1μL、3μL、5μL裂解结合液(胍盐溶液),以及1μL、3μL、5μL、10μL洗涤液Ⅰ(胍盐+异丙醇溶液),来模拟不同裂解结合液(胍盐溶液)或洗涤液Ⅰ(胍盐+异丙醇溶液)的残留量。然后继续流程加入125uL羧基磁珠溶液混合孵育,随后取上清,加入40ul的第二羧基磁珠溶液,20.5μL洗脱液洗脱。
测试组与不加入干扰物的对照组别所得游离DNA富集提取产物作为待测样本进入建库测序并上机测序,测序结果分析三组样本胎儿浓度(Fcy)。
实施例3乙醇残留对胎儿游离DNA富集效果的影响
使用同一份男胎混合血浆模拟孕妇血浆作为测试样本(其中该血浆样本中直接所提游离DNA中胎儿占比为8%)。
使用实施例1方案进行游离DNA的富集提取,弃去洗涤液Ⅱ后,三个测试组分别加入0μL、10μL、15μL洗涤液Ⅱ,模拟洗涤液Ⅱ(80%乙醇)残留量。然后继续流程加入125uL羧基磁珠溶液混合孵育,随后取上清,加入40ul的第二羧基磁珠溶液,20.5μL洗脱液洗脱后建库,上机测序,测序结果分析三组样本胎儿浓度(Fcy)。
实施例4提取产物文库构建及上机测序(如无特殊说明,试剂均购自诺唯赞。)
1.分别取上述各实施例所得游离DNA产物19.5ul,使用按照下述步骤构建文库。
1)末端修复和加腺苷酸尾步骤:
取19.5ul游离DNA产物,在用于末端修复和加腺苷酸尾(加A尾)处理的建库缓冲液Ⅰ中进行末端修复和加腺苷酸尾处理,得到末端修复并加腺苷酸尾(加A尾)的DNA溶液Ⅰ。
①缓冲液Ⅰ、酶Ⅰ和游离DNA产物按照下表配置末端修复和加腺苷酸尾反应体系:
试剂名称(25μL) | 单个反应量(μL) |
缓冲液Ⅰ | 5 |
酶Ⅰ | 0.5 |
游离DNA产物 | 19.5 |
其中,缓冲液Ⅰ含有:10mM Tris缓冲液;10mM Mg2+(MgCl2);110mM的Na+(NaCl)、0.01质量%Tween20;1mMATP,dNTP(四种三磷酸脱氧核苷酸,dATP、dTTP、dCTP、dGTP各1mM);PH 8.8;基底为ddH2O。。
其中,酶Ⅰ含有:5U/μL T4 DNA polymerse;5U/μL klenow fragemengt(3’-5’exo-);5U/μL T4 Polynucleotide Kinase。
②温育,反应条件:37℃,10min;70℃,20min;4℃,forever。
仪器:Life Touch PCR基因扩增仪(杭州博日科技有限公司,TC-96/G/H(b)B)。
2)连接步骤:
将已末端修复和加腺苷酸尾处理后的DNA溶液Ⅰ在连接缓冲液中连接接头,获得带接头DNA溶液Ⅱ。
①缓冲液Ⅱ、酶Ⅱ和接头(浓度为1μmol/L)和DNA溶液Ⅰ,按照如下反应体系进行配制,震荡混匀,瞬时离心至管底,取27μL,分装到PCR板中。
试剂名称(52μL) | 单个反应量(μL) |
缓冲液Ⅱ | 25 |
酶Ⅱ | 1 |
接头(浓度为1μmol/L) | 1 |
DNA溶液Ⅰ | 25 |
其中,缓冲液Ⅱ:33mM Tris-HCl;1mM二硫苏糖醇(DTT)、体积百分含量为20体积%的PEG 600;基底为ddH2O。
其中,酶Ⅱ:连接酶为T4 DNA ligase(商购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,货号:N103-01)。
其中,接头序列为:(*表示硫代修饰)
Adapter-1:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
Adapter-2:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T
②将1)中末修加A步骤的产物加入到上一步分装好的混合液中,混匀。
③温育反应条件:20℃,30Min。
3)纯化反应
使用52μL筛选磁珠溶液对连DNA溶液Ⅱ进行纯化,用19μL洗脱液(TET)溶解成DNA溶液Ⅲ。
4)PCR反应
①PCR反应液、公共引物、标签引物(按照样本数量确定需要的标签引物数量)以及DNA溶液Ⅲ按照下表配置反应体系:
试剂名称(50μL) | 单个反应量(μL) |
PCR反应液 | 25 |
公共引物 | 4 |
标签引物 | 4 |
DNA溶液Ⅲ | 17 |
其中,
公共引物序列:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC。
标签引物序列:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAXXXXXXXXTGACTGGAGTTC。(X表示序列一直的标签序列,标签)
其中,PCR反应液:KAPAHiFi HotStart ReadyMix(商购自KAPABiosystems,
货号:KK2631)。
②按以下条件进行PCR扩增:
③PCR结束后,得到PCR扩增产物为DNA溶液Ⅳ。
5)纯化反应
使用50μL筛选磁珠溶液对DNA溶液Ⅳ进行纯化,用50μL洗脱液(TET)溶解,上清即为构建文库。
2.使用2.0Flurometer(Life Technologies,CA,USA,以下简称Qubit 2.0)检测所得文库浓度。
3.使用Caliper LabChip GX检测所得文库峰图。
4.使用illumina测序平台,上机测序,对测序数据进行数据分析,基于胎儿Y染色体计算胎儿浓度(Fcy)。
实验结果1:实施例1、对比例1和对比例2中所提取游离DNA富集提取产物标准建库后的文库浓度以及上级测序后的胎儿游离DNA
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结果分析:
1.实施例1和对比例2的方案所得游离DNA富集提取产物胎儿浓度高于对比例1方案的胎儿浓度(Fcy),且胎儿浓度(Fcy)是对比文件1的2~3倍;说明了相对于仅采用羟基磁珠提取孕妇血浆全部游离DNA,增加羧基磁珠富集方案,可显著提高所得游离DNA提取产物中胎儿游离DNA占比。
2.实施例1与对比例2的方案相比,实施例1较对比例2案所得游离DNA富集提取产物的胎儿浓度更高且组间稳定性高,实施例文库产量高且稳定性强。说明相较于羟基磁珠提取与羧基磁珠筛选纯化分别进行的方案,羟基磁珠提取与羧基磁珠筛选纯化简并的技术方案的提取效果更为稳定。
实验结果2:胍盐(裂解结合液)、胍盐及异丙醇(洗涤液Ⅰ)残留对胎儿游离DNA富集效果的影响
测序结果分析三组样本胎儿浓度fcY
分组 | 平行1(Fcy) | 平行2(Fcy) | 平行3(Fcy) | 胎儿浓度均值 |
1ul裂解结合液 | 23.74% | 24.62% | 23.89% | 24.08% |
3ul裂解结合液 | 22.42% | 23.61% | 22.88% | 22.97% |
5ul裂解结合液 | 22.39% | 21.67% | 21.99% | 22.01% |
1ul洗涤液Ⅰ | 23.72% | 24.03% | 23.82% | 23.86% |
3ul洗涤液Ⅰ | 23.39% | 24.07% | 23.95% | 23.81% |
5ul洗涤液Ⅰ | 24.01% | 23.34% | 23.65% | 23.67% |
10ul洗涤液Ⅰ | 24.24% | 22.23% | 22.96% | 23.14% |
对照组(不加入干扰物) | 24.03% | 24.65% | 24.36% | 24.35% |
结果分析:
随着裂解结合液(胍盐)残留量(浓度)、洗涤液Ⅰ(胍盐+异丙醇)残留量(浓度)上升,胎儿浓度与对照组相比降低,且测试组内三个平行样本的结果一致性明显下降,说明裂解结合液(胍盐)、洗涤液Ⅰ(胍盐+异丙醇)的加入降低了片段分选能力的准确性和精密度,即胍盐、异丙醇等成分会影响羧基磁珠的片段分选能力。
该实验结果也说明,在羧基磁珠前使用羟基磁珠提取的双核设计的必要性,可避免裂解液(胍盐溶液)与羧基磁珠在同一体系中直接接触,从而避免胍盐对磁珠片段分选能力的准确性和精密度的影响。
实验结果3:乙醇残留对胎儿游离DNA富集效果的影响
结果分析:
其中0μL/10μL组间T检验P值0.366、0μL/15μL组间T检验P值0.647,无显著性差异。在本方案提取流程体系下,可克服乙醇残留对胎儿游离DNA富集效果的影响。
Claims (12)
1.一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法,其包括:
全部游离DNA回收和大片段游离DNA去除;
其中,
所述全部游离DNA回收,是通过在盐离子酸性溶液体系下,使游离DNA与羟基结合部结合,获得结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分和包含其余成分的液相部分;分离并除去液相部分,获得结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分;
所述大片段游离DNA去除,通过在碱性条件下使含有羧基结合部的液相与结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分进行混合孵育,获得包含有与羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分和包含未与羧基结合部和/或羟基结合部结合的游离DNA片段的液相部分;
分离固相和液相,获得包含待富集胎儿来源游离DNA片段的液相部分;
所述羟基结合部包括带有羟基修饰基团的核酸结合载体;
所述羧基结合部包括带有羧基修饰基团的核酸结合载体。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述羧基结合部具有游离DNA片段筛选能力,可同时洗脱羟基结合部上结合的游离DNA片段,并选择性地结合其中目标片段大小的游离DNA片段。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述盐离子酸性溶液体系通过向体系中加入裂解液实现;
任选地,所述裂解结合液含有高浓度离液盐;所述离液盐,包括碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、异硫氰酸胍中的任一种或多种;
任选地,所述裂解结合液还含有表面活性剂、Tris、EDTA;
任选地,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂;
任选地,所述表面活性剂为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯中的一种或多种;
任选地,所述Tris为Tris-HCl和Tris-AC中的任一种或两种;
任选地,所述裂解结合液含有4~6M异硫氰酸胍,0.5~2M盐酸胍,1~4重量%TritonX-100,50~100mM Tris-HCl,pH5~6,5~10mM EDTA。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述羟基结合部选自羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜、带羟基硅胶模、微孔玻璃、嵌入二氧化硅颗粒滤膜、硅胶颗粒、二氧化硅构成的藻土型树脂、玻璃纤维中的任一种或多种;
任选地,所述羟基结合部选自羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜中的任一种或多种;
任选地,所述羟基结合部为羟基磁珠;
任选地,所述羟基磁珠为羟基磁珠悬浮液,其包含30~80mg/ml羟基修饰磁珠;
任选地,所述羟基磁珠悬浮液,其包括40mg/ml羟基修饰磁珠。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种;
任选地,所述羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种;
任选地,所述羧基结合部为羧基磁珠;
任选地,所述羧基磁珠为含有PEG和盐离子的碱性羧基磁珠悬浮液;
任选地,所述羧基磁珠悬浮液,其组成选自可实现目标胎儿游离DNA富集浓度提升的任一组合。
任选地,所述PEG选自PEG6000~20000任一种或多种;
任选地,所述羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.05~2重量%的羧基修饰磁珠,10~20重量%的PEG6000~20000,1~4M的NaCl,1-100mM的Tris-HCl,以及0.1-10mM的EDTA,pH值为6.0~9.0;
任选地,所述羧基磁珠悬浮液,其组成包括1重量%的羧基修饰磁珠,14重量%的PEG10000,1.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述大片段游离DNA是指除片段长度大于N的游离DNA片段;所述N大小为50bp~300bp中的任一长度;
任选地,所述N大小为50~250bp中的任一长度;
任选地,所述N大小为100-200bp中的任一长度;
任选地,所述N大小为150bp。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,大片段游离DNA去除步骤后还包括小片段游离DNA回收和洗脱;其中,
所述小片段游离DNA回收是通过将大片段游离DNA去除步骤中获得包含待富集胎儿来源游离DNA片段的液相部分与第二羧基结合部进行混合孵育,获得包含有与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分和包含其余成分的液相部分;
分离固相和液相,获得与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相部分;
所述洗脱,是通过低盐溶液洗脱第二羧基结合部上结合的游离DNA片段,洗脱溶液即为胎儿来源游离DNA占比提升的游离DNA富集提取产物;
所述第二羧基结合部包括带有羧基修饰基团的核酸结合载体。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述洗脱步骤前还包括洗涤步骤,其可去除残留在与第二羧基结合部相结合的游离DNA片段的固相上的PEG和盐溶液;
任选地,所述洗涤步骤使用70%~80%乙醇溶液。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述第二羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种;
任选地,所述第二羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种;
任选地,所述第二羧基结合部为羧基磁珠;
任选地,所述羧基磁珠为含有PEG和盐离子的碱性第二羧基磁珠悬浮液,所述第二羧基磁珠悬浮液中的PEG和盐离子浓度大于羧基磁珠悬浮液;
任选地,所述PEG选自PEG6000~20000;
任选地,所述第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括0.05~2重量%的羧基修饰磁珠,15~30重量%的PEG6000~20000,1~4M的NaCl,1-100mM的Tris-HCl,以及0.1-10mM的EDTA,pH值为6.0~9.0;
任选地,所述第二羧基磁珠悬浮液,其组成包括1重量%的羧基修饰磁珠,25重量%的PEG10000,2.5M的NaCl,20mM的Tris-HCl,以及1.5mM的EDTA,pH值为8.0。
10.根据权利要求1或7任一项所述的方法,其特征在于,所述全部游离DNA回收步骤前还包括游离DNA的释放步骤,其通过将孕妇血浆样本进行消化裂解,释放游离DNA进入到消化液中;
任选地,所述游离DNA的释放进一步包括将孕妇血浆样本,与含有蛋白酶K和SDS的体系进行混合孵育;
任选地,所述混合孵育为37℃下的恒温孵育。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法,其特征在于,所述全部游离DNA回收和大片段去除步骤间还包括洗涤步骤,其可去除结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分上残留的蛋白和盐离子;
任选地,所述洗涤步骤先后使用洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ,清洗结合有游离DNA片段的羟基结合部的固相部分。
12.根据权利要求1和7所述的方法,其特征在于,所述核酸结合载体包括但不限于磁珠、玻璃珠、玻璃纤维、硅胶颗粒、硅胶膜、二氧化硅颗粒中的任一种或多种;
任选地,所述核酸结合载体为磁珠,其为通用的磁性纳米颗粒;
任选地,所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒。
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