CN106591297A - 一种磁珠法核酸提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磁珠法核酸提取方法，包括：在生物样品中加入裂解缓冲液，裂解分离出生物样品中的核酸；核酸与裂解缓冲液中的纳米磁珠结合，在外部磁场作用下，形成磁珠‑核酸复合物；向磁珠‑核酸复合物中加入洗涤缓冲液，将磁珠‑核酸复合物中进行离心洗涤，去除磁珠‑核酸复合物上的杂质，收集洗涤后的磁珠‑核酸复合物；向洗涤后的磁珠‑核酸复合物中加入洗脱缓冲液，并加入去抑制剂；直接将磁珠‑核酸复合物和洗脱缓冲液的混合物进行后续的荧光定量PCR反应。本发明用离心代替磁力架吸附磁珠，将洗脱液和磁珠分离，根据不同种类的核酸可以设置不同的转速和时间，使洗脱液和磁珠彻底分开，提高提取的浓度和纯度。

Description

一种磁珠法核酸提取方法
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，特别涉及磁珠法核酸提取方法。
背景技术
磁珠法核酸提取为运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的核酸和RNA分离出来，可应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
磁珠法核酸提取一般可以分为四步：裂解—结合—洗涤—洗脱。与传统核酸提取方法相比，磁珠法核酸提取具有以下优势：1)、能够实现自动化、大批量操作，目前已有96孔的核酸自动提取仪，用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理，这一特点明显优于其他的提取方法。2)、操作简单、用时短，整个提取流程只需四步，大多可以在36-40分钟内完成，整个提取流程只有四步，大多可以在36-40分钟内完成。3)、安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害大大降低。4)、磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸的纯度和浓度都得到提升。
现有技术中，磁珠核酸提取方法，在提取过程中要经过多次的洗脱和洗涤，核酸DNA/RNA在提取过程中容易损失，影响最终提取核酸DNA/RNA的纯度和浓度。在向磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液后，洗涤去除磁珠-核酸复合物上的杂质时，要应用到外部磁场的作用，易造成洗涤液和磁珠-核酸复合物分离不完全，DNA纯度和浓度较低，最终提取的样本不能完全满足试验的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种磁珠法核酸提取方法，可以有效提高最终提取的DNA纯度和浓度，可以满足不同试验的需求。
本发明提供的技术方案如下：
本发明提供一种磁珠法核酸提取方法，包括以下步骤：S1、在生物样品中加入裂解缓冲液，裂解分离出所述生物样品中的核酸DNA/RNA；所述核酸DNA/RNA与所述裂解缓冲液中的纳米磁珠结合，在外部磁场作用下，形成磁珠-核酸复合物；S2、向所述磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液，在预设转速和预设时间下将所述磁珠-核酸复合物中进行离心洗涤，去除磁珠-核酸复合物上的杂质，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；重复离心洗涤一次；S3、向所述洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，并加入去抑制剂；直接将磁珠-核酸复合物和洗脱缓冲液的混合物进行后续的荧光定量PCR反应。
进一步，所述裂解缓冲液中的高浓度盐包括以下成分：2-3M盐酸胍、1-3M碘化钠和5-10mM EDTA；所述裂解缓冲液还包括以下成分：1-2％曲拉通X-100，1-2％吐温-20，1-2％SDS，30-40％％糖原，5-10％磁珠；所述裂解缓冲液的PH值＝7.4。
进一步，所述洗涤缓冲液包括以下成分：5-10mM EDTA，10-50mM Tris-HCl，75％乙醇；所述洗涤缓冲液的PH值＝6.4。
进一步，所述洗脱缓冲液采用1×TE。
进一步，所述纳米磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，所述纳米磁珠直径为20-100nM。
进一步，所述去抑制剂包括聚氧乙烯醚Brij58，甘油醛-3-磷酸，磷酸二羟丙酮的一种或多种组合。
进一步，所述生物样品包括有细胞液体样品和无细胞液体样品。
进一步，所述有细胞液体样品包括细胞、全血、动物组织匀浆液。
进一步，所述无细胞液体样品包括血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、尿液、病毒培养液。
与现有技术相比，本发明提供的磁珠法核酸提取方法，具有以下优点：
本发明利用离心对磁珠-核酸复合物进行离心洗涤，不仅能够去除磁珠-核酸复合物中的杂质，还能将洗涤缓冲液和磁珠分离，根据不同种类的核酸可以设置不同的转速和时间，使洗涤缓冲液和磁珠彻底分开，提高提取的浓度和纯度。
传统地，生物样品经过裂解与结合、清洗1、清洗2、洗脱，洗脱缓冲液洗脱磁珠-核酸复合物后，得到核酸。然而，本发明中省去洗脱磁珠的步骤，加入去抑制剂，直接将其进行后续的PCR反应，这样不仅便于操作而且能减少在DNA洗脱过程中的损失。
本发明中加入去抑制剂，防止洗脱缓冲液立即将核酸从磁珠-核酸复合物中洗脱出来，从而避免在洗脱过程中，核酸DNA/RNA出现损失，进而避免影响最终提取核酸DNA/RNA的纯度和浓度。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种磁珠法核酸提取方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1是本发明一种磁珠法核酸提取方法中四组试验的荧光定量PCR结果示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将说明本发明的具体实施方式。显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以获得其他的实施方式。
实施例1：
一种磁珠法核酸提取方法，包括以下步骤：S1、将200μl唾液的生物样品放入离心管内，向离心管加入1000μl、PH值＝7.4的裂解缓冲液，室温混匀3分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，裂解分离出所述生物样品中的核酸DNA/RNA，所述核酸DNA/RNA与所述裂解缓冲液中的直径为20nM的纳米磁珠结合，纳米磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，在外部磁场作用下，形成磁珠-核酸复合物；吸弃上清；
其中，裂解缓冲液的；裂解缓冲液的成分为：2M盐酸胍、2M碘化钠和10mM EDTA；1％曲拉通X-100(Triton X-100)，1％吐温-20(Tween-20)，1％SDS(十二烷基硫酸钠)，30％糖原，5％磁珠；其余成分为水。
S2、再向离心管中加入600μl、PH值＝6.4洗涤缓冲液，混匀1分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，去除磁珠-核酸复合物上的杂质；吸弃上清，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；重复上述操作步骤一次，并开盖凉置1分钟；
其中，洗涤缓冲液的成分为：10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)，75％乙醇；其余成分为水。
S3、最后向离心管中加入50μl洗脱缓冲液，洗脱缓冲液采用1×TE，TE洗脱缓冲液由Tris(三羟甲基氨基甲烷)和EDTA(乙二胺四乙酸)配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA；混匀1分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中，即可得到最终提取纯化的DNA溶液。
其中，去抑制剂为聚氧乙烯醚Brij58，或甘油醛-3-磷酸，或磷酸二羟丙酮，或聚氧乙烯醚Brij58和甘油醛-3-磷酸，或聚氧乙烯醚Brij58、甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮。
实施例2：
一种磁珠法核酸提取方法，包括以下步骤：S1、将200μl唾液的生物样品放入离心管内，向离心管加入1000μl、PH值＝7.4的裂解缓冲液，室温混匀3分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，裂解分离出所述生物样品中的核酸DNA/RNA，所述核酸DNA/RNA与所述裂解缓冲液中的直径为20nM的纳米磁珠结合，纳米磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，在外部磁场作用下，形成磁珠-核酸复合物；吸弃上清；
其中，裂解缓冲液的；裂解缓冲液的成分为：2M盐酸胍、2M碘化钠和10mM EDTA；1％曲拉通X-100(Triton X-100)，1％吐温-20(Tween-20)，1％SDS(十二烷基硫酸钠)，30％糖原，5％磁珠；其余成分为水。
S2、再向离心管中加入600μl、PH值＝6.4洗涤缓冲液，混匀1分钟后，在预设转速为12000g和预设时间为5min下，将所述磁珠-核酸复合物中进行离心洗涤，去除磁珠-核酸复合物上的杂质，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物，吸弃上清；重复离心洗涤一次；并开盖凉置1分钟；
其中，洗涤缓冲液的成分为：10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)，75％乙醇；其余成分为水。
S3、最后向离心管中加入50μl洗脱缓冲液，洗脱缓冲液采用1×TE，TE洗脱缓冲液由Tris(三羟甲基氨基甲烷)和EDTA(乙二胺四乙酸)配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA；混匀1分钟后将离心管离心(12000g，5min)，将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中，即可得到最终提取纯化的DNA溶液。
其中，去抑制剂为聚氧乙烯醚Brij58，或甘油醛-3-磷酸，或磷酸二羟丙酮，或聚氧乙烯醚Brij58和甘油醛-3-磷酸，或聚氧乙烯醚Brij58、甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮。
实施例3：
一种磁珠法核酸提取方法，包括以下步骤：S1、将200μl唾液的生物样品放入离心管内，向离心管加入1000μl、PH值＝7.4的裂解缓冲液，室温混匀3分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，吸弃上清；裂解分离出所述生物样品中的核酸DNA/RNA，所述核酸DNA/RNA与所述裂解缓冲液中的直径为20nM的纳米磁珠结合，纳米磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，在外部磁场作用下，形成磁珠-核酸复合物；
其中，裂解缓冲液的；裂解缓冲液的成分为：2M盐酸胍、2M碘化钠和10mM EDTA；1％曲拉通X-100(Triton X-100)，1％吐温-20(Tween-20)，1％SDS(十二烷基硫酸钠)，30％糖原，5％磁珠；其余成分为水。
S2、再向离心管中加入600μl、PH值＝6.4洗涤缓冲液，混匀1分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，去除磁珠-核酸复合物上的杂质；吸弃上清，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物，重复离心洗涤一次；并开盖凉置1分钟；
其中，洗涤缓冲液的成分为：10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)，75％乙醇；其余成分为水。
S3、最后向离心管中加入50μl洗脱缓冲液，洗脱缓冲液采用1×TE，TE洗脱缓冲液由Tris(三羟甲基氨基甲烷)和EDTA(乙二胺四乙酸)配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA；并加入去抑制剂，直接将磁珠-核酸复合物、洗脱缓冲液的混合物进行后续的荧光定量PCR反应。
其中，去抑制剂为聚氧乙烯醚Brij58，或甘油醛-3-磷酸，或磷酸二羟丙酮，或聚氧乙烯醚Brij58和甘油醛-3-磷酸，或聚氧乙烯醚Brij58、甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮。
实施例4：
一种磁珠法核酸提取方法，包括以下步骤：S1、将200μl唾液的生物样品放入离心管内，向离心管加入1000μl、PH值＝7.4的裂解缓冲液，室温混匀3分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，吸弃上清；裂解分离出所述生物样品中的核酸DNA/RNA，所述核酸DNA/RNA与所述裂解缓冲液中的直径为20nM的纳米磁珠结合，纳米磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，在外部磁场作用下，形成磁珠-核酸复合物；
其中，裂解缓冲液的；裂解缓冲液的成分为：2M盐酸胍、2M碘化钠和10mM EDTA；1％曲拉通X-100(Triton X-100)，1％吐温-20(Tween-20)，1％SDS(十二烷基硫酸钠)，30％糖原，5％磁珠；其余成分为水。
S2、再向离心管中加入600μl、PH值＝6.4洗涤缓冲液，混匀1分钟后在预设转速为12000g和预设时间为5min下，将所述磁珠-核酸复合物中进行离心洗涤，去除磁珠-核酸复合物上的杂质；吸弃上清，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；重复离心洗涤一次；并开盖凉置1分钟；
其中，洗涤缓冲液的成分为：10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)，75％乙醇；其余成分为水。
S3、最后向离心管中加入50μl洗脱缓冲液，洗脱缓冲液采用1×TE，TE洗脱缓冲液由Tris(三羟甲基氨基甲烷)和EDTA(乙二胺四乙酸)配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA；并加入去抑制剂，直接将磁珠-核酸复合物、洗脱缓冲液的混合物进行后续的荧光定量PCR反应。
其中，去抑制剂为聚氧乙烯醚Brij58，或甘油醛-3-磷酸，或磷酸二羟丙酮，或聚氧乙烯醚Brij58和甘油醛-3-磷酸，或聚氧乙烯醚Brij58、甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮。
实施例1是利用磁力去杂质+上清液转移得到提取纯化的DNA溶液；实施例2是利用离心去杂质+上清液转移得到提取纯化的DNA溶液；实施例3是利用磁力去杂质+混合液转移；实施例4是利用离心去杂质+混合液转移。四个实施例的实验结果数据，如下表1所示。
表1：
CT是测定人体某一局部组织或器官密度大小的一种计量单位，通常称亨氏单位。根据表1可知，第一组到第四组的平均CT值分别为28.12，25.51，23.98，和22.80，可知四组的DNA浓度大小为组4>组3>组2>组1，可以得出本专利的优化方法有效。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种磁珠法核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在生物样品中加入裂解缓冲液，裂解分离出所述生物样品中的核酸DNA/RNA；所述核酸DNA/RNA与所述裂解缓冲液中的纳米磁珠结合，在外部磁场作用下，形成磁珠-核酸复合物；
S2、向所述磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液，在预设转速和预设时间下将所述磁珠-核酸复合物中进行离心洗涤，去除磁珠-核酸复合物上的杂质，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；重复离心洗涤一次；
S3、向所述洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，并加入去抑制剂；直接将磁珠-核酸复合物和洗脱缓冲液的混合物进行后续的荧光定量PCR反应。
2.如权利要求1所述的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：
所述裂解缓冲液中的高浓度盐包括以下成分：2-3M盐酸胍、1-3M碘化钠和5-10mMEDTA；
所述裂解缓冲液还包括以下成分：1-2％曲拉通X-100，1-2％吐温-20，1-2％SDS，30-40％糖原，5-10％磁珠；
所述裂解缓冲液的PH值＝7.4。
3.如权利要求1所述的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：
所述洗涤缓冲液包括以下成分：5-10mM EDTA，10-50mM Tris-HCl，75％乙醇；
所述洗涤缓冲液的PH值＝6.4。
4.如权利要求1所述的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：
所述洗脱缓冲液采用1×TE。
5.如权利要求1所述的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：
所述纳米磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，所述纳米磁珠直径为20-100nM。
6.如权利要求1所述的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：
所述去抑制剂包括聚氧乙烯醚Brij58，甘油醛-3-磷酸，磷酸二羟丙酮的一种或多种组合。
7.如权利要求1～6中任意一项所述的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：
所述生物样品包括有细胞液体样品和无细胞液体样品。
8.如权利要求7所述的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：
所述有细胞液体样品包括细胞、全血、动物组织匀浆液。
9.如权利要求7所述的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：
所述无细胞液体样品包括血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、尿液、病毒培养液。
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