CN106987588B

CN106987588B - 一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量pcr检测方法

Info

Publication number: CN106987588B
Application number: CN201710391720.9A
Authority: CN
Inventors: 龚小鹏; 韩典霖; 杨亮
Original assignee: Jifan Biotechnology (beijing) Co Ltd
Current assignee: Jifan Biotechnology (beijing) Co Ltd
Priority date: 2017-05-27
Filing date: 2017-05-27
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2037-05-27
Also published as: CN106987588A

Abstract

本发明公开了一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量PCR检测方法，属于生物检测领域。所述裂解液由NaCl、triton X‑100、十二烷基硫酸锂和EDTA‑2Na与纯化水混匀而成。采用本发明的裂解液，在PCR反应的过程中可以省略提纯DNA的步骤，样本的核酸提取和扩增检测在一个反应管中进行，无需加热，离心，震荡等分离或纯化操作，操作过程简单、方便、成本低廉，对操作人员要求极低，大幅度压缩了检测时间，特别适用于重大疾病的床边诊断和爆发重大疫情时的现场检验检疫工作。

Description

一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及病毒和细菌的核酸提取和检测技术领域，具体涉及一种用于提取病毒、细菌核酸的裂解液及采用该裂解液进行荧光定量PCR的检测方法。

背景技术

在现有技术中，血清、血浆中病毒提取方法主要有以下几种：

一、煮沸法：向血清或血浆等病毒、细菌样本中加入裂解液，水浴或者干浴煮沸，高速离心取上清作为PCR模板，其优点是操作简单，缺点是提取的核酸杂质含量高，容易抑制后期PCR扩增，另外由于煮沸产生局部高压，容易造成气溶胶污染，导致检测结果阴阳不分。

二、离心柱提取法：血清或血浆等病毒、细菌样本通过加入高盐低pH的裂解液，然后使用核酸吸附膜吸附，再使用洗涤液洗涤2-3次，最后使用低盐高pH值的洗脱液将核酸洗脱下来作为PCR模板。该方法提取的核酸纯度高，但是缺点是需要多次高速离心，手工操作繁杂，效率低，而且无法实现自动化。

三、磁珠法：磁珠法可以视为离心柱法的改进，将吸附膜同功能物包裹在磁性纳米微粒上，血清或血浆等病毒、细菌样本通过加入高盐低pH值的裂解液，然后使用包裹了核酸吸附膜的纳米磁性微粒吸附，再使用洗涤液洗涤2-3次，最后使用低盐高pH值的洗脱液将核酸洗脱下来作为PCR模板。该方法提取的核酸纯度高，而且可以实现自动化提取，但是该技术需要操作人员具有较高的实验技能，不易推广，如果配备自动化设备，则会增加检测成本。

上述几种提取方法中，采用了化学方法实现细胞破裂、核酸释放，再基于核酸比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性的特性将核酸进行分离、纯化，纯化步骤操作时间长、成本高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉的病毒/细菌的裂解液及荧光定量PCR检测方法，其能满足绝大多数临床常见病毒、细菌无需核酸纯化直接进行荧光定量PCR检测的要求，用以解决现有核酸提取过程中纯化时间长、操作繁琐、成本高的问题。

为实现上述目的，本发明方法采用一种快速裂解病毒、细菌外壳蛋白释放出其遗传物质的裂解液，直接将其加入相应的PCR反应液中，即可实现针对待测病原微生物的定量或者定性检测。具体地，该病毒/细菌的裂解液，由NaCl、triton X-100、十二烷基硫酸锂和EDTA-2Na与纯化水混匀而成，各组分的终浓度：NaCl为0.8～1.2M，triton X-100为10v.％～15v.％，十二烷基硫酸锂为0.01％～0.05％w/v(即质量体积比)，EDTA-2Na为5～10mM。

优选的，各组分的终浓度配比：NaCl为1M，triton X-100为10v.％，十二烷基硫酸锂为0.02％，EDTA-2Na为5mM。

优选的，各组分的终浓度配比：NaCl为1M，triton X-100为12v.％，十二烷基硫酸锂为0.04％，EDTA-2Na为8mM。

上述技术方案中，采用高浓度氯化钠有利于蛋白盐析变性从而与核酸分离；triton X-100和十二烷基硫酸锂分别属于非离子型和离子型表面活性剂，利于病毒外壳蛋白裂解以及核酸与蛋白的分离，其中非离子型表面活性剂对后期PCR不会产生明显抑制，因此使用体积浓度优选10～15v.％，更优选10v.％，离子型活性剂在高剂量时会抑制掉PCR，因此优选使用0.01～0.05％w/v(质量体积比)，更优选0.04％w/v。EDTA-2Na可以与样品中二价金属离子形成螯合物，从而使得DNA酶没有催化剂，从而间接保护DNA不受降解。上述各组分之间协同作用，将病毒或细菌裂解后可以直接进行PCR扩增，绕开核酸提纯过程。

本发明还提供了一种病毒/细菌的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

A、按照上述病毒/细菌的裂解液的配比，配制裂解液；

B、提取病毒/细菌核酸：向PCR反应管中加入步骤A中所得裂解液和待检测血清或血浆样本，混匀、静置5～15min，得病毒/细菌的DNA样本；

C、PCR扩增：向步骤B中所得DNA样本的PCR反应管中加入PCR反应液，置于荧光定量PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增和荧光检测。

步骤A中配制裂解液的方法如下：

向容器中加入46.8～70.2克(即0.8～1.2mol)氯化钠，100～150mL triton X-100，1～5克的十二烷基硫酸锂，0.5M pH值为8.0的EDTA-2Na 10～20mL，然后加纯化水600mL，混匀后，定容到1000mL。

步骤B中所述PCR反应液包括：PCR缓冲溶液(PCR Buffer)、MgCl₂、dNTPs、检测病毒/细菌的引物对和对应探针以及Taq DNA聚合酶或酶混合液。

本发明方法具有如下优点：采用本发明的裂解液，在PCR反应的过程中可以省略提纯DNA的步骤，样本的核酸提取和扩增检测在一个反应管中进行，无需加热，离心，震荡等分离或纯化操作，操作过程简单、方便、成本低廉，对操作人员要求极低，大幅度压缩了检测时间，特别适用于重大疾病的床边诊断和爆发重大疫情时的现场检验检疫工作。

附图说明

图1是实施例2中4个梯度大肠杆菌的扩增曲线，其中横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

以猪圆环病毒2型(PCV-2)的荧光定量PCR检测为例，说明本发明裂解液的应用。

A、配制裂解液：向容器中加入58.5克氯化钠，100mL triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，2克的十二烷基硫酸锂，浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA-2Na溶液10mL，然后加纯化水600mL，混匀后，转移至容量瓶中，定容到1000mL。

B、提取病毒/细菌核酸：向PCR反应管中加入步骤A中配制的裂解液5μL和待检测血清或血浆样本5μL，使用移液器反复吹打3次混匀，静置10min，得细菌的DNA样本；

C、PCR扩增：向步骤B中所得DNA样本的PCR反应管中加入配制好的PCR反应液40μL，将PCR反应管置于荧光定量PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增和荧光检测，PCR扩增反应程序参见表1。本实施例采用型号为宏石SLAN-48P的荧光定量PCR仪进行检测。

同时以纯化水作为阴性对照，以含有猪圆环病毒2型细菌的培养液作为阳性对照，分别按照上述条件进行PCR扩增和荧光检测。

表1PCR反应程序和条件

其中，PCR反应液的组分和浓度参见表2。

表2PCR反应液的组分和浓度

组分	单人份用量(μL)
		5×PCR Buffer	10
MgCl<sub>2</sub>(1M)	0.5
		dNTPs(25mM)	0.5
PCV-2-F(50pmol/μL)	0.4
		PCV-2-R(50pmol/μL)	0.4
PCV-2-P(50pmol/μL)	0.2
		Taq DNA聚合酶(5U/μL)	1
纯化水	补足到40

上述PCR Buffer的组分及浓度为：250mM tris HCl、pH值为8.0,375mM KCl，25％(体积比)甘油，25％硫酸铵(体积比)。

用于扩增猪圆环病毒2型的上游引物PCV-2-F、下游引物PCV-2-R和检测扩增猪圆环病毒2型的探针PCV-2-P采用现有技术中已经成熟的核苷酸序列即可，本实施例采用的核苷酸序列参见表3。

表3用于检测猪圆环病毒2型的引物和探针序列

按照上述的方法对54例猪圆环病毒2型血清样品进行检测。同时作为对照，对每例样品按照离心柱提取法进行核酸提纯，具体方法如下：在血清样本中加入高盐低pH值的裂解液，然后使用核酸吸附膜吸附，再使用洗涤液洗涤2-3次，最后使用低盐高pH值的洗脱液将核酸洗脱下来作为PCR模板，加入表2中配制好的PCR反应液，按照表1的PCR反应程序和条件进行扩增和检测。本实施例采用的是济凡生物科技(北京)有限公司提供的FinePure病毒DNA/RNA柱式提取试剂盒。

将本实施例和对照例的检测结果进行比对，参见表4。

表4实施例1与对照例的检测结果比对

以上结果表明：采用本实施例的裂解剂和相应的方法与经典离心柱提取检测阳性率接近，而且本实施例操作简单，可以规避离心柱提取过程中产生的失误导致假阴性结果的出现。

实施例2

A、配制裂解液：向容器中加入58.5克氯化钠，150mL triton X-100，4克的十二烷基硫酸锂，浓度为0.5M、pH为8.0的EDTA-2Na溶液16mL，然后加纯化水600mL，混匀后，转移至容量瓶中，定容到1000mL。

B、制备待测样本：将已知浓度的大肠杆菌菌液稀释到1×10⁷cfu/ml、1×10⁶cfu/ml、1×10⁵cfu/ml、1×10⁴cfu/mL四个10倍稀释梯度浓度。

取多个PCR反应管，分别加入步骤A中配制的裂解液5μL，并依次加入上述四个浓度的大肠杆菌菌液5μL，使用移液器反复吹打3次混匀、静置10min，得病毒裂解体系；

C、PCR扩增：向步骤B中所述病毒裂解体系中加入配制好的PCR反应液40μL，按照表1中PCR反应程序和条件进行扩增，检测。

其中以纯化水作为阴性对照。

本实施例PCR反应液的组分和浓度参见表5。

表5 PCR反应液的组分和浓度

组分	单人份用量(μL)
		5×PCR Buffer	10
MgCl<sub>2</sub>(1M)	0.5
		dNTPs(25mM)	0.5
Ec-F(50pmol/μL)	0.2
		Ec-R(50pmol/μL)	0.2
Ec-P(50pmol/μL)	0.1
		Taq DNA聚合酶(5U/μL)	1
Rox(50μM)	0.1
		纯化水	补足到40

本实施例中5×PCR Buffer的浓度和组分与实施例1相同。

用于检测大肠杆菌上游引物Ec-F、下游引物Ec-R和探针Ec-P是现有技术中已经成熟的技术。本实施例中所采用的核苷酸序列参见表6。

表6用于扩增环病毒2型的引物和探针序列

扩增结果参见图1，测得的Ct值见表7。

表7大肠杆菌的检测结果

大肠杆菌溶液	检测结果(Ct值)
		1×10<sup>7</sup>cfu/ml	20.01
1×10<sup>6</sup>cfu/ml	23.11
		1×10<sup>5</sup>cfu/ml	26.73
1×10<sup>4</sup>cfu/ml	29.88

以上结果表明：本实施例的裂解液针对细菌样本具有良好的灵敏性，并且Ct值随浓度减少呈梯度改变。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 济凡生物科技（北京）有限公司

<120> 一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量PCR检测方法

<130> 2010

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

cccgcagtat tctgattac 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

gacagcagtt gaggagtacc att 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

gaccccgttg gaatggtact cc 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

ggttgattga acgccgctc 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

gtgagacgct gaataaggag tg 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

tccgcgacta tcgtcgttaa tcacc 25

Claims

1.一种病毒/细菌的裂解液，其特征在于，所述裂解液由NaCl、triton X-100、十二烷基硫酸锂和EDTA-2Na与纯化水混匀而成，各组分的终浓度：NaCl为1～1.2M，triton X-100为10v.％～12v.％，十二烷基硫酸锂为0.01％～0.04％w/v，EDTA-2Na为5～8mM。

2.根据权利要求1所述的病毒/细菌的裂解液，其特征在于，各组分的终浓度配比：NaCl为1M，triton X-100为10v.％，十二烷基硫酸锂为0.02％，EDTA-2Na为5mM。

3.根据权利要求1所述的病毒/细菌的裂解液，其特征在于，各组分的终浓度配比为：NaCl为1M，triton X-100为12v.％，十二烷基硫酸锂为0.04％，EDTA-2Na为8mM。

4.一种病毒/细菌的非疾病诊断的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、按照权利要求1所述病毒/细菌的裂解液的配比，配制裂解液；

5.根据权利要求4所述的病毒/细菌的非疾病诊断的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤A中配制裂解液的方法如下：

向容器中加入58.5～70.2克氯化钠，100～120mL triton X-100，1～4克的十二烷基硫酸锂，0.5M pH值为8.0的EDTA-2Na 10～16mL，然后加纯化水600mL，混匀后，定容到1000mL。

6.根据权利要求4所述的病毒/细菌的非疾病诊断的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤B中向PCR反应管中加入的裂解液和待检测血清或血浆样本各5μL，混匀、室温静置10min。

7.根据权利要求4所述的病毒/细菌的非疾病诊断的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤C中所述PCR反应液包括：PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、检测病毒/细菌的引物对和对应探针以及Taq DNA聚合酶或酶混合液。