CN114451485B - 中药多糖提取物冻干保护剂、直投发酵剂及其制备方法 - Google Patents

中药多糖提取物冻干保护剂、直投发酵剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了中药多糖提取物冻干保护剂、直投发酵剂及其制备方法，属于饲料发酵剂技术领域；复合中药多糖提取物冻干保护剂，包括茯苓多糖提取物、白术多糖提取物、党参多糖提取物、L‑酪氨酸、α‑环糊精和聚乙烯亚胺。将其用于水产发酵饲料直投发酵剂的冻干保护，可减少冷冻干燥对菌体造成的损伤，提高冻干后发酵剂中菌种存活率，并可有效延长发酵剂的贮藏期，确保贮藏期间发酵活力一直维持在较高水平。

Description

中药多糖提取物冻干保护剂、直投发酵剂及其制备方法
技术领域
本发明属于饲料发酵剂技术领域，具体涉及中药多糖提取物冻干保护剂、直投发酵剂及其制备方法。
背景技术
发酵饲料能调节水产动物体内的微生态平衡，促进动物健康生长，提高生产性能，降本增效，还可调控和保护水体生态环境，符合健康环保型渔业发展要求，具有广阔的市场应用前景。
目前发酵饲料的制备通常是将休眠状态下的生产菌种经活化、多次扩培等工序制成液体发酵剂，然后接种饲料原料进行发酵。每一批次饲料生产前都需重复液体发酵剂的制备过程，工艺繁琐，对发酵设备和技术人员技能要求较高，并且液体发酵剂运输成本高，菌种活力容易退化。
基于液体发酵剂存在的问题，直投式固体发酵剂应运而生；菌种通过高密度培养和菌体浓缩分离后，与保护剂混匀得菌悬液，最后通过干燥、无菌包装制备成高浓度和标准化的直投式发酵剂；实际生产时，不再需要活化、扩培等过程，直接投入使用；其体积小、携带方便，省去了生产前发酵剂的制备工序，减少了菌种车间的投资，且可以有效防止菌种的退化和污染，发酵活力高、保藏期长，可使发酵生产的劳动生产率和产品质量大大提高。
目前制约直投式发酵大规模推广的关键问题在于干燥。常用的菌体干燥方式包括喷雾干燥、真空低温干燥及真空冷冻干燥等；其中，前两种方法因对菌体损伤严重，制备的菌剂活力低且难以长期保存的问题而受到限制；真空冷冻干燥已成为主流的干燥方法，其先在低温下冷冻样品(样品中的水冻结成冰)，继而通过真空条件冰晶发生升华，脱去水分，保证样品达到干燥状态；但若直接进行真空冷冻干燥，不可避免地对菌体造成一定程度的损伤，降低菌体的存活率和细胞活力，影响其发酵性能，而在菌体中添加冻干保护剂可以有效改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持细胞原有的各种生理生化特性和生物活性。因此冻干保护剂的筛选是制备高活力直投式发酵剂的核心问题。然而，现有的微生物冻干保护剂对菌体的保护效果不理想，导致菌种存活力较低，尤其在贮藏一段时间后，菌种发酵活力下降，且菌种启动发酵速度较慢。
因此，如何降低冻干过程对菌体的影响，保证直投发酵剂的发酵活力是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明公开了中药多糖提取物冻干保护剂、直投发酵剂及其制备方法，可有效减少冷冻干燥对菌体造成的损伤。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
复合中药多糖提取物冻干保护剂，包括茯苓多糖提取物、白术多糖提取物、党参多糖提取物、L-酪氨酸、α-环糊精和聚乙烯亚胺。
本发明冻干保护剂与水分子结合后，能够使溶液的粘性增加，弱化水的结晶过程，减轻溶质损伤，维持菌体细胞膜的通透性与完整性，从而达到保护菌体细胞的作用；将其用于对水产发酵饲料直投发酵剂进行保护，可减少冷冻干燥对菌体造成的损伤，提高冻干后发酵剂中菌种存活率，并可有效延长发酵剂的贮藏期，确保贮藏期间发酵活力一直维持在较高水平。
进一步地，茯苓多糖提取物10.0～30.0g/100mL、白术多糖提取物10.0～20.0g/100mL、党参多糖提取物5.0～20.0g/100mL、L-酪氨酸2.0～10.0g/100mL、α-环糊精2.0～7.0g/100mL和聚乙烯亚胺2.0～5.0g/100mL。
上述复合中药多糖提取物冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)茯苓粉经碱化、醚化、醇沉、干燥，制得茯苓多糖提取物；
(2)白术粉经醇提、超声提取、干燥，制得白术多糖提取物；
(3)党参粉经微波提取、醇沉、干燥，制得党参多糖提取物；
(4)将茯苓多糖提取物、白术多糖提取物、党参多糖提取物混于水中，灭菌后得溶液A；
(5)将L-酪氨酸、α-环糊精、聚乙烯亚胺混于水中，灭菌后得溶液B；
(6)将溶液A和溶液B混合，得到所述冻干保护剂。
进一步地，步骤(1)中，
茯苓粉过100～150目筛；
碱化：向茯苓粉中加入NaOH溶液，持续搅拌至茯苓粉完全溶解，得到茯苓碱化溶液；每100g茯苓粉中加入NaOH溶液200～400mL，NaOH溶液的质量分数为40～60％；
醚化：向茯苓碱化溶液中加入氯乙酸，持续搅拌，45～65℃反应时间6～8h，得到茯苓醚化溶液；以每100g茯苓粉计，分批次加入氯乙酸固体共计40～100g；
醇沉：向茯苓醚化溶液中加入95％乙醇-乙酸溶液进行沉淀，沉淀用水复溶，使用质量分数95％的乙醇溶液醇沉，收集沉淀；
95％乙醇-乙酸溶液与茯苓醚化溶液的体积比为3:1～5:1，95％乙醇-乙酸溶液为质量分数95％的乙醇溶液与乙酸以1:1体积比混合制得；
干燥：醇沉步骤所得沉淀采用真空干燥方式，35～45℃干燥4～6h。
进一步地，步骤(2)中，
白术粉过100～150目筛；
醇提：白术粉中加入乙醇溶液，80～85℃加热回流提取2～3h，过滤获得白术颗粒；乙醇溶液质量分数为70～75％，用量按每克白术粉添加20mL计算；
超声辅助提取：在白术颗粒中加入蒸馏水，75～80℃超声提取60～90min，过滤所得滤液备用；
干燥：滤液采用真空冷冻干燥方式，置于-20～-35℃预冻5～8h后进行冻干处理；
进一步地，步骤(3)中，
党参粉过100～150目筛；
微波提取：党参粉加水浸泡8～12h后，在微波反应器中加热反应，反应温度200～260℃，时间1～1.5h，过滤获得党参微波提取溶液；每100g党参粉中加入1000～2000mL水；
醇沉：党参微波提取液中加入3～5倍体积的乙醇进行醇沉，静置6～8h，4000r/min离心10～15min，去掉上清液后，再加sewage试剂，涡旋混匀后5000r/min二次离心10～15min，取离心所得上清液二次醇沉，收集沉淀；sewage试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1体积比配制而成；
干燥：醇沉步骤所得沉淀采用真空干燥方式，35～45℃干燥4～6h。
上述冻干保护剂可用于水产发酵饲料生产用微生物的冻干保护。
直投发酵剂，包括上述复合中药多糖提取物冻干保护剂，粪肠球菌，产朊假丝酵母，黑曲霉，凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌。
上述直投发酵剂的制备方法：将粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的混合菌液与冻干保护剂按照1:1～1:4体积比混合，冷冻干燥，制得直投发酵剂。
进一步地，混合菌液中，
粪肠球菌的活菌浓度为1.0×1010-6.0×1010CFU/mL；
产朊假丝酵母的活菌浓度为3.0×108-6.0×108CFU/mL；
黑曲霉的活菌浓度为8.0×107-2.0×108CFU/mL；
凝结芽孢杆菌的活菌浓度为5.0×107-3.0×108CFU/mL；
侧孢短芽孢杆菌的活菌浓度为1.0×108-4.0×108CFU/mL。
进一步地，粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的混合菌液制备方法如下：
(1)活化各菌种；
(2)活化后各菌进行混合增殖培养，培养液离心，生理盐水重悬，得到混合菌液；
增殖培养过程中使用的增殖培养基为菊芋茯苓复合培养基；
菊芋茯苓复合培养基制备方法为：菊芋全粉、茯苓水提物和水按2:3:5质量比混合，65℃水解60min后升温至95℃继续水解60min，冷却后用8层纱布过滤，滤液调节pH值为7.0～7.3，即得菊芋茯苓复合培养基；
菊芋全粉制备方法：新鲜菊芋切片，70～80℃烘干至含水量低于8％，粉碎过100目筛后制得菊芋全粉；
茯苓水提物制备方法：新鲜茯苓切片，70～80℃烘干后粉碎；加入10～15倍质量无水乙醇，浸提2～4h后过滤；滤渣加8～10倍质量蒸馏水，加热回流提取2h，过滤，重复2次，合并滤液，减压浓缩干燥后，得茯苓水提物。
进一步地，各菌种活化过程为：
将各菌种斜面分别接种一级种子培养基，培养后得一级种子液，再将一级种子液二次活化扩大培养，得二级种子液；
粪肠球菌菌种活化条件：一级种子培养条件32～35℃，48h；二级种子接种量为0.5％-2％，培养条件32～35℃，120～180r/min摇床培养18～24h，4℃保存备用；
产朊假丝酵母菌种活化条件：一级种子培养条件25～28℃，48h；二级种子接种量为3.0％-7.0％，培养条件25～28℃，120～180r/min摇床培养18～24h，4℃保存备用；
黑曲霉菌种活化条件：一级种子培养条件30～35℃，20h；二级种子接种量为3.0％-7.0％，培养条件32～35℃，120～180r/min摇床培养12～18h，4℃保存备用；
凝结芽孢杆菌菌种活化条件：一级种子培养条件45～-55℃，16h；二级种子接种量为1.0％-3.0％，培养条件45～-55℃，120～180r/min摇床培养12～18h，4℃保存备用；
侧孢短芽孢杆菌菌种活化条件：一级种子培养条件20～40℃，24h；二级种子接种量为2.0％-5.0％，培养条件20～40℃，120～180r/min摇床培养24～32h，4℃保存备用；
粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌及侧孢短芽孢杆菌一级、二级种子培养基组成为：每100mL中含酵母粉1.0～2.0g，牛肉膏2.0～3.0g，胰蛋白胨2.5～4.5g，碳酸氢钠0.1～0.2g，葡萄糖1.8～3.6g，氯化钠0.1～0.3g，乙酸钠0.1～0.2g，硫酸镁0.015～0.020g，硫酸锰0.005～0.008g。
进一步地，冷冻干燥步骤中，先于-80℃预冻3h，待菌液完全冻结后迅速转移至真空冷冻干燥机进行冻干；冻干条件为真空度10Pa，冷阱温度-55℃，隔板温度设定程序为10℃先加热2h、再升温至20℃加热3h、最后升至30℃进行加热，冻干时间20h。
上述直投发酵剂或上述方法制备的直投发酵剂应用于水产发酵饲料制备，可保证发酵活力，进而有利于保证水产发酵饲料生产的稳定性及产品质量。
综上所述，本发明冻干保护剂成分简单、成本低，可减少冷冻干燥对浓缩菌体造成的损伤，提高冻干后发酵剂中菌种存活率，并可有效延长发酵剂的贮藏期，适合菌种的长期保存。利用该冻干保护剂制备的直投发酵剂菌种存活率高，且具有较高的发酵性能，启动发酵速度快，确保贮藏期间发酵活力一直维持在较高水平，且在低温下贮藏150天后，活菌数及发酵性能与液体发酵无明显差别，适合用于水产发酵饲料的生产，有利于提升饲料质量的安全与稳定。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种冻干保护剂，包括以下组分：茯苓多糖提取物10.0g/100mL、白术多糖提取物10.0g/100mL、党参多糖提取物5.0g/100mL、L-酪氨酸2.0g/100mL、α-环糊精2.0g/100mL、聚乙烯亚胺2.0g/100mL。
上述冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取茯苓饮片，经普通中药材粉碎机粉碎后，过100目筛，得茯苓粉；
碱化：向茯苓粉中加入NaOH溶液，持续搅拌至茯苓粉完全溶解，得到茯苓碱化溶液；每100g茯苓粉中加入NaOH溶液200mL，NaOH溶液的质量分数为50％；
醚化：向茯苓碱化溶液中分批次缓慢加入氯乙酸固体(国产分析纯)，持续搅拌，45℃反应时间6h，得到茯苓醚化溶液；以每100g茯苓粉计，氯乙酸固体用量共计100g；
醇沉：向茯苓醚化溶液中加入95％乙醇-乙酸溶液进行沉淀，沉淀用水复溶，使用质量分数95％的乙醇溶液醇沉，收集沉淀；95％乙醇-乙酸溶液与茯苓醚化溶液的体积比为3:1，95％乙醇-乙酸溶液为质量分数95％的乙醇溶液与乙酸以1:1体积比混合制得；
干燥：醇沉步骤所得沉淀采用真空干燥方式，35℃干燥4h，制得茯苓多糖提取物；
(2)取白术饮片，经普通中药材粉碎机粉碎后，过100目筛，得白术粉；
醇提：白术粉中加入乙醇溶液，80℃加热回流提取2h，过滤获得白术颗粒；乙醇溶液质量分数为75％，用量按每克白术粉添加20mL计算；
超声辅助提取：在白术颗粒中加入蒸馏水，75℃超声提取60min，过滤所得滤液备用；
干燥：滤液采用真空冷冻干燥方式，置于-30℃预冻6h后进行冻干处理(冻干条件为：真空度10Pa，冷阱温度-55℃，隔板温度设定程序为10℃先加热2h、再升温至20℃加热3h，最后升至30℃进行加热，冻干时间约20h)，制得白术多糖提取物；
(3)取党参饮片，经普通中药材粉碎机粉碎后，过100目筛，得党参粉；
微波提取：党参粉加纯化水浸泡8h后，在微波反应器中加热反应，反应温度250℃，时间1h，过滤获得党参微波提取溶液；每100g党参粉中加入1000mL纯化水；
醇沉：党参微波提取液中加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置6h，4000r/min离心10min，去掉上清液后，再加sewage试剂，涡旋混匀后5000r/min二次离心10min，取离心所得上清液二次醇沉，收集沉淀；sewage试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1体积比配制而成；
干燥：醇沉步骤所得沉淀采用真空干燥方式，35℃干燥4h，制得党参多糖提取物。步骤(1)、(2)、(3)无先后顺序。
(4)将上述茯苓多糖提取物、白术多糖提取物、党参多糖提取物混于纯化水中，121℃高压蒸汽灭菌30min后得溶液A。
将L-酪氨酸、α-环糊精、聚乙烯亚胺混于纯化水中，121℃高压蒸汽灭菌30min后得溶液B。步骤(4)和(5)无先后顺序。
(5)无菌操作环境下，将溶液A和溶液B混合，得到冻干保护剂。
上述茯苓饮片、白术饮片、党参饮片采购自中国(亳州)中药材交易中心；L-酪氨酸、α-环糊精、聚乙烯亚胺均为AR级，购自中国医药(集团)上海化学试剂有限公司。
一种水产发酵饲料直投发酵剂，包括上述冻干保护剂、粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌。
粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CGMCC1.15424，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
产朊假丝酵母(Candidautilis)CGMCC2.3047，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC3.15663，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CGMCC1.10823，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)CGMCC1.15160，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
上述水产发酵饲料直投发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将各菌种斜面分别接种一级种子培养基，培养后得一级种子液，再将种子液二次活化扩大培养，得二级种子液；
粪肠球菌菌种活化条件：一级种子培养条件32℃，48h；二级种子接种量为0.5％，培养条件32℃，120r/min摇床培养18h，4℃保存备用；
产朊假丝酵母菌种活化条件：一级种子培养条件25℃，48h；二级种子接种量为3.0％，培养条件25℃，120r/min摇床培养18h，4℃保存备用；
黑曲霉菌种活化条件：一级种子培养条件30℃，20h；二级种子接种量为3.0％，培养条件32℃，120r/min摇床培养12h，4℃保存备用；
凝结芽孢杆菌菌种活化条件：一级种子培养条件45℃，16h；二级种子接种量为1.0％，培养条件45℃，120r/min摇床培养12h，4℃保存备用；
侧孢短芽孢杆菌菌种活化条件：一级种子培养条件20℃，24h；二级种子接种量为2.0％，培养条件20℃，120r/min摇床培养28h，4℃保存备用；
粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌及侧孢短芽孢杆菌活化用一级、二级种子培养基组成为：每100mL中含酵母粉1.0g，牛肉膏2.0g，胰蛋白胨2.5g，碳酸氢钠0.1g，葡萄糖1.8g，氯化钠0.1g，乙酸钠0.1g，硫酸镁0.015g，硫酸锰0.005g。
(2)各菌种活化两次后，接入增殖培养基中，粪肠球菌接种量2％、产朊假丝酵母接种量1％、黑曲霉接种量2％、凝结芽孢杆菌接种量3％、侧孢短芽孢杆菌接种量2％；34℃混合培养12h，培养后离心弃上清液，加入等量已灭菌0.85％生理盐水洗涤菌体2次，再以同样的条件离心收得粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌及侧孢短芽孢杆菌混合菌泥，将混合菌泥悬浮于生理盐水中，最终体积为原发酵液体积的1/10，制得混合菌液，经测定混合菌液中各菌活菌浓度符合以下范围：
粪肠球菌的活菌浓度：1.0×1010-6.0×1010CFU/mL；
产朊假丝酵母的活菌浓度：3.0×108-6.0×108CFU/mL；
黑曲霉的活菌浓度：8.0×107-2.0×108CFU/mL；
凝结芽孢杆菌的活菌浓度：5.0×107-3.0×108CFU/mL；
侧孢短芽孢杆菌的活菌浓度：1.0×108-4.0×108CFU/mL。
向混合菌液中加入冻干保护剂，得到混合液；混合菌液与冻干保护剂体积比1:1。
增殖培养基为菊芋茯苓复合培养基；
菊芋茯苓复合培养基制备方法：菊芋全粉、茯苓水提物和水按2:3:5比例混合(w/w/w)，65℃水解60min后升温至95℃继续水解60min，冷却至室温后将糖化液用8层纱布过滤，滤液调节pH值为7.0～7.3，即得菊芋茯苓复合培养基。
菊芋全粉制备方法：新鲜菊芋经切片，70℃烘干至含水量低于8％，粉碎过100目筛后制得菊芋全粉。
茯苓水提物制备方法：新鲜茯苓切片、70℃烘干后粉碎，先加入10倍质量无水乙醇，浸提2h后滤过，滤渣加8倍质量蒸馏水，加热回流提取2h，滤过，重复2次，合并滤液，减压浓缩干燥后，得茯苓水提物。
(3)冷冻干燥：取步骤(3)获得混合液2mL分装进小瓶中，-80℃预冻3h，待菌液完全冻结后迅速转移至真空冷冻干燥机进行冻干，冻干条件为：真空度10Pa，冷阱温度-55℃，隔板温度设定程序为10℃先加热2h、再升温至20℃加热3h，最后升至30℃进行加热，冻干时间约20h。
冻干后即得发酵剂，无菌包装即得成品，4℃低温保存。
通过冻干存活率、发酵活力评价直投发酵剂性能：
冻干存活率的计算方式为将冻干后的菌粉复水至冻干前的体积，以粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌及侧孢短芽孢杆菌适宜培养基培养计数。细胞存活率＝冻干后样品测得的活菌总数/冻干前样品测得的活菌总数×100％。
表1直投发酵剂各贮藏期菌体活菌数及存活率
Figure BDA0003489492900000121
采用茯苓、白术、党参复合多糖提取物冻干保护剂制得的直投发酵剂在4℃贮藏150天后，菌粉的活菌数仍持续稳定保持在1010CFU/g以上，存活率仍然达到94.8％，且在整个贮藏过程中存活率稳定在91.4～96.6％。
发酵活力评价方式为采用贮藏150天的直投发酵剂按1.5％接种量接入10％菊芋浸汁中进行发酵，评价发酵剂发酵过程中活菌数、pH值、还原糖、总糖以及总氨基态氮变化。以菌株直接活化扩培种子液接种作为对照。
表2直投发酵剂贮藏150天后发酵性能评价
Figure BDA0003489492900000131
采用茯苓、白术、党参复合多糖提取物冻干保护剂制得的直投发酵剂能够维持较高的发酵活力，发酵10％菊芋浸汁过程中，菌体生长迅速、产酸能力强、还原糖和总糖的消耗速度快，且总体效果与直接活化接种无明显差别。
表1及表2中所述活菌数为粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌及侧孢短芽孢杆菌活菌数之和。
实施例2
冻干保护剂，包括以下组分：茯苓多糖提取物30.0g/100mL、白术多糖提取物20.0g/100mL、党参多糖提取物20.0g/100mL、L-酪氨酸10.0g/100mL、α-环糊精7.0g/100mL、聚乙烯亚胺5.0g/100mL。
上述冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取茯苓饮片，经普通中药材粉碎机粉碎后，过100目筛，得茯苓粉；
碱化：向茯苓粉中加入NaOH溶液，持续搅拌至茯苓粉完全溶解，得到茯苓碱化溶液；每100g茯苓粉中加入NaOH溶液300mL，NaOH溶液的质量分数为50％；
醚化：向茯苓碱化溶液中分批次缓慢加入氯乙酸固体(国产分析纯)，持续搅拌，50℃反应时间7h，得到茯苓醚化溶液；以每100g茯苓粉计，氯乙酸固体用量共计50g；
醇沉：向茯苓醚化溶液中加入95％乙醇-乙酸溶液进行沉淀，沉淀用水复溶，使用质量分数95％的乙醇溶液醇沉，收集沉淀；95％乙醇-乙酸溶液与茯苓醚化溶液的体积比为4:1，95％乙醇-乙酸溶液为质量分数95％的乙醇溶液与乙酸以1:1体积比混合制得；
干燥：醇沉步骤所得沉淀采用真空干燥方式，40℃干燥5h，制得茯苓多糖提取物；
(2)取白术饮片，经普通中药材粉碎机粉碎后，过100目筛，得白术粉；
醇提：白术粉中加入乙醇溶液，82℃加热回流提取2h，过滤获得白术颗粒；乙醇溶液质量分数为75％，用量按每克白术粉添加20mL计算；
超声辅助提取：在白术颗粒中加入蒸馏水，80℃超声提取80min，过滤所得滤液备用；
干燥：滤液采用真空冷冻干燥方式，置于-30℃预冻6h后进行冻干处理(冻干条件为：真空度10Pa，冷阱温度-55℃，隔板温度设定程序为10℃先加热2h、再升温至20℃加热3h，最后升至30℃进行加热，冻干时间约20h)，制得白术多糖提取物；
(3)取党参饮片，经普通中药材粉碎机粉碎后，过100目筛，得党参粉；
微波提取：党参粉加纯化水浸泡10h后，在微波反应器中加热反应，反应温度250℃，时间1h，过滤获得党参微波提取溶液；每100g党参粉中加入1500mL纯化水；
醇沉：党参微波提取液中加入4倍体积的乙醇进行醇沉，静置7h，4000r/min离心12min，去掉上清液后，再加sewage试剂，涡旋混匀后5000r/min二次离心12min，取离心所得上清液二次醇沉，收集沉淀；sewage试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1体积比配制而成；
干燥：醇沉步骤所得沉淀采用真空干燥方式，40℃干燥5h，制得党参多糖提取物。
步骤(1)、(2)、(3)无先后顺序。
(4)将上述茯苓多糖提取物、白术多糖提取物、党参多糖提取物混于纯化水中，121℃高压蒸汽灭菌30min后得溶液A。
将L-酪氨酸、α-环糊精、聚乙烯亚胺混于纯化水中，121℃高压蒸汽灭菌30min后得溶液B。
步骤(4)和(5)无先后顺序。
(5)无菌操作环境下，将溶液A和溶液B混合，得到冻干保护剂。
上述茯苓饮片、白术饮片、党参饮片采购自中国(亳州)中药材交易中心；L-酪氨酸、α-环糊精、聚乙烯亚胺均为AR级，购自中国医药(集团)上海化学试剂有限公司。
一种水产发酵饲料直投发酵剂，包括上述冻干保护剂、粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌。
粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CGMCC1.15424，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
产朊假丝酵母(Candidautilis)CGMCC2.3047，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC3.15663，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CGMCC1.10823，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)CGMCC1.15160，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
上述水产发酵饲料直投发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
(2)菌种活化：将各菌种斜面分别接种一级种子培养基，培养后得一级种子液，再将种子液二次活化扩大培养，得二级种子液；
粪肠球菌菌种活化条件：一级种子培养条件34℃，48h；二级种子接种量为1.0％，培养条件34℃，150r/min摇床培养18h，4℃保存备用；
产朊假丝酵母菌种活化条件：一级种子培养条件26℃，48h；二级种子接种量为4.6％，培养条件26℃，150r/min摇床培养18h，4℃保存备用；
黑曲霉菌种活化条件：一级种子培养条件32℃，20h；二级种子接种量为5.0％，培养条件32℃，150r/min摇床培养18h，4℃保存备用；
凝结芽孢杆菌菌种活化条件：一级种子培养条件45℃，16h；二级种子接种量为2.0％，培养条件45℃，120r/min摇床培养12h，4℃保存备用；
侧孢短芽孢杆菌菌种活化条件：一级种子培养条件30℃，24h；二级种子接种量为4.0％，培养条件30℃，150r/min摇床培养30h，4℃保存备用；
粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌及侧孢短芽孢杆菌活化用一级、二级种子培养基组成为：每100mL中含酵母粉1.8g，牛肉膏2.4g，胰蛋白胨3.0g，碳酸氢钠0.1g，葡萄糖2.4g，氯化钠0.2g，乙酸钠0.1g，硫酸镁0.015g，硫酸锰0.006g。
(2)各菌种活化两次后，接入增殖培养基中，粪肠球菌接种量3％、产朊假丝酵母接种量2％、黑曲霉接种量3％、凝结芽孢杆菌接种量4％、侧孢短芽孢杆菌接种量3％；34℃混合培养12h，培养后离心弃上清液，加入等量已灭菌0.85％生理盐水洗涤菌体2次，再以同样的条件离心收得粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌及侧孢短芽孢杆菌混合菌泥，将混合菌泥悬浮于生理盐水中，最终体积为原发酵液体积的1/10，制得混合菌液，经测定混合菌液中各菌活菌浓度符合以下范围：
粪肠球菌的活菌浓度：1.0×1010-6.0×1010CFU/mL；
产朊假丝酵母的活菌浓度：3.0×108-6.0×108CFU/mL；
黑曲霉的活菌浓度：8.0×107-2.0×108CFU/mL；
凝结芽孢杆菌的活菌浓度：5.0×107-3.0×108CFU/mL；
侧孢短芽孢杆菌的活菌浓度：1.0×108-4.0×108CFU/mL。
向混合菌液中加入冻干保护剂，得到混合液；混合菌液与冻干保护剂体积比1:3。
增殖培养基为菊芋茯苓复合培养基；
菊芋茯苓复合培养基制备方法：菊芋全粉、茯苓水提物和水按2:3:5比例混合(w/w/w)，65℃水解60min后升温至95℃继续水解60min，冷却至室温后将糖化液用8层纱布过滤后滤液调节pH值为7.0～7.3，即得菊芋茯苓复合培养基。
菊芋全粉制备方法：新鲜菊芋经切片，75℃烘干至含水量低于8％，粉碎过100目筛后制得菊芋全粉。
茯苓水提物制备方法：新鲜茯苓切片、75℃烘干后粉碎，先加入12倍质量无水乙醇，浸提3h后滤过，滤渣加10倍质量蒸馏水，加热回流提取2h，滤过，重复2次，合并滤液，减压浓缩干燥后，得茯苓水提物。
(3)冷冻干燥：取步骤(3)获得混合液2mL分装进小瓶中，-80℃预冻3h，待菌液完全冻结后迅速转移至真空冷冻干燥机进行冻干，冻干条件为：真空度10Pa，冷阱温度-55℃，隔板温度设定程序为10℃先加热2h、再升温至20℃加热3h，最后升至30℃进行加热，冻干时间约20h。
冻干后即得发酵剂，无菌包装即得成品，4℃低温保存。
评价直投发酵剂的冻干存活率、发酵活力。
表3直投发酵剂贮藏期菌体活菌数及存活率
Figure BDA0003489492900000181
采用茯苓、白术、党参复合多糖提取物冻干保护剂制得的直投发酵剂在4℃贮藏150天后，菌粉的活菌数仍持续稳定保持在1010CFU/g以上，存活率仍然达到95.3％，且在整个贮藏过程中存活率稳定在93.8～96.9％。
采用贮藏150天的直投发酵剂按1.5％接种量接入10％菊芋浸汁中进行发酵，评价发酵剂发酵过程中活菌数、pH值、还原糖、总糖以及总氨基态氮变化。以菌株直接活化扩培种子液接种作为对照。
表4直投发酵剂贮藏150天后发酵性能评价
Figure BDA0003489492900000182
Figure BDA0003489492900000191
采用茯苓、白术、党参复合多糖提取物冻干保护剂制得的直投发酵剂能够维持较高的发酵活力，发酵10％菊芋浸汁过程中，菌体生长迅速、产酸能力强、还原糖和总糖的消耗速度快，且总体效果与直接活化接种无明显差别。
表1及表2中所述活菌数为粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌及侧孢短芽孢杆菌活菌数之和。
实施例3
按照表5所示组分配置冻干保护剂，并制备直投发酵剂；实验过程具体步骤及参数设置按实施例2进行。
表5实验设计
Figure BDA0003489492900000192
不同贮藏时间后菌体冻干存活率如表6所示。
表6不同组方下贮藏期间冻干存活率(％)
Figure BDA0003489492900000193
Figure BDA0003489492900000201
由表5及表6可知，采用实验7多糖提取物冻干保护剂可显著提升菌体冻干存活率，尤其是150天贮藏期间，相对于单独使用或是两两配对效果显著。
实施例4
按实施例3实验7组方配置冻干保护剂及直投发酵剂，实验过程具体步骤及参数设置按实施例2进行，调整混合菌液与冻干保护剂的混合比例(v/v)。
表7不同混合比例下贮藏期间冻干存活率(％)
Figure BDA0003489492900000202
由上表可以看出，在混合菌液与冻干保护剂的体积比为1:1～1:4时，菌体冻干存活率在贮藏第150天时，仍能达到87.9～94.5％；而在体积比1:0.5时，冻干存活率明显降低，贮藏第150天时，冻干存活率仅为69.9％；体积比为1:4.5及1:5.0时，冻干存活率分别为79.5％及80.1％。因此，本发明优选的浓缩菌种细胞悬浮液与冻干保护剂的体积比为1:1～1:4。进一步地，优选为1:1.5～1:4。进一步地，优选为1:2.5～1:4。
实施例5
在实施例3实验7组方上根据实施例4选出的最佳配比制备直投发酵剂，另购置4种市售饲料用直投发酵剂(均处于保质期内)，动态比较分析本专利直投发酵剂与市售发酵剂活菌数及pH值发酵性能上区别。发酵性能评价方法参照实施例2。
结果如表8所示，相较于市售直投发酵剂，本发明直投发酵剂能够维持较高的发酵活力，发酵10％菊芋浸汁过程中，启动发酵速度最快，且菌体生长迅速、产酸性能最好。
表8本专利直投发酵剂与市售发酵剂发酵性能比较
Figure BDA0003489492900000211
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.复合中药多糖提取物冻干保护剂，其特征在于，所述复合中药多糖提取物冻干保护剂由下述原料制得：
茯苓多糖提取物10.0～30.0g/100mL、白术多糖提取物10.0～20.0g/100mL、党参多糖提取物5.0～20.0g/100mL、L-酪氨酸2.0～10.0g/100mL、α-环糊精2.0～7.0g/100mL和聚乙烯亚胺2.0～5.0g/100mL；
且，所述复合中药多糖提取物冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)茯苓粉经碱化、醚化、醇沉、干燥，制得茯苓多糖提取物；
(2)白术粉经醇提、超声提取、干燥，制得白术多糖提取物；
(3)党参粉经微波提取、醇沉、干燥，制得党参多糖提取物；
(4)将茯苓多糖提取物、白术多糖提取物、党参多糖提取物混于水中，灭菌后得溶液A；
(5)将L-酪氨酸、α-环糊精、聚乙烯亚胺混于水中，灭菌后得溶液B；
(6)将溶液A和溶液B混合，得到所述冻干保护剂。
2.根据权利要求1所述的复合中药多糖提取物冻干保护剂，其特征在于，
步骤(1)中，
茯苓粉过100～150目筛；
碱化：向茯苓粉中加入NaOH溶液，持续搅拌至茯苓粉完全溶解，得到茯苓碱化溶液；每100g茯苓粉中加入NaOH溶液200～400mL，所述NaOH溶液的质量分数为40～60％；
醚化：向茯苓碱化溶液中加入氯乙酸，持续搅拌，45～65℃反应6～8h，得到茯苓醚化溶液；以每100g茯苓粉计，分批次加入氯乙酸固体共计40～100g；
醇沉：向茯苓醚化溶液中加入95％乙醇-乙酸溶液进行沉淀，沉淀用水复溶，使用质量分数95％的乙醇溶液醇沉，收集沉淀；
95％乙醇-乙酸溶液与茯苓醚化溶液的体积比为3:1～5:1，95％乙醇-乙酸溶液为质量分数95％的乙醇溶液与乙酸以1:1体积比混合制得；
干燥：醇沉步骤所得沉淀采用真空干燥方式，35～45℃干燥4～6h；
步骤(2)中，
白术粉过100～150目筛；
醇提：白术粉中加入乙醇溶液，80～85℃加热回流提取2～3h，过滤获得白术颗粒；乙醇溶液质量分数为70～75％，用量按每克白术粉添加20mL计算；
超声辅助提取：在白术颗粒中加入蒸馏水，75～80℃超声提取60～90min，过滤所得滤液备用；
干燥：滤液采用真空冷冻干燥方式，置于-20～-35℃预冻5～8h后进行冻干处理；
步骤(3)中，
党参粉过100～150目筛；
微波提取：党参粉加水浸泡8～12h后，在微波反应器中加热反应，反应温度200～260℃，时间1～1.5h，过滤获得党参微波提取溶液；每100g党参粉中加入1000～2000mL水；
醇沉：党参微波提取液中加入3～5倍体积的乙醇进行醇沉，静置6～8h，4000r/min离心10～15min，去掉上清液后，再加sewage试剂，涡旋混匀后5000r/min二次离心10～15min，取离心所得上清液二次醇沉，收集沉淀；所述sewage试剂由三氯甲烷和正丁醇按4:1体积比配制而成；
干燥：醇沉步骤所得沉淀采用真空干燥方式，35～45℃干燥4～6h。
3.直投发酵剂，其特征在于，
包括如权利要求1所述的复合中药多糖提取物冻干保护剂，粪肠球菌，产朊假丝酵母，黑曲霉，凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌。
4.一种如权利要求3所述直投发酵剂的制备方法，其特征在于，
将粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的混合菌液与冻干保护剂按照1:1～1:4体积比混合，冷冻干燥，制得直投发酵剂。
5.根据权利要求4所述直投发酵剂的制备方法，其特征在于，所述混合菌液中，
粪肠球菌的活菌浓度为1.0×1010-6.0×1010CFU/mL；
产朊假丝酵母的活菌浓度为3.0×108-6.0×108CFU/mL；
黑曲霉的活菌浓度为8.0×107-2.0×108CFU/mL；
凝结芽孢杆菌的活菌浓度为5.0×107-3.0×108CFU/mL；
侧孢短芽孢杆菌的活菌浓度为1.0×108-4.0×108CFU/mL。
6.根据权利要求5所述直投发酵剂的制备方法，其特征在于，
粪肠球菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的混合菌液制备方法如下：
(1)活化各菌种；
(2)活化后各菌进行混合增殖培养，培养液离心，生理盐水重悬，得到混合菌液；
增殖培养过程中使用的增殖培养基为菊芋茯苓复合培养基；
所述菊芋茯苓复合培养基制备方法为：菊芋全粉、茯苓水提物和水按2:3:5质量比混合，65℃水解60min后升温至95℃继续水解60min，冷却后用8层纱布过滤，滤液调节pH值为7.0～7.3，即得菊芋茯苓复合培养基；
所述菊芋全粉制备方法：新鲜菊芋切片，70～80℃烘干至含水量低于8％，粉碎过100目筛后制得菊芋全粉；
所述茯苓水提物制备方法：新鲜茯苓切片，70～80℃烘干后粉碎；加入10～15倍质量无水乙醇，浸提2～4h后过滤；滤渣加8～10倍质量蒸馏水，加热回流提取2h，过滤，重复2次，合并滤液，减压浓缩干燥后，得茯苓水提物。
7.根据权利要求5所述直投发酵剂的制备方法，其特征在于，
冷冻干燥步骤中，先于-80℃预冻3h，待菌液完全冻结后迅速转移至真空冷冻干燥机进行冻干；冻干条件为真空度10Pa，冷阱温度-55℃，隔板温度设定程序为10℃先加热2h、再升温至20℃加热3h、最后升至30℃进行加热，冻干时间20h。
8.一种如权利要求3所述直投发酵剂或如权利要求4-7任一方法制备的直投发酵剂在水产发酵饲料制备中的应用。
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