CN106754890B

CN106754890B - 一种病毒rna的提取试剂盒和提取方法

Info

Publication number: CN106754890B
Application number: CN201710052461.7A
Authority: CN
Inventors: 吴英松; 刘天才; 杨学习; 陈瑶
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: GUANGZHOU BDS BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2037-01-24
Also published as: CN106754890A

Abstract

本发明提供了一种病毒RNA的提取试剂盒，包括裂解结合液A、洗涤液B、洗脱液C和消解液D，裂解结合液A含有20～50mM蔗糖，20～50mM硫酸铵，10～50mM Tris‑HCl，1～5% （V/V）Brij‑58，0.2～0.5mg/mL磁珠；pH值为4.5～5.5，洗涤液B含有1～5%（V/V） Brij‑58，5～25mM Tris‑HCl，0.5～1mg/mL蛋白酶K，pH值为6～7；利用该试剂盒进行RNA的提取，该方法不依赖传统的Chaotropic盐，在低盐离子环境下即可裂解、吸附和洗涤RNA，同时洗涤液中不含醇类物质，即可去除相关的盐分和杂质。本发明的方法简单可行，成本低廉，具有更实际的应用价值。

Description

一种病毒RNA的提取试剂盒和提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，更具体地，涉及一种病毒RNA的提取试剂盒和提取方法。

背景技术

核酸提取是核酸检测整个技术流程的第一步，也是分子生物学中最关键的方法之一。它是下游核酸检测和科学研究的基础，抽提的核酸的质量及其完整性会直接影响临床研究或诊断的结果。一般的核酸提取过程包括两大步骤：样品的裂解和纯化。裂解指使样品中的核酸释放到反应体系中，纯化则是指使核酸与反应体系中的其它成分，如蛋白质、盐类以及其他杂质彻底地分离。常用的RNA的提取方法有TRIZOL法、异硫氰酸胍法、CTAB-LiCl法及国内外各生物公司的总RNA提取试剂盒等。RNA提取的经典方法是TRIZOL法，它是一种基于异硫氰酸肌/苯酚/氯仿抽提原理的方法，该法适用范围广，动植物都适用，提取的RNA基本无基因组DNA的污染，但是该法操作步骤繁琐，提取试剂中使用了苯酚、氯仿等有毒试剂，而且该法不适用于富含多糖多酚材料 RNA的提取。CTAB-LiCl法常被用来提取植物组织RNA，但是由于CTAB本身是一个与SDS功能相类似的试剂，尽管它可和RNA以及DNA形成不溶的复合物，但CTAB法通常要结合其它操作，如再经LiCl沉淀等步骤，使得该法操作繁琐，并且在抽提时使用有毒试剂氯仿。传统的提取试剂,由于提取得率相对较低，且步骤较为繁杂，给提取工作带来一定影响，因此难以得到合格的RNA样品。

磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法。磁珠的直径为几十纳米至数微米，在磁场下表现出磁性，由无机/有机或者无机/无机材料组成的外形呈现为球状的复合粒子。磁珠法提取核酸不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的核酸纯度高、产量大。专利号为201010281633.6、201510023368.4等公开了提取病毒DNA或RNA的方法，但这些方法都是基于Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍、高氯酸钠等）下裂解和吸附DNA或RNA，接着用一定比例的乙醇进行洗涤，最后再将核酸释放到洗脱液中。其中Chaotropic盐是一种破坏分子力（氢键）稳定性的一种盐，它可使疏水性的蛋白质更易溶于水，不能在低盐干扰分子间的由非共价键（力）形成的相互作用，在Chaotropic盐中磁珠吸附核酸的能力会有所增强，目前国内已公开的专利中提取RNA基本上都是在此基础上衍生出来的。现有技术很少有不基于Chaotropic盐的提取RNA的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种病毒RNA的提取试剂盒。

本发明的第二个目的是提供一种利用上述RNA提取试剂盒对病毒RNA进行核酸提取的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种病毒RNA的提取试剂盒，包括裂解结合液A、洗涤液B、洗脱液C和消解液D，所述裂解结合液A含有20～50mM蔗糖，20～50mM硫酸铵，10～50mM Tris-HCl，1～5% （V/V）Brij-58，0.2～0.5mg/mL磁珠；pH值为4.5～5.5，所述洗涤液B含有1～5% （V/V）Brij-58，5～25mMTris-HCl，0.5～1mg/mL蛋白酶K，pH值为6～7。

本发明试剂盒的工作原理：在消解液D的作用下，病毒的外壳被破坏掉，病毒核酸RNA被释放出来，同时在裂解结合液A的作用下，使RNA可以结合到磁珠上，然后再通过洗涤液B对磁珠上的RNA进行清洗，去除多余的盐分及蛋白分子，最后通过洗脱液C使磁珠上的RNA洗脱下来。

这里裂解结合液A的pH值保证在4.5～5.5，可保证RNA不被溶解，同时低PH值的环境利于磁珠吸附核酸，可以使核酸最大程度地结合在磁珠上面。

优选地，所述洗脱液C含有10～20 mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH值为8.5。

优选地，所述消解液D含有20mg/mL蛋白酶K。

优选地，所述磁珠的粒径为0.5～1μm。

本发明还提供一种利用所述试剂盒进行核酸提取的方法，包括以下步骤：

S1. 取样本，加入消解液D和裂解结合液A，混匀离心后，吸弃上清液；

S2. 加入洗涤液B，混匀10min离心后，再次吸弃上清液；

S3. 加入洗涤液B，混匀1min离心后，再次吸弃上清液；

S4. 加入洗脱液C，温浴一段时间，温浴期间震荡混匀，离心后，吸取上清液至新的离心管即得核酸。

优选地，S1所述样本和裂解结合液A的混合体积比为1：3。

优选地，S4所述温浴的条件为56～75℃，洗脱液C的加入体积为50～100μL。

优选地，S2和S3所述洗涤液B的加入体积为300～600μL。

作为一种具体的实施方案，本发明所述进行核酸提取的方法包括以下步骤：

S1. 将200μL新鲜血浆或血清样本加入到1.5ml离心管内，向离心管内加入20μ1消解液D和600μ1裂解结合液A，室温混匀15分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离1min，吸弃上清；

S2. 向离心管中加入500μ1洗涤液B，室温混匀10分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离1min，吸弃上清；

S3. 向离心管中加入500μ1洗涤液B，室温混匀1分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离1min，吸弃上清；

S4. 向离心管中加入100μ1洗脱液C，温浴6分钟（期间需不停震荡混匀），瞬时离心后再将离心管置于磁力架上，磁力分离1min，吸取上清至新的离心管中即可。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种病毒RNA的提取试剂盒，包括裂解结合液A、洗涤液B、洗脱液C和消解液D，所述裂解结合液A含有20～50mM蔗糖，20～50mM硫酸铵，10～50mM Tris-HCl，1～5%（V/V） Brij-58，0.2～0.5mg/mL磁珠；pH值为4.5～5.5，所述洗涤液B含有1～5% （V/V）Brij-58，5～25mM Tris-HCl，0.5～1mg/mL蛋白酶K，pH值为6～7；利用该试剂盒进行RNA的提取，该方法不依赖传统的Chaotropic盐，在低盐离子环境下即可裂解、吸附和洗涤RNA，同时洗涤液中不含醇类物质（乙醇）即可去除相关的盐分和杂质。本发明的方法简单可行，成本低廉且不含任何污染环境的成分。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。

实施例1

一种病毒RNA的提取试剂盒，包括裂解结合液A、洗涤液B、洗脱液C、消解液D（这里指20mg/mL蛋白酶K）。

裂解结合液A组成为：20mM 蔗糖，50 mM 硫酸铵，10mM Tris-HCl（pH 4.0），1% （V/V）Brij-58，0.5mg/ml磁珠，溶剂为高压灭菌水，裂解结合液A的终pH为4.5。

洗涤液B的组成为：1% （V/V）Brij-58，5 mM Tris-HCl（pH 6.6），1mg/ml蛋白酶K，溶剂为高压灭菌水，洗涤液B的终pH为6.6。

洗脱液C的组成为：10mM Tris-HCl，0. 5 mM EDTA水溶液，洗脱液C的终pH为8.5。

采用上述试剂盒提取HIV-1血浆或血清样本RNA，包括以下步骤：

（1）将200μL新鲜HIV-1血浆或血清样本加入到1.5ml离心管内，向离心管内加入20μL消解液D和600μL裂解结合液A，室温混匀15分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离1min，吸弃上清；

（2）向离心管中加入500μL洗涤液B，室温混匀10分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离1min，吸弃上清；

（3）向离心管中加入500μL洗涤液B，室温混匀1分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离1min，吸弃上清；

（4）向离心管中加入100μ1洗脱液C，温浴6分钟（期间需不停震荡混匀），瞬时离心后再将离心管置于磁力架上，磁力分离1min，吸取上清至新的离心管中。

对照试剂选用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的样本量为200µl，洗脱体积为100µl。

提取完成后，取上述核酸RNA提取液20µl作为模板，应用达安基因的人类免疫缺陷综合征病毒1型核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）进行检测，检测结果见下表1。

表1 不同样本CT值比较

样本编号	本发明检测结果（CT值）	Qiagen试剂检测结果（CT值）
			1	24.21	24.35
2	35.98	35.32
			3	30.47	31.05
4	27.12	27.31
			5	32.34	32.67
6	36.21.	36.01

结果表明，利用本发明实施例1所述试剂盒提取核酸的效率与现有的核酸提取试剂的提取效率处于同一水平，因此，本发明在HIV-1 RNA核酸提取应用方面具有明显优势。

实施例2

裂解结合液A组成为：30mM 蔗糖，30 mM 硫酸铵，30mM Tris-HCl（pH 4.0），3%（V/V）Brij-58，0.4mg/ml磁珠，溶剂为高压灭菌水，裂解结合液A的终pH为5.0。

洗涤液B的组成为：3% （V/V）Brij-58，18 mM Tris-HCl（pH 6.6），0.8mg/ml蛋白酶K，溶剂为高压灭菌水，洗涤液B的终pH为6.0。

洗脱液C的组成为：15mM Tris-HCl，0. 5 mM EDTA水溶液，洗脱液C的终pH为8.5。

实施例3

裂解结合液A组成为：50mM 蔗糖，20 mM 硫酸铵，50mM Tris-HCl（pH 4.0），5%（V/V）Brij-58，0.5mg/ml磁珠，溶剂为高压灭菌水，裂解结合液A的终pH为5.5。

洗涤液B的组成为：5%（V/V） Brij-58，25 mM Tris-HCl（pH 6.6），0.5mg/ml蛋白酶K，溶剂为高压灭菌水，洗涤液B的终pH为7.0。

洗脱液C的组成为：20mM Tris-HCl，0. 5 mM EDTA水溶液，洗脱液C的终pH为8.5。

对比例1

该对比例所用的RNA试剂盒同实施例一所述RNA试剂盒，唯一不同的是，裂解结合液A的pH值为7.0，利用实施例1所述方法进行检测，其结果表现为：对比例1的结果明显差于实施例1，低浓度样本无检测结果。检测结果如表2。

表2 不同样本CT值比较

样本编号	实施例1结果（CT值）	对比例1检测结果（CT值）
			1	24.58	28.98
2	35.12	-
			3	30.06	38.05
4	27.32	32.14
			5	32.54	38.37
6	36.83	-

对比例2

该对比例所用的RNA试剂盒同实施例一所述RNA试剂盒，唯一不同的是，裂解液中Brij-58的浓度为（V/V）10%，利用实施例1所述方法进行检测，其结果表现为：对比例2的结果明显差于实施例1，证明提取效率没有达到最优。检测结果如表3。

表3 不同样本CT值比较

样本编号	实施例1结果（CT值）	对比例2检测结果（CT值）
			1	24.58	27.17
2	35.12	38.72
			3	30.06	32.15
4	27.32	29.52
			5	32.54	34.37
6	36.83	38.85

Claims

1.一种病毒RNA的提取试剂盒，其特征在于，由裂解结合液A、洗涤液B、洗脱液C和消解液D组成，所述裂解结合液A含有20～50mM蔗糖，20～50mM硫酸铵，10～50mM Tris-HCl，1～5％V/V Brij-58，0.2～0.5mg/mL磁珠， pH值为4.5～5.5；所述洗涤液B含有1～5％V/VBrij-58，5～25mM Tris-HCl，0.5～1mg/mL蛋白酶K，pH值为6～7；所述洗脱液C含有10～20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH值为8.5；所述消解液D含有20mg/mL蛋白酶K。

2.根据权利要求1所述的病毒RNA的提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠的粒径为0.5～1μm。

3.一种利用权利要求1或2所述试剂盒进行核酸提取的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.取病毒样本，加入消解液D和裂解结合液A，混匀离心后，吸弃上清液；

S2.加入洗涤液B，混匀10min离心后，再次吸弃上清液；

S3.加入洗涤液B，混匀1min离心后，再次吸弃上清液；

S4.加入洗脱液C，温浴一段时间，温浴期间震荡混匀，离心后，吸取上清液至新的离心管即得病毒RNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1所述样本和裂解结合液A的混合体积比为1：3。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S4所述温浴的条件为56～75℃，洗脱液C的加入体积为50～100μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2和S3所述洗涤液B的加入体积为300～600μL。