CN113201459B - 一种微生物快速冻干保存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物保存技术领域，特别是关于一种微生物快速冻干保存的方法，包括：微生物活化、培养、富集得菌含量1×108cfu/mL～1×109cfu/mL的菌悬液；在菌悬液中加入权利要求1～3任一项所述微生物冻干保护，混匀得混合菌液；将球霰石碳酸钙按照重量体积比1g:0.8～2mL加入至混合菌液中混匀，快速冷冻，然后干燥即得冻干粉。本发明方法操作简便，可迅速完成对微生物的冻干保存；经本申请方法冻干保存的微生物，存活率不低于90％，显著提高了微生物的保藏期，利于微生物制剂的加工、储藏及转输，此外，还有利于提高冻干产酸菌的产酸活性，相对于常规冻干保存方法有助于维持产酸菌的生物学活性。

Description

一种微生物快速冻干保存的方法
技术领域
本发明涉及微生物保存技术领域，特别是关于一种微生物快速冻干保存的方法。
背景技术
微生物在食品健康方面的应用主要包括两个方面，其一是利用有益微生物的作用制作发酵食品，在现代发酵工程中应用较为普遍，其二则是防止有害微生物污染食品，以确保食品安全。
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。其在自然界中分布极为广泛，在工农业、食品加工业和医药产业等均具有极高的应用价值。然而，普通乳酸菌活力较弱，而且对营养成分和外界环境要求较高，长期储存下其存活率和活性会发生极速下降，严重限制了其应用。
目前多以冻干保存的方式储存乳酸菌，然而对其直接冷冻干燥时会严重影响其活性，因此多添加冻干保护剂以保护微生物活性。例如申请号CN2013103232152的发明专利以四氢嘧啶、海藻糖、脱脂乳和谷氨酸钠作为冻干保护剂，而申请号CN2018106931842的发明专利则以甘油、海藻糖、脱脂乳粉、维生素C和***胶作为真空冷冻干燥保护剂，申请号2019106154468的发明专利则以单组份羧甲基茯苓多糖作为冻干保护对乳酸菌进行冻干保护，然而上述现有技术均存在乳酸菌存活率有不同程度的下降的缺陷，而且均未对复活的乳酸菌的产酸活性进行验证。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对现有技术存在的至少一种技术问题，本申请提供一种可显著微生物存活率的微生物冻干保护剂，成分包括茶氨酸与羟乙基多糖。本发明还提供一种有利于提高微生物存活率、提升冻干产酸菌产酸活性且操作简单的微生物快速冻干保存方法。
(二)技术方案
为解决上述技术问题或未实现上述技术目的，本发明提供如下技术方案。
一种微生物冻干保护剂，其包括重量比1:4.5～6的茶氨酸与羟乙基多糖。
茶氨酸与羟乙基多糖的重量比更优选1:5～5.5，最优选1:5.5。
羟乙基多糖选自羟乙基猴头菇多糖、羟乙基茯苓多糖或羟乙基香菇多糖的至少一种。
羟乙基多糖优选羟乙基猴头菇多糖。
微生物包括乳酸菌或酪酸菌的至少一种。
乳酸菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌或保加利亚乳杆菌的至少一种。
本申请所述微生物冻干保护剂可用于包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌等乳酸菌菌种及酪酸菌的快速冻干保存和/或冻干粉制备，本申请所述冻干保护剂可单独应用，也能与其他常规冻干保护剂如脱脂乳、海藻酸、乳清蛋白等搭配使用，具有显著的提升冻干保存微生物的存活率的作用，相比于应用常规保护剂，微生物的存活率得到大幅提高。
茶氨酸与羟乙基多糖在快速冻干保存微生物中的应用。
微生物包括乳酸菌或酪酸菌的至少一种。
乳酸菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌或保加利亚乳杆菌的至少一种。
所述应用包括提高冻干乳酸菌的存活率。
所述应用包括提高冻干乳酸菌的产酸活性。
本申请所述茶氨酸与羟乙基多糖利于乳酸菌或酪酸菌等益生菌的快速冻干保存，可单独应用，也能与其他常规冻干保护剂搭配应用，可发挥出显著提升冻干保存微生物的存活率的作用，此外，验证发现以本申请所述茶氨酸和羟乙基多糖作为保护剂有助于提高冻干产酸菌的产酸活性，相对于常规冻干保存方法有助于维持产酸菌的生物学活性，可能的原因是茶氨酸和羟乙基多糖的存在可诱使产酸菌细胞在冻干过程中产生了抗性物质，从而提高了其在冻干过程中的免疫力，有利于产酸菌遗传性质和产酸活性的稳定性。
一种微生物快速冻干保存的方法，包括：
S1、微生物活化、培养、富集得菌含量1×108cfu/mL～1×109cfu/mL的菌悬液；
S2、按照0.5～1.5g/100mL的量加入茶氨酸，2.25～9g/100mL的量加入羟乙基多糖，混匀得混合菌液；
S3、将球霰石碳酸钙按照重量体积比1g:0.8～2mL加入至混合菌液中混匀，快速冷冻，然后干燥即得冻干粉。
微生物包括乳酸菌或酪酸菌的至少一种。
微生物是乳酸菌时，培养至生长稳定期即进行富集，得到菌含量1～2×108cfu/mL的菌悬液。
微生物是酪酸菌时，培养至对数期即进行富集，得到菌含量5～10×108cfu/mL的菌悬液。
茶氨酸与羟乙基多糖的添加方式可以选取水溶液的形式。
茶氨酸与羟乙基多糖具有1:4.5～6、更优选1:5～5.5、最优选1:5.5的重量比。
除添加茶氨酸和羟乙基多糖外，混合菌液中还含有5～10g/100mL的脱脂奶粉和5～10g/100mL的海藻糖。
羟乙基多糖选自羟乙基猴头菇多糖、羟乙基茯苓多糖或羟乙基香菇多糖的至少一种。
球霰石碳酸钙依据下述步骤制得：等摩尔浓度的碳酸钠溶液和氯化钙溶液迅速等体积混合，1000～1200r/min搅拌20～30s后结束反应，以蒸馏水和无水乙醇交替洗涤、离心2～3次后干燥即得。本发明中制备球霰石碳酸钙的步骤简单易操作，反应进程较为彻底，所得产物中椭球型球霰石型碳酸钙的含量较高，粒度均一，粒度介于3-5μm之间，无明显团聚现象，适于用于对微生物的吸附与保护，相较于普通碳酸钙粒子更加有助于冻干保存微生物的存活。
快速冷冻是将混合物以20～30℃/min的速度降温至-45～-60℃冷冻至少12h。
冷冻干燥是在1～10Pa下冷冻干燥至少24h。
依据前述方法获得的微生物冻干制剂。
本发明方法中，首先对微生物进行活化、培养后富集得菌悬液，然后加入包括茶氨酸和羟乙基多糖的微生物冻干保护剂，最后将球霰石碳酸钙与混合菌液混匀，以特定降温速度降至低温后冷冻并干燥即可完成对微生物的快速冻干保存，本发明方法操作简便，可迅速完成对微生物的冻干保存；经本申请方法冻干保存的微生物，存活率不低于90％，显著提高了微生物的保藏期，利于微生物制剂的加工、储藏及转输，此外，本申请方法还有利于提高冻干产酸菌的产酸活性，相对于常规冻干保存方法有助于维持产酸菌的生物学活性；因此本申请方法可应用于微生物的大型化、自动化、连续化的现代化生产，具有广阔的前景。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有如下优点：
1)本申请所述冻干保护剂可用于乳酸菌菌种及酪酸菌菌种的快速冻干保存和/或冻干粉制备，冻干保护剂可单独应用，也能与其他常规冻干保护剂搭配使用，具有显著的提升冻干保存微生物的存活率的作用；
2)以本申请所述茶氨酸和羟乙基多糖作为保护剂有助于提高冻干产酸菌的产酸活性，维持产酸菌的生物学活性，可能的原因是茶氨酸和羟乙基多糖的存在可诱使产酸菌细胞在冻干过程中产生了抗性物质，从而提高了其在冻干过程中的免疫力，有利于产酸菌遗传性质和产酸活性的稳定性；
3)以粒度均一、无明显团聚现象的球霰石型碳酸钙对微生物进行吸附与保护，相较于普通碳酸钙粒子更加有助于冻干保存微生物的存活，将菌液与碳酸钙的混合液以特定降温速度降至低温后冷冻并干燥即可完成对微生物的快速冻干保存，方法操作简便，可迅速完成对微生物的冻干保存，显著提高了微生物的保藏期，利于微生物制剂的加工、储藏及转输。
本发明为实现上述目的而采用了上述技术方案，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
为让本发明的上述和/或其他目的、特征、优点与实例能更明显易懂，所附附图的说明如下：
图1是改性前后的猴头菇多糖的红外光谱图，A表示改性前，B表示改性后；
图2是球霰石碳酸钙的XRD图，c表示方解石晶型，v表示球霰石晶型；
图3是微生物产酸活性示意图；
图4是微生物的存活率示意图；
图5是牛胆盐胁迫示意图。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当替换和/或改动工艺参数实现，然而特别需要指出的是，所有类似的替换和/或改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和制备方法已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本发明使用本文中所描述的方法和材料；但本领域中已知的其他合适的方法和材料也可以被使用。本文中所描述的材料、方法和实例仅是说明性的，并不是用来作为限制。所有出版物、专利申请案、专利案、临时申请案、数据库条目及本文中提及的其它参考文献等，其整体被并入本文中作为参考。若有冲突，以本说明书包括定义为准。
除非具体说明，本文所描述的材料、方法和实例仅是示例性的，而非限制性的。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但本文仍描述了合适的方法和材料。
除非另外说明，所有的百分数、份数、比例等都以重量计；另有说明包括但不限于“wt％”意指重量百分比、“mol％”意指摩尔百分比、“vol％”意指体积百分比。
本申请所述猴头菇多糖具体经由下述步骤获得：将市售猴头菇多糖复溶于水中，在20KHz、0.4W/cm2超声波作用下、40℃浸提2h，过滤后真空浓缩，90％乙醇沉淀，复溶后以Sevage法脱蛋白，5％双氧水脱色后洗涤，最后冷冻干燥得到。
本申请所述植物乳杆菌购买自山东诺然特殊医学用途配方食品有限公司。
本申请所述羧甲基茯苓多糖购买自陕西摩尔生物科技有限公司。
以下详细描述本发明。
实施例1
制备羟乙基猴头菇多糖：1重量份猴头菇多糖加入至50重量份含1％氢氧化钠和1％氯化钠的溶液中，室温120r/min搅拌30min后降温至0℃；逐滴滴入1.5重量份环氧乙烷，升温至30℃，180r/min搅拌反应36h，1mol/L盐酸中和至中性后加入5倍体积的丙酮，离心取沉淀后溶于水，以去离子水为介质应用1KDa透析袋透析3d，每天换水，冻干即得。
实施例2
制备球霰石碳酸钙：配制0.5mol/L的碳酸钠溶液和0.5mol/L的氯化钙溶液，等体积迅速混合，1200r/min搅拌30s后结束反应，以蒸馏水和无水乙醇交替洗涤、离心3次后80℃干燥至恒重即得。
实施例3
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、植物乳杆菌活化后培养至生长稳定期，富集得菌含量1×108cfu/mL的菌悬液；
S2、分别将茶氨酸和实施例1所得羟乙基猴头菇多糖溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入1.4g茶氨酸、7.7g羟乙基猴头菇多糖、6g脱脂奶粉和6g海藻糖，混匀得混合菌液；
S3、将实施例2所得球霰石碳酸钙按照重量体积比1g:1mL加入至混合菌液中混匀，25℃/min的速度降温至-60℃冷冻12h，然后在5Pa下冷冻干燥24h即得冻干粉。
实施例4
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、植物乳杆菌活化后培养至生长稳定期，富集得菌含量2×108cfu/mL的菌悬液；
S2、分别将茶氨酸和实施例1所得羟乙基猴头菇多糖溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入1g茶氨酸、5.5g羟乙基猴头菇多糖、8g脱脂奶粉和5g海藻糖，混匀得混合菌液；
S3、将实施例2所得球霰石碳酸钙按照重量体积比1g:1.5mL加入至混合菌液中混匀，以30℃/min的速度降温至-55℃冷冻12h，然后在4Pa下冷冻干燥24h即得冻干粉。
实施例5
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、植物乳杆菌活化后培养至生长稳定期，富集得菌含量4×108cfu/mL的菌悬液；
S2、同实施例4的S2；
S3、同实施例4的S3。
实施例6
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的步骤S1；
S2、将茶氨酸溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入6.5g茶氨酸、8g脱脂奶粉和5g海藻糖，混匀得混合菌液；
S3、同实施例4的步骤S3。
实施例7
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的步骤S1；
S2、将实施例1所得羟乙基猴头菇多糖溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入6.5g羟乙基猴头菇多糖、8g脱脂奶粉和5g海藻糖，混匀得混合菌液；
S3、同实施例4的步骤S3。
实施例8
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的步骤S1；
S2、以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入8g脱脂奶粉和5g海藻糖，混匀得混合菌液；
S3、同实施例4的步骤S3。
实施例9
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的步骤S1；
S2、分别将谷氨酸钠和实施例1所得羟乙基猴头菇多糖溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入1g谷氨酸钠、5.5g羟乙基猴头菇多糖、8g脱脂奶粉和5g海藻糖，混匀得混合菌液；
S3、同实施例4的步骤S3。
实施例10
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的步骤S1；
S2、分别将茶氨酸和羧甲基茯苓多糖溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入1g茶氨酸、5.5g羧甲基茯苓多糖、8g脱脂奶粉和5g海藻糖，混匀得混合菌液；
S3、同实施例4的步骤S3。
实施例11
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的步骤S1；
S2、分别将茶氨酸和实施例1所得羟乙基猴头菇多糖溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入1g茶氨酸、5.5g羟乙基猴头菇多糖和5g海藻糖，混匀得混合菌液；
S3、同实施例4的步骤S3。
实施例12
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的S1；
S2、分别将茶氨酸和实施例1所得羟乙基猴头菇多糖溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入1g茶氨酸、5.5g羟乙基猴头菇多糖和8g脱脂奶粉，混匀得混合菌液；
S3、同实施例4的步骤S3。
实施例13
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的步骤S1；
S2、分别将茶氨酸和实施例1所得羟乙基猴头菇多糖溶于水中，以每100mL菌悬液计，在菌悬液中依次加入1g茶氨酸和5.5g羟乙基猴头菇多糖，混匀得混合菌液；
S3、同实施例4的S3。
实施例14
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的步骤S1；
S2、同实施例4的步骤S2；
S3、S2所得混合菌液以30℃/min的速度降温至-50℃冷冻12h，然后在10Pa下冷冻干燥24h即得冻干粉。
实施例15
一种植物乳杆菌快速冻干保存方法，包括：
S1、同实施例4的S1；
S2、同实施例4的S2；
S3、将4μm左右粒径的碳酸钙按照重量体积比1g:1.5mL加入至混合菌液中混匀，以30℃/min的速度降温至-50℃冷冻12h，然后在10Pa下冷冻干燥24h即得冻干粉。
实验例1
分别称取一定量的实施例1中改性前后的猴头菇多糖，以溴化钾压片，在4000～500cm-1范围内进行红外光谱扫描，图像如图1所得。
由图1可知，3330cm-1和2920cm-1附近分别出现较宽的峰，分别属于O-H伸缩振动特征峰和-CH2反对称伸缩振动特征峰，1045cm-1及1640cm-1出分别出现了C-O和C＝O，多糖改性前后均有表现，而改性后的多糖在1457～1363cm-1间出现-CH2的面向弯曲振动峰，在2920cm-1附近-CH2的反对称伸缩振动峰加强，表明修饰成功。
实验例2
分别对实施例2所得球霰石碳酸钙进行物相分析，得出其XRD图如图2所示。由图2可以看出球霰石晶型的占比较高，球霰石晶型的大比表面积、较高溶解性和分散性以及较轻的比重均适宜用于对微生物的吸附与保护。
实验例3
分别将实施例3～15中经冻干的植物乳杆菌经抽真空后置于4℃保存；应用GB4789.35-2010食品微生物学检验乳酸菌检验的方法验证冻干后的存活率以及抽真空后置于4℃保存6个月后的存活率，存活率计算方式是复活后的微生物总数与冻干保存前的微生物总数的比值，测定结果如表1所示。
表1冻干存活率
实施例 冻干后存活率/％ 6个月后存活率/％
3 94.3 94.1
4 94.5 94.2
5 92.6 91.4
6 86.1 82.8
7 85.4 82.6
8 82.5 80.4
9 90.4 89.5
10 89.9 89.1
11 93.8 93.4
12 94.0 93.8
13 93.6 93.4
14 87.6 85.8
15 89.5 89.0
由表1可以看出，以本申请所述方法可实现对微生物的快速冻干保存，优选方案实施例3和4所得冻干后存活率和真空低温保存6个月后的存活率均不低于94％，实现了对乳酸菌的高效率、高存活率保存；实施例5表明菌悬液中微生物的含量过高反而不利于乳酸菌的存活，因此本申请所述1～2×108cfu/mL是乳酸菌的较佳冻干保存浓度，浓度过高不利于乳酸菌存活，浓度过低则无法达到物尽其用，提升了保存成本；结合实施例6～10可知本申请的茶氨酸与羟乙基猴头菇多糖结合有利于提升冻干保存微生物的存活率，并且相对于常规冻干保护剂谷氨酸钠或羧甲基茯苓多糖也具有相当程度的提升；由实施例11～13可以看出本申请含有茶氨酸与羟乙基猴头菇多糖的冻干保护剂可单独利用，也能与常规冻干保护剂结合使用；实施例14中直接含有冻干保护剂的菌悬液进行冷冻干燥，实施例15中以普通碳酸钙粉末进行冷冻干燥，均不能确保微生物的高存活率保存，表明本申请的球霰石型碳酸钙利于对微生物的保存，而该应用并未有过相关公开。
实验例4
将实验例3中经真空低温保存后的微生物复活，活化后以2vol％的接种率接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养36h，并以未进行冻干保存的微生物作为对照，通过测定pH衡量其相对产酸活性，结果如图3所示。
由图3可以看出，本申请方案实施例3～5所得菌剂复活后的微生物具有较为优异的产酸活性，相对于冻干保护剂中未添加茶氨酸和/或羟乙基猴头菇多糖，以及以谷氨酸钠代替茶氨酸、以羧甲基茯苓多糖代替羟乙基猴头菇多糖等方案，本申请的茶氨酸搭配羟乙基猴头菇多糖的方案具有显著的提高冻干乳酸菌的产酸活性的作用，可能的原因是本申请的保存方法利于微生物的存活，其复活后能获得较好的生长能力，从而产酸能力得以较好的保留。从图3还可以看出，脱脂奶粉和/或海藻糖的添加于微生物的产酸能力没有显著影响，而球霰石碳酸钙的选取亦对微生物的产酸活性不具有明显的增益作用。
实验例5
在实施例4的基础上，控制冻干保护剂包括8g脱脂奶粉、5g海藻糖以及共计6.5g的茶氨酸和羟乙基猴头菇多糖的混合物，通过改变茶氨酸和羟乙基猴头菇多糖混合物中二者的重量比，并依据与实施例4相同的方法获得一系列微生物冻干制剂；并依据与实验例3相同的方法测定冻干制剂复活后的微生物的存活率，统计结果如图4所示。由图4可以看出，通过变更冻干保护剂中茶氨酸和羟乙基猴头菇多糖的重量比，冻干制剂中的微生物复活后的存活率存在一定的波动，具体表现为当茶氨酸与羟乙基多糖具有1:4.5～6的重量配比时，冻干保存微生物可获得较为优异的存活率，存活率介于93.7～94.5％，茶氨酸或羟乙基多糖的占比过多或者过少均不利于微生物的存活，表明二者在特殊重量配比条件下发挥出协同作用以提升冻干保存微生物的存活率。
实验例6
将实验例3中经真空低温保存后的微生物复活，活化后以2vol％的接种率接种于含0.1g/100mL牛胆盐的MRS培养基中，37℃恒温培养，并以未进行冻干保存的微生物作为对照，分别于0、2、4、6、8h取样并采用平板计数法测定活菌数，测定结果如图5所示。
由图5中可以看出，在0.1g/100mL牛胆盐的胁迫下，本申请所述植物乳杆菌的生长具有一定的抑制作用，对比分析实施例4、14、15可以看出，将仅含有冻干保护剂的菌悬液直接进行冷冻干燥保存以及以普通碳酸钙粉末对微生物菌液进行冻干保存均不利于提升冻干微生物的牛胆盐耐受性。众所周知，微生物冷冻干燥过程伴随着胞内冰晶的形成以及细胞膜透性的变化，其具体包括细胞质内盐浓度升高、pH值和离子强度改变等，而细胞膜的影响则包括膜稳定性降低、膜内异形混合物出现及膜透性增加，此外冷冻干燥还可能导致部分细胞蛋白、水解酶和抑制因子的流失，而抑制因子的释放可能导致细胞代谢作用损伤，从而降低细胞的活性与耐性。从图5中可知，本申请的优选方案实施例4中的微生物在牛胆盐胁迫下相比于未冻干保存的微生物仅发生了轻微的耐性损失，其对牛胆盐胁迫依然具有相当优异的耐受性，可能的原因是大比表面积、较高溶解性和分散性的球霰石碳酸钙的存在有利于维持微生物细胞膜的完整性，降低冻干过程中的细胞损伤，提高冻干微生物的牛胆盐耐受性。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
虽然上述具体实施方式已经显示、描述并指出应用于各种实施方案的新颖特征，但应理解，在不脱离本公开内容的精神的前提下，可对所说明的装置或方法的形式和细节进行各种省略、替换和改变。另外，上述各种特征和方法可彼此独立地使用，或可以各种方式组合。所有可能的组合和子组合均旨在落在本公开内容的范围内。上述许多实施方案包括类似的组分，并且因此，这些类似的组分在不同的实施方案中可互换。虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本发明，但本领域技术人员应理解，本发明可超出具体公开的实施方案延伸至其它的替代实施方案和/或应用以及其明显的修改和等同物。因此，本发明不旨在受本文优选实施方案的具体公开内容限制。
本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (4)

1.一种微生物快速冻干保存的方法，其特征在于包括：
S1、微生物活化、培养、富集得菌含量1×108cfu/mL～1×109cfu/mL的菌悬液；
S2、在菌悬液中加入微生物冻干保护剂，所述微生物冻干保护剂具体是重量比1:4.5～6的茶氨酸与羟乙基猴头菇多糖，混匀得混合菌液；
S3、将球霰石碳酸钙按照重量体积比1g:0.8～2mL加入至混合菌液中混匀，快速冷冻，然后干燥即得冻干粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：球霰石碳酸钙依据下述步骤制得：等摩尔浓度的碳酸钠溶液和氯化钙溶液迅速等体积混合，1000～1200r/min搅拌20～30s后结束反应，以蒸馏水和无水乙醇交替洗涤、离心2～3次后干燥即得。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：快速冷冻是将混合物以20～30℃/min的速度降温至-45～-60℃冷冻至少12h。
4.依据权利要求1～3任一项所述方法获得的微生物冻干制剂。
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